Medida de la concentración de lactosa Lactosa: es un disacárido formado por una molécula de glucosa y una de galactosa. [1]
Figura 1. Fórmula de la lactosa
Medición por DNS Los métodos enzimáticos para cuantificar lactosa están basados en la hidrólisis de la misma a Dgalactosa y D-glucosa con β-galactosidasa, seguida por la determinación de cualquiera de los azucares obtenidos. La medida de la D-galactosa liberada es más confiable, debido a que las preparaciones pueden contener D-Glucosa libre en mayores cantidades. Las determinaciones enzimáticas de D-galactosa son muy lentas, esto se debe a la baja tasa de mutarotación entre las formas anomericas de la D-galactosa, ya que solamente la forma β es reconocida por la β-galactosa deshidrogenasa, por lo que se deben usar una mayor cantidad de reactivos para llevar a cabo el proceso en forma más ágil y lograr las mediciones deseadas. Cuando se tiene la β-D-galactosa se oxida por un NAD+ formando NADH y ácido D-galactonico, la cuantificación del NADH formado es estequiométrico con la cantidad de lactosa, esta medida se realiza en un espectrofotómetro a 340 nm de longitud de onda[2] El DNS reacciona únicamente con los azúcares reductores. La lactosa es un disacárido no reductor, pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa y galactosa que sí son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por métodos espectrofotométricos es proporcional a la concentración de lactosa[3]. Para medir la Lactosa por método de DNS es necesario realizar una desproteinizacion, así como una neutralización de la muestra a medir, se mezcla la muestra de lactosuero con el reactivo DNS y luego se diluye en 5 ml, la solución se mantiene en agua hirviendo por 5 min y es enfriada para medir la absorbancia a 540 nm.[4]
Es necesario tener en cuenta para la cuantificación de la lactosa que el método posee un límite de cuantificación que es de 2 mg lactosa /ml, teniendo en cuenta eso se debe realizar una curva patrón con diferentes concentraciones de lactosa para tener así la correlación y saber al momento de la medición que cantidad de lactosa se tiene en la muestra.[5] Durante estudios previos se realizaron pruebas de DNS, para comprobar la factibilidad de la medida de la concentración de la lactosa y el grado de hidrólisis de la misma [6], a continuación se muestran las graficas obtenidas en la medida del DNS para lactosa, glucosa y una mezcla de estas a diferentes concentraciones y las sustancias puras.
Glucosa 4
3.5
3.5
3
3 Cocnentración g/l
Cocnentración g/l
Lactosa 4
2.5 2 1.5
2.5 2 1.5
1
1
0.5
0.5
0
0
0.5 1 Absorbancia (540 nm)
1.5
Figura 2 a: Curva de calibración para lactosa mediante DNS
0
0
0.5
1 1.5 Absorbancia (540 nm)
2
2.5
Figura 2 b: Curva de calibración para glucosa mediante DNS
Absorbancia (540 nm)
% Glucosa en mezcla Figura 2 c: Absorbancia de mezcla, respecto a % de glucosa
Al observar las gráficas y luego de realizar una revisión bibliográfica, se llega a la conclusión que por el método del DNS no se puede cuantificar el grado de hidrólisis de la lactosa, ya que ambos azúcares presentan coloración al reaccionar con el DNS, lo que genera un ruido y una imposibilidad de saber cuál de las dos biomoléculas se está cuantificando y no se puede saber con exactitud la cantidad de lactosa remanente luego de la hidrólisis. El método tendría gran aplicación si se pudiera medir la absorbancia de uno de los azúcares a una longitud de onda diferente, ya que se evitarían lo errores producidos por la medición a la misma longitud de onda, pero en ninguno de los casos hallados se reporta una longitud de onda diferente para cualquiera de las biomoléculas trabajadas. Analizador de Leche La función de este equipo es realizar un análisis rápido de grasa (FAT), sólidos no grasos (SNF), proteínas, porcentaje de lactosa y contenido de agua, temperatura y en algunos caso pH, punto de congelación, sólidos y conductividad, así como la densidad de la muestra. El equipo debe ser configurado antes de ser entregado con las muestras que se desea analizar. Rangos de Medida Grasa
de 0,01% a 25%
SNF
de 3% a 15%
Densidad
de 1015 a 1040 kg/m3
Proteínas
de 2% a 7%
Lactosa
de 0,01% a 6%
Contenido de agua
de 0 a 70%
Temperatura de la leche
de 1°C a 40°C
Punto de congelación
de -0,4 a -0,7 °C
Solidos
de 0,4 a 1,5 %
El pH y la conductividad son medidas que se deben pedir al momento de realizar la compra del equipo.[7] Procedimiento básico de manejo del equipo y preparación previa de la muestra En la preparación previa de la muestra se debe tener en cuenta la procedencia de la materia prima, se debe asegurar que la muestra tenga las mismas características, es decir en el caso del lacto-suero provenga de la misma empresa y del mismo proceso de producción, de lo contrario se deben llevar a cabo medidas de cada una de las materias primas disponibles.
Uno de los puntos que mayor influencia tienen en la calidad de los resultados obtenidos es la correcta agitación previa de la muestra a analizar, es necesario realizar una adecuada agitación del recipiente que almacena toda la materia prima, esta se debe agitar por no menos de 5 min, con movimientos verticales y circulares. La cantidad recomendada de muestras para tener resultados confiables debe ser no menor a 200 ml. Para la toma de las mediciones, se debe asegurar la limpieza del equipo uno de los factores más importantes en la precisión de las medidas tomadas, luego de asegurarse de esto se enciende el equipo y es necesario esperar a que el mismo se encuentre listo para empezar a tomar la medidas, para esto se debe esperar a que se muestre el mensaje “Analyzer ready”, luego de esto se selecciona el modo de trabajo de acuerdo a las muestras a analizar, se pone la muestra preliminar en la probeta y se presiona el botón Enter; las medidas de esta primera muestra no se deben tener en cuenta, por ello se debe realizar un duplicado con muestra nueva para obtener resultados confiables. Después de cada medida se debe limpiar el equipo con agua destilada y al momento de cambiar de tipo de muestra se debe realizar la limpieza con las soluciones de limpieza del equipo, para asegurar su conservación y calibración. Pretatamiento Básico Durante experimentaciones anteriormente realizadas se encontró que el mejor esquema de pretratamiento para el trabajo con lacto suero, donde se remueve mayor cantidad de proteínas es el siguiente [8] En este pre tratamiento se ha eliminado el procedimiento de filtración debido a que la proteína desnaturalizada del lactosuero después del proceso de auto clavado presenta un buen tamaño de floculo y puede removerse a través de una centrifugación a 6000 RPM por 15 minutos, si se llegara a presentar el caso de que el tamaño del floculo fuese muy pequeño, la filtración tendría que hacerse para no afectar las condiciones del sustrato final. Después de realizado el ajuste de pH al de fermentación (7), para fines académicos es necesario remover las sales que se precipitan mediante una centrifugación a 12000 RPM, para evitar tener que centrifugar grandes volúmenes de medio, se recomienda dejar reposar el medio después del ajuste de pH durante varias horas y luego separar por decantación el volumen rico en precipitado y el clarificado, luego, para recuperar medio líquido, se deberá realizar la centrifugación para separar completamente las sales formadas; todo lo anterior favorece a un mejor seguimiento de los microorganismos y condiciones de fermentación. Por último, para no tener que realizar un segundo auto clavado que podría degradar los azucares (Glucosa y Galactosa) que servirán como fuente de alimento para el Bacillus Megaterium y que incrementará los gastos energéticos del proceso, será necesario mantener las condiciones de asepsia en todos los pasos subsecuentes después de la desnaturalización de la proteína y la
hidrolisis de la lactosa, por lo tanto se recomienda mantener aséptico (auto clavado) todo el material que se requerirá para llevar a cabo los estudios necesarios.
Figura 3. Esquema de pretratamiento seleccionado
Pretratamiento fino Para este tipo de pretratamiento usado principalmente con fines académicos y para el correcto seguimiento de la cinética de crecimiento microbiana, se usara el método de ultrafiltración para separar correctamente tanto las proteínas desnaturalizadas como las sales precipidadas durante el ajuste de pH. Ultrafiltración La ultrafiltración es el tipo de Filtración que utiliza membranas para separar diferentes tipos de sólidos y líquidos. El tamaño de poro no es tan fino como en la Nanofiltración y tampoco requiere tanta energía para efectuar la separación, y es mas pequeño que el de las membranas de microfiltración. La membranas de Ultrafiltración están dispuestas en forma de capilares y están construidas con materiales plásticos que son porosos semipermeables
La Ultrafiltración es capaz de concentrar sólidos suspendidos, bacterias, algunas proteínas, algunos colorantes y compuestos con un peso molecular mayor a 150,000 Daltons.[9] Como pretratamiento usando ultrafiltración se propondría el esquema siguiente:
Lactosuero entero
Ultrafiltración
Hidrolisis de la lactosa
Adición del medio formulado
Autoclavado 121 °C, 15 min
Ajuste de pH
Medio listo para fermentación Figura 4. Pretratamiento de lactosuero usando ultrafiltración.
Esta primera propuesta de pretratamiento para la obtención de un lactosuero más puro, nos ayuda a mejorar las condiciones de la materia prima para el trabajo experimental en el laboratorio, donde se necesitan las mejores condiciones de trabajo, sobre todo al momento de realizar mediciones precisas. Consiste inicialmente en una ultrafiltración, donde se espera remover la mayor cantidad de proteínas y sólidos suspendidos en el lactosuero, a continuación se procede a realizar una hidrólisis de la lactosa presente en azucares más simples, esta hidrólisis puede ser tanto acida, térmica o enzimática, luego se debe realizar un ajuste de pH al valor deseado, se lleva al autoclave, para eliminar los microorganismos indeseados, finalmente se agrega el resto de los nutrientes necesarios al medio y se procede a realizar la fermentación deseada.
Lactosuero artificial Para la formulación de un lactosuero artificial se debe tener la caracterización de uno natural, del cual se pueda sacar el contenido de lactosa y además tener conocimiento del medio formulado que se debe agregar para que los microorganismos tengas las fuentes de minerales necesarias para su crecimiento. De caracterizaciones realizadas con anterioridad en otros trabajos se presenta el contenido del lacto-suero natural y de igual manera los nutrientes y la cantidad necesaria a agregar para obtener el medio formulado. Tabla 1. Composición de Lactosuero dulce y acido [10] Componente Lactosuero dulce [g/L] Lactosuero acido [g/L] Solidos totales 63,0 – 70,0 63,0 – 70,0 Lactosa 46,0 – 52,0 44,0 – 46,0 Proteína 6,0 – 10,0 6,0 – 8,0 Calcio 0,4 – 0,6 1,2 – 1,6 Fosfatos 1,0 – 3,0 2,0 – 4,5 Lactato 2,0 6,4 Cloruros 1,1 1,1 Se sabe entonces que se debe tener una concentración aproximada de glucosa del 5 % Tabla 2. Composición del medio formulado REACTIVO Sulfato de amonio Fosfato diácido de potasio Fosfato ácido de sodio Sulfato de magnesio heptahidratado
FORMULA QUIMICA (NH4)2SO4
CANTIDAD (g/l) 1
KH2PO4
1,5
Na2HPO4
9
MgSO4 · 7H2O
Solucion elementos trazas Sulfato de hierro heptahidratado FeSO4 · 7H2O
0,2 1 ml 10
Sulfato de zinc
ZnSO4 · 7H2O
2,25
Sulfato de cobre
CuSO4 · 5 H2O
1
Sulfato de manganeso tetrahidratado
MnSO4 · 4H2O
0,5
Cloruro de calcio dihidratado
CaCl2 · 2H2O
Borato de sodio Molibdato de amonio
Na2B4O7.10H2O (NH4)2Mo7O24
Ácido clorhídrico 35%
HCl
2 0,23 0,2 10ml
REFERENCIAS 1.
2. 3.
4. 5.
José J.B. Machado, J.A.C., Eugénia A. Macedo, Solid–liquid equilibrium of a-lactose in ethanol/water. Solid–liquid equilibrium of a-lactose in ethanol/water, 2000. 173: p. 121134. Scientific, T., Measuring Lactose in Milk: A Validated Method, Dionex, Editor. 2011. IMPLEMENTACIÓN DE METODOLOGÍAS ANALÍTICAS PARA DETERMINAR EL NIVEL DE DEGRADACIÓN DE LA CELULOSA EN SOPORTE PAPEL POR PROCESOS DE OXIDO REDUCCIÓN O HIDRÓLISIS. . 2006. Félix Amárita, C.R.F., Fernando Alkorta, Hybrid biosensors to estimate lactose in milk. Analytica Chimica Acta, 1997. 349: p. 153-158. Guzmán, M.B.J.J., Influencia de las proteínas de la leche y su tratamiento
térmico en la actividad de la β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis, in Ciencias Biológicas y de la Salud. 2003, Universidad Autónoma Metropolitana: IZTAPALAPA. p. 93. 6. 7.
Salamanca, Y.M., Producción de PHB a partir de lactosuero. 2011, Universidad Nacional de Colomba: Manizales. Lac -S MILK ANALYZER Operation Manual, B. Germany, Editor. 2006: Hamburg. p. 91.
8.
Rios, W.S.O.d.l., PRODUCCRIÓN DE PHB POR BACILLUS
MEGATERIUM UTILIZANDO LACTOSUERO SUSTRATO. . 2012, Universidad Nacional de Colombia: Manizales. 9.
COMO
S.A., A.y.A. Ultrafiltración. Tecnología de flitración de membranas. 2011 01/08/2012]; Available from: http://www.ultrafiltracion.com.mx/.
10. ALAIS, CH. Ciencia de la Leche, Principios de la Técnica Lechera. Editorial Reverté
S.A. España. 2003.
