CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en: a) Su consistencia b) Su utilización c) Su composición d) Su origen
a) SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA): denominándose por esta 1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.
2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura a mbiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y no se funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunqu Aunqu e el ag ar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos: - agarosa, c on poco sulfato, libre libre de ácido pirúvico, y - agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.
3)
Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos
un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias
SEGÚN SU UTILIZACIÓN. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. nutritivo. Otros representantes de este g rupo son el agar tripticase de soja, el agar Col umbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan incorporan una serie de factores indispensables indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, Isovitalex, etc ) El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada adicionada al m edio de cultivo (agar chocolate). 3)
Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas
bacterias contenidas en una población polimicrobiana. polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.
4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.
6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de
los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificació n para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto últimos los medios CPS ID3 o Uriline ID (Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos. 7)
Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir
de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.
8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases periódicos de placa a placa, b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descrem ada estéril al 0,1%.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart -Amies, Cary-Blair, etc.
ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN. Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:
1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.
2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida.
3)
Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para
ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.
Según su origen: a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los m edios que contienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factore s de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIOS DE CULTIVO COMUNES . Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología.
Agar nutritivo:
Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial.
Agar sangre : Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis (, ß ó gamma). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento
bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre pa ra romper los erit rocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles. La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes.
Agar chocolate:
El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos y meningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clásico es el Thayer -Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocola te enriquecido al cual se ha añadido una mezcla de tres antibióticos específicos que impedirán el crecimiento del resto de la flora acompañante.
Agar MacConkey:
Es un medio utilizado para el aislamiento e identificación de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los gérmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composición lleva un azúcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferen cial. Los gérmenes que fermenten la lactosa producen una acidificación del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas serán incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja).
Agar C.L.E.D.:
El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos po r Proteus.La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromo timol. Las c olonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.
Agar S.S.:
El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos.
La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se mani fiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. Así, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y será exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioquímicas confirmatorias de es ta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen.
Agar Hektoen: Es
un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacteri as. La presencia de tres azúcares (lactosa, sacarosa y salicilina) permiten ampliar el poder diferencial de este m edio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular). El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obteniéndose colonias más numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibición tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que señalar que el vibrión colérico crece bien en este m edio.
C.P.S. ID3. :
Medio cromogénico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificación de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualización d el cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrón). La identificación solo requiere la adición de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificación habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para detección de Estreptococos agalactiae, mediante la utilización de un sustrato cromogénico específico de este microorganismo.
Agar Mueller-Hinton:
Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. A él nos referiremos más ampliamente en el capítulo correspondiente
Agar Tripticase de soja:
Es un medio utilizado para el crecimiento de gérmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Estreptococos. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy
microaerófilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio.
Agar Chapman:
Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sódico permite la inhibición de la mayoría de los otros gérmenes. La presencia de ma nitol y rojo fenol convierten a este m edio en diferencial: así se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegérmen crece bien en medios salados y fer menta el manitol (colonias amarillas).
Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto.
Medio de Loeffler:
Es un medio específico para el cultivo de Corynebacterium
difteriae.
Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):
Similar al agar SS. Es un
medio diferencial e inhibidor a la vez.
Agar Kligler :
Medio específico para pruebas de identificación de enterobacterias. Aunque de él hablaremos con más detenimiento en el capítulo de pruebas de identificación bacteriana, podemos ir adelantando que se trata de un m edio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azúcares (glucosa y lactosa), investigar la formación de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfato ferroso a partir del tiosulfato sódico.
Agar Levine ó EMB
(Eosina azul de metileno): Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metálico característico.
Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas. Agar Cetrimida. Agar King:
Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayoría de enterobacterias. El segundo pone además de manifiesto la pigmentación fluores cente de Pseudomonas bajo luz UV.
Agar Schaedler:
Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo
de anaerobios.
Agar Gardnerella:
Agar con sangre humana más una mezcla de antibióticos que permiten la observación de colonias betahemolíticas características de Gardnerella vaginalis
Campylosel:
Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42º C en microaerofilia.
Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):
Se utiliza para el aislamiento de
bacterias del género Legionella
Löwenstein-Jensen:
Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita para inhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.
Nutritivo Agar Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se r efiere a requerimientos nutritivos. Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Fundamento Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para f acilitar el cultivo de microorganismos exigentes.
Fórmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Pluripeptona
5.0
Extracto de carne
3.0
Cloruro de sodio
8.0
Agar
15.0
Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
pH final: 7.3 ± 0.2
Siembra En superficie o por la técnica de pour plate, según el uso a que s e destine.
Incubación En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.
Resultados a-Agar nutritivo: Microorganismos
Crecimiento
P. mirabilis ATCC 43071
Bueno-excelente
E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923 B. cereus ATCC 10876 E. faecalis ATCC 29212 P. aeruginosa ATCC 27853
Bueno-excelente Bueno-excelente Bueno-excelente Bueno-excelente Bueno-excelente
B-Agar nutritivo suplementado con 5% de sangre de carnero: Microorganismos
Crecimiento
Hemólisis
S. pyogenes ATCC 19615 S. pneumoniae ATCC 6305 S. pneumoniae ATCC 49619
Abundante Abundante Abundante
Beta Alfa Alfa
Características del medio Medio preparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.
Almacenamiento Medio deshidratado: a 10 -35 ºC. Medio preparado: a 2 -8 ºC.
Presentación x 100g :Código: B02-122-05
x 500g :Código: B02-122-06
6 x 50 ml: B04-122-84
MEDIOS DE CULTIVO Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razón por la cual es difícil aislarlas. A menudo nuestro interés es caracterizar una especie bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos últimos se basan muchos de los principios del aislamiento.
OBJETIVOS: Conocer la clasificación de los m edios de cultivo. Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación del
medio de cultivo en la práctica microbiológica. Adquirir práctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus
componentes individuales.
Reconocer la necesidad de evitar la contaminación tanto de los medios de cultivo
como de los demás elementos utilizados en el laboratorio de microbiología.
INTRODUCCIÓN: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es cualquier medio que proporcione sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Los requisitos que debe r eunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. El conocimiento de las necesidades nutritivas y físicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Las características de los microorganismos a tener en cuenta al momento de preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:
Tipo trófico: se refiere a los requerimientos de carbono y energía, según los cuales se los clasifica en autótrofos, heterótrofos, quimiotrofos (litotrofos u organotrofos) y fototrofos.
Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos.
Agar nutritivo
Temperatura óptima de crecimiento: según el rango de temperatura al cual el Microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en psicrófilos, mesófilos y Termófilos. Rango de pH: en general el rango óptimo de pH para la mayoría de las bacterias oscila entre 6,6 y 7,2.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU ORIGEN Los medios de cultivos pueden clasificarse en:
Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc.
Artificiales: Están compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en sintéticos y complejos. Un medio del cual se conoce ex actamente su c omposición química se denomina sintético o químicamente definido; puede ser una simple solución de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos compuestos orgánicos. Un medio no sintético o complejo e s aquel del que se desconoce su composición química exacta; se trata básicamente de extractos de tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentración no se conoce con exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo nutritivo.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS ARTIFICIALES COMPLEJOS SEGÚN S U FINALIDAD I. Comunes Medios Artificiales Complejos II. Especiales II.a. Enriquecidos II.b. Selectivos II.c. Diferenciales I. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos, como el Caldo carne y agar carne. II. Medios especiales : se los clasifica según su finalidad. II.a Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio común, con el agregado de elementos nutritivos elegidos según las necesidades. Tales como sangre, albúmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismos exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ej emplos el agar sangre y el agar chocolate. II.b Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera para que, en una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo tiempo inhiban la proliferación de la flora acompañante. Para esto últ imo se busca establecer condiciones desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por el agregado de inhibidores.
El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el des arrollo de la mayoría de las bacterias. Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde brillante), los antibióticos, el alcohol fenil etílico y la azida de sodio. II.b.1 Medios selectivos para enriquecimiento: Son m edios en los que los microorganismos crecen en libre competencia, viéndose favorecidos aquellos para los cuales las condiciones de desarrollo son las más apropiadas, no llegándose a inhibir totalmente el crecimiento del resto de microorganismos. Se logra así la multiplicación de los microorganismos que se desea identificar, hasta un número suficiente tal que sea posible su aislamiento en medios selectivos apropiados. II.b.2 Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos sólidos, se utilizan para sembrar directamente con la muestra incógnita o a partir del medio selectivo para enriquecimiento. II.c Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies que coexisten en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o más tipos de microorganismos pueden crecer en este medio, algún elemento presente en él permite diferenciarlos, por ejemplo un indicador. Estas diferencias se basan en alguna propiedad bioquímica que unos poseen y otros no. Un ejemplo de este t ipo es el agar con eosina azul de metileno que diferencia Escherichia coli de Enterobacter aerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus respectivas colonias. Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de color blanco grisáceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E. coli son oscuras y con brillo metálico, en cambio las colonias de E. aerogenes son rosadas con un centro azul y rara vez presentan brillo. En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregado de agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo- diferenciales resultan muy útiles para el aislamiento de un microorganismo separándolo de la flora acompañante. Se ponen en evidencia las colonias de los microorganismos que se desea aislar y a su vez se diferencian de aquellas que pudieran haber desarrollado provenientes de la flora acompañante.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO Como ya se ha señalado, la provisión de elementos nutritivos en concentración adecuada,
depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hábitat natural. La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH, la fluidez y la presión osmótica que se le quiera brindar a los microorganismos. En función de la consistencia se puede clasificar a los medio el líquidos y sólidos. En el laboratorio, los medios de cultivo pueden present arse en forma líquida, en cuyo caso se los denominacal dos, o en forma sólida si se le agreg a agar al caldo. En cuanto a la esterilización, este procedimiento garantiza la destrucción de todos los microorganismos no deseados que se encuentran present es durante la preparación del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al autoclave (121 ºC, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibióticos y compuestos fácilmente oxidables al calor, se los esteriliza por separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado cuando se haya enfriado a 50 ºC. En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros. Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentración adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estéril y que no contenga sustancias inhibidoras.
CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CU LTIVO Los elementos citados a continuación, son los más frecuentemente usados en la preparación de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los únicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparación.
Agua destilada o desionizada . Libre de inhibidores del crecimiento. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacárido, al que acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los 98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los 42°C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser sólido a la temperatura de incubación. Con la excepción de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega aga r al 3 %.
Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitógeno y carbono.
Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad química definida; se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas, polipéptidos y aminoácidos.
Fluidos Corporales . Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo Para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviación del pH.
Indicadores de pH . Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los medios de cultivo Con objeto de detectar variaciones del pH.
Agentes reductores. Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores que se añaden a Los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios.
Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede Convertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc.,
a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
PREPARACIÓN En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso re hidratar. En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo. En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparación de un medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la fórmula que constituye una receta que deberá respetarse estrictamente. Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van incorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran. Generalmente figura en primer término el compuesto que actúa como tampón, como puede ser el PO4H2K, que además provee fósforo y potasio. Es conveniente añadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno antes de agregar el siguiente. Al finalizar la preparación y una vez que ésta se enfríe, se debe verificar que el pH sea el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).
ACTIVIDADES I.
Preparación de medios de cultivo
Materiales: - Erlenmeyer - pipetas de 10 ml - tubos de ensayo con sus tapones - gradillas - tiras de pH - drogas correspondientes a cada fórmula - balanza - autoclave
A. Caldo nutritivo (Caldo carne)
Es el medio complejo más común para el cultivo de microorganismos. Fórmula: Peptona............................................. 5 g Extracto de carne.......... 3 g Agua c.s.p................. 1000 ml pH.................................. 7,2
Preparación: 1) Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente. 2) Disolver los ingredientes de a uno y por orden. 3) Llevar a ebullición agitando periódicamente con una varilla de vidrio. 4) Completar el volumen hasta 1000 ml. 5) Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M. 6) Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volúmenes apropiados en frascos.
7)
Tapar, colocar capuchón de papel y esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.
B. Agar nutritivo Fórmula: Agar........................... 20 g Caldo nutritivo........ 1000 ml
Preparación: 1) Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente. 2) Agregar el agar calentando a baño maría agitando hasta disolución total. 3) Ajustar pH hasta 7,2. 4) Llevar 10 ml a tubos de ensayo. 5) Esterilizar. Cuando se prepara agar nutritivo no es necesario usar c aldo estéril, la esterilización se lleva a cabo una vez que se ha envasado el caldo agarizado. Se prepararán tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant), para ello se colocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez afuera del autoclave, cuando están aún líquidos, se apoyan sobre la mesada con un cierto ángulo hasta que solidifiquen.
Se prepararán también tubos con agar para punción. En este caso, una vez que los tubos fueron retirados del autoclave se dej an solidificar en posición vertical. Por último se prepararán cajas de Petri con agar nutritivo. Para ello se puede utilizar medio de cultivo recién esterilizado y todavía líquido, o bien medio solidificado y fundido a ebullición en Baño María. Se deja enfriar el agar hasta 45 ºC, luego se lo vuelca asépticamente en caja de Petri estéril, teniendo la precaución de flamear previamente la boca del tubo o recipiente a la llama del mechero. Se deja solidificar en posición horizontal.
Medio de cultivo caldo brilla Introducción Las disponibilidades en agua constituyen un factor fundamental para el desarrollo económico y la salud pública. Los abastecimientos de agua se consideran en todos los países como inversiones básicas de interés general, en el sentido de que posibilitan actividades humanas e industriales directamente productivas que influyen en la tasa de crecimiento económico. La contaminación es un proceso de alteración o de modificación más o menos importante de los equilibrios físicos, químicos o biológicos del agua que son responsables de su calidad y la hacen inadecuada para sus numerosos usos y aplicaciones. Dicha contaminación puede tener dos orígenes: Químico o microbiológico. El agua natural constituye un reservorio de microorganismos autóctonos ( Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus ) o exógenos (Escherichia coli, Enterococcus ). No debe olvidarse que recibe y arrastra partículas cargadas de bacterias, de tal modo que en cercanías de las g randes poblaciones incluso el agua de lluvia es portadora de un elevado número de microorganismos (Guinea, 1979, 1 -8). El análisis microbiológico por recuento de bacterias indicadoras de contaminación fecal en aguas es de suma importancia al evaluar el estado sanitario del sistema en estudio. Las bacterias que se utilizan normalmente forman parte de un grupo llamado coliforme, dentro de la familia Enterobacteriaceae (Madigan, 2004, 927- 941). Dicho grupo se caracteriza por estar formado por microorganismos que habitan el tracto gastrointestinal de los vertebrados. Su presencia indica el potencial patogénico en aguas, es decir la probable existencia de agentes causantes de enfermedades como cólera, hepatitis, polio, fiebre tifoidea, giardiasis, amebiasis, etc. Debido a que la concentración de dichos agentes habitualmente es baja, su detección directa en agua s
es complicada, por la cual se utiliza, entre otras, a las bacterias coliformes, que son de fácil detección y cultivo en laboratorio y presentan un tiempo de supervivencia que excede al de los patógenos en ese a mbiente (Vullo, 2000, 137 -141). Dentro de los métodos de recuento de bacterias se encuentran dos que son los más ampliamente utilizados: la técnica de Número Más Probable (NMP) y la técnica de recuento en placa. Con la primera sólo se obtiene una estimación de la población de microorganismos contenidos en una muestra, no proporcionando una enumeración precisa. Cuando la población es muy elevada, el recuento en placa supera en precisión a este método. Por el contrario en poblaciones bajas (menos de 10 células por mL) es más eficaz la técnica de NMP porque permite la utilización de muestras de mayor tamaño. El objetivo del presente trabajo práctico es la comparación de dos métodos de enumeración de bacterias de importancia sanitaria, mediante la realización de recuentos paralelos de aguas de diferentes grados de contaminación, utilizando las técnicas de NMP y recuento en placa, en medios selectivos para coliformes.
Metodología Tiempo estimado de realización y distribución de los grupos de trabajo
La experiencia fue diseñada para tres clases de trabajos prácticos de tres horas de duración cada una pertenecientes a la materia de grado Microbiología General e Industrial de la Licenciatura en Ciencias Químicas de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales-UBA. Como dichas clases cuentan con alrededor de 20 estudiantes, se forman 10 grupos de trabajo de 2 per sonas cada uno. M uestras
de agua
Se analizan 250 mL de muestras de agua de diferentes grados de contaminación: agua del Río de la Plata y agua de pozo, perteneciente al conurbano bonaerense. Las muestras deben tomarse en forma estéril, utilizando frascos adecuados. M edios
de cultivo
Caldo Brila Fluorocult (Merck, 1994, 275) : Pepton a 10 g/l; Lactosa 10 g/l; Bilis de buey desecada 20 g/l; Verde brillante 0,0133 g/l; L -triptofano 1 g/l; 4 -metilumbeliferil-D-glucurónido 0,1 g/l. Caldo Citrato de Koser: Cloruro de sodio 5 g/l; Sulfato de magnesio 0,2 g/l; Hidrógeno fosfato de diamonio 1 g/l; Hidrógeno fosfato di potásico 1 g/l; disolver los componentes hasta obtener una solución límpida; agregar 2 g/l de ácido cítrico y se lleva a pH=6 con hidróxido de sodio 1N.
Agar Chromocult (Merck, 1994, 270): Peptona 3 g/l; Cloruro sódico 5 g/l; Dihidrógenofosfato potásico 1,7 g/l; Hidrógeno fosfato di potásico 3 g/l; Piruvato sódico 1 g/l; Triptófano 1 g/l; Laurilsulfato sódico 0,1 g/l; Agar-agar 12 g/l; Mezcla de cromógenos 0,2 g/l. Recuento
de bacterias del grupo coliforme según la técnica de N MP
1- Disponer de series de tres tubos con 10 mL cada uno de Caldo Brila -Fluorocult doble concentración y series de tres tubos con 5 mL cada uno del mismo caldo, pero simple concentración. Todos deben poseer en su interior una campana de Durham para ver producción de gas. 2- Sembrar 10 mL de la muestra en cada uno de los tubos de doble concentración, 1 mL o 0,1 mL en los de simple concentración. Ver esquema de la Figura 1. 3- Incubar los tubos 48 hs a 37°C.
4- Seleccionar los tubos que posean gas en el interior de la campana de Durham. Dichos tubos serán considerados positivos. Buscar en la tabla (Figura 2) el NMP de bacterias coliformes totales / 100 mL de muestra. Calcular en forma paralela el NMP/100 mL (AWWA, WEF, APHA, 1998, 9-53, Hurst, 2002 178-179) según: NMP/100 mL= nº tubos positivos x 100 / (mL muestra en tubos negativos x mL muestra totales)½. 5- Sembrar con ansa recta, a partir de cada tubo con gas, en Caldo Citrato de Koser. Incubar 48 hs. a 37°C. 6- Exponer los tubos positivos de Caldo Brila -Fluorocult a la luz ultravioleta. Los medios con Fluorocult poseen MUG: 4-metilumbeliferil--D-glucurónido, sustrato de la enzima-D- glucuronidasa, que al clivarse libera un producto (4 -umbeliferona) de fluorescencia azul. Existen muchos grupos bacterianos que poseen dicha enzima, pero dentro de las Enterobacterias sólo Escherichia coli y algunas especies de Salmonella y Shigella cuentan con ella. Por lo tanto la aparición de fluorescencia y gas lleva a poder inferir la presencia de bacterias coliformes fecales (E. Coli ). Para poder considerar estos tubos positivos para coliformes de origen fecal debe agregarse 1 mL de reactivo de Kovacs (p-dimetilamino benzaldehído 5%(p/v) en alcohol amílico o isoamílico con 2,5%(v/v) de HCl(c), Merck, 1994, 307) para la prueba de indol en cada tubo, y ver el desarrollo de color púrpura en la fase org ánica. Con este patrón de tubos positivos, calcular por ambos métodos el NMP de bacterias coliformes fecales / 100 mL de muestra. 7- Según los resultados positivos por la aparición de turbidez en los tubos con Caldo Citrato de Koser, calcular el NMP de bacterias coliformes de origen no fecal.
8- Efectuar las correcciones por normalización, detalladas en la Figura 1 e informar los resultados del recuento. Recuento
en placa de bacterias del grupo coliforme
1- Inocular por duplicado 0,1 mL de muestra en placas de Petri preparadas con Agar Chromocult. Rastrillar el inóculo con espátula de Drigalsky. 2- Incubar a 37°C durante 48 hs. 3- Observar y contar las colonias obtenidas. El Agar Chromocult identifica coliformes totales (enterobacterias fermentadoras de lactosa) y Escherichia coli a través de dos sustancias cromógenas: Salmon-gal que pone en evidencia la-D-galactosidasa dando colonias de color rojo y X-glucurónido que determina la presencia de la-D glucuronidasa dando colonias azules. Escherichia coli escinde ambos compuestos dando coloración violeta. Las colonias rojas y violetas son características de bacterias coliformes. Las rojas pertenecen al grupo de las no fecales, mientras que las violetas a las fecales. Las especies que no poseen ninguna de las enzimas se evidencian a través de colonias transparentes. El medio tiene también laurilsulfato de sodio para inhibir el desarrollo de Gram positivas y triptófano para realizar la prueba de indol (rec onocimiento de E. coli )
4- Calcular el número promedio de unidades formadoras de colonias por mL (UFC/mL) de bacterias coliformes totales, fecales y no fecales presentes en la muestra, según la expresión: UFC/mL = Número de colonias promedio de ambas placas Dilución x volumen del inóculo
Obtención, manejo e interpretación de resultados
Recuento
en placa de bacterias del grupo coliforme
A. Muestra: Río de la Plata Se realizan diluciones seriadas al décimo de la muestra hasta 10-4. Se siembran en placas de Agar Chromocult y se calcula el número de UFC/mL de las colonias rojas (Coliformes no fecales), violetas indol positivas (Coliformes fecales) y la suma de ambas (Coliformes totales). Los resultados se resumen en la Tabla 4. B. Muestra de agua de pozo del con urbano bonaerense
Se siembra la muestra sin diluir en placas de Agar Chromocult. y se calcula el número de UFC/mL de las colonias rojas (Coliformes no fecale s), violetas indol
positivas (Coliformes fecales) y la suma de ambas (Coliformes totales). Los resultados se resumen en la Tabla 5.
Discusión de los resultados Una vez realizada la lectura de los resultados para las distintas muestras, se dispone de una última clase destinada a la discusión e interpretación de los resultados obtenidos por los distintos grupos de trabajo. Así por ejemplo para el caso de agua de río, se determina que el recuento de bacterias coliformes totales por mL, obtenido mediante la técnica de NMP corresponde a la mitad con respecto al valor en placa (Tablas 2 y 4). El intervalo de 95% de confianza para el método de NMP es muy amplio (AWWA, WEF, APHA, 1998, 9-52). Para el recuento de coliformes totales, el NMP calculado es 7,6 x 105 / 100 mL (Tabla 2: dilución 10-4 de la muestra original) y su intervalo de 95% de confianza oscila entre 3 y 25 x 105 / 100 mL. Los valores de recuento en placa ( Tabla 4) están dentro de este intervalo. En este caso, según el error de la técnica, el resultado oscila entre 2,4 y 1,2 x 104 UFC/mL. Los resultados muestran entonces una mayor precisión en el recuento en placa, ya que el método de NMP es un concepto estadístico, derivado de la teoría de probabilidades, aplicable a la enumeración de microorganismos bajo ciertas condiciones, es decir cuando las muestras son lo suficientemente diluidas como para realizar un recuento en placa. Para el caso de un agua de pozo, no se puede realizar el recuento en placa debido a la baja proporción de bacterias coliformes presentes en la muestra. Un recuento tan bajo como 3,6 bacterias coliformes totales/100 mL sólo se puede estimar por la técnica de NMP. En este caso el interva lo del 95% de confianza se encuentra entre 1 y 13 bacterias coliformes totales/100 mL (AWWA, WEF, APHA, 1998, 9-52). Como conclusión general del trabajo, es necesario conocer el origen y posible nivel de contaminación microbiológica de una muestra de agua a analizar, para utilizar el método de enumeración de mayor precisión en cada caso.
Levine EMB Agar. Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de ba cilos entéricos, a partir de muestras clínicas, aguas servidas, y otros ma teriales. Es recomendado por la A merican Public Health Association, para el análisis microbiológico de productos lácteos y alimentos, y por la U SP para la realización de los ensayos límite microbiológico.
Fundamento
La fórmula original de este medio de cultivo, fue modificada por Levine, eliminando la
sacarosa e increm entando la concentración de lactosa, lo que permite una m ejor diferenciación de E. coli.
Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias. La combinación utilizada de eosina y a zul de metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gra m negativas fastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. Los microorganismos fermentadores de lact osa, originan colonias de color azulado negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras.
Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y levad uras, pueden crecer, originando colonias incoloras y puntiformes.
Este medio de cultivo, es útil para la orientación y no confirmación de especies bacterianas (ya que numerosas cepas de Citrobacter spp. producen colonias con brillo metálico), por lo cual será necesario real izar pruebas bioquímicas, para la identificación de género y especie.
Fórmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Peptona
10.0
Lactosa
10.0
Fosfato di potásico
2.0
Agar
15.0
Eosina
0.4
Azul de metileno
0.065
Suspender 37,4 g de polvo por litro de agua destilada, dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta disolución total. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121°C.
pH final:7.1 ± 0.2
Siembra Directa, estriando la superficie.
Incubación De 18-24 horas a 35- 37 °C, en aerobiosis.
Resultados Microorganismos
Crecimiento
Escherichia coli ATCC 25922
Bueno a excelente Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
Klebsiella 700603
pneumoniae
ATCC Bueno a excelente
Características de las colonias
Mucosas, rosa púrpura, confluentes
P. aeruginosa ATCC 27853
Bueno a excelente Incoloras
Proteus mirabilis ATCC 43071
Bueno a excelente Incoloras
S. aureus ATCC 25923
Pobre
Incoloras, pequeñas, puntiformes
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Pobre
Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022 Salmonella 14028
typhimurium
Bueno a excelente Incoloras ATCC Bueno a excelente
Incoloras
Características del medio
Medio preparado: color púrpura con tonos verdosos, ligeramente op alescente con un precipitado floculento disperso.
Placas preparadas: color púrpura. La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agita ción. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Almacenamiento Medio deshidratado: a 10 -35 ºC. Medio preparado: a 2 -8 ºC.
Presentación x 100g :Código: B02-104-05 x 500g :Código: B02-104-06 6 x 50 ml: B04-104-84
E.M.B. Agar. Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobac teriaceae.
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. Como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. Crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. Y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
Fórmula (en gramos por litro) Peptona
10.0
Lactosa
5.0
Sacarosa
5.0
Fosfato di potásico
2.0
Agar
13.5
Eosina
0.4
Azul de metileno
0.065
Instrucciones Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.
pH final: 7.2 ± 0.2
Siembra En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubación De 24 a 48 horas a 35 -37 °C, en aerobiosis.
Resultados Microorganismos
Tipo de Colonia
Escherichia coli ATCC 25922
Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis ATCC 43071
Incoloras
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022
Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Incoloras
Características del medio:
Placas preparadas: color púrpura. La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10 -35 ºC. Medio preparado: a 2 -8 ºC.
Presentación x 100g :Código: B02-101-05 x 500g :Código: B02-101-06 6 x 50 ml: B04-101-84
