Slavica Spasić Zorana Jelić�lvanovi Jelić�lvanovićć Vesn Vesna a Spasojev Spasojevic� ic�Kali Kalimanovs manovska ka
MEDICI MEDICINSKA NSKA BIOHEMIJA BIOHEMIJA Periferne ćelije
Apo Ap o A� A�ll rece re cept ptor or
Holesterol
Apo A�l A�l Jetra
Glicero"
Holesterol
Holesterol TrigMcerJdi estri kA i
F�6J03
/DM0VG?W6 Slavica Spasić Zorana Jelić�lvanović Vesna Vesn a Spasojevic�Kalimanovska Spasojevic� Kalimanovska
MEDICINSKA BIOHEMIJA
Beograd, Beograd, 2003. 2 003.
Slavica Spasić Zorana Jelić�lvanović Vesna Spasojević�K Spasoj ević�Kaliman alimanovska ovska MEDICINSKA BIOHEMIJA Recenzenti: doc. dr Violeta Dopsaj Farmaceutski fakultet, Beograd prof. dr Vesna Matović Farmaceutski fakultet, Beograd
Izdavač: Autori Auto ri Tehnička i kompjuterska obrada: Autori Aut ori
Tiraž:
400 primeraka
Štampa: Foto Futura, Beograd
Odlukom Naučno�nastavnog veća Farmaceutskog fakulteta od 10. 1. 2003. godine odobreno kao udžbenik za nastavu studentima V godine Farmaceutskog fakulteta na smeru diplomirani farmaceut
Sadržaj Poglavlje 1. Uvod (autor: Zorana Jelić�lvanović)
Vrste biološkog materijala Uticaj fizioloških fizi oloških faktora
1�1 1�2
Poglavlje 2. Ugljeni hidrati (autor: Zorana Jelić�lvanović)
Varenje i apsorpcija Korišćenje glukoze gluko ze Uloga jetre jetr e u metabolizmu ugljenih hidrata Uloga mišića u metabolizmu ugljenih hidrata Povezanost metabolizma ugljenih hidrata sa metabolizmom lipida i proteina Uticaj hormona na metabolizam ugljenih hidrata Regulacija koncentracije glukoze u krvi Diabetes mellitus .:...': .:...':.:" .:" '.V Hipogli Hipo glikemi kemija ja :.^. :.^..v .v;r ;r.; .;.... Meliturije Laktat i piruvat Glikogenoze
2�1 2�3 2�3 2�4 2�5 2�5 2�6 2�6 2�13 2�15 2�22 2�23 2�25 2�25
Poglavlje 3. Proteini (autor: Zorana Jelić�lvanović)
Varenje i apsorpcija proteina Pregled metabolizma proteina Proteini*telesnih tečnosti Proteini plazme Proteini u urinu
3�1 3�4 3�6 3�6 3�6 3�6 3�16
Poglavlje 4. Lipidi (autor. Vesna Spasojević�Kalimanovska)
Normalni metabolizam lipida Varenje i apsorpcija lipida Trigliceridi Holesterol Metabolizam Metaboliz am lipida u jetri jetr i Metabolizam Metaboliz am lipida u adipoznom adipozn om tkivu
4�1 4�2 4�5 4�6 4�7 4�9
II Lipoproteini � struktura i metabolizam Struktura lipoproteinskih čestica Metabolizam lipoproteina Ateroskleroza i metabolizam lipoproteina Poremećaji u metabolizmu lipoproteina Hipehipoproteinemije Hipolipoproteinemije Stečene hiperlipoproteinemije Određivanje lipidnog statusa
4�11 4�11 4�14 4�22 4�26 4�26 4�33 4�35 4�38
Poglavlje 5. Voda (autor: Slavica Spasić)
Funkcija i metabolizam vode Funkcionalna raspodela vode Sastav vode u različitim telesnim prostorima Održavanje raspodele vode između telesnih prostora Osmolalnost telesnih tečnosti Regulacija vode Unošenje vode Apsorpcija vode u digestivnom traktu Izlučivanje vode Reapsorpcija vode pod uticajem antidiuretičnog hormona Akvaporini (vodeni kanali) Poremećaji u metabolizmu vode Dehidracija Hiperhidracija Poremećaji u osmolalnosti telesnih tečnosti
5�1 5�1 5�2 5�4 5�5 5�5 5�5 5�6 5�7 5�8 5�10 5�11 5�11 5�12 5�14
Poglavlje 6. Elektroliti (autor: Slavica Spasić)
Natrijum Unošenje i izlučivanje natrijuma Regulacija natrijuma Sistem renin�angiotenzin�aldosteron Natriuretični faktor Azot�monoksid Balans natrijuma kod povećanog unošenja Poremećaji u balansu natrijuma Nedostatak natrijuma u organizmu Višak natrijuma u organizmu Poremećaji u koncentraciji natrijuma u plazmi Kalijum Unošenje i izlučivanje kalijuma Izlučivanje kalijuma bubrezima Regulacija ekskrecije kalijuma Poremećaji balansa kalijuma
6�1 6�1 6�6 6�6 6�9 6�9 6�10 6�11 6�11 6�11 6�12 6�14 6�14 6�15 6�17 6�18
III Nedostatak kalijuma u organizmu Višak kalijuma u organizmu Poremećaji u koncentraciji kalijuma u plazmi Hloridi Poremećaji balansa hlorida
6�18 6�18 6�18 6�20 6�20
Poglavlje 7. Acido�bazna regulacija (autor: Slavica Spasić)
Poreklo kiselina u organizmu Održavanje konstantnog pH telesnih tečnosti Fiziološki puferi Regulacija acido�bazne ravnoteže respiratornim sistemom Renalna regulacija acido�bazne ravnoteže Poremećaji acido�bazne ravnoteže Poremećaji nastali zbog nedostatka baze 1. Metabolička acidoza (pnmarni nedostatak bikarbonata) 2. Respiratorna acidoza (relativni nedostatak baze) Poremećaji zbog viška baze 1. Metabolička alkaloza (primarni višak baze) 2. Respiratorna alkaloza (relativni višak bikarbonata)
7�1 7�2 7�2 7�4 7�6 7�10 7�10 7�10 7�14 7�15 7�15 7�15
Poglavlje 8. Enzimi (autor. Slavica Spasić)
Ulazak enzima u krv Eliminacija enzima iz krvi Specifičnost enzima za pojedine organe (enzimska slika organa) Aktivnosti enzima u bolestima različitih organa Aminotransferaze Alkalna fosfataza Kisela fosfataza Gama�glutamiltransferaza (GGT) Kreatin�kinaza Laktat�dehidrogenaza Alfa�amilaza
8�1 8�2 8�2 8�4 8�5 8�8 8�9 8�10 8�11 8�12 8�13
Poglavlje 9. Kalcijum, fosfat i magnezijum (autor: Aleksandra Topić)
Kalcijum
9�1
Metabolizam kalcijuma Apsorpcija kalcijuma u intestinumu Reapsorpcija i izlučivanje kalcijuma u bubrezima Regulacija metabolizma kalcijuma Paratiroidni hormon 1,25(OH) 2�holekalciferol[1,25(OH)2�vitamin D 3] Kalcitonin Poremećaji u koncentraciji kalcijuma u plazmi Hiperkalcemija
9�2 9�3 9�4 9�6 9�7 9�9 9�10 9�11 9�11
IV Hipokalcemija Neorganski fosfat Metabolizam fosfata Apsorpcija fosfata u intestinumu Reapsorpcija i izlučivanje fosfata bubrezima Regulacija fosfata Poremećaji u koncentraciji fosfata u plazmi Hiperfosfatemija Hipofosfatemija Magnezijum Metabolizam magnezijuma •�• Apsorpcija magnezijuma u crevima Renalno izlučivanje magnezijuma Regulacija magnezijuma Poremećaji koncentracije magnezijuma u plazmi Hipermagnezijemija Hipomagnezijemija
9�12 9�13 9�13 9�14 9�14 9�14 9�15 9�16 9�16 9�17 9�17 9�18 9�18 9�t9 9�19 9�19 9�20
Poglavlje 10. Gvožđe (autor: Vesna Spasojević�Kalimanovska) Metabolizam i regulacija gvožđa Poremećaji u metabolizmu gvožđa Deficijencija gvožđa Opterećenje gvožđem Parametri za ispitivanje statusa gvožđa
10�1 10�8 10�8 10�10 10�12
Poglavlje 11 . Hemoglobin (autor: Vesna Spasojević�Kalimanovska) Struktura i funkcija hemoproteina Struktura mioglobina Struktura hemoglobina Vezivanje kiseonika za mioglobin i hemoglobin Alosterni modulatori funkcije hemoglobina Mehanizmi održavanja eritrocita i zaštita hemoglobina Normalni humani hemoglobini Derivati hemoglobina Hemoglobinopatije Strukturne varijante hemoglobina Talasemije
11�2 11�3 11�4 11�8 11�9 11�14 11�15 11�19 11�21 11�21 11�27
Poglavlje 12. Bubre g i neprotei nska azotna jedinje nja (autor: Slavica Spasić) Eksk�etoma funkcija bubrega Regulatorna funkcija bubrega Reapsorpcija u tubulima Sekrecija u tubulima Testovi za ispitivanje funkcije proksimalnih i distalnih tubula
12�1 12�3 12�3 12�4 12�4
V Endokrina funkcija bubrega Pregled urina Analiza sedimenta urina Mokraćni kamenci Ureja Poremećaji u koncentraciji ureje Kreatin i kreatinin Poremećaji u koncentraciji kreatina i kreatinina Mokraćna kiselina Poremećaji u koncentraciji mokraćne kiseline
12�5 12�5 12�9 12�11 12�12 12�13 12�15 12�16 12�17 12�19
Poglavlje 13. Ispitivanje funkcije jet re (autor: Vesna Spasojević�Kalimanovska)
Ispitivanje ekskretorne funkcije jetre Bilirubin Žučne kiseline Ispitivanje sintetske funkcije jetre Ispitivanje metaboličke funkcije jetre Amonijak
13�3 13�3 13�11 13�17 13�20 13�21
Poglavlje 14. Ispitivanje funkcije gast rointes tinalno g trakta
(autor: Vesna Spasojević�Kalimanovska) Ispitivanje funkcije želuca Ispitivanje egzokrine funkcije pankreasa Ispitivanje funkcije digestije i apsorpcije
14�1 14�3 14�5
Poglavlje 15. Uticaj lekova na rezultate biohemijsk ih analiza
(autor: Zorana Jelić�lvanović) Analitički (in vitro) uticaji lekova Farmakološki (in vivo) efekti
15�1 15�3
Poglavlje 1. Uvod U biohemijskim laboratorijama zdravstvenih ustanova vrše se analize uzoraka biološkog materijala uzetog od pacijenata, u cilju procene stanja zdravlja pacijenata. Pod procenom stanja zdravlja, ovde se ne podrazumeva samo postavljanje dijagnoze ili isključivanje bolesti na koju je lekar posumnjao na osnovu karakterističnih simptoma. Biohemijska određivanja imaju značajno mesto i u procesu praćenja toka bolesti, prognoze bolesti, kao i praćenja efikasnosti primenjene terapije. Određena laboratorijska ispitivanja rade se i kod zdrave populacije. Jedan od primera za to bi bilo ispitivanje svakog zdravog novorođenčeta (screening) na određena nasledna oboljenja čije se posledice mogu u velikoj meri sprečiti ako se dijagnoza postavi već u prvim danima života (npr. fenilketonurija ili urođeni hipotiroidizam). Isto tako, značajno je da se kod zdravih osoba ispitaju faktori rizika za neka česta oboljenja, koja se mogu sprečiti ili odložiti određenim merama prevencije (npr. lipidni status kao važan faktor rizika od ateroskleroze). U okviru medicinske biohemije izučava se povezanost oboljenja sa karakterističnim promenama metabolizma. Metaboličke promene mogu da budu uzrok bolesti (npr. anemija srpastih ćelija, koja je posledica kvalitativne promene u sintezi globinskog lanca), posledica bolesti (npr.poremećaj metabolizma kalcijuma u hroničnoj bubrežnoj insuficijenciji), kao i osnov za razvoj akutnih i hroničnih komplikacija bolesti (npr. diabetes mellitus). Medicinska biohemija takođe izučava kvalitativne i kvantitativne promene u sastavu telesnih tečnosti do kojih dolazi u raznim bolestima (biohemijski markeri), analitičke metode koje se primenjuju za ta ispitivanja, kao i biološki materijal koji se analizira (izborom i način obrade biološkog materijala).
VRSTE BIOLOŠKOG MATERIJALA U biohemijskim laboratorijama najčešće se vrši analiza krvi (uključujući serum i plazmu koji se iz nje dobijaju) i urina. Međutim, za dijagnozu i praćenje velikog broja bolesti neophodne su i analize drugih vrsta biološkog materijala, pa se u laboratorijama ustanova u kojima se lece takve bolesti vrše odgovarajuća ispitivanja uzoraka znatno većeg broja različitih vrsta biološkog materijala (Tabela 1�1). Uzorci venska i kapilarne krvi obično se uzimaju u laboratoriji, dok vađenje arterijske krvi (koja se koristi mnogo rede i to samo za određene vrste analiza) može da izvodi jedino lekar. Serum je bistra, žućkasta tečnost, koja se dobija centrifugiranjem krvi posle završene koagulacije. Plazma je krv bez krvnih ćelija, a dobija se centrifugiranjem pune krvi koje se može izvršiti neposredno posle vađenja krvi. Osnovna razlika u sastavu seruma i plazme je da plazma sadrži fibrinogen, dok se pri dobijanju seruma, fibrinogen konvertuje u fibrin i na taj način uklanja iz uzorka. Ako je potrebno da se iz krvi izdvoji plazma, ili ako se za analizu kao uzorak koristi puna krv, neophodno je da se spontani proces koagulacije krvi spreči dodatkom nekog antikoagulansa. Ova sredstva se dodaju u epruvete u kojima se sakuplja krv, a kao antikoagulansi se mogu koristiti: heparin, EDTA, citrat oksalat itd., zavisno od vrste
Medicinska biohemija
1�2
Tabela 1�1. Vrste biološkog materijala.
Krv venska krv kapilarna krv arterijska krv Serum, plazma Urin prvi jutarnji urin 24�časovni urin Mokraćni kamen Feces Cerebrospinalna tečnost Amnionska tečnost Sinovijalna tečnost Serozne tečnost pleuralna tečnost peritonealna tečnost perikardijalna tečnost Želudačni sok Duodenalni sok
analize koja se izvodi u uzorku. Kvalitativni pregled urina i sedimenta najčešće se izvodi u prvom jutarnjem uzorku, koji je najkoncentrovaniji. Za kvantitativna određivanja koristi se 24�časovni urin ili urin skupljen u kraćem, ali tačno definisanom vremenskom periodu (npr. 12�časovni urin).
UTICAJ FIZIOLOŠKIH FAKTORA Različite bolesti dovode do karakterističnih promena koncentracija pojedinih sastojaka biološkog materijala. Međutim, na sastav telesnih tečnosti mogu da utiču i određeni fiziološki faktori. Fiziološki faktori koji utiču na sastav telesnih tečnosti mogu se podeliti u dve grupe: 1. Faktori koji ispoljavaju dugoročne efekte (ovi efekti se najčešće ne mogu kontrolisati) 2. Faktore koji ispoljavaju kratkoročne efekte (efekti koji se mogu kontrolisati).
Dugoročni efekti
Saliva
U grupu faktora koji ispoljavaju dugoročne efekte spadaju: starost, genetski faktori (pol, rasa itd.), faktori sredine (npr. klimatski uticaji), dugoročne ciklične promene (npr. uticaj godišnjih doba), telesna masa, način ishrane i fizička aktivnost. U većini slučajeva, uticaj ovih faktora nije moguće eliminisati, već se njihov efekat uzima u obzir prilikom interpretacije rezultata.
Znoj Sperma Čvrsta tkiva
Kratkoročni efekti Među faktore koji izazivaju kratkoročne promene u sastavu telesnih tečnosti spadaju: položaj tela pri uzimanju krvi, vreme proteklo od poslednjeg obroka, cirkadijalni ritam, kao i fizička aktivnost, pušenje, unošenje alkohola ili lekova kraće vreme pre uzimanja uzorka. Po pravilu, dejstvo ovih faktora moguće je eliminisati odgovarajućom pripremom pacijenta pre i u toku uzimanja biološkog materijala.
Poglavlje 2. Ugljeni hidrati Ugljeni hidrati su glavni izvor energije u organizmu, koja se oslobađa oksidacijom ovih jedinjenja do ugljen�dioksida i vode. Oni se takođe koriste kao polazni materijal za sintezu drugih biomolekula, kao što su masne kiseline i sastavni su deo molekula nekih biološki značajnih jedinjenja, kao npr. glikoproteina, heparina, nukleinskih kiselina i dr.
VARENJE I APSORPCIJA Polisaharidi (škrob i glikogen) i disaharidi (uglavnom saharoza i laktoza), uneseni hranom, hidrolizuju se u procesu varenja do monosaharida, pod dejstvom enzima pljuvačke (amilaza), pank� reasnog soka (amilaza) i sluzokože tankog creva (disaharidaze). Salivama i pankreasna amilaza hidrolizuju a(1�>4) glukozidne veze škroba i glikogena, pri čemu nastaju glukoza, maltoza i izomaltoza (Slika 2�1). Dejstvom salivarne amilaze, hidrolizuje se manji deo a(1�>4) glukozidnih veza, zbog ograničenog vremena zadržavanja hrane u usnoj šupljini. Kada hrana dospe u želudac, salivarna amilaza se inaktivira u kiseloj sredini, a hidroliza se nastavlja pod dejstvom pankreasnog enzima. Smesa glukoze, maltoze i izomaltoze je konačni proizvod hidroli� tičkog dejstva amilaza. Oslobođena glukoza se apsorbuje, dok se disaharidi nastali hidrolizom poli� saharida (maltoza i izomaltoza), kao i oni uneseni hranom (saharoza, laktoza) najpre hidrolizuju do monosaharida pod dejstvom disaharidaza (glikozidaza). Ovi enzimi su lokalizovani u plazma membranama mikrovila četkastog pokrova ćelija sluzokože creva. Kod čoveka postoji najmanje sedam disaharidaza, od kojih su pet glukozidaze, a dve galaktozidaze. Glukozidaze hidrolizuju maltozu, sa� harozu, izomaltozu i trehalozu, a galaktozidaze laktozu. Pod dejstvom ovih enzima, disaharidi se u plazma membrani hidrolizuju do monosaharida: glukoze, fruktoze i galaktoze. Pored ovih, u crevnom sadržaju se nalaze i drugi monosaharidi, kao npr. manoza (nastala razlaganjem glikoproteina) i pentoze (oslobođene varenjem nukleinskih kiselina). Brzine apsorpcije pojedinih monosaharida u sluzokoži creva, znatno se međusobno razlikuju, a opadaju sle'dećim redosledom: galaktoza > glukoza > fruktoza > manoza > pentoze. Ove razlike se objašnjavaju činjenicom da se monosaharidi apsorbuju različitim mehanizmima: aktivnim transportom (galaktoza i glukoza), olakšanom difuzijom (fruktoza) ili prostom difuzijom (manoza, pentoze). Isto tako, na brzinu apsorpcije nekih monosaharida utiče istovremeno davanje drugih šećera. Tako se npr. galaktoza sporije apsorbuje, ako se unese zajedno sa glukozom, zbog toga što se ovi monosaharidi transportuju pomoću zajedničkog sistema aktivnog transporta.
Medicinska biohemija
2�2
Maltotrioza
a�Granični dekstrin
Maltoza
Glukoza
Slika 2�1. Varenje amilopektina pod dejstvom salivarne i pankreasne a�amilaze
Na apsorpciju glukoze u crevu utiče opšte stanje organizma (infekcije, intoksikacije, neishran jenost i nedostatak vitamina, naročito tiamina, pantotenske kiseline i piridoksina). Apsorpcija je smanjena i kod stanja praćenih povećanim motilitetom creva (dijareja i dr.), usled skraćenja perioda kontakta šećera sa apsorptivnom površinom. Strukturni ili funkcionalni poremećaji sluzokože tankog creva takođe otežavaju apsorpciju, kao npr. kod zapaljenja (enteritisa), edema (kongestivna bolest srca), ili celijakije. Kako tiroksin ubrzava apsorpciju heksoza, ona je povećana u hipertiroidizmu, a smanjena u hipotiroidizmu. U insuficijenciji kore nadbubrežne žlezde (Addison�ova bolest), apsorpcija je usporena usled sniženja koncentracije natrijuma, od kojeg zavisi funkcija mehanizma aktivnog transporta glukoze. Nedostatak disaharidaza Kod osoba sa urođenim nedostatkom aktivnosti laktaze, posle uzimanja mleka javljaju se simptomi kao što su bolovi i naduvenost abdomena ili dijareja, a kod nekih osoba javlja se jaka dijareja i malnutricija već prvih dana posle rođenja. Takođe, postoji težak oblik nedostatka disaharidaze, kod kojeg se laktoza izlučuje putem urina, a dolazi i do oštećenja jetre i bubrega, sa povećanom ekskre� cijom aminokiselina. Kod drugih osoba, simptomi nepodnošenja laktoze javljaju se tek u pubertetu ili nešto kasnije. Kod mnogih sisara, aktivnost intestinalne laktaze se normalno gubi rano u toku života. Međutim, kod čoveka se u većini populacija to ne dešava, sem kod američkih crnaca, Bantu i orijentalnih naroda, kod kojih su simptomi nedostatka laktaze uobičajena pojava. Sem urođenog, nedostatak laktaze može da bude i stečeni poremećaj koji se javlja kao posle� dica nekih oboljenja gastrointestinalnog trakta (zapaljenja, infekcije). Simptomi nedostatka laktaze su delom posledica osmotskog efekta nehidrolizovane laktoze, a delom fermentacije pod dejstvom crevnih bakterija, pri čemu se stvara mlečna kiselina i masne kiseline kratkog lanca, koje iritiraju crevo. Drugi poremećaj sa nedostatkom disaharidaza je urođeni kombinovani deficit saharaze i izomal� taze. Simptomi ovog poremećaja (dijareja) javljaju se posle unošenja saharoze i škroba.
Sudbina apsorbovanih ugljenih hidrata Pre nego što dospeju u sistemsku cirkulaciju, apsorbovani monosaharidi putem portalnog krvotoka prolaze kroz jetru. Nekim svojim metaboličkim aktivnostima, jetra moža da smanji koncentraciju ugljenih hidrata u krvi, dok drugi, suprotni mehanizmi dovode do oslobađanja glukoze, zavisno od potreba organizma (v. okvir). Posle prolaska kroz jetru, ugljeni hidrati ulaze u sistemsku cirkulaciju, kojom dospevaju do ek� strahepatičnih tkiva, gde se koriste. Kako jetra utiče na koncentraciju i sastav ugljenih hidrata u sis�
Z. Jelić �Ivanović: Metabolizam u gljenih hidrata
2�3
temskoj cirkulaciji, metabolizam ugljenih hidrata u ćelom organizmu zavisi od funkcionalnog stanja ovog organa. Mehanizmi hepatocita koji smanjujuju nivo ugljenih hidrata u krvi:
a) b) c) d)
prevođenje fruktoze i galaktoze u glukozu ugrađivanje glukoze u glikogen (glikogeneza) oksidacija glukoze uz oslobađanje energije korišćenje glukoze za sintezu masnih kiselina i nekih aminokiselina
Mehanizmi koji dovode do oslobađanja glukoze iz jetre u krv:
a) stvaranje glukoze iz drugih heksoza b) oslobađanje glukoze iz glikogena u jetri (glikogenoliza) c) sinteza glukoze iz drugih jedinjenja (glukoneogeneza)
Endogeni izvori glukoze Glavni izvor endogenih ugljenih hidrata je glikogen jetre. Glikogen mišića ne može da se hidroli� zuje do slobodne glukoze koja bi mogla da dospe u krv, ali mlečna kiselina, koja nastaje kao proiz vod glikolize mišićnog glikogena, može da se transportuje putem krvi u jetru, gde se po potrebi prevodi u glukozu i glikogen. Isto tako, male količine glukoze mogu da nastanu u organizmu i iz endogene galaktoze, manoze ili pentoza. Sem iz ugljenih hidrata, glukoza pod određenim uslovima može da se sintetiše i iz drugih, neugljenohidratnih jedinjenja (glukoneogeneza), i to najvećim delom iz glukogenih aminokiselina. Smatra se da oko polovina ukupne količine proteina u organizmu može potencijalno da se transfor� miše u glukozu. Masne kiseline ne mogu da se prevedu u glukozu, ali one svojom oksidacijom obez� beđuju energiju potrebnu za odvijanje glukoneogeneze. Za razliku od masnih kiselina, glicerol koji se oslobodi hidrolizom masti može da posluži kao supstrat za sintezu glukoze. Proces glukoneogeneze je najvećim delom lokalizovan u jetri.
KORIŠĆENJE GLUKOZE Glukoza koja se unese putem hrane, ili se sintetiše u samom organizmu, može da se uključi u nekoliko metaboličkih puteva, zavisno od trenutnih potreba organizma. Skladištenje Ukoliko ne postoji potreba za oslobađanjem energije ili konverzijom u druga jedinjenja, višak glukoze se skladišti u formi glikogena u jetri, mišićima i drugim tkivima (glikogeneza). Međutim, kako je količina glikogena koja može da se formira u tkivima ograničena, dalje količine glukoze se pretvaraju u masne kiseline i skladište se u masnom tkivu u obliku triglicerida. Oksidacija Kada postoji potreba organizma za energijom, glukoza se oksiduje do ugljen�dioksida i vode u procesima glikolize i ciklusa limunske kiseline. Pod izvesnim okolnostima, oksidacija glukoze u mišićima može da bude samo delimična (glikoliza). Mlečna kiselina, koja nastaje kao proizvod glikolize, dalje se metabolizuje u drugim tkivima, pre svega u jetri, lako je proces glikolize i ciklus limunske kiseline glavni put katabolizma ugljenih hidrata, u organizmu postoje i alternativni putevi aerobne oksidacije, od kojih je najznačajniji heksoza monofosfatni odvojak (fosfoglukonatni put). U enzimskim reakcijama koje su sastavni deo ovog metaboličkog puta, stvara se NADPH, neophodan za neke
Medicinska biohemija
2�4
važne procese (npr. za biosintezu masnih kiselina), kao i pentoze (za biosintezu nukleinskih kiselina). Prevođenje u masti Kada se kapacitet skladištenja glikogena u tkivima prevaziđe, višak glukoze se transformiše u masne kiseline. Proizvod katabolizma glukoze, acetil koenzim A, ujedno je i supstrat za biosintezu masnih kiselina, kao i proizvod njihove oksidacije. Preko ovog jedinjenja, zajedničkog za metabolizam ugljenih hidrata i masnih kiselina, odvija se neprestana i brza interkonverzija: ispitivanja sa radioaktivnim izotopima su pokazala da se veliki deo glukoze koja će se oksidovati, najpre prevodi u masne kiseline, a zatim oksiduje do ugljen dioksida i vode. Međutim, pretvaranje glukoze u masne kiseline je ireverzibilno zbog toga što je kod čoveka reakcija stvaranja acetil koenzima A iz piruvata ireverzibilna. Zbog toga, količina ugljenih hidrata u organizmu ne može da se povećava na račun masnih kiselina. Suprotno tome, prevođenje glukoze u glicerol koji takođe ulazi u sastav lipida, potpuno je reverzibilno. Prevođenje u druge ugljene hidrate Male količine glukoze se prevode u druge ugljene hidrate, kao što su: riboza i dezoksiriboza (potrebne za sintezu nukleinskih kiselina); manoza, glukozamin i galaktozamin (sastavni deo molekula mukopolisaharida i glikoproteina); glukuronska kiselina (potrebna za konjugaciju lekova i nekih toksičnih jedinjenja u jetri, takođe je komponenta mukopolisaharida); galaktoza (sastavni deo molekula glikolipida); laktoza (sintetiše ze u mlečnim žlezdama u periodu laktacije iz glukoze i galaktoze koja takođe nastaje iz glukoze). Prevođenje u aminokiseline Neke od aminokiselina koje su sastavni deo proteina u organizmu, ne moraju da se unose putem hrane, već mogu da se sintetišu u organizmu iz glukoze, odnosno metabolita glukoze (neesancijelne aminokiseline). Sve aminokiseline koje nastaju iz glukoze su ujedno i glukogene (iz njih može da se sintetiše glukoza u procesu glukoneogeneze). Međutim, sve glukogene aminokiseline nisu obavezno neesencijelne, pošto i neke od esencijelnih aminokiselina mogu putem glukoneogeneze da se prevedu u glukozu.
ULOGA JETRE U METABOLIZMU UGLJENIH HIDRATA Glikogeneza i glikogenoliza Pored opštih puteva metabolizma ugljenih hidrata, koji se u jetri odvijaju kao i u drugim tkivima, neke fiziološki veoma značajne reakcije mogu da se odigravaju samo u jetri, zahvaljujući prisustvu određenih enzima u hepatocitima. Jedan od njih je glukoza�6�fosfataza, koja katalizuje hidrolizu glu� koza�6�fosfata do glukoze i neorganskog fosfata. Prisustvo glukoza�6�fosfataze u hepatocitima omogućuje da se, po potrebi, iz glikogena jetre dobije slobodna glukoza koja prelazi u krv. Isto tako, slobodna glukoza može da se dobije direktno iz raznih izvora glukogenog materijala, bez prethodnog ugrađivanja u glikogen. Treba napomenuti da, u nekim tkivima, glukoza�6�fosfat može da se hidroli� zuje pod dejstvom nespecifičnih fosfataza, ali je taj izvor glukoze od manjeg značaja za održavanje normalne koncentracije glukoze u krvi. Polazne supstance za sintezu glikogena u jetri su: glukoza (iz krvi), ili bilo koje jedinjenje od ko jeg može da nastane piruvat, kao što su: glicerol, laktat dospeo u krv iz mišića ili glukogene aminokiseline. Sadržaj glikogena u jetri u svakom trenutku je rezultat odnosa između brzine glikogenolize i glikt^eneze. Unošenje ugljenih hidrata sa hranom je najvažniji faktor koji određuje brzinu gliko� geneze, a odnos brzine glikogenolize i glikogeneze najvećim delom zavisi od koncentracije glukoze u krvi. Prosečan sadržaj glikogena u jetri je 5 do 6%. Posle uzimanja hrane, količina glikogena se
Z. Jelić �Ivanović: Metabolizam ugljenih hidrata
2�5
povećava (i do 10%), dok se prilikom gladovanja glikogen troši, pa se rezerve u jetri smanjuju (i od 1%). Glukoneogeneza Glavno mesto sinteze glukoze iz neugljenohidratnih jedinjenja (glukoneogeneza) je jetra. Kvantitativno najvažniji supstrat glukoneogeneze su glukogene aminokiseline: pirogrožđana kiselina, koja je proizvod njihovog katabolizma, prevodi se u glukozu, odnosno glikogen. Već je pomenuta mogućnost sinteze glukoze iz glicerola, ali je ovaj supstrat od mnogo manjeg značaja. Proces glukoneogeneze se ubrzava u svim stanjima praćenim nedostatkom ugljenih hidrata, a hormoni kore nadbubrežne žlezde su značajan faktor u regulaciji glukoneogeneze iz aminokiselina. Asimilacija ugljen�dioksida Ugljen�dioksid nije samo krajnji produkt bioloških oksidacija, već je i značajan učesnik u nekim anaboličkim reakcijama. Asimilacija ugljen�dioksida je najvećim delom lokalizovana u jetri. Jedna od najznačajnijih reakcija ovog tipa je prevođenje piruvata u oksalacetat, pod dejstvom mitohondrijalnog enzima, piruvat�karboksilaze. Dokle god ima dovoljno piruvata, ova reakcija omogućava stvaranje oksalacetata, koji ima veoma važnu katalitičku ulogu u zajedničkom putu katabolizma, ciklusu limun� ske kiseline. Kako je piruvat intermedijerni proizvod metabolizma ugljenih hidrata, njegova količina je pod normalnim uslovima uvek dovoljna za nesmetano odvijanje ciklusa limunske kiseline.
ULOGA MIŠIĆA U METABOLIZMU UGLJENIH HIDRATA Glikogeneza
Sinteza mišićnog glikogena se odvija pomoću istih reakcija kao i u jetri, ali je glavni izvor polaznog materijala za sintezu samo glukoza iz krvi, a ne i glukoneogeneza. Međutim, kako u mišićima nema enzima glukoza�6�fosfataze, a ni nespecifičnih fosfataza, mišićni glikogen ne može direktno da doprinosi održavanju koncentracije glukoze u krvi. Sadržaj glikogena u mišićima zavisi od unosa ugl jenih hidrata sa hranom, ali ne varira toliko kao u jetri: sadržaj mišićnog glikogena kod čoveka se obično kreće oko 1% (od 0,8 do 3,9%). Svi hormoni, sem glukagona utiču na metabolizam glikogena u mišićima na isti način kao i na onaj u jetri (vidi: Uticaj hormona na metabolizam ugljenih hidrata). Glikoliza Proces glikolize u mišićima je ireverzibilan: izotopska ispitivanja su pokazala da se mlečna kiselina u mišićima ne prevodi u glikogen, već se lako oksiduje do ugljen�dioksida i vode. Ova pojava se objašnjava činjenicom da se neki glikolitički enzimi javljaju u dva oblika: mišićni, koji favorizuju oksidaciju glukoze i jetreni, koji usmeravaju metabolizam u pravcu glukoneogeneze. Isto tako, membrane mišićnih ćelija su veoma lako propustljive za mlečnu kiselinu, koja nastaje kao krajnji proizvod glikolize u uslovima relativnog nedostatka kiseonika. Praktično sva količina stvorene mlečne kiseline brzo se eliminiše iz mišića u cirkulaciju, odakle je preuzima jetra i prevodi u glikogen, ili glukozu koja zatim odlazi u krv. Ovaj metabolički put je poznat pod nazivom Cori�jev ciklus: glukoza u krvi � mišićni glikogen � laktat � glukoza�6�fosfat u jetri � glukoza u krvi. Mišićna kontrakcija U kontrakciji mišića, mišićni protein miozin reaguje sa adenozin trifosfatom (ATP), pri čemu se ATP hidrolizuje, a energija koja se pri tom oslobađa omogućava skraćenje miofibrila, odnosno kontrakciju. Za vreme rada mišića, količina raspoloživog kiseonika nije dovoljna za potpunu oksidaci] glukoze, pa katabolizam glukoze teče putem glikolize do laktata, koji odlazi u krv. Količina AT nastaje u procesu glikolize nije dovoljna da obezbedi energiju za rad mišića. Zbog toga se za kontrakcije koristi energija uskladištena u vidu fosfokreatina, koji reaguje sa ADP, pri čemu se dodatna količina ATP i kreatin. Za vreme mirovanja, u mišićima se stvara višak ATP, najvećim
2�6
Medicinska biohemija
kompletnom oksidacijom ugljenih hidrata, ali i oksidacijom masnih kiselina i ketonskih tela. Višak ATP reaguje sa kreatinom, pri čemu se regeneriše fosfokreatin potreban za buduće kontrakcije.
POVEZANOST METABOLIZMA UGLJENIH HIDRATA SA METABOLIZMOM LIPIDA I PROTEINA Metabolizam ugljenih hidrata je povezan sa metabolizmom proteina i lipida preko više zajedničkih metabolita. Najvažniji među njima je acetil�koenzim A, koji nastaje kao intermedijerni proizvod katabolizma ugljenih hidrata, lipida i proteina (vidi okvir), i polazna je supstanca ciklusa limunske kiseline, zajedničkog puta aerobnog katabolizma kojim se ugljeni hidrati, proteini i lipidi oksiduju do ugljen dioksida i vode. c
� � �
Izvori acetil�koenzima A: oksidativna dekarboksilacija piruvata (koji nastaje iz ugljenih hidrata i glukogenih aminokiselina) oksidacija masnih kiselina katabolizam ketogenih aminokiselina
Sem toga, glukogene aminokiseline mogu, direktnim ili indirektnim putem da se prevedu u druge metabolite ugljenih hidrata. Kako su u jetri glavni putevi metabolizma ugljenih hidrata reverzibilni, od ovih aminokiselina može da se sintetiše glukoza, odnosno glikogen. Obrnuto, od ugljenih hidrata mogu da se sintetišu neesencijelne aminokiseline (aminacijom odgovarajuće a�keto kiseline, npr. piruvat � alanin, oksalacetat � asparaginska kiselina, a�ketoglutarat � glutaminska kiselina) i trigliceridi (iz masnih kiselina nastalih iz acetil�koenzima A i glicerola, nastalog takođe iz ugljenih hidrata). U jetri, acetil�koenzim A može da se uključi u neki od više raspoloživih metaboličkih puteva:
� � � �
Putevi metabolizma acetil�koenzima A: kondenzacija sa oksalacetatom, pri čemu nastaje citrat i oksidacija do ugljen dioksida i vode u ciklusu limunske kiseline sinteza masnih kiselina sinteza holesterola sinteza ketonskih tela (ketogeneza) u jetri i bubrezima
UTICAJ HORMONA NA METABOLIZAM UGLJENIH HIDRATA Regulacija metabolizma ugljenih hidrata, a time i održavanje stalne koncentracije glukoze postiže se koordiniranim dejstvom nekoliko hormona: insulin, s jedne strane, snižava koncentraciju glukoze, a nekoliko hormona antagonista insulina (glukagon, kortizol, adrenalin i hormon rasta), povećavaju nivo glukoze u krvi.
Insulin Struktura, sinteza i sekrecija. Insulin se sintetiše u p�ćelijama Langerhans�ovih ostrvaca endokrinog pankreasa, u obliku prekurzora velike molekulske mase, pre�proinsulina (M=11500). Otkidanjem peptida sastavljenog od 24 ostatka aminokisleina sa N�terminalnog kraja, pre�proinsulin se prevodi u proinsulin (M=9000), koji pokazuje svega oko 5% insulinske aktivnosti. Molekul proinsulina se sastoji od� A i B lanaca insulina, međusobno povezanih sa dva disulfidna mosta, kao i preko C� peptida ("connecting peptide", M=3000), koji povezuje N�terminalni deo A lanca sa C terminusom B
Z. Jelić �Ivanović: Metabolizam ugljenih hidrata
2�7
lanca insulina. Otkidanjem C�peptida nastaje molekul slobodnog insulina (M=6000), u kojem su dva polipeptidna lanca međusobno povezana jedino disulfidnim mostovima. Ceo proces se odvija u ćeli jama pankreasa: pre�proinsulin se sintetiše u Goldžijevom kompleksu, gde se "pakuje" u sekretorne granule. Unutar granula, pre�proinsulin se otkidanjem odgovarajućih peptida najpre prevodi u proin� sulin, a zatim u insulin. Pod dejstvom faktora koji stimulišu sekreciju insulina (nervni, hormonski faktori ili unošenje hrane), na plazma membrani p�čelija dolazi do otpuštanja sadržaja sekretornih granula u cirkulaciju, pri čemu u krv dospeva podjednaka količina insulina i C�peptida, a samo vrlo mala količina proinsulina. Uticaj insulina na metabolizam. Najvažniji efekti insulina na metabolizam ugljenih hidrata, proteina i lipida (vidi okvir), svode se na stimulaciju korišćenja glukoze svim raspoloživim putevima (oksidacija, glikogeneza, lipogeneza), kao i stimulaciju sinteze proteina. Najvažnija'dejstva insulina: 1. Olakšan transport glukoze kroz ćelijsku membranu jetra: aktivacija glukokinaze mišići: povećanje propustljivosti membrane mozak: nema uticaja 2. Ubrzana glikogeneza aktivacija glikogen�sintaze inhibicija glikogen�fosforilaze 3. Stimulacija katabolizma glukoze aktivacija fosfofruktokinaze 4. Inhibicija glukoneogeneze inhibicija enzima glukoneogeneze inhibicija katabolizma proteina (smanjena raspoloživost supstrata za glukoneogenezu) 5. Stimulacija skladištenja triglicerida u masnom tkivu povećana sinteza masnih kiselina i triglicerida (indirektno) inhibicija hormon�senzitivne lipaze masnog tkiva 6. Inhibicija ketogeneze 7. Stimulacija sinteze proteina olakšan ulazak aminokiselina u ćelije ubrzana translacija inhibicija katabolizma proteina Neka dejstva insulina pokazuju određene specifičnosti zavisno od vrste tkiva na koje ovaj hormon deluje. Glukoza slobodno difunduje u ćelije jetre i bez prisustva insulina, ali insulin aktivacijom glukokinaze ubrzava fosforilaciju glukoze, što dovodi do zadržavanja glukoze u ćelijama i omogućava dalju difuziju jnolekula glukoze iz krvi u hepatocite. U ćelijama skeletnih mišića, ovaj mehanizam uticaja insulina na transport glukoze u ćeliju je od mnogo manjeg značaja, a efekat insulina se ostvaruje direktnim dejstvom na propustljivost membrane: bez prisustva insulina, mišićne ćelije su nepropust� Ijive za glukozu, sem kod teškog mišićnog rada, dok se u prisustvu insulina glukoza transportuje kroz membranu u smeru koncentracionog gradijenta. Insulin pospešuje transport glukoze u ćelije srčanog mišića i masnog tkiva na sličan način kao što utiče na ćelije skeletnih mišića, a nema uticaja na moždane ćelije koje su propustljive za glukozu i bez posredovanja ovog hormona. Razlike u dejstvu insulina na ulazak glukoze u ćelije različitih tkiva, posledica su prisustva različitih tipova transportnih sistema koji postoje u njihovim membranama. Transport glukoze M ćelije vrši se procesom olakšane difuzije, posredstvom proteina transportera glukoze. Do sada je dokazano postojanje pet različitih vrsta transportera glukoze, GLUT1�GLUT5 (Tabela 2�1). Ovi transportni sis�
Medicinska biohemija
2�8
temi omogućuju ulazak glukoze iz intersticijalnog prostora u ćelije (glukoza dospeva u intersticijalni prostor prostom difuzijom iz krvi). Tabela 2 � 1 . Karakteristike različitih tipova transportera glukoze.
Tip
Tkiva
Kinetika
Tip transporta
GLUT1
Većina ćelija: eritrociti placenta, debelo crevo, bubrezi
Niska Km (1�2 mmol/L)
Olakšana difuzija
GLUT2
Jetra, tanko crevo, bubrezi, p�ćelije pankreasa
Visoka K m (>10 mmol/L), visoka Vmax)
Olakšana difuzija, dvosmema
GLUT3
Većina ćelija, mozak, placenta, bubrezi
Niska Km (1�2 mmol/L),
Olakšana difuzija
GLUT4
GLUT5
niska Vmax (6�7 mmol/L)
Skeletni mišići, adipociti, srce
Km 2�10 mmol/L
Olakšana difuzija Insulin�zavisan
Crevo, bubrežni tubuli
Transportuje glukozu nasuprot gradijentu koncentracije
Aktivni transport, kotransport Na + � glukoza
GLUT4
Egzocitoza
Endocitoza
Membranozna
vezikula
«,si6S>,r*&s
Plazma membrana
>'
Slika 2�2. Translokacija transportera GLUT4 na plazma�membranu pod dejstvom insulina
Z. Jelić �Ivanović. Metabolizam ugljenih hidrata
2�9
Ćelije raznih tkiva imaju u svojim membranama smese transportera glukoze, čiji sastav određuje karakteristično ponašanje tih ćelija u odnosu na ulazak glukoze iz ekstracelularnog prostora u ćeliju. Transportni sistemi GLUT1 i GLUT3 se stalno nalaze na površini ćelije. Naprotiv, GLUT4 se nalazi u unutrašnjosti ćelije, a tek pod dejstvom insulina se pomera na plazma membranu (Slika 2�2). Eritrociti su insulin�nezavisne ćelije, jer imaju samo GLUT1. Centralni nervni sistem je relativno zaštićen od neuroglikopenije niskom Km vrednošću svog GLUT3 transportera (niska K m vrednost znači veliki afinitet za glukozu i omogućuje efikasan transport i u uslovima niske koncentracije glukoze). Mnoge ćelije imaju u svojim membranama različite transportere u različitim odnosima, koje se mogu menjati u zavisnosti od uslova: na primer, za vreme gladovanja u membranama ćelija jetre nalazi se povećan broj GLUT1 i GLUT3. Ulazak glukoze posredstvom GLUT1�GLUT4 transportnih sistema vrši se mehanizmom olakšane difuzije niz koncentracioni gradijent. Aktivnost ćelijskih enzima koji fosforilišu glukozu do glukoza�6� fosfata (heksokinaza, glukokinaza), obezbeđuje nisku koncentraciju slobodne glukoze u intracelular� nom prostoru i dalji ulazak glukoze u ćeliju. Samo neka tkiva, kao što su enterociti i ćelije bubrežnih tubula, imaju GLUT5 transportni sistem, koji im omogućuje da vrše aktivan transport glukoze nasuprot koncentracionom gradijentu. Takav transport se vrši zamenom glukoze koja ulazi u ćeliju za na� trijumove jone koji izlaze. Kao izvor energije koristi se gradijent Na + koji je prethodno stvoren dejstvom K+/Na + ATP�aze (Slika 2�3). In te st in al ni lum en
•*�
Simport Na + i glukoze (aktivan)
�• Kapilari
Uniport glukoze (pasivan)
Glukoza
Ćelija četkaste prevlake
(Na + ~K+)�ATP�aza
Slika 2�3. Transcelularni transport glukoze u enterocitima. Ulazak glukoze iz lumena creva odvija se pomoću sistema aktivnog transporta, dok je izlazak posredovan transportnim sistemom Dejstvo insulina. Insulin povećava sadržaj glikogena u jetri na taj način što inhibira fosforilazu (enzim gjjkogenolize), a povećava aktivnost glikogen�sintaze (enzim glikogeneze). U mišićima, njegovo dejstvo se ispoljava na sličan način: ako se glukoza koja uđe u ćelije ne potroši za energetske potrebe rada mišića, ona se skladišti u obliku glikogena, ali u manjim količinama nego u jetri. Povećavajući aktivnost fosfofruktokinaze u ćelijama mišića i drugih perifernih tkiva, insulin ubrzava glikolizu. Na taj način favorizuje se iskorišćavanje glukoze kao izvora energije, što smanjuje potrebu za katabolizmom masti. Insulin takođe inhibira glukoneogenezu, uglavnom na taj način što smanjuje količinu i akti jetrenih enzima koji su sastavni deo ovog metaboličkog puta. Pored toga, usled smanjen
2�10
Medicinska biohemija
puštanja aminokiselina iz ekstrahepatičnih tkiva, smanjuje se i količina prekurzora glukoneogeneze u jetri, što takođe doprinosi usporavanju ovog procesa. Uticaj insulina na metabolizam lipida je sporiji i manje izražen u poređenju sa efektom ovog hormona na metabolizam ugljenih hidrata. Međutim, dugoročno, ovaj uticaj je fiziološki vrlo značajan, što najbolje dokazuju teški poremećaji metabolizma lipida koji se javljaju u dijabetesu. Insulin stimuliše sintezu masnih kiselina i skladištenje triglicerida u masnom tkivu i to svoje dejstvo ostvaruje putem nekoliko mehanizama. Pre svega, favorizujući korišćenje glukoze kao izvora energije u tkivima, on smanjuje potrebu za oksidacijom lipida i na taj način ih štedi. Već je pomenuto da insulin povećava ulazak glukoze u hepatocite. Kada se zasiti kapacitet skladištenja glikogena u jetri, dalja glikogeneza se inhibira, a višak glukoze je raspoloživ za sintezu masnih kiselina. Pored toga, kako se katabolizuje velika količina glukoze, u ciklusu limunske kiseline nastaje višak citrata i izocitrata koji aktiviraju acetil�koenzim A karboksilazu, enzim koji katalizuje prvu reakciju u sintezi masnih kiselina. Masne kiseline se zatim transportuju iz jetre do masnog tkiva. Insulin stimuliše sintezu masnih kiselina i u samim adipocitima, što je kvantitativno od manjeg značaja obzirom na to da u masno tkivo čoveka dospe svega jedna desetina od one količine glukoze, koja uđe u ćelije jetre. Značajnija posledica olakšanog ulaska glukoze u masno tkivo je ta da iz nje nastaje i a�glicerofosfat koji je, pored masnih kiselina, neophodan za sintezu triglicerida (u adipocitima nema enzima koji je potreban da se glicerol prevede u a�glicerofosfat). Insulin takođe inhibira aktivnost hormon�senzitivne lipaze, enzima koji dovodi do hidrolize triglicerida u masnom tkivu, što sprečava otpuštanje masnih kiselina u cirkulaciju. Insulin utiče i na metabolizam proteina, tako da povećava količinu proteina u tkivima. Ovaj efekat insulina ostvaruje se putem nekoliko mehanizama: ubrzavanjem aktivnog transporta nekih aminokiselina u ćelije, ubrzanjem translacije direktnim dejstvom hormona na ribozome, ubrzanjem rep� likacije i transkripcije (dugoročan efekat), inhibicijom katabolizma proteina u tkivima, kao i inhibicijom glukoneogeneze u jetri (smanjena potrošnja glukogenih aminokiselina). Zbog svog uticaja na sintezu proteina, insulin je potreban za normalan rast, na koji deluje sinergistički sa hormonom rasta. Mehanizam dejstva. Da bi ispoljio svoje dejstvo na nivou ćelije, insulin najpre mora da se veže za specifične receptore, koji se nalaze na plazma membrani ćelija osetljivih na insulin (Slika 2�4). Insulinski receptor je tetramerni protein koji se sastoji od dve a i dve (3�subjedinice. Insulin se vezuje za a�subjedinicu koja je lokalizovana na spoljašnjoj strani plazma�membrane. (3�Subjedinica se proteže kroz membranu u unutrašnjost ćelije i u svom intracelularnom delu sadrži domen koji pokazuje aktivnost tirozin�kinaze. Vezivanjem insulina za a�subjedinicu aktivira receptorsku tirozin�kinazu, koja dovodi do autofosforilacije (3�subjedinice receptora, a zatim i aktivacije serin� i treonin�protein�kinaza i sinteze drugih glasnika. To dovodi do promena aktivnosti ranije pomenutih enzima i translokacije GLUT4 na površinu plazma�membrane. Najveći broj efekata insulina ostvaruje se posredstvom IRS�1 i IRS�2 (IRS � skraćenica engleskog termina Insulin Receptor Substrate). Međutim, brojni i veoma raznoliki metabolički efekti insulina ne mogu se postići dejstvom samo jednog "drugog glasnika", niti posredstvom samo jednog mehanizma. Glukoregulatomi i antilipolitički efekti insulina su brzi i ostvaruju se posredstvom serin i treonin�kinaza i c�AMP, uz verovatno učešće još nekih sistema drugih glasnika ( H +, Ca 2+ , diacilgli� cerol, protein�kinaza C i glikozil�fosfatidilinozitol). Regulacija sekrecije. Najvažniji faktor koji kontroliše lučenje insulina je sama koncentracija glukoze u krvi: povećanje nivoa glukoze stimuliše, a sniženje inhibira sekreciju ovog hormona. Pored glukoze i neke aminokiseline (naročito arginin i lizin) stimulišu lučenje insulina, što je, obzirom na uticaj insulina na metabolizam proteina, značajno za pravilno korišćenje aminokiselina. Efekat aminokiselina je slab ako je koncentracija glukoze u krvi normalna, ali je mnogo izraženiji ukoliko istovremeno postoji i hiperglikemija (u tom slučaju sekrecija insulina je dvostruko veća od one koju bi izazvala sama hiperglikemija). Gastrointestinalni hormoni koji se oslobađaju iz gastrointestinalnog trakta posle obroka: gastrin, sekretin, holecistokinin i gastrični inhibitorni peptid (GIP), takođe stimulišu sekreciju insulina, a slično deluju i neki drugi hormoni, kao glukagon, hormon rasta, kortizol i, u manjoj meri, progesteron i estrogeni.
2�11
Z. Jelić �Ivanović : Metabolizam ugljenih hidrata
Insulin Ekstracelularni prostor
Glukoza
Intracelularni prostor
Regulacija metabolizma Sinteza proteina Slika 2�4. Mehanizam dejstva insulina na ciljne ćelije.
IGF I i IGF II IGF I i IGF II (IGF � Insulin�like Growth Factor � faktor rasta sličan insulinu) su peptidni hormoni koji se stvaraju uglavnom u jetri pod uticajem hormona rasta. Ovi hormoni pokazuju metaboličke efekte slične insulinu. IGF I je jedan od glavnih regulatora rasta i diferencijacije ćelije, dok tačna fiziološka uloga IGF II još uvek nije sa sigurnošću utvrđena. Koncentracija IGF u cirkulaciji je oko hil jadu puta veća od koncentracije insulina, a u krvi se nalaze vezani za specifične proteine koji regulišu njihovu aktivnost. Efekti IGF na ciljna tkiva ostvaruju se posredstvom specifičnih receptora ili insulin� skog receptora. IGF I receptor je po svojoj strukturi i biohemijskim osobinama veoma sličan insulin� skom. Može da vezuje i insulin, ali je afinitet receptora prema insulinu mnogo manji nego prema IGF I. Naprotiv, IGF II receptor je potpuno drugačiji: on nema aktivnost tirozin�kinaze, a njegov fiziološki značaj još uvek nije poznat. Značaj IGF u homeostazi glukoze nije poznat. Davanje IGF izaziva hipoglikemiju, dok nedostatak IGF I ima za posledicu patuljast rast. Neke neoplazme mogu da produkuju IGF u višku (naročito IGF II), a kod takvih pacijenata se često javlja hipoglikemija.
Antagonisti insulina Glukagon. Glukagon se sintetiše u a�ćelijama Langerhans�ovih ostrvaca, a sastoji se iz jednog polipeptidnog lanca molekulske mase 3 485, koji sadrži 29 ostataka aminokiselina. Pokazuje veoma snažan efekat na povišenje koncentracije glukoze u krvi (svega 1 ug glukagona/kg telesne težine može da poveća koncentraciju glukoze za oko 1 mmol/L). Do porasta glukoze u krvi pod uticajem glukagona dolazi usled stimulacije glikogenolize i glukoneogeneze. Najizraženiji efekat glukagona je ubrzanje glikogenolize u jetri. Pod dejstvom ovog hormona kao i pod dejstvom adrenalina, aktivira se adenilat�ciklaza u membrani hepatocita, koja dovodi do stva�
2�12
Medicinska biohemija
ranja cikličnog adenozin monofosfata (cAMP) unutar ćelije. U kaskadnom sistemu aktivacije enzima, posredstvom protein�kinaze i fosforilaza�kinaze, neaktivni oblik fosforilaze, fosforilaza b, transformiše se u aktivnu fosforilazu a, koja ubrzava razgradnju glikogena do glukoza�1�fosfata. Posle konverzije glukoza�1�fosfata u glukoza�6�fosfat, pod dejstvom glukoza�6�fosfataze oslobađa se glukoza, koja iz hepatocita difunduje u krv. Glukagon nema nikakvog uticaja na mišićni glikogen, na šta ukazuje činjenica da posle davanja glukagona ne dolazi do porasta koncentracije laktata i piruvata u krvi. Pod dejstvom glukagona, koncentracija glukoze u krvi može da se poveća i kada se potroši rezerva glikogena u jetri. To je posledica stimulacije glukoneogeneze u jetri, do koje verovatno dolazi usled aktivacije enzimskog sistema koji prevodi piruvat u fosfoenolpiruvat. Koncentracija glukoze u krvi reguliše sekreciju glukagona dejstvom u suprotnom smislu od onog kako deluje na sekreciju insulina. Smanjenje nivoa glukoze u krvi stimuliše sekreciju glukagona, koji dovodi do mobilizacije glukoze iz jetre, štiteći na taj način organizam od hipoglikemije. Kada koncentracija glukoze poraste, lučenje glukagona se inhibira. Aminokiseline takođe pospešuju sekreciju glukagona, čime se sprečava pojava hipoglikemije posle obroka koji se sastoji samo od proteina. Naime, već je pomenuto da neke aminokiseline izazivaju lučenje insulina koji snižava nivo glukoze, pa povećana sekrecija glukagona može da ublaži ili poništi ovaj efekat. Kortizol. Grupa hormona kore nadbubrežne žlezde (glukokortikoidi) takođe utiču na metabolizam ugljenih hidrata, povećavajući koncentraciju glukoze u krvi. Kortizol je u ovom pogledu najaktivniji među glukokortikoidima, nešto manju aktivnost pokazuje 11�dehidro�17�hidroksikortikosteron (kortizon), a najmanju kortikosteron i 11�dehidrokortikosteron. Glavni efekat kortizola i srodnih hormona jeste stimulacija glukoneogeneze, koja se ostvaruje putem nekoliko mehanizama. Pre svega, kortizol stimuliše biosintezu ključnih enzima koji učestvuju u glukoneogenezi: glukoza�6�fosfataze, fruktoza�1,6�difosfataze, fosfoenolpiruvat�karboksikinaze i piruvat�karboksilaze u hepatocitima. Glukokortikoidi ubrzavaju mobilizaciju proteina, prvenstveno iz mišića i njihovu degradaciju do aminokiselina, koje služe kao prekurzori za glukoneogenezu u jetri. Ovi hormoni stimulišu i oslobađanje masnih kiselina iz masnog tkiva, čijom oksidacijom se dobija velika količina energije. Zbog smanjenih potreba za energijom, usporava se glikoliza u jetri, odnosno, ravnoteža između katabolizma i sinteze glukoze pomera se u korist sinteze. Pored toga, usled povećane oksidacije masnih kiselina, stvara se veća količina acetil koenzima A koji aktivira piruvat karboksilazu i na taj način ubrzava glukoneogenezu. Glukokortikoidi takođe inhibiraju indukciju gliko� litičkih enzima pod dejstvom insulina što je još jedan način na koji ovi hormoni pomeraju ravnotežu u korist glukoneogeneze. Zbog toga što dovode do povećanja koncentracije glukoze u krvi, glukokortikoidi se ponekad nazivaju dijabetogenim hormonima. Kod pacijenata sa Cushing�ovim sindromom, kod kojih je povećano stvaranje ovih hormona usled tumora ili hiperplazije kore nadbubrežne žlezde, postoji sklonost ka hiperglikemiji. Naprotiv, kod Addison�ove bolesti (insuficijencija kore nadbubrežne žlezde usled destrukcije ili atrofije), često se javlja umerena hipoglikemija. Adrenalin. Adrenalin je hormon srži nadbubrežne žlezde, čija se osnovna uloga u metabolizmu ugljenih hidrata sastoji u obezbeđivanju glukoze za potrošnju u perifernim tkivima. Ovo dejstvo adrenalin pokazuje pre svega u uslovima izraženije hipoglikemije, kao i fizičkog ili emocionalnog stresa, kada se luči u većoj količini, dok je pod normalnim uslovima njegov uticaj na metabolizam glukoze od manjeg značaja. Pre svega, adrenalin stimuliše glikogenolizu u jetri i mišićima, što dovodi do povećanja koncentracije glukoze (iz jetrenog glikogena) i laktata (iz mišića) u plazmi. Adrenalin takođe inhibira glukoneogenezu i sekreciju insulina, a pojačava sekreciju glukagona, ali su ovi efekti manje izraženi u poređenju sa ubrzanjem glikogenolize pod dejstvom ovog hormona. Slično glukagonu, i adrenalin ostvaruje svoje dejstvo posredstvom cAMP kao "drugog glasnika". Kod pacijenata sa feohromocitomom, tumorom srži nadbubrežne žlezde koji luči adrenalin i noradrenalin, javlja se umerena hiperglikemija koja perzistira dok se ne istroše rezerve glikogena u jetri.
Z. Jelić �Ivanović: Metabolizam ugljenih hidrata
2�13
Hormon rasta. Hormon rasta (somatotropni hormon) je polipeptidni hormon prednjeg režnja hipofize. On stimuliše glukoneogenezu, ubrzava lipolizu i antagonizuje dejstvo insulina na ulazak glukoze u ćelije insulin�senzitivnih tkiva. Ostali hormoni koji utiču na metabolizam glukoze
Tiroksin ubrzava glikogenolizu u jetri, što dovodi do povećanja koncentracije glukoze u krvi i potrošnje rezervi glikogena. Međutim, tiroksin istovremeno ubrzava metabolizam i cirkulaciju krvi, a time i korišćenje glukoze, što delimično poništava njegov hiperglikemijski efekat. Pod dejstvom ovog hormona, takođe se ubrzava pražnjenje želuca i apsorpcija heksoza u tankom crevu. Pacijenti sa hiperfunkcijom tiroideje obično imaju blaži poremećaj tolerancije glukoze, mada je koncentracija glukoze u krvi natašte najčešće normalna. Somatostatin je polipeptid koji se najvećim delom stvara u 5�ćelijama pankreasa i hipotalamusu. Ovaj hormon istovremeno smanjuje sekreciju insulina i njegovih antagonista, hormona rasta i gluka� gona, čime modulira dejstvo ovih hormona. Humani placentarni laktogen (HPL) je polipeptidni hormon sa anti�insulinskom aktivnošću. Smatra se daje upravo ovaj hormon odgovoran za pojavu dijabetične ketoacidoza kod nekih trudnica koja nikad ranije nisu imale dijabetes, i kojima posle porođaja nije potrebna terapija insulinom. Amilin je polipeptidni hormon koji se sastoji od 37 ostataka aminokiselina, a sekretuju ga p�ćelije pankreasa zajedno sa insulinom. Kod osoba sa insulin�zavisnim diabetes mellitus�om postoji nedostatak amilina. Naprotiv, kod osoba sa rezistencijom na insulin i hipennsulinemijom, koncentracija amilina u plazmi je povećana. Amilin antagonizuje efekat insulina da stimuliše sintezu glikogena u skeletnim mišićima, verovatno na tak način što, suprotno insulinu, dovodi do aktivacije glikogen fos� forilaze i inhibicije glikogen sintaze. Ovaj hormon utiče i na brzinu pražnjenja želuca, tako da se apsorpcija glukoze produžava, a skok koncentracije glukoze posle obroka ublažava.
REGULACIJA KONCENTRACIJE GLUKOZE U KRVI Koncentracija glukoze u krvi i drugim telesnim tečnostima održava se kod zdravih osoba u relativno uskom rasponu vrednosti, usprkos velikih razlika u raspoloživosti egzogene glukoze u periodima gladovanja, odnosno posle uzimanja hrane. Održavanje stalne koncentracije glukoze u krvi od posebnog je značaja za funkciju moždanih ćelija, zbog toga što njihov metabolizam zavisi najvećim delom od glukoze, kojim se snabdevaju direktno iz krvi. Nivo glukoze u krvi je rezultanta dva suprotna procesa: brzine ulaska glukoze u krv i brzine njenog uklanjanja iz krvi. Brzina ulaska glukoze u krv zavisi od brzine glikogenolize i glukoneogeneze u jetri, prevođenja drugih ugljenih hidrata u glukozu, kao i brzine apsorpcije glukoze u gastrointestinalnom traktu (Tabela 2�2). Kod zdravog, normalno uhranjenog organizma, najvažniji izvor glukoze u postapsorptiv� nom periodu je jetreni glikogen. Naprotiv, posle obroka, brzina ulaska glukoze u krv uglavnom zavisi od apsorpcije u tankom crevu. Deo apsorbovane glukoze preuzima jetra, dok ostatak ulazi u sistemsku cirkulaciju. Udeo glukoze koja se zadržava u jetri zavisi od trenutnog kapaciteta jetre da sintetiše glikogen, kao i od brzine apsorpcije u gastrointestinalnom traktu. Tiroidni hormoni ubrzavaju apsorpciju, što povećava udeo glukoze koji prolazi iz portalnog u sistemski krvotok. Naprotiv, u stanjima sa povećanim motilitetom creva apsorpcija je usporena, zbog brzog prolaska glukoze kroz gornji deo tankog creva, gde se inače maksimalno apsorbuje.
2�14
Medicinska biohemija
Tabela 2�2. Faktori koji utiču na ravnotežu između brzine ulaska glukoze u krv i izlaska iz krvi
/. Brzina ulaska glukoze u krv a) Brzina glikogenolize u jetri: T sniženje koncentracije glikoze u krvi adrenalin tiroksin mišićni rad I porast koncentracije glukoze u krvi insulin b) Ulazak glukoze u sistemski krvotok posle apsorpcije u tankom crevu: t visok sadržaj glikogena u jetri ubrzana apsorpcija u tankom crevu (hormoni tiroideje) i nizak sadržaj glikogena u jetri spora apsorpcija (povećan motilitet creva) c) Glukoneogeneza: t glukokortikoidi i insulin d) Sinteza glukoze iz drugih ugljenih hidrata //. Brzina izlaska glukoze iz krvi:
t i
ubrzano korišćenje glukoze u tkivima (porast koncentracije glukoze u krvi; insulin) usporeno korišćenje glukoze (sniženje koncentracije glukoze u krvi; glukokortikoidi)
Brzina izlaska glukoze iz krvi direktno zavisi od brzine njenog korišćenja u tkivima (za oksidaciju, glikogenezu, lipogenezu i dr.), zbog toga što slobodna glukoza ne može da se skladišti u ćeli jama u značajnijim količinama. Pod fiziološkim uslovima, eliminacija glukoze zavisi od više faktora: porast koncentracije glukoze i insulin stimulišu ovaj proces, dok glukokortikoidi i hormon rasta usporavaju korišćenje glukoze u tkivima, pa time i izlazak iz krvi. Osnovni mehanizam regulacije. Procesi glikogenolize u jetri i korišćenja glukoze u tkivima, osetljivi su na relativno male varijacije koncentracije glukoze u krvi. Kada koncentracija glukoze poraste, ubrzava se giikogenoliza i korišćenje glukoze, usled čega se nivo glukoze snižava. Sniženje koncentracije glukoze u krvi ima suprotan efekat. Ravnoteža između stvaranja i korišćenja glukoze u najvećoj meri zavisi od odnosa insulin/glukagon.
Pod fiziološkim uslovima, mnogi faktori neprestano utiču na metabolizam ugljenih hidrata, do vodeći do promene koncentracije glukoze u krvi: apsorpcija glukoze u crevu, fizička i mentalna aktivnost, razna emocionalna stanja i dr. Glavni efekat većine takvih faktora jeste porast koncentracije glukoze, koji zatim pokreće niz, ranije pomenutih, regulatomih mehanizama: smanjuje prelazak glukoze iz jetre u krv ubrzava korišćenje glukoze u tkivima.
f
Z. Jelić �Ivanović : Metabolizam ugljenih hidrata
2�15
DIABETES MELLITUS Klasifikacija
Diabetes mellitus (DM) i drugi poremećaji tolerancije glukoze, podeljeni su na nekoliko osnovnih tipova (Tabela 2�3). Tip I (insulin�zavisni diabetes mellitus). Diabetes mellitus ovog tipa je posledica nedovoljnog lučenja insulina (insulinopenije). U vreme postavljanja dijagnoze, pacijenti obično već imaju izražene znake bolesti, povećanu koncentraciju glukoze u krvi i druge metaboličke poremećaje. Bez terapije insulinom, poremećaj metabolizma se progresivno pogoršava i dovodi do smrti. Davanjem insulina može da se postigne zadovoljavajuća kontola koncentracije glukoze u krvi, ali se ipak kod mnogih pacijenata vremenom javljaju hronične komplikacije, kao što su: retinopatija, oboljenja nerava (neu� ropatija), bubrega (nefropatija) i krvnih sudova (angiopatija). Tip I diabetes mellitusa se javlja kod oko 10% svih pacijenata obolelih od dijabetesa. Etiologija tipa I diabetes mellitusa nije sa sigurnošću ut vrđena. Kod većine pacijenata, oboljenje je verovatno prouzrokovano destrukcijom (3�ćelija Langer� hans�ovih ostrvaca u autoimunoj reakciji na virusnu infekciju. Prema ovoj hipotezi, antitela na proteine virusa ne mogu da razlikuju proteine (3�ćelija od virusnih proteina, pa dolazi do oštećenja ovih ćelija i pojave diabetesa. Kod velikog broja dijabetičara tipa I utvrđeno je prisustvo antitela na (3�ćelije u toku prve dve godine bolesti. Tabela 2�3. Klasifikacija DM i drugih poremećaja tolerancije glukoze
Kliničke klase Diabetes mellitus Tip I (insulin�zavisni DM) Tip II (insulin�nezavisni DM) Malnutricijski DM Drugi tipovi DM povezani sa nekim stanjima i sindromima Poremećaj tolerancije glukoze Klase statistički povećanog rizika Raniji poremećaj tolerancije glukoze Potencijalni poremećaj tolerancije glukoze
Tip II (insulin�nezavisni diabetes mellitus). Kod pacijenata sa tipom II dijabetesa, koncentracija insulina u plazmi može da bude niska (retko), normalna ili povećana. Kod većine pacijenata, nivo insulina je nešto veći od normalnog, ali ipak nedovoljan da održi normalnu koncentraciju glukoze u krvi. Prema tome, za razliku od tipa I, većina pacijenata sa tipom II diabetes mellitusa ima relativni nedostatak aktivnosti insulina, odnosno rezistenciju na insulin. Ova rezistencija može da bude rezultat smanjenog broja funkcionalnih insulinskih receptora, ili poremećaja nekog od procesa koji se normalno odvijaju posle vezivanja insulina za receptore. Insulin�nez,avisni DM je najčešći tip dijabetesa, sa zastupljenošću od oko 80�90% od ukupnog broja dijabetičara.
2�16
Medicinska biohemija
DM poze biti posledica određenih stanja i sindroma, kao što je hronični pankreatitis sa insufici� jencijom endokrine i egzokrine funkcije pankreasa, Cushing�ov sindrom (povišen kortizol), ak� romegalija (povišen hormon rasta), glukagonomi (tumori Langerhans�ovih ostrvaca pankreasa, koji luče glukagon), feohromocitomi (povišeni kateholamini), somatostatinomi (povišen somatostatin), primarni aldosteronizam, teška oboljenja jetre, ili nekih lekova i hemikalija, za koje je utvrđeno da prouzrokuju hiperglikemiju. Nastanku DM može da doprinese i fiziološko stanje, kao što je trudnoća (gestacioni Diabetes mellitus). Kod obolelih žena postoji visok rizik morbiditeta fetusa. Rana dijagnoza gestacionog dijabetesa je veoma značajna, jer se pravovremenom terapijom obično može postići da se trudnoća dovede do kraja bez većih komplikacija. Kod mnogih žena sa gestacionim DM, kasnije u toku života se ponovo javlja dijabetes mellitus tipa II (30�60%), dok se kod drugih metabolizam ugljenih hidrata posle porođaja trajno normalizuje. Poremećaj tolerancije glukoze. U ovu grupu spadaju osobe koje imaju izvestan poremećaj metabolizma glukoze (patološki rezultati testa opterećenja glukozom, v. kasnije u ovom poglavlju), ali ne toliko izražen da bi sa sigurnošću mogla da se postavi dijagnoza diabetes mellitusa. Kod ovih osoba postoji povećan rizik pojave simptoma pravog dijabetesa, kao i kardiovaskularnih bolesti, dok se mik� rovaskularne komplikacije retko javljaju. Učestalost poremećaja tolerancije glukoze se kreće oko 5� 11%.
Raniji poremećaj tolerancije glukoze. Kod osoba kod kojih je ranije bio utvrđen poremećaj koncentracije glukoze, posle čega se stanje normalizovalo, povećan je rizik od pojave diabetes mellitusa. U ovu grupu spadaju npr. gojazni pacijenti sa tipom II DM, koji su posle smanjenja telesne težine imali normalne rezultate testa opterećenja glukozom, ili žene sa gestacionim dijabetesom, kod kojih se posle porođaja tolerancija glukoze normalizovala. Potencijalni poremećaj tolerancije glukoze. Ova grupa obuhvata osobe bez ikakvih znakova dijabetesa, ali sa povećanim teorijskim rizikom od pojave DM, kao što su npr. monozigotni blizanac osobe sa tipom II dijabetesa, ili osoba čija su oba roditelja obolela od tipa II DM, zatim gojazne osobe, kao i članovi nekih etničkih grupa sa visokom učestalošću diabetes mellitus�a.
Metaboličke posledice nedostatka dejstva insulina Jetra
Pankreas
Masno tkivo
Mišići
Proteini Slika 2�5. Metaboličke posledice nedostatka dejstva insulina.
2�17
Z. Jelić �Ivanović : Metabolizam ugljenih hidrata
Nedostatak dejstva insulina u diabetes mellitusu dovodi do velikih poremećaja metabolizma, ne samo ugljenih hidrata, već i proteina i masti (Slika 2�5). Ukratko, poremećaj metabolizma ugljenih hidrata uključuje sprečavanje ulaska glukoze u insulin�zavisne ćelije, aktivaciju glukoneogeneze i glikogenolize. Usporava se katabolizam hilomikrona i VLDL čestica (u nedostatku insulina nema odgovarajuće aktivacije lipoproteinske lipaze); povećava se produkcija i sekrecija VLDL�a iz jetre. U nekontrolisanom DM dolazi do masovne lipolize triglicerida u masnom tkivu (nedostatak inhibicije hormon�senzitivne lipaze), što dovodi do stvaranja velike količine ketonskih tela. Ubrzan je katabolizam proteina, čime se oslobađaju glukogene aminokiseline, koje služe kao supstrat za glukoneo� genezu.
Akutne komplikacije diabetes mellitusa Najvažnije akutne komplikacije dijabetesa su: ketoacidoza, hiperosmolama koma i laktatna aci� doza.
Slobodne masne kiseline
Acet il �KoA
/
Acetoacetil�KoA
L
T
3�Hidroksi�3�metilglutaril�KoA(HMG�KoA)
A cetoa ce ta t
A ceton
Acetil�KoA
Biosinteza holesterola
P�Hidroksibutirat
Slika 2�6. Stvaranje ketonskih tela. U stanjima u kojima brzina stvaranja acetil�koenzima A veća od brzine raz laganja u ci kl us u limu ns ke kiseline (diabete s me llit us , gladovan je), dolazi do nagomilavanja ketonskih tela. Dijabetična ketoacidoza. Dijabetična ketoacidoza se javlja kod nekontrolisanog diabetes mellitusa tipa I. Kao što se vidi na Slici 2�6, acetil�koenzim A se nalazi na mestu ukrštanja metabolizma glukoze, proteina i masti. On može da se uključi u ciklus limunske kiseline, pri čemu se oksiduje do ugljen�dioksida i vode. Molekul acetil�koenzima A takođe može da se kondenzuje sa drugim molekulom acetil�koenzima A, pri čemu se stvara acetoacetil�koenzim A. U reakciji sa trećim molekulom acetil�koenzima A, nastaje p�hidroksi�p�metilglutaril�koenzim A (HMG�KoA), koji može da posluži kao prekurzor u biosintezi holesterola, ili može da se metabolizuje do acetoacetata. Deo stvorenog ace�
2�18
Medicinska biokemija
toacetata redukuje se pod dejstvom enzima p�hidroksibutirat�dehidrogenaze do (3�hidroksibutirata. Mali deo acetoacetata se u alveolama pluća spontano dekarboksiliše do acetona. Ketonska tela se normalno metabolizuju u ćelijama mozga, bubrega i skeletnih mišića. Kod zdravih osoba normalno se stvara vrlo mala količina ketonskih tela. Kod insulin�zavisnog diabetes mellitusa, nedostatak insulina prouzrokuje gladovanje ćelija kod kojih transport glukoze kroz ćelijsku membranu ne može da teče bez prisustva insulina (npr. ćelije mišića i masnog tkiva). Takve ćelije reaguju na nedostatak insulina mobilizacijom masnih kiselina iz triglicerida, a katabolizam oslobođenih masnih kiselina postaje glavni izvor energije. Ubrzani katabolizam masnih kiselina dovodi do stvaranja velike količine acetil�koenzima A. Znatan deo acetil�koenzima A se uključuje u ciklus limun� ske kiseline, kojim se oksiduje uz oslobađanje energije, a višak acetil�koenzima A postaje supstrat za ketogenezu. Povećano stvaranje ketokiselina prouzrokuje sniženje pH krvi (acidozu). Znatna količina ketonskih tela se eliminiše putem bubrega (ketonurija), što je praćeno gubitkom natrijuma i k'alijuma, kao i retencijom vodonikovih jona. Pored povećanja koncentracije glukoze, sniženja pH, ketonemije i ketonurije, ostali karakteristični laboratorijski rezultati uključuju: znatno povećanje koncentracije ureje u serumu, povećanje koncentracije kalijumovih jona (u početku, usled redistribucije između intracelu� larne i ekstracelularne tečnosti; kasnije koncentracija opada usled gubitka kalijumovih jona urinom), sniženje neorganskog fosfata. Ista metabolička slika se javlja i kod gladovanja, samo u tom slučaju umesto hiperglikemije postoji hipoglikemija. Hiperosmolarna koma. Hiperosmolarna koma se javlja prvenstveno kao akutna komplikacija in� sulin�nezavisnog diabetes mellitusa. Karakteriše se veoma visokim koncentracijama glukoze u krvi (u pravilu iznad 45 mmol/L), visokom osmolalnošću seruma (>350 mOsm/kg) i normalnim ili blago sniženim pH krvi, gubitkom elektrolita i vode. lako je količina natrijumovih i kalijumovih jona u organizmu snižena zbog gubitka urinom, koncentracija ovih elektrolita u plazmi može da bude povećana, normalna ili snižena, u zavisnosti od odnosa između količine izgubljenih elektrolita i količine izgubljene ekstracelularne vode. Koncentracija ketonskih tela je normalna, što se objašnjava različi�A tom osetljivošću metabolizma glukoze i metabolizma masti na insulin: za inhibiciju lipolize dovoljna je desetina insulina potrebnog da reguliše metabolizam glukoze, lako kod dijabetesa tipa II postoji rezistencija na insulin, dejstvo insulina je ipak dovoljno da spreči preteranu mobilizaciju masti. Laktatna acidoza. Infekcije i oštećenja kardiovaskularnog sistema kod dijabetičara dovode do smanjene perfuzije perifernih tkiva arterijskom krvlju, usled čega se usporava oksidacija piruvata aerobnim putevima metabolizma. Isto tako, u nedostatku insulina smanjuje se aktivnost enzimskog kompleksa piruvat�dehidrogenaze, koji katalizuje konverziju piruvata u acetil�koenzim A, odnosno uključivanje piruvata u ciklus limunske kiseline. Zbog toga se veća količina piruvata redukuje do lak� tata pod dejstvom laktat�dehidrogenaze.
Hronične komplikacije Dugotrajni dijabetes dovodi do poremećaja u mikrocirkulaciji i funkciji nerava, koji se klinički manifestuju kao nefropatija, retinopatija i neuropatija. Rizik od nastanka takvih komplikacija zavisi od kretanja koncentracije glukoze u krvi: ako je u dugim vremenskim periodima koncentracija glukoze u krvi izrazito povećana, veća je verovatnoća da će se komplikacije ranije pojaviti. Medjutim, takođe je značajna i genetska predispozicija pacijenata, pa će se zbog toga kod nekih pacijenata sa relativno dobro kontrolisanom koncentracijom glukoze u krvi ipak pojaviti komplikacije, dok će drugi pacijenti dobro podnositi hiperglikemiju koja traje i više dekada. Retinopatija. Retinopatija može da bude posledica proliferacije malih krvnih sudova u retini. Isto tako, kod dijabetičara često dolazi do formiranja zamućenja u očnom sočivu (katarakte). Neuropatija. Neuropatija je najčešća komplikacija dijabetesa, koja se manifestuje različitim znacima kao što su: bol, umrtvljenost, osećaj žarenja u ekstremitetima, vrtoglavica i dvostruko viđenje. Ovi simptomi su prouzrokovani smanjenom brzinom provođenja nervnih impulsa kod obolelih, što je posledica degenerativnih promena na aksonima i demijelinizacije. Angiopatija. Angiopatija u diabetes mellitusu je posledica oštećenja bazalne membrane krvnih sudova. Angiopatija povećava rizik od pojave koronarnih bolesti i moždanog insulta, prouzrokuje reti� nopatiju i nefropatiju.
Z. Jelić �Ivanović : Metabolizam ugljenih hidrata
2�19
Nefropatija. Nefropatija je teška komplikacija i čest uzrok smrtnosti među dijabetičarima. Usled zadebljanja bazalne membrane glomerula, kao i oštećenja kapilara, progresivno se razvija insufici� jencija bubrega. Jedan od prvih znakova ovog oboljenja je proteinurija, do koje dolazi usled povećanja propustljivosti glomerula. Početna oštećenja glomerula, u prekliničkoj, reverzibilnoj fazi, mogu da se otkriju utvrđivanjem pojave mikroalbuminurije (malog povećanja ekskrecije albumina urinom, kod kojeg je reakcija koja se u laboratorijama obično koristi za dokazivanje proteina u urinu još uvek negativna). Uspostavljanjem bolje metaboličke kontrole u ovoj fazi stanje može da se popravi. Međutim, kada se pojavi makroalbuminurija (pozitivna reakcija za dokazivanje proteina u urinu), nefropatija je već ireverzibilna, i stanje pacijenta se postepeno pogoršava. Infekcije. Postoji velika sklonost dijabetičara prema infekciji, pojavi ulceracija i gangrene, naročito na ekstremitetima. Hiperlipoproteinemije i ateroskleroza. Kod pacijenata sa diabetes mellitusom javljaju se različiti tipovi hiperlipoproteinemija, koje mogu da budu prouzrokovane bilo povećanim stvaranjem VLDL, LDL ili HDL, bilo smanjenom eliminacijom hilomikrona, LDL ili HDL. Koncentracije triglicerida i holes� terola su često povećane kod oba tipa dijabetesa. Kod insulin�zavisnog dijabetesa, usled nedostatka insulina, snižena je aktivnost lipoproteinske lipaze, pa glavni uzrok povećanja nivoa triglicerida kod ovih pacijenata leži u neadekvatnoj eliminaciji iz plazme. To je i uzrok jake hilomikronemije koja se viđa u dijabetičnoj ketoacidozi. Terapija insulinom normalizuje katabolizam hilomikrona i inhibira mobilizaciju masnih kiselina. Kod pacijenata sa diabetes mellitusom tipa II, često su povećane koncentracije triglicerida i holesterola, kao posledica povećane sinteze u jetri. Višak triglicerida se sekretuje u plazmu u formi VLDL. Međutim, ako je višak toliki da se zasiti kapacitet jetre da sekretuje VLDL, dolazi do akumulacije triglicerida u hepatocitima. lako je povećanje nivoa triglicerida obično povezano sa povećanjem VLDL, često dolazi i do povećanja nivoa drugih klasa lipoproteina (LDL). Sman jenjem unosa ugljenih hidrata, kod pacijenata sa insulin�nezavisnim diabetes mellitusom, snižava se nivo triglicerida i VLDL. Nivo ukupnog holesterola i LDL može da se popravi ograničavanjem unosa holesterola i zasićenih masnih kiselina. Zbog aterogenih osobina VLDL i LDL, povećava se rizik po jave ateroskleroze kod dijabetičara, lako je kod nekih pacijenata povećan nivo ukupnog HDL, frakcija nascentnog HDL koja štiti od ateroskleroze obično je snižena, što još više doprinosi povećanju rizika od nastanka ateroskleroze i pojave koronarnih bolesti. Lipidni status kod dijabetičara zavisi i od mnogih drugih faktora, kao što su: gojaznost, rezistencija na insulin, ishrana, fizička aktivnost, ili postojanje naslednih hiperlipoproteinemija kcd ovih pacijenata. Hiperlipoproteinemije nisu jedini uzrok ateroskleroze u dijabetičara, već kod njih može da dođe i do sinteze masti in situ, u arterijskom zidu, naročito kod pacijenata sa dijabetesom tipa II, nezavisno od toga da li je koncentracija masti u plazmi normalna ili ne. Biohemijski osnov hroničnih komplikacija dijabetesa Neenzimska glikozilacija proteina. Proteini eritrocita, plazme, glomerula, nervnih ćelija i drugih tkiva podležu procesu neenzimske glikozilacije. Brzina cvog procesa proporcionalna je koncentraciji glukoze u ekstracelularnoj tečnosti. Karbonilna grupa glukoze (ali i drugih šećera: manoze, galak� toze, ksiloze, riboze, fruktoze, ili intermedijera njihovog metabolizma), reaguje sa slobodnim amino� grupama proteina (N�terminalna amino�grupa ili s�amino grupa ostataka lizina). U ranoj fazi glikozi� laciije, najpre nastaje intermedijer tipa Schiff�ove baze, aldimin (Slika 2�7). Amadori�jevim premešta� njem, aldimin ireverzibilno prelazi u stabilni ketoamin. Aldimin je labilna forma glikoziliranog proteina: on se brzo stvara, ali lako hidrolizuje pri čemu se oslobađa amino�grupa proteina i karbonilna grupa šećera. Naprotiv, reakcija u kojoj se stvara ketoamin je ireverzibilna. Kako proces dalje odmiče, ketoamin se razlaže dajući razne proizvode koji sadrže karbonilnu grupu. Ovi reaktivni proizvodi dalje reaguju sa slobodnim amino grupama i drugim bočnim grupama ostataka aminokiselina u proteinskim molekulima. Pri tome nastaje kompleksna smesa proizvoda ove adicije, uključujući i agregate koji se sastoje iz dva ili više molekula proteina međusobno povezanih ukrštenim vezama (krajnji proizvodi poodmakle faze glikozilacije).
Medicinska biohemija
2�20 Ostatak lizina (npr. ApoB LDL�a) �CONH� NH�,
CHO H�C�OH HO�C�H H�i�OH H�C�OH CH,OH
�CONH� (C H 2 ) 4 N Ama dorijevo II CH prem eštanje I • H�C�OH HO�C�H H�C�OH I H�C�OH
CH2OH
Aldimin
�CONH�
(CH 2 )4 N�H 1 H�C�H C=0 HO�C�H H�
Ketoamin
Glukoza Slika 2�7. Rana faza neenzimske glikozilacije proteina. Promene u strukturi proteina do kojih dolazi u procesu glikozilacije, često dovode do poremećaja funkcije glikoziliranog proteina. Tako npr. glikozilacija a�kristalina, proteina koji se nalazi u očnom sočivu, smanjuje njegovu rastvorljivost, što može da bude povezano sa nastankom katarakte. Glikozilacija kolagena bazalne membrane krvnih sudova prouzrokuje zadebljanje membrane slično onom koje se javlja kod dijabetičara. Oštećenje funkcije imunoglobulina G (IgG) neenzimskom glikozilacijom povezano je sa učestalim infekcijama koje se javljaju u diabetes mellitusu. Povećanje koncentracije LDL takođe može da bude posledica glikozilacije lizil�ostataka apolipoproteina B, usled koje se smanjuje njegov afinitet prema specifičnim receptorima, a time i katabolizam LDL. Na osnovu ovih činjenica, pretpostavlja se da se postanak mnogih komplikacija dijabetesa može objasniti po javom glikozilacije raznih specifičnih proteina u organizmu. Pored toga, određivanje glikoziliranih proteina krvi, pre svega glikoziliranog hemoglobina (HbAic) ili glikoziliranih proteina plazme ("frukto� zamin"), dragoceno je za praćenje toka bolesti, jer daje uvid u prosečno kretanje nivoa glukoze u krvi u određenom vremenskom periodu. Akumulacija sorbitola. Kod pacijenata sa diabetes mellitusom, glukoza ulazi u one ćelije, kod kojih transport glukoze nije zavisan od prisustva insulina (ćelije glomerula, nervne ćelije, ćelije očnog sočiva). Pod dejstvom enzima aldoza�reduktaze, glukoza se redukuje do sorbitola, koji teško prolazi kroz ćelijsku membranu. Uklanjanje sorbitola iz ćelije zavisi od dejstva sorbitol�dehidrogenaze, enzima koji oksiduje sorbitol do fruktoze koja slobodno prolazi kroz membranu. Međutim, kada je koncentracija glukoze visoka, količina nastalog sorbitola prevazilazi kapacitet ćelije da konvertuje sorbitol u fruktozu, pa dolazi do nagomilavanja sorbitola u ćeliji. Kako je sorbitol osmotski aktivna supstanca, ovo dovodi do bubrenja ćelije i oštećenja ćelijskih struktura. Ovo je osnov jedne od hipoteza kojima se objašnjava pojava hroničnih komplikacija dijabetesa. Ispitivanja su pokazala da inhibitori aldoza� reduktaze mogu da poboljšaju funkciju nervnih ćelija kod dijabetičara.
Funkcionalni testovi Oralni test opterećenja glukozom. Test za konačnu dijagnozu diabetes mellitus�a je oralni test opterećenja glukozom (oralni glukoza�tolerans test, OGTT). Međutim, ovaj test nije uvek neophodan za postavljanje dijagnoze. Prema preporuci Svetske zdravstvene organizacije, nivo glukoze u plazmi našte iznad 7,0 mmol/L, dobijen u dva navrata, dovoljan je za utvrđivanje dijabetesa, dok se vrednost ispod 6,0 mmol/L smatra normalnom. U slučaju vrednosti koje se nalaze između ovih granica, ili ako
Z. Jelić �Ivanović : Metabolizam ugljenih hidrata
2�21
se u dva navrata dobiju nekonzistentni rezultati, potrebno je da se uradi test opterećenja glukozom. Test opterećenja glukozom se izvodi ujutro, posle 10�16 sati gladovanja u toku noći (dozvoljeno je uzimanje vode). Kod pacijenata koji su na dijeti sa niskim unosom ugljenih hidrata (manje od 125 g/dan), ovaj unos treba nešto povećati najmanje tri dana pre testa. Za vreme testa, pacijent treba da miruje i da ne puši. Najpre se uzme uzorak krvi za određivanje glukoze natašte, a zatim se oralno da 75 g glukoze rastvorene u 250�300 mL vode (deci se daje 1,75 g glukoze/kg telesne mase, a najviše 75 g). Zatim se uzima krv svakih 30 minuta u toku 2 sata od unošenja glukoze i u svakom uzorku se odredi koncentracija glukoze. Slika 2�8 prikazuje tipične krive kretanja koncentracije glukoze kod zdravih osoba i dijabetičara.
30
60
90
120
Vre me (m in)
� Zdravi (srednja vrednost) ��•� • Zdravi(min) A Zdravi (max) —•��DM Slika 2�8. Kretanje koncentracije glukoze u toku OGTT kod zdravih osoba i dijabetičara. Kod zdravih osoba, dobija se koncentracija glukoze ispod 6 mmol/L pre davanja glukoze i manje od 7,8 mmol/L 2 h posle davanja glukoze. Koncentracija glukoze u plazmi u uzorku uzetom posle 2 sata veća od 11,0 mmol/L potvrđuje dijagnozu diabetes mellitus�a. Vrednosti glukoze u plazmi između 7,8 i 11,0 mmol/L u uzorku uzetom posle 2 sata, ukazuje na poremećaj tolerancije glukoze. Kada se jednom postavi dijagnoza dijabetesa, dalje izvođenje GTT nije od koristi za praćenje toka bolesti. Međutim, kod pacijenata sa promenjenom tolerancijom glukoze postoji povećan rizik pojave dijabetesa, pa test treba ponavljati u intervalima od 1�2 godine. Intravenski test opterećenja glukozom. Kod pacijenata sa nekim oboljenjima gastrointestinal� nog trakta ne može da se radi oralni test opterećenja glukozom, jer bi poremećaj apsorpcije glukoze uticao na rezultate testa. Zbog toga se u tim slučajevima primenjuje test opterećenja glukozom da� tom intravenskim putem. Test opterećenja insulinom. Ovim testom se ispituje osetljivost organizma na insulin, kao i sposobnost organizma da reaguje na hipoglikemiju izazvanu davanjem insulina. Kod zdravih osoba, koncentracija glukoze u krvi pola sata posle davanja insulina pada otprilike na polovinu vrednosti pre početka testa.
Medicinska biohemija
2�22
Test opterećenja tolbutamidom. Zahvaljujući osobini tolbutamida da stimuliše sekreciju insulina, ovaj test može da se primenjuje u dijagnostici diabetes mellitus�a, kao i hipoglikemije koja se javlja kao posledica insulinoma. Kod zdravih osoba, koncentracija glukoze 20 minuta posle intraven� skog davanja tolbutamida obično je niža od 75% vrednosti pre početka testa. Kod dijabetičara se ne postiže toliko sniženje nivoa glukoze. Naprotim, kod insulinoma (tumori koji sekretuju insulin), pod dejstvom tolbutamida luči se velika količina insulina, pa je pad koncentracije glukoze znatno izraženiji. Test opterećenja adrenalinom. Porast koncentracije glukoze u krvi posle davanja adrenalina služi kao pokazatelj količine i raspoloživosti glikogena u jetri.
HIPOGLIKEMIJA Interpretacija niske vrednosti koncentracije glukoze u krvi nije moguća bez poznavanja kliničkih uslova pod kojima je takva vrednost dobijena, što se pre svega odnosi na starost osobe kao i na okolnosti kod uzimanja krvi (da li je krv uzeta posle obroka ili u postapsorptivnom periodu). Hipoglikemija kod novorođenčadi i dece. Opšte je prihvaćeno da se koncentracije glukoze niže od 1,67 mmol/L kod donesene novorođenčadi, odnosno <1,11 mmol/L kod prevremeno rođene dece smatraju patološkim. U Tabeli 2�4. navedena su neka stanja kod kojih se javlja hipoglikemija u novorođenčadi i dece.
Tabela 2�4. Uzroci hipoglikemije kod novorođenčadi i dece. Prolazna hipoglikemija Niska telesna težina na rođenju, prevremeno rođenje Diabetes ili toksemija kod majke Policiternija Respiratorni "distres" sindrom Trajna hipoglikemija Defekt u stvaranju glukoze Glikogenoze Deficit enzima glukoneogeneze Poremećaji sekrecije hormona antagonista insulina Galaktozemija Nasledna nepodnošljivost fruktoze Endogeni hiperinsulinizam Idiopatska hipoglikemija
Hipoglikemija kod odraslih. Ako se radi o hipoglikemiji kod odrasle osobe, postoje bitne razlike u zavisnosti od toga da li se ona javlja natašte, tj. u postapsorptivnom periodu, ili posle obroka. Po java hipoglikemije posle obroka nije retka pojava, a može da bude neurogenog porekla, da se javi posle operativnih zahvata u gastrointestinalnom traktu kao posledica brzog pražnjenja želuca, ili u ranom diabetes mellitus�u usled poremećaja lučenja insulina (povremeno preterano ili odloženo lučenje insulina). Međutim, hipoglikemija u postapsorptivnom periodu kod odraslih je skoro uvek znak nekog ozbiljnog oboljenja (Tabela 2�5).
Z. Jelić �Ivanović: Metabolizam ugljenih hidrata
2�25
Pentozurija
Pentozurija može da se javi kao alimentarna pentozurija, kod zdravih osoba posle unošenja većih količina voća bogatog pentozama, pri čemu se urinom ekskretuje L�arabinoza. Esencijalna pentozurija je bezopasan nasledni poremećaj, bez poremećaja metabolizma drugih ugljenih hidrata. U urinu se javlja L�ksiluloza, i to nezavisno od količine unetih pentoza. Laktozurija
Javlja se kod mnogih zdravih žena u periodu laktacije, kao i kod 80% trudnica i to pretežno u kasnijim mesecima trudnoće. Galaktozurija
Alimentarna galaktozurija. Javlja se posle uzimanja većih količina galaktoze kod pacijenata sa oštećenom funkcijom je tre. Galaktozemija. Ozbiljan urođeni poremećaj u konverziji galaktoze u glukozu, koji kod obolele dece dovodi do malnutricije, hepatomegalije, ciroze, katarakte, a često i mentalne retardacije. Galaktozurija se javlja posle unošenja mleka i mlečnih proizvoda. Ako se dijagnoza postavi na vreme, iz� begavanjem uzimanja mleka nestaju navedeni simptomi. Uzrok poremećaja je nedostatak enzima galaktoza�1�fosfat�uridiltransferaze, koji učestvuje u pretvaranju galaktoze u glukozu. Galaktoza i galaktoza�1�fosfat se nagomilavaju u tkivima i telesnim tečnostima, što dovodi do karakterističnih morfoloških pramena. Dolazi do oštećenja tubula sa proteinurijom i aminoacidurijom. Nešto lakši oblik galaktozemije prouzrokovan je nedostatkom galaktokinaze u ćelijama. Maltozurija
Pojava maltoze u urinu je retka i nije praćena nikakvim kliničkim simptomima.
LAKTAT I PIRUVAT^ Laktat u krvi potiče najvećim delom iz mišićnog tkiva i eritrocita, a metabolizuje se u jetri. Za vreme fizičkog napora, nivo laktata može da se poveća i za više od deset puta. Kako u ovom slučaju paralelno raste i koncentracija piruvata, odnos laktat/piruvat ostaje normalan. Kod raznih stanja praćenih nedostatkom kiseonika u tkivima, usporena je aerobna oksidacija piruvata. Umesto da se oksiduje do ugljen�dioksida i vode putem ciklusa limunske kiseline, piruvat se redukuje do laktata, čija koncentracija u krvi zbog toga raste. Povećan nivo laktata u krvi često se javlja u šoku, srčanoj dekompenzaciji, hematološkim oboljenjima, insuficijenciji pluća. Izražena mlečno�kiselinska acidoza sa ekstremno visokim vrednostima laktata (i 25 puta većim od normalnih) i povećanim odnosom laktat/piruvat, javlja se u ireverzibilnom stadijumu šoka, dijabetičnoj komi bez ketoze, kao i u terminalnom stadijumu raznih oboljenja. Kako se laktat normalno metabolizuje u jetri, njegova koncentracija u krvi može da se poveća i u slučaju smanjene perfuzije jetre. Nivo laktata u cerebrospinalnoj tečnosti normalne prati njegov nivo u krvi, a može da se menja nezavisno od koncentracije u krvi kod nekih oboljenja centralnog nervnog sistema, kao što su: intrak� ranijalno krvarenje, bakterijski meningitis, cerebrovaskulami insulti, epilepsija i dr.
GLIKOGENOZE Glikogenoze su grupa urođenih poremećaja kod kojih dolazi do akumulacije glikogena ili srodnih jedinjenja u raznim organima: jetri, bubrezima, srcu, mišićima. Ova oboljenja su prouzrokovana defi�
Medicinska biohemija
2�26
cijencijom nekog od enzima koji učestvuje u sintezi ili razlaganju glikogena. U zavisnosti od vrste materijala koji se nagomilava, mesta akumulacije i enzima čijim su deficitom prouzrokovane, gliko� genoze se dele na sedam glavnih tipova (Tabela 2�7). Tip I (von Gierke�ova bolest). Glikogen se nagomilava u jetri i bubrezima. Usled deficita glu� koza�6�fosfataze, razlaganjem glikogena u jetri ne može da se dobije slobodna glukoza. Koncentracija glukoza�6�fosfata u hepatocitima je visoka, što stimuliše glikogenezu. Kako vrlo malo glukoze iz jetre dospeva u krv, kod dece sa ovom bolešću javlja se hipoglikemija. Kao izvor energije koriste se uglavnom masti, što izaziva lipemiju, acidemiju i ketozu, kao i povećanje koncentracije holesterola u tolikoj meri da se javljaju ksantomi. Dolazi do masne infiltracije jetre. Hipoglikemija inhibira sekre� ciju insulina, što dovodi do usporene sinteze proteina, pa dolazi do zastoja u rastu. Hipoglikemija stimuliše sekreciju adrenalina, koji ubrzava glikogenolizu u mišićima. Proizvod glikogenolize u mišićima je mlečna kiselina, koja izlazi iz mišićnih ćelija pa njena koncentracija u krvi raste. Postoji kompeticija mlečne i mokraćne kiseline za ekskreciju putem bubrega, pa je ekskrecija mokraćne kiseline usporena, što dovodi do porasta koncentracije u krvi. Većina obolele dece umire, neki preživljavaju do adolescencije, kada, iz neutvrđenih razloga, može da dođe do velikog poboljšanja. Tip II (Pompe�ova bolest). Ovaj tip glikogenoze je posledica deficijencije lizozomalnog enzima kisele maltaze (a�1,4�glukoziđaze). Glikogen se nagomilava u skoro svim tkivima. Srce je znatno uvećano, a slabost mišića veoma izražena. U većini slučajeva, bolest se završava fatalno do devetog meseca života. Tip III (granična dekstrinoza). Uzrok je deficijencija "enzima razgranjavanja" (koji hidrolizuje a� 1,6�glukozidne veze, tj. mesta račvanja u molekulu glikogena). Dejstvom fosforilaze glikogen se katabolizuje do graničnog dekstrina, koji dalje ne može da se razlaže, pa se nagomilava u jetri i mišićima. Kliničke manifestacije su slične tipu I, ali blaže. Tip IV (amilopektinoza). Nedostaje "enzim grananja" koji u procesu glikogeneze katalizuje stvaranje račvi, tj. formiranje oc�1,6�glukozidnih veza. Nagomilava se proizvod sa malo račvi i dugačkim spoljnim lancima � amilopektin, i to najviše u jetri. Dolazi do hepatomegalije i ciroze, kao i umerene hipoglikemije. Bolest ima fatalan ishod najkasnije do četvrte godine života. Tip V (McArdle�ova bolest). Postoji deficijencija fosforilaze u mišićima. Javljaju se bolovi posle umerenog fizičkog napora, koji prestaju u toku mirovanja, kada mišići koriste uglavnom masti kao izvor energije. Tip VI (Hers�ova bolest). Ovo je slabo definisana grupa oboljenja. Sadržaj glikogena u jetri je obično povećan, a u nekim slučajevima je utvrđeno da je uzrok deficijencija fosforilaze u hepatocitima. Klinička slika podseća na blagi oblik glikogenoze tipa I. Tabela 2�7. Klasifikacija glikogenoza Tip I II III IV V VI VII
Naziv
von Gierke�ova bolest Pompe�ova bolest granična dekstrinoza amilopektinoza
McArdle�ova bolest Hers�ova bolest �
Nagomilava se:
Tkivo
Enzimski defekt
glikogen
jetra, bubrezi
glukoza 6�fosfataza
26%
glikogen
sva tkiva (srce, mišići)
lizozomalna kisela maltaza (a�1,4�glukozidaza)
17%
granični dekstrin
jetra, mišići
"enzim razgranjavanja"
22%
amilopektin jetra
"enzim grananja"
retka
glikogen
mišići
glikogen fosforilaza (mišići)
retka
glikogen
jetra
glikogen fosforilaza (jetra)
31 %
fosfofruktokinaza
retka
glikogen (umereno)
mišići
Učestalost
Z. Jelić �Ivanović : Metabolizam ugljenih hidrata
2�27
Tip VII. Postoji umerena akumulacija glikogena u mišićima. Deficijentan enzim je fosfofrukto� kinaza, pa se nagomilavaju glukoza�6�fosfat i fruktoza�6�fosfat, a koncentracija fruktoza�1,6�difosfata je snižena. Simptomi su slični glikogenozi tipa V.
c
Poglavlje 3. Proteini
Proteini su klasa biomolekula velike molekulske mase, koja se sastoji od aminokiselina međusobno povezanih u linearni lanac peptidnim vezama. Svaka vrsta živih organizama sadrži veliki broj proteina specifičnih za pojedine organe ili tkiva, kao i za pojedine organizme u celini. Za razliku od polisaharida i složenih lipida, proteini su informacioni makromolekuli: sekvenca aminokiselina u njihovoj strukturi genetski je određena sekvencom nukleotida u strukturi DNK. Svi proteini u sadrže ugljenik, vodonik, kiseonik, azot i sumpor, a pojedini mogu da sadrže i fosfor, jod, gvožđe, bakar, cink ili druge elemente. Prisustvo azota u strukturi svih proteina je karakteristika po kojoj se oni bitno razlikuju od drugih klasa biomolekula, kao što su ugljeni hidrati i lipidi. Prosečan sadržaj azota u suvoj težini proteina je približno 16%.
VARENJE I APSORPCIJA PROTEINA Egzogeni proteini uneti hranom hidrolizuju se u želucu i tankom crevu pod dejstvom peptidaza. Peptidaze koje učestvuju u varenju proteina mogu da se podele u dve glavne grupe, zavisno od lokalizacije peptidne veze koju hidrolizuju: Endopeptidaze � hidrolizuju peptidnu vezu u unutrašnjosti popipeptidnog lanca, Egzopeptidaze � deluju na krajevima polipeptidnog niza, a dele se na: Karboksipeptidaze (odcepljuju C�terminalnu aminokiselinu) i Aminopeptidaze (odcepljuju N�terminalnu aminokiselinu) Peptidaze se luče u obliku neaktivnih proenzima, koji se u gastrointestinalnom traktu aktiviraju parcijalnom hidrolizom, tj. odvajanjem peptida određene dužine iz molekula proenzima. Varenje u želucu odvija se pod dejstvom pepsina, familije enzima koje spadaju u grupu karboksil� proteaza (za njihovo dejstvo je neophodno prisustvo karboksilne grupe u aktivnom centru). Najvažniji enzim ove grupe je pepsin A, koji se luči u formi neaktivnog proenzima, pepsinogena A. Aktivira se najpre procesom autoaktivacije (pod dejstvom samih molekula pepsinogena u kiseloj sredini, pH < 5), a potom autokatalizom (pod dejstvom molekula aktivnog pepsina). Endopeptidaze pokazuju
Medicinska biohemija
3�2
određenu grupnu specifičnost prema mestu dejstva � tako pepsin hidrolizuje peptidne veze koje grade aromatične aminokiseline (pre svega fenilalanin i tirozin) sa drugim aminokiselinama. U egzokrinim ćelijama pankreasa stvaraju se endopeptidaze: tripsin, himotripsin i elastaza. Sva tri enzima spadaju u serin�proteaze, jer je za njihovo dejstvo bitno prisustvo serina u aktivnom centru. Sva tri se luče u obliku proenzima (tripsinogen, himotripsinogen i proelastaza). Tripsinogen se konvertuje u aktivan tripsin pod dejstvom enteropeptidaze, enzima koje luče epitelne ćelije creva pod dejstvom gastrointestinalnom hormona holecistokinina. Pored toga, tripsin deluje autokatalitički na tripsinogen, i katalitički na himotripsinogen i proelastazu, koje konvertuje u odgovarajuće aktivne enzime. Tripsin hidrolizuje peptidnu vezu koju grade bazne aminokiseline (arginin i lizin) sa drugim aminokiselinama; himotripsin na vezu aromatičnih aminokiselina (tirozin, triptofan, fenilalanin), metionina i leucina, a elastaza deluje na mestima gde se u polipeptidnom lancu nalaze ostaci alanina, glicina i serina. , Pored navedenih endopeptidaza, pankreas luči i dve karboksipeptidaze: karboksipeptidazu A i B. Oba enzima spadaju u cink�peptidaze, pošto je za njihovo enzimsko dejstvo potreban cink u aktivnom centru. Luče se u obliku prokarboksipeptidaza, a aktivacija teče pod dejstvom tripsina, koji ima centralno mesto u procesu aktivacije pankreasnih enzima (Slika 3�1) Karboksipeptidaza A odvaja C�terminalne ostatke valina, leucina, izoleucina i alanina, a karboksipeptidaza B deluje na C� terminalne ostatke arginina ili lizina. Polipeptidi Oligopeptidi Aminokiseline
Intestinalne endokrine ćelije kretj?.
H**!*^' Pankreasne egzokrine ćelije
i Holecistokinin * Intestinalne epitelne ćelije
Enteropeptidaza Tripsinogen Himotripsinogen Proelastaza Prokarboksipeptidaza
•*• Tripsin Himotripsin �• Elastaza Karboksipeptidaza
Slika 3�1. Aktivacija pankreasnih peptidaza koje učestvuju u varenju proteina centralno mesto tripsina u procesu aktivacije
Varenje proteina se nastavlja u tankom crevu, gde na proizvode delimične hidrolize pod dejstvom do sada pomenutih enzima, oligopeptide, deluju membranski enzimi mikrovila enterocita (endopeptidaze, dipeptidaze i aminopeptidaze različitih specifičnosti). Udruženim dejstvom svih ovih enzima, nastaju krajnji produkti varenja proteina, aminokiseline i dipeptidi. Ceo opisani proces varenja proteina pojednostavljeno je prikazan na slici 3�2.
Z. Jelić�lvanović: Proteini
3�3 Aminokiseline (40%)
Aminokiseline
Polipeptidi Dipeptidi Tripeptidi
Oligopeptidi (60%) pepsin tripsin himotripsin elastaza karboksipeptidaza A i B
endopeptidaza aminopeptidaza dipeptidaza
želudačni i pankreasni enzimi
enzimi mikrovila tankog creva
Slika 3�2. Varenje proteina: rezime Aminokiseline i dipeptidi se apsorbuju iz lumena tankog creva pomoću specifičnih transportnih sistema (slika 3�3). Postoji više transportnih sistema za aminokiseline, koji se međusobno razlikuju po specifičnosti u odnosu na aminokiseline koje transportuju: neutralne aminokiseline sa kratkim ili polarnim bočnim lancem (Ser, Thr, Ala) neutralne aminokiseline sa aromatičnim ili hidrofobnim bočnim lancem (fenilalanin, tirozin, metionin, valin, leucin, izoleucin) imtno�kiseline (prolin i hidroksiprolin), (3�Aminokiseline ((3�alanin, taurin), bazne aminokiseline (lizin, arginin) i cistin, kisele aminokiseline (asparaginska i glutaminska kiselina). Dipeptidi se u enterocitima hidrolizuju pod dejstvom ćelijskih dipeptidaza i tripeptidaza, pa se u portalnoj cirkulaciji, od konačnih proizvoda varenja proteina pojavljuju samo aminokiseline.
Aminokiseline
*•
*
Na +
Aminokiseline
Dipeptidi Tripeptidi Dipeptidaze Tripeptidaze Lumen
Enterocit
Slika 3�3. Apsorpcija produkata varenja proteina
Kapilar
3�4
Medicinska biohemija
PREGLED METABOLIZMA PROTEINA Uvid u status proteina u organizmu velikim delom se može ispitati i prikazati praćenjem sudbine azota, karakterističnog sastojka proteinskih molekula.
Balans azota Najveći deo azota koji se unese hranom potiče iz proteina hrane, mada se u namirnicama nalazi i mala količina neproteinskih organskih supstanci koje sadrže azot, kao i tragovi neorganskih soli (nitrata i nitrita). U telesnim tečnostima i tkivima nalaze se mnoge azotne materije. Proteini sačinjavaju prosečno oko 20% vlažne težine većine tkiva. U krvi se pored proteina nalaze i neproteinske azotne supstance: ureja, kreatin, kreatinin, mokrćana kiselina. Slobodne aminokiseline se takođe nalaze u krvi, na putu od jednog organa do drugog gde će se razgraditi ili poslužiti kao supstrati biosintetskih reakcija. Glavni put ekskrecije azota je eliminacija putem urina. Ureja je krajnji proizvod katabolizma proteina i kvantitativno najznačajniji azotni sastojak urina. Ekskrecija ureje urinom direktno zavisi od količine proteina koja se unosi hranom. Aminokiseline se posle filtracije u glomerulima skoro potpuno apsorbuju u tubulima, pa se u urinu nalaze samo u tragovima. Kako se azot unosi putem hrane najvećim delom u formi proteina, a kako je sa druge strane najveći deo ekskretovanog azota takođe poreklom iz proteina, balans između unetog i ekskretovanog azota daje dobar uvid u status proteina u organizmu. Balans azota definiše se kao razlika između količine azota unete hranom i količine koja se ekskretuje. Balans azota je pozitivan onda kada je unos azota veći od ekskrecije, što je slučaj uvek kada se stvara novo tkivo: u periodu rasta, u trudnoći, ili za vreme oporavka od različitih stanja sa negativnim balansom azota. Kod negativnog balansa azota, ekskrecija azota je veća od unosa. Ovo stanje, koje mora biti ograničenog trajanja, javlja se kod nedovoljnog unošenja proteina hranom (gladovanje, bolesti digestivnog trakta), u stanjima kod kojih postoji ubrzan katabolizam tkivnih proteina (febrilna stanja, infekcije, trauma i dr), ili kada je na neki način povećano gubljenje proteina iz organizma (laktacija uz neadekvatnu ishranu, albuminurija, "protein�losing enteropatije"). Nedovoljno unošenje esencijalnih aminokiselina takođe dovodi do negativnog azotnog balansa.
Obnavljanje proteina Koncentracija svakog tipa proteina u ćeliji zavisi od ravnoteže između njegove sinteze i razgradnje. Svi proteini u organizmu podležu konstantnom procesu obnavljanja, tj. degradacije i resinteze, čime se postiže više efekata. Pre svega, relativno brze promene koncentracije glavnih regulatomih enzima metaboličkih puteva, peptidnih hormona ili molekula receptora omogućuju metaboličku fleksibilnost ćelije. Obnavljanje proteina takođe štiti ćeliju od mogućeg nagomilavanja abnormalnih proteina. Konačno, procesi rasta i razvoja organizma zavise od pravovremene degradacije, kao i od sinteze. Brzine obnavljanja proteina znatno se razlikuju zavisno od funkcije proteina i vrste tkiva. Proteini koji imaju strukturnu ulogu u pravilu imaju dug poluživot. Tako naprimer, neki proteini vezivnog tkiva kao što je kolagen, često imaju poluživot koji se izražava u godinama. Naprotiv, poluživoti regulatomih enzima obično se izražavaju u minutima. Takođe, brže se obnavljaju proteini onih tkiva koja su izloženija spoljašnjim uticajima, što omogućuje ćelijama da se brže prilagode promenama okoline: poluživot proteina jetre i intestinalne mukoze iznosi oko 10 dana, Proteini plazme 15, a mišića oko 180 dana. Aktivna resinteza se odvija čak i za vreme perioda gladovanja, a razlaganje i za vreme perioda u kojem postoji azotna ravnoteža. Tkivni proteini se razlazu pod dejstvom intracelulamih proteaza, koje su lokalizovane u raznim delovima ćelije. To su citoplazmatični proteolitički enzimi kalpaini, koji se aktiviraju pod dejstvom Ca 2+ jona i lizozomalni katepsini. Danas se smatra da se "obeležavanje" molekula proteina koji je određen za degradaciju vrši kovalentnim vezivanjem nekoliko molekula ubikvitina, malog proteina koji se nalazi u citoplazmi i u jedru. Posle
Z. Jelić�lvanović: Proteini
3�5
aktivacije, ubikvitin se vezuje za e�amino grupe ostataka lizina proteina koji će se razgraditi, ali se ne razgrađuje zajedno sa proteinom već se regeneriše i po potrebi uključuje u novi ciklus degradacije proteina. Aminokiseline koje se oslobode degradacijom endogenih proteina, kao i aminokiseline poreklom iz proteina hrane, čine metabolički pool aminokiselina koji, zavisno od potreba organizma može da se usmeri ka kataboličkim ili anaboličkim putevima. Koncentracije slobodnih aminokiselina u ćelijama su mnogostruko veće u poređenju sa koncentracijama u plazmi.
Uticaj hormona na metabolizam proteina Metabolizam proteina regulisan je dejstvom nekih hormona, čiji efekti mogu da budu anabolički ili katabolički (Tabela 3�1). Dejstvo anaboličkih hormona ubrzava se sinteza proteina, balans azota je pozitivan, dolazi do sniženja koncentracije slobodnih aminokiselina i ureje u plazmi, a ekskrecija azota urinom je smanjena. Naprotiv, katabolički hormoni dovode do negativnog balansa azota i porasta nivoa ureje u plazmi i urinu. Hormon rasta ima izrazit anabolički efekat na metabolizam proteina. Njegov uticaj je najznačajniji u periodu rasta i razvoja, a ostvaruje se stimulacijom transkripcije DNK u jedru i translacije mRNK na ribozomima, kao i ubrzanjem transporta aminokiselina u ćelije. Androgeni su takođe anabolički hormoni: testosteron ima izrazit uticaj na biosintezu proteina, dok je dejstvo androsterona mnogo slabije. Glukokortikoidi inhibiraju anabolizam, a stimulišu katabolizam proteina u perifernim tkivima. Efekat na sintezu proteina ostvaruju dejstvom na svim nivoma toka informacije od DNK, preko mRNK do proteina a dovode i do usporavanja ulaska aminokiselina u ćelije perifernih tkiva. Ubrzana razgradnja mRNK i proteina u perifernim tkivima obezbeđuje dovoljno prekurzora glukoneogeneze, koju ovi hormoni stimulišu. U ćelijama jetre, glukokortikoidi ubrzavaju sintezu određenih proteina, pre svega enzima koji učestvuju u glukoneogenezi.
Tabela 3�1. Uticaj nekih hormona na metabolizam proteina Hormon Hormon rasta Androgeni
Dejstvo
Mehanizam
Stimulacija anabolizma
Ubrzana transkripcija DNK Ubrzana translacija mRNK Ubrzan ulazak aminokiselina
Stimulacija anabolizma Stimulacija katabolizma
Glukokortikoidi Inhibicija anabolizma
Stimulacija anabolizma
Insulin
Ubrzana razgradnja proteina Inhibicija transkripcije DNK Inhibicija translacije mRNK Usporen ulazak aminokiselina Ubrzana razgradnja mRNK Ubrzana transkripcija DNK Ubrzana translacija mRNK Ubrzan ulazak aminokiselina
Inhibicija katabolizma Tiroksin
Stimulacija anabolizma
Ubrzana transkripcija DNK
Glukagon
Inhibicija anabolizma
Usporena sinteza u jetri
|
3�6
Medicinska biohemija
Insulin ne utiče samo na metabolizam ugljenih hidrata, već i na metabolizam proteina i lipida. Pored toga što ubrzava transport aminokiselina u ćelije, insulin deluje i direktno na ubrzanje sinteze proteina tako što stimuliše transkripciju DNK u jedru i translaciju mRNK na ribozomima. Katabolizam proteina se pod dejstvom ovog hormona usporava. Insulin utiče na biosintezu ključnih enzima tako što ima sposobnost da reguliše (stimuliše ili inhibira) ekspresiju određenih gena i na taj način utiče na brzinu nekoliko metaboličkih puteva. Tako npr., fizološke koncentracije insulina imaju izrazito inhibitorno dejstvo na transkripciju gena za enzim fosfoenolpiruvat�karboksikinazu, koji je glavni regulatorni enzim glukoneogeneze. Inhibicijom glukoneogeneze, insulin "štedi" aminokiseline, odnosno proteine. Sem sinteze intracelularnih enzima, insulin reguliše i sintezu drugih specifičnih proteina sa različitim funkcijama (strukturni proteini, proteini koji se sekretuju iz ćelija itd). Tiroidni hormoni u fiziološkim dozama stimulišu sintezu proteina i značajni su za rast i razvoj organizma. Oni ostvaruju svoje dejstvo tako što ubrzavaju transkripciju DNK. Pod dejstvom ovih hormona, ubrzava se i transkripcija gena za hormon rasta, koji se tada ubrzano sintetiše. U veoma ' visokim, nefiziološkim koncentracijama, oni imaju katabolički efekat na metabolizam proteina. Glukagon je antagonist insulina ne samo u pogledu uloge koju ova dva hormona imaju u homeostazi glukoze, već i po svome dejstvu na metabolizam proteina: za razliku od insulina, glukagon usporava ugrađivanje aminokiselina u proteine.
PROTEINI TELESNIH TEČNOST! U ljudskom genomu sadržano je nekoliko desetina hiljada strukturnih gena koji određuju strukturu istog broja različitih vrsta proteina. Pomoću savremenih analitičkih metoda, u plazmi može da se identifikuje više od 300 različitih proteina. Neki od njih se nalaze u plazmi samo u određenoj fazi razvoja, ili pod određenim fiziološkim i patološkim okolnostima. Mnogi proteini su strukturni elementi ćelija ili tkiva, pa se mogu analizirati tek nakon oslobađanja iz odgovarajuće strukture nekom od metoda za solubilizaciju. Drugi se nalaze rastvoreni u intracelulamoj ili ekstracelularnoj tečnosti. Raznolikost proteina još više se povećava različitim posttranslacionim modifikacijama, koje utiču na funkciju proteina i njihovu podložnost degradaciji. Proteini nisu raznoliki samo po svom sastavu i strukturi, već i po funkciji, raspodeli u organizmu, kao i po koncentracijama u raznim telesnim tečnostima u zdravlju i bolestima. Za laboratorijska ispitivanja najpristupačniji su proteini krvi, urina, cerebrospinalne tečnosti, amnionske, peritonealne i pleuralne tečnosti, salive i fecesa.
Proteini plazme Proteini plazme imaju više različitih funkcija kao što su: nutritivna, transportna, zaštitna, puferska, uloga u održavanju koloidno�osmotskog pritiska, enzimska aktivnost ili inhibicija određenih enzima. Nutritivna funkcija. Razlaganjem proteina plazme mogu da se obezbede aminokiseline koje mogu da posluže kao supstrat za sintezu novih proteina, za glukoneogenezu ili za oksidaciju do ugljen�dioksida i vode pri čemu se oslobađa energija. Održavanje koloidno�osmotskog pritiska. Koloidno�osmotski pritisak proteina plazme suprotstavlja se hidrostatskom pritisku krvi, koji bi u suprotnom doveo do izlaska vode iz intravaskularnog prostora. Na taj način se održava stalna zapremina krvi u cirkulaciji. Koloidno� osmotski pritisak zavisi od broja proteinskih molekula, pa je utoliko veći ukoliko je sadržaj proteina veći a njegova relativna molekulska masa manja. Kako je albumin kvantitativno najzastupljeniji protein u plazmi, a njegova molekulska masa je relativno mala, ovaj protein je glavni nosilac koloidno�osmotskog pritiska plazme.
••*
Tabela 3 �2. Karakte ristike najznačajnijih proteina p lazme (Rl�referentni interval; Mr� relativna molekuls ka masa; t�1/2� poluživot)
�
Protein
Prealbumin Albumin
Rl(g/L)
Mr
ti/2
0,20�0,40
54 000
12 h
35�50
66 000
15�19 d
0,78�2,0 0,50�1,5 1,70�3,25 0,00003
55 000 40 000 200 000 69 000
4d 5d
0,30�2,15 1,25�4,10 0,20�0,50
85 000�1 000 000 800 000 160 000
2d 5d 4,5 d
2,0�3,5 0,50�1,15 0,60�1,55 0,10�0,40
77 000 57 000 ~3 000 000 206 000
7d
2,0�4,0 0,70�1,5 0,001�0,002
340 000 180 000 11 000
2,5 d
Koagulacija krvi � prekurzor fibrina Protein sistema komplementa Laki lanac HLA
5,25�16,5 0,40�3,1 0,25�3,1 <0,008
160 000 170 000 900 000 �120 000
24 d 6d 5d
Humoralni imunitet Površinski imunitet Humoralni imunitet (primarni odgovor) Protektivni protein
Funkcija Vezuj e tiro ksin ; transp ortuje vitami n A Onkotski pritisak; transport raznih metabolita i lekova; rezervoar aminokiselina
ai�Globulinska regija
ctrAntitripsin a^Kiseli glikoprotein a r Lipoprotein (apolipoprotein A) a r Fetoprotein a2 �Globulinska regija
Haptoglobin a2�Makroglobulin Ceruloplazmin
Inhibitor proteaza Funkcija nije sa sigurnošću utvrđena Transport lipida Protein fetalne plazme Vezu je hemo glob in u plazm i Inhibitor proteaza Oksidazna aktivnost, transport bakra, antioksidans �
ftrGlobulinska regija
Transferin Hemopeksin P�Lipoprotein (apolipop rotein B) C4 p2 �Globulinska regija
Fibrinogen C3 p2�Mikroglobulin
Transport gvožđa Vezuje hem Transport lipida Protein sistema komplementa
A�Glob ulins ka regija
IgG IgA IgM C�reaktivni protein
Tabela 3�2. Karakteristike najznačajnijih proteina plazme (Rl�referentni interval; Mr�relativna mo lekulska masa; ti/2� poluživot)
Protein Prealbumin Albumin
Funkcija
Rl(g/L)
Mr
ti/2
0,20�0,40
54 000
12 h
35�50
66 000
15�19 d
0,78�2,0 0,50�1,5 1,70�3,25 0,00003
55 000 40 000 200 000 69 000
4d 5d
Inhibitor proteaza Funkcija nije sa sigurnošću utvrđena Transport lipida Protein fetalne plazme
0,30�2,15 1,25�4,10 0,20�0,50
85 000�1 000 000 800 000 160 000
2d 5d
Vezu je hemo globi n u plazmi Inhibitor proteaza Oksidazna aktivnost, transport bakra, antioksidans
2,0�3,5 0,50�1,15 0,60�1,55 0,10�0,40
77 000 57 000 ~3 000 000 206 000
7d
2,0�4,0 0,70�1,5 0,001�0,002
340 000 180 000 11 000
2,5 d
Koagulacija krvi � prekurzor fibrina Protein sistema komplementa Laki lanac HLA
5,25�16,5 0,40�3,1 0,25�3,1 <0,008
160 000 170 000 900 000 �120 000
24 d
Humoralni imunitet Površinski imunitet Humoralni imunitet (primarni odgovor) Protektivni protein
Vezu je tiro ksin ; transp ortuje vitam in A Onkotski pritisak; transport raznih metabolita i lekova; rezervoar aminokiselina
a�rGlobulinska regija
a r An titri ps in a r Kiseli glikoprotein a r Lipoprotein (apolipoprotein A) c^�Fetoprotein a2 �Globulinska regija
Haptoglobin a2�Makroglobulin Ceruloplazmin
4,5 d
PrGlobulinska regija
Transferin Hemopeksin (3�Lipoprotein (apolipoprotein B) C4
Transport gvožđa Vezuje hem
Transport lipida Protein sistema komplementa
fc�Globulinska regija
Fibrinogen C3 (32�Mikroglobulin A�Glob ulins ka regija
IgG IgA IgM
C�reaktivni protein
6d 5d
Medicinska biohemija
3�8
Transport. Neki metaboliti, hormoni, lekovi i joni transportuju se putem krvi vezani za određene proteine plazme. Albumin učestvuje u transportu više različitih supstanci (masne kiseline, bilirubin, neki lekovi i joni), za razliku od drugih proteina koji imaju specifične transportne funkcije (npr. transferin transportuje gvožđe). Pomoću proteina plazme transportuju se hormoni (kortizol i tiroksin), lipidi, liposolubilni vitamini, joni metala i lekovi. Zaštitna funkcija. Imunoglobulini su antitela koja obezbeđuju odbranu organizma od infekcije. Sistem komplementa se takođe sastoji od proteinskih komponenti. Većina faktora koagulacije su proteinske prirode, kao i inhibitori koagulacije i komponente fibrinolitičkog sistema. Proteini koji se ubrzano sintetišu u inflamatomim reakcijama (proteini akutne faze, v. kasnije) takođe imaju određene protektivne funkcije u organizmu. Puferi. Proteini igraju određenu ulogu u održavanju pH krvi. Pri fiziološkom pH krvi oni su negativno naelektrisani i mogu da vezuju vodonikov jon. Enzimi i inhibitori. U plazmi je prisutan veliki broj različitih enzima. Neki od njih vrše svoju osnovnu fiziološku funkciju u samoj plazmi, dok su drugi poreklom iz ćelija ili drugih telesnih tečnosti. Neki proteini plazme imaju sposobnost da inhibiraju aktivnost određenih enzima (npr. ai�antitripsin, ai�antihimotripsin). Razdvajanjem proteina plazme elektroforezom n agaroznom gelu ili na celuloza�acetatu, dobija se šest frakcija: albuminska i pet globulinskih: a 1? a 2 , pi, |32 i Y (Slika 3�4). Ako se umesto plazme kao uzorak za analizu nanese serum, dobija se pet globulinskih frakcija, jer se na elektroferogramu serumskih proteina ne vidi p2 �globulinska frakcija. U Tabeli 3�2. prikazane su osnovne karakteristike najvažnijih proteina plazme.
f y
t
(3
t
a2
t Alh. . ai
Albumin
Slika 3�5. Frakcije proteina seruma izdvojene elektroforezom na agaroznom gelu.
Uobičajeni uzroci sniženja koncentracije bilo kojeg specifičnog proteina u plazmi su: (1) Smanjena sinteza, do koje dolazi bilo usled oštećenja funkcije jetre da sintetiše proteine, bilo usled nedostatka supstrata za sintezu (nedovoljna količina aminokiselina). Nedostatak aminokiselina može da bude posledica nedovoljnog unošenja proteina sa hranom ili poremećaja u njihovom varenju i apsorpciji. (2) Povećano gubljenje proteina putem bubrega (nefrotski sindrom), gastrointestinalnog trakta ("protein losing" enteropatije) ili preko kože (teški i obimni dermatiti ili opekotine). Najveće količine proteina se gube putem bubrega i gastrointestinalnog trakta. Koncentracija svakog proteina zavisi i od količine vode u plazmi, pa se kod hemokoncentracije javlja relativna hiperproteinemija, a kod hemodilucije relativna hipoproteinemija. Količine proteina u plazmi su normalne, ali su njihove koncentracije povećane, odnosno snižene i to u istoj meri za sve individualne proteine. Pored navedenih opštih poremećaja, u nekim stanjima se specifično snižava ili povećava koncentracija samo jednog ili nekoliko određenih proteina. Prealbumin i RBP. Prealbumin i RBP (Retinol Binding Protein � protein koji vezuje retinol) se sintetišu u hepatocitima, a elektroforetska pokretljivost im je veća od pokretljivosti albumina. Oba proteina imaju kratak poluživot, pa je njihovo određivanje u plazmi vrlo osetljiv pokazatelj malnutricije proteinima ili smanjene sposobnosti jetre da sintetiše proteine. U istu svrhu se mogu određivati i albumin ili transferin čija koncentracija u ovim stanjima takođe opada, ali je njihov poluživot duži, pa
Z. Jelić�lvanović: Proteini
3�9
je zato potrebno da protekne duže vreme od pojave poremećaja do sniženja koncentracije albumina i transferina u plazmi. Prealbumin i RBP su transportni proteini. Prealbumin vezuje tiroksin i trijodotironin. RBP, u kompleksu sa prealbuminom u odnosu 1:1, transportuje retinol (vitamin A). Pošto preda retinol ćelijama na korišćenje, ovaj kompleks se razlaže na svoje proteinske komponente. Glavni uzroci poremećaja koncentracije prealbumina i RBP u serumu su: Prealbumin Povećanje Sniženje RBP Povećanje (urin) Povećanje (serum) Sniženje
Hodgkin�ova bolest Inflamatorne reakcije, maligne bolesti Ciroza jetre, malnutricija proteinima Tubularna proteinurija Insuficijencija bubrega Oboljenja jetre, malnutricija proteinima Nedostatak cinka (potreban za sintezu)
Albumin. Albumin je kvantitativno najznačajniji protein plazme, koji sačinjava 40�60% ukupnih proteina. Sintetiše se u jetri, a brzina sinteze zavisi od njegove koncentracije u plazmi: snižena koncentracija ubrzava, a povećana inhibira sintezu. Normalno se u svim ekstravaskulamim tečnostima nalaze tragovi albumina. lako kroz glomerulami filter prolazi vrlo mala količina albumina u odnosu na njegovu visoku koncentraciju u plazmi, u toku 24 časa se profiltrira oko 3,6 g. Najveći deo filtriranog albumina reapsorbuje se u proksimalnim tubulima, gde se razlaže na aminokiseline, a u finalni urin dospeva samo minimalna količina ovog proteina. Poluživot albumina u plazmi je oko 15� 19 dana, a katabolizam se odvija u raznim tkivima pod dejstvom intracelulamih proteaza. Aminokiseline koje se na taj način oslobode mogu da posluže za sintezu drugih proteina. Koloidno�osmotski (onkotski) pritisak plazme je jedan od važnih faktora koji utiče na raspodelu vode između intra� i ekstravaskularnog prostora. Koncentracija albumina u plazmi ima presudan uticaj na onkotski pritisak zbog visoke koncentracije ovog proteina i njegove relativno niske molekulske mase (onkotski pritisak je koligativna osobina koja zavisi od broja čestica u jedinici zapremine). Ako se koncentracija albumina znatno snizi, voda iz intravaskulamog izlazi u intersticijalni prostor i dolazi do edema. Albumin ima i važnu transportnu funkciju, jer ima sposobnost da vezuje veći broj liganada. Npr., albumin vezuje nepolama jedinjenja kao što su bilirubin i dugolančane masne kiseline. On transportuje mnoge hormone: tiroksin, trijodotironin, kortizol i aldosteron, koji su u kompleksu sa albuminom neaktivni, a po potrebi mogu da se brzo mobilišu. Albumin transportuje i mnoge lekove (salicilate, fenilbutazon itd), kao i deo kalcijuma (oko 40% ukupne količine koja se nalazi u plazmi). Kako koncentracija albumina u plazmi zavisi od unošenja aminokiselina hranom, njeno određivanje se može koristiti kao parametar kojim se procenjuje nutricioni status. Promene koncentracije albumina utiču na odnos slobodnog (aktivnog) i vezanog (neaktivnog) oblika liganada koje transportuje. Na taj način, nivo albumina utiče na metabolizam bilirubina, kalcijuma i masnih kiselina, kao i na dejstvo hormona i lekova. Povećanje koncentracije albumina se javlja samo kod dehidratacije, kao relativna hiperalbuminemija. Naprotiv, sniženje koncentracije albumina se može javiti kod mnogih bolesti i stanja (Tabela 3�3).
3�10
Predavanja iz medicinske biohemije
Tabela 3�3. Glavni uzroci hipoalbuminemije.
Poremećaj
Stanja
Oboljenja jetre Malnutricija Malapsorpcija Ubrzan katabolizam Oštećenje tkiva Inflamacija Nefrotski sindrom Hronični glomerulonefritis Gubitak proteina Nefropatija u Diabetes mellitus�u Nefropatija kod Sistemskog eritemskog lupusa "Protein losing" enteropatije Teške opekotine Ascites (izlazak iz intravaskularnog prostora u Poremećaj distribucije peritonealnu tečnost)
Poremećaj sinteze
Alfa r antitripsin. Alfai�antitripsin (AAT) je glikoprotein koji deluje kao inhibitor proteaza, a sintetiše se u jetri, lako deluje na mnoge proteaze (tripsin, himotripsin, renin, kalikrein), njegovo glavno fiziološko dejstvo sastoji se u inhibiciji elastaze koja se oslobađa iz lizozoma polimorfonuk� learnih leukocita. Kako je AAT protein relativno male molekulske mase, on prolazi kroz kapilarni zid u tkivnu tečnost, vezuje proteazu u inaktivan kompleks i zatim se vraća natrag u cirkulaciju. Proteaza vezana za AAT može da se prenese na a2�makroglobulin koji kao veliki molekul ne može da prođe kroz kapilarni endotel. Ćelije retikuloendotelnog sistema uklanjaju kompleks proteaza�a2�makroglob� ulin iz cirkulacije i katabolizuju ga do aminokiselina. Antielastazna aktivnost AAT je najznačajnija u plućima, gde se udahnuta zrnca prašine i bakterije moraju stalno uklanjati dejstvom polimorfonukl� earnih leukocita. Pri fagocitozi stranih čestica, dolazi do izlivanja lizozomalne elastaze iz leukocita. Bez inhibitornog dejstva AAT, slobodna elastaza bi hidrolizovala elastin, značajan strukturni protein alveolarnog zida, koji daje alveolama elastičnost neophodnu za njihovo normalno funkcionisanje. AAT je genetski polimorfan protein, a normalan fenotip MM je najzastupljeniji u svim populacijama. Neke od njegovih varijanti karakterišu se niskim koncentracijama AAT u serumu: kod fenotipa Z vrednosti su drastično snižene, a umereno sniženje se nalazi kod osoba sa MZ i kod nas veoma retkim fenotipom S. Ako je nivo AAT u serumu nizak, biće snižena i njegova koncentracija u plućima. Antielastazna zaštita pluća osoba sa tim fenotipovima je neadekvatna, pa dolazi do propadanja elastina, destrukcije plućnog parenhima i razvoja teških emfizema. Isto tako, sekrecija Z varijante AAT iz hepatocita u cirkulaciju je poremećena, pa se agregati ovog proteina nagomilavaju u hepatocitima i mogu da izazovu teška oštećenja jetre kod dece i odraslih. Sem urođene deficijencije AAT, i drugi faktori mogu da prouzrokuju sniženje ili povećanje koncentracije AAT u serumu:
Snižena koncentracija
Respiratorni distres sindrom novorođenčadi Gubljenje proteina Urođena deficijencija
Povećana koncentracija
Inflamatorna reakcija Estrogeni (trudnoća, preparati sa estro� genima)
Alfa�pkiseli glikoprotein. Za razliku od ostalih proteina plazme, alfal�kiseli glikoprotein (AAG) ima vrlo nisku izoelektričnu tačku (2,7�3,5). U svojoj strukturi, ovaj glikoprotein sadrži veliku količinu ugljenih hidrata (oko 45%) i to heksoza, heksozamina i sijalinske kiseline. Fiziološka uloga ar kiselog glikoproteina nije još uvek sa sigurnošću utvrđena, ali se zna da on na neki način učestvuje u
Z. Jelić�lvanović: Proteini
3�11
inflamatomoj reakciji, lako je plazmatski AAG kod zdravih osoba poreklom isključivo iz jetre, utvrđeno je da i ćelije nekih tumora mogu da sintetišu ovaj protein. Određivanje koncentracije AAG kod pacijenata sa takvim tumorima može da posluži za praćenje razvoja bolesti i procenu efikasnosti terapije. AAG vezuje lidokain i propranolol, lekove koji se često koriste u terapiji infarkta miokarda. Porast koncentracije AAG u plazmi posle infarkta otežava adekvatno doziranje ovih lekova: doza data neposredno posle infarkta može da bude nedovoljna posle porasta nivoa AAG. Alfa^fetoprotein. Za vreme prvih 13 nedelja života fetusa, arfetoprotein (AFP) je glavni protein fetalne plazme. Genetski i strukturno je srodan albuminu. Maksimalna koncentracija AFP se dostiže oko 30. nedelje. Kako se ubrzava sinteza albumina, postepeno opada koncentracija AFP, pa je njegov sadržaj u plazmi novorođenčeta svega oko 50 mg/L. Posle 18 meseci starosti i dalje, vrednosti su još niže i normalno ne prelaze 2 ug/L. Određivanje koncentracije ovog proteina u amnionskoj tečnosti i cirkulaciji majke značajno je za dijagnostiku teških urođenih malformacija nervnog sistema (anencephalia i spina bifida), kod kojih se povećava koncentracija ovog proteina i u amnionskoj tečnosti i u serumu trudnice. AFP se određuje i kao tumor�marker kod hepatocelularnih karcinoma i karcinoma germinativnih ćelija. Spada u grupu onkofetalnih antigena � proteina koji se normalno sintetišu u fetalnom periodu, a čija koncentracija raste u serumu pacijenata sa malignim bolestima, kao rezultat reaktivacije gena prouzrokovane malignom transformacijom ćelija. Povećane vrednosti AFP se takođe javljaju kod drugih bolesti jetre kao što su hepatitis ili ciroza, ali su uobičajene vrednosti u ovim stanjima niže u poređenju sa koncentracijama koje se viđaju kod karcinoma. Haptoglobin. Haptoglobin je glikoprotein koji se sintetiše u jetri, a na elektroforegramu se izdvaja u a 2�globulinskoj frakciji. Molekul se sastoji od dva para polipeptidnih lanaca, a i p, povezanih disulfidnim vezama, pa se struktura tetramera obeležava sa a 2(32. Polipeptid a je genetski polimorfan i javlja se u dve forme: a1 i a2. Kombinacijom ovih varijanti oc�lanaca sa (3�lancem, nastaju tri fenotipa haptoglobina: HAP 1�1 (a12(32), HAP 2�1 (a1a2(32) i HAP 2�2 (a2 2 p 2 ). Fenotipovi koji sadrže a2� polipeptidni lanac (HAP 2�1 i HAP 2�2) imaju osobinu da stvaraju oligomerne forme sa većom relativnom molekulskom masom od one koju ima odgovarajući tetramer. Haptoglobin je reaktant akutne faze. Glavna funkcija haptoglobina je vezivanje slobodnog hemoglobina u plazmi, pri čemu svaki molekul haptoglobina može da veže dva molekula hemoglobina. Haptoglobin se vezuje za a� globinske lance hemoglobina A, F, S i C, dok methemoglobin, hem, ili neuobičajene forme hemoglobina koje u svojoj strukturi nemaju a�globinski lanac ne mogu vezati. Vezivanje hemoglobina za haptoglobin je ireverzibilno, a nastali kompleks se za nekoliko minuta uklanja iz plazme dejstvom ćelija retikuloendotelnog sistema. U ćelijama RES sistema kompleks se u toku nekoliko sati katabolizuje do aminokiselina i gvožđa. Na taj način, haptoglobin sprečava ekskreciju hemoglobina putem urina a time i gubljenje gvožđa sadržanog u njegovoj strukturi. Ukupna količina haptoglobina koja se nalazi u cirkulaciji može da veže oko 3 g hemoglobina. U toku samo jedne akutne epizode intravaskularne hemolize na ovaj način može da se utroši sav haptoglobin plazme, posle čega je potrebno oko nedelju dana da se u jetri sintetiše količina haptoglobina koja je dovoljna da se koncentracija u plazmi vrati na normalu. Alfa 2�makroglobulin. Najveći protein plazme po svojoj molekulskoj masi (625 000 do preko 800 000), zadržava se u intravaskulamom prostoru. Po svojoj strukturi je glikoprotein sa oko 8% sadržaja ugljenih hidrata. Sintetiše se u jetri i ćelijama relikuloendotelnog sistema, a poluživot u plazmi mu je 51/2 dana. Ima sposobnost vezivanja različitih molekula i jona, od kojih su najvažniji enzimi endopeptidaze: plazmin, pepsin, tripsin, himotripsin, katepsin D. Alfa 2�makroglobulin (AMG) ireverzibilno vezuje ove proteaze, ali pri tom ne inhibira u potpunosti njihovu enzimsku aktivnost. Međutim, stvoreni kompleks AMG sa enzimom se veoma brzo uklanja iz plazme dejstvom ćelija retikuloendotelnog sistema. Ima važnu ulogu u imunološkim i zapaljivim procesima, koja još uvek nije potpuno objašnjena. AMG nije protein akutne faze i njegovo određivanje nema veliki klinički značaj. Njegova koncentracija raste u nefrotskom sindromu: smatra se da povećanom sintezom AMG u jetri,
3�12
Predavanja iz medicinske biohemije
organizam pokušava da kompenzuje veliki gubitak albumina i pad onkotskog pritiska. Koncentracija ovog proteina raste i pod uticajem estrogena (trudnoća, preparati koji sadrže estrogene), a fiziološki je viša kod dece do 15 godina starosti. Povećane koncentracije AMG u plazmi nalaze se i kod nekih bolesti jetre, diabetes mellitus�a, atopijskog dermatitisa, defekata neuralne tube i Down�ovog sindroma. Ceruloplazmin. Ceruloplazmin je a 2�glikoprotein, čiji se molekul sastoji od jednog polipeptidnog lanca i 6 do 7 atoma bakra. Ne utiče bitno na intenzitet a2�globulinske frakcije, sem u slučaju kada je njegova koncentracija u plazmi izrazito povećana. Ceruloplazmin ima nekoliko funkcija. On pokazuje enzimsku aktivnost "feroksidaze": katalizuje oksidaciju Fe(ll) u Fe(lll), što omogućuje vezivanje gvožđa za transferin. Oko 95% od ukupne količine bakra koji cirkuliše u plazmi sadržano je u strukturi ceruloplazmina, koji služi kao stabilni pool bakra u netoksičnom obliku. Ćelije tkiva koja koriste bakar vrše endocitozu ceruloplazmina, koji potom mora da se razloži da bi se oslobodio bakar i iskoristio za sintezu određenih enzima. Ceruloplazmin deluje i kao antioksidans: on sprečava peroksidaciju lipida i stvaranje slobodnih radikala, pa se pretpostavlja da je to njegova uloga u reakciji akutne faze. Ceruloplazmin je kasni reaktant akutne faze, njegova koncentracija se povećava u infekcijama, malignim bolestima, traumi, a posebno u bolestima retikuloendotelnog sistema, kao npr. kod Hodgkin�ove bolesti. Takođe je povećan kod infekcije ili opstrukcije žučnih puteva. Međutim, određivanje ceruloplazmina ima najveći klinički značaj u dijagnostici VVilson�ove bolesti, gde je njegova koncentracija izrazito snižena. Međutim, oko 20% odraslih pacijenata sa Wilson�ovom bolešću imaju koncentraciju ceruloplazmina u serumu u granicama referentnih vrednosti, ali ne veću od 0,3 g/L. Vrednosti ceruloplazmina su snižene i kod malnutricije, malapsorpcije, nefroze i teških oboljenja jetre, naročito primarne bilijame ciroze. Transferin. Transferin je glikoprotein relativne molekulske mase 77000, koji se elektroforezom izdvaja u (3�globulinskoj regiji. Postoji najmanje 20 genetskih varijanti transferina, ali ovaj polimorfizam nije klinički značajan sa izuzetkom retkog naslednog poremećaja, atransferinemije. Transferin ima sposobnost da vezuje više različitih katjona, ali je jedino vezivanje gvožđa fiziološki značajno. Molekul transferina može da veže dva Fe(lll) jona i anjon, koji je u fiziološkim uslovima obično bikarbonat. Afinitet gvožđa prema transferinu opada pri nižim pH vrednostima. Transferin se sintetiše u jetri i u manjoj meri u ćelijama retikuloendotelnog sistema i nekim endokrinim žlezdama. Poluživot u plazmi mu je oko 7 dana. Koncentracija transferina u plazmi zavisi od raspoloživosti gvožđa: u nedostatku gvožđa, koncentracija transferina u plazmi raste, ali posle uspešne terapije gvožđem opada. Oko polovina ekstracelularnog transferina nalazi se u ekstravaskularnim tečnostima, kao što su limfa i cerebrospinalna tečnost. Transferin utiče na metabolizam gvožđa u ćeliji, naročito u ćelijama mukoze tankog creva. Transferin koji cirkuliše u plazmi, vezuje gvožđe oslobođeno katabolizmom hemoglobina ili apsorbovano iz digestivnog trakta i transportuje ga do mesta skladištenja (jetra i retikuloendotelni sistem, gde se gvožđe skladišti u obliku feritina i hemosiderina) i do ćelija koje koriste gvožđe za sintezu hemoglobina, mioglobina ili citohroma. Ćelije koje brzo proliferišu imaju površinske receptore za kompleks transferin�gvožđe. Posle vezivanja za receptor, oslobađa se gvožđe koje preuzima ćelija, dok se apotransferin oslobađa i vraća u plazmu gde može ponovo da vrši svoju funkciju transportnog proteina. Pod normalnim uslovima, oko 1/3 transferina je zasićena gvožđem, dok je preostala količina slobodna. Određivanje koncentracije transferina je veoma korisno u diferencijalnoj dijagnostici anemija, kao i u praćenju terapije. Kod hipohromne anemije se nalaze povećane koncentracije transferina, što je posledica ubrzane sinteze. Međutim, kako je koncentracija gvožđa snižena, niži je i procenat zasićenja transferina gvožđem. Naprotiv, ako je anemija prouzrokovana poremećajem u ugradnji gvožđa u eritrocite, koncentracija transferina je snižena ili normalna, ali je stepen zasićenja visok. Transferin je negativni reaktant akutne faze, pa se snižene koncentracije nalaze kod inflamatomih procesa i malignih bolesti. Isto tako, nivo transferina je nespecifično snižen i kod malnutricije, hroničnih oboljenja jetre, kao i kod stanja praćenih gubitkom proteina, kao što je npr. nefrotski sindrom. Nivo transferina raste pod uticajem estrogena � u trudnoći i za vreme uzimanja preparata
3�14
Predavanja iz medicinske biohemije
Mesto
Mesto
vez iva nja
vezi vanja
antigena
antigena
Regioni od kojih zavisi komplementarnost
"ooe Slika 3�5. Šematski prikaz strukture molekula humanog imunoglobulina G. V označava va ri ja bi ln i re gi on , a C � ko ns ta nt ni re gi on .
Jedan par identičnih polipeptidnih lanaca ima oko dva puta veću molekulsku masu od drugog para. Lanci veće molekulske težine označeni su kao teški (H) lanci (engl. heavy), dok su lanci manje molekulske težine označeni kao laki (L) lanci (engl. light). Svaki polipeptidni lanac ima jedan aminoterminalni � varijabilni region (V) i jedan karboksiterminalni � konstantni (C) region. Deo molekula imunoglobulina koji vezuje antigen oblikuje vrlo mali broj aminokiselina V regiona H i L lanaca. Ove su aminokiseline dovedene u bliski dodir presavijanjem V regiona. Ostale aktivnosti imunoglobulina su vezane za konstantni C region teških lanaca. Svi L lanci imaju molekulsku masu od oko 23000, a mogu se svrstati u dva tipa: K i X. Ova podela izvršena je na osnovu višestrukih strukturnih razlika u konstantnim regionima. Odnos između zastupljenosti K i X lanaca u imunoglobulinima različit je u različitim vrstama, a kod čoveka je taj odnos 2:1. Dati molekul imunoglobulina uvek sadrži istovetne K ili X lance, a nikada mešavinu oba tipa lanaca. Postoji pet klasa H lanaca koji se međusobno razlikuju po strukturi konstantnih regiona, a označeni su kao: y, a, \i, 8 i s. Klasa teškog lanca određuje klasu imunoglobulina. Shodno tome, postoje sledeće klase imunoglobulina: IgG, IgA, IgM, IgD i IgE. Većina H lanca je takođe podeljena na potklase na osnovu seroloških ili fizičko�hemijskih razlika konstantnih regiona, na primer: y lanac ima četiri potklase koje kod čoveka daju lgG1, lgG2, lgG3 i lgG4. Što se tiče L lanaca, nema potklasa K lanca u odnosu na C region, ali zato kod čoveka postoje četiri posebna oblika X lanca (podtipovi). Sposobnost vezivanja antigena nalazi se na Fab fragmentima � tj. na V H i VL domenima, dok je većina sekundarnih bioloških aktivnosti imunoglobulina (npr. fiksacija komplementa) povezana sa Fc fragmentima. Molekuli antitela su krajnje heterogeni što se može i očekivati ako se ima u vidu njihova izuzetna raznolikost u odnosu na vezivanje antigena kao i njihove različite biološke aktivnosti. Ako se uporede koncentracije različitih klasa imunoglobulina u plazmi, vidi se da su najzastupljeniji IgG, zatim IgM, pa IgA (Tabela 3�2), dok se IgD i E nalaze u plazmi u vrlo niskim
3�15
Z. Jelić�lvanović: Proteini
koncentracijama. U toku fetalnog razvoja, najpre počinje da se sintetiše IgM, Zatim IgG, pa IgA, koji kod dece najkasnije dostiže koncentraciju kakvu nalazimo kod odraslih osoba (Slika 3�6).
•v © ©
c
x >
> "c on
CL
5
7.5
Gesiaeija (mesed)
Rođjenj«
Starost (cjođtne)
Slika 3�6. Nivo glavnih klasa imunoglobulina u fetalnoj cirkulaciji za vreme gestacije i u toku prve godine života deteta. Isprekidanom linijom obeležen je maternalni IgG koji dospeva u fetalnu cirkulaciju preko placente. Sniženje koncentracije imunoglobulina može da bude primarno (retko) ili sekundarno (češće). Primarna deficijencija nastaje usled nekog defekta u stvaranju antitela, a može da bude: • generalizovana (sve klase imunoglobulina), ili • selektivna (pojedine klase ili kombinacije više klasa). Sekundarna deficijencija može da bude posledica: • poremećaja stvaranja imunoglobulina (limfoidni maligniteti; toksične reakcije: insuficijencija bubrega, diabetes mellitus; lekovi: fenitoin, penicilamin; prolazno zakašnjenje početka sinteze Ig kod prevremeno rođene dece) • gubitka imunoglobulina putem bubrega (nefrotski sindrom), gastrointestinalnog trakta (protein�losing enteropatije), ili preko kože (teške opekotine). Povećanje koncentracije imunoglobulina može da bude poliklonskog ili monoklonskog tipa. Povećanje poliklonskih imunoglobulina predstavlja normalan odgovor organizma na infekciju. Kod različitih stanja dolazi do karakterističnog porasta određenih klasa imunoglobulina: • Infekcije: o Kožne, crevne, respiratorne i bubrežne � predominira IgA o Virusne infekcije, malarija � predominira IgM o Hronične bakterijske infekcije � svi Ig o Intrauterine infekcije � povećan IgM u krvi pupčanika • Autoimune reakcije � predominira IgG • Oboljenja jetre: o Primarna bilijarna ciroza � izrazit porast IgM o Hronični aktivni hepatitis � povećan IgG i ponekad IgM o Portalna ciroza � IgA i ponekad IgG • Alergijske reakcije � povećanje IgE.
3�16
Predavanja iz medicinske biohemije
U monoklonskim hiperimunoglobulinemijama (paraproteinemijama) nagomilavaju se paraproteini, koji po svojoj strukturi mogu da budu: • Monomeri imunoglobulina • Fragmenti Ig o Laki lanci (Bence�Jones�ovi proteini) � češće o Teški lanci � retko • Polovine molekula Ig (jedan teški i jedan laki lanac) � retko Uzroci nagomilavanja monoklonskih imunoglobulina su: • Multipli mijelom (u oko 60% slučajeva) • Druga stanja sa povećanim stvaranjem B limfocita u limfnim čvorovima: limfomi, hronicna limfocitna leukemija, Waldenstrom�ova makroglobulinemija ili bolest teških lanaca (oko 15% slučajeva) • Benigna paraproteinemija (oko 25% slučajeva) Izgled elektroforegrama proteina seruma kod pacijenata sa poliklonskom hiperimunoglobulinemijom razlikuje se od elektroforegrama kod monoklonske hiperimunoglobulinemije (Slika 3�7). Dok se u prvom slučaju vidi difuzna y�globulinska regija povećanog intenziteta, u drugom slučaju se uočava oštra frakcija monoklonskog imunoglobulina (molekuli identične strukture).
Slika 3�7. Izgled elektroferograma proteina seruma (odozgo na dole): normalan nivo imunoglobulina, poliklonska hiperimunoglobulinemija, monoklonska hiperimunoglobulinemija.
Proteini u urinu U glomerulima dolazi do ultrafiltracije proteina plazme kroz glomerularnu membranu, pri čemu se najveći deo proteina zadržava u plazmi. Vrsta i količina proteina koji prelaze u primarni filtrat zavise od veličine molekula proteina i njegove koncentracije u plazmi. Što je molekul manji, a njegova koncentracija u plazmi veća, to će veća količina proteina dospeti u filtrat. IgM (Mp = 900000) se zbog toga praktično ne filtrira; albumin (Mp = 66000, visoka koncentracija u plazmi) prolazi u minimalnoj količini, od koje se najveći deo reapsorbuje i katabolizuje u tubulima; mali proteini (Mr 15000�40000) prolaze kroz glomerularnu membranu i reapsorbuju se i razlazu u tubulima. Normalno se urinom izluči od 20 do 150 mg/d, a tu količinu čine prvenstveno albumin (oko 60% filtrirane količine) i Tamm�Horsfall�ov protein (uromukoid). Pod pojmom proteinurija podrazumeva se povećana ekskrecija proteina urinom. Razlikujemo sledeća četiri osnovna tipa proteinurije: 1. Glomerularna 2. Tubulama 3. Prerenalna
Z. Jelić�lvanović: Proteini
3�17
4. Postrenalna Glomerularna proteinurija je posledica povećane permeabilnosti glomerulame membrane, a količina ekskretovanih proteina može da bude veoma velika. Zavisno od stepena oštećenja, razliku jemo: • selektivnu proteinuriju (veći molekuli se zadržavaju, u urinu se nalazi prvenstveno albumin) • neselektivnu proteinuriju (veće oštećenje glomerulame membrane, koja postaje propustljiva za sve proteine � u urinu se pored albumina nalaze i proteini velike molekulske mase, kao npr IgG). Glomerularna proteinurija se javlja: • Zbog oštećenja permeabilnosti glomerula u sistemskim bolestima Diabetes mellitus
•
•
Sistemski eritemski lupus Multipli mijelom Funkcionalna (benigna) proteinurija o Promena protoka krvi kroz bubrege o Vežbanje, pireksija, izlaganje hladnoći, hipertenzija, arterioskleroza Ortostatska proteinurija (obično prolazna, može da se javi i u trudnoći)
Tubularna proteinurija javlja se zbog smanjena sposobnosti tubula da reapsorbuju proteine. Proteini male molekulske mase se zbog toga u povećanoj količini ekskretuju putem urina ([J2 � mikroglobulin, a1�mikroglobulin, RBP, lizozim, a1�kiseli glikoprotein). Može da bude akutna (npr. kod opekotina, akutnog pankreatitisa, pod dejstvom nekih nefrotoksičnih lekova) ili hronična (Fanconi�ev sindrom, hronicni pijelonefritis, ciroza, sarkoidoza, lekovi, toksične materije). Ekskrecija proteina je u pravilu manja od 1500 mg/d. Čisto tubularna proteinurija se rede javlja, a mnogo češće kao mešovita (glomerulamo�tubularna) proteinurija, kod koje gubitak proteina može da bude znatno veći. Prerenalna proteinurija nastaje onda kada se u plazmi pojavi neki protein koji prolazi kroz glomerule. Npr. kod intravaskularne hemolize, hemoglobin se iz eritrocita oslobađa u plazmu, pa dolazi do hemoglobinurije. Drugi primeri proteinurije ovog tipa su mioglobinurija ili Bence�Jones�ova proteinurija. Postrenalna proteinurija se javlja kod zapaljivih i malignih procesa u urinarnom traktu distalno od bubrega.
Poglavlje 4. Lipidi
NORMALAN METABOLIZAM LIPIDA Uloga lipida u organizmu Lipidi imaju više funkcija u organizmu. (1) Lipidi predstavljaju najveći energetski depo u organizmu, pri čemu u toj funkciji lipida prednjače trigliceridi. (2) Druga važna uloga lipida je da su strukturni elementi ćelijske membrane. Fosfolipidi čine osnovu strukture lipidnog dvosloja u kome se nalaze još i glikolipidi i inkorporiran holesterol. Pored te strukturne funkcije u ćelijskoj membrani posebnu ulogu imaju fosfolipidi i sfingolipidi u građi nervnih ćelija i prenosu nervnih impulsa. (3) Lipidi imaju ulogu hormona poput steroidnih hormona i prostaglandina koji imaju ulogu lokalnih medijatora (Slika 4�1). U lipide spadaju i liposolubilni vitamini poput: vitamina A, D, E i K. Holesterol služi za sintezu žučnih kiselina koje su neophodne za varenje i apsorpciju lipida, a to je ujedno i put eliminacije viška holes� terola.
LIPIDI i Energetski depo I
Strukturni elem enti I
Specija lne funkcije
Slika 4�1. Uloga lipida u humanom organizmu.
4�2
Medicinska biohemija
Sastav lipida u ishrani
Normalna ishrana ljudi podrazumeva sledeći procentualni unos hranljivih materija: 40 % masti, 48 % ugljenih hidrata i 12 % proteina. Ovi odnosi ukazuju na veliki sadržaj masti u normalnoj ishrani pri čemu je prosečni unos masti 50 do 100 g dnevno. Lipidi uneti hranom su najvećim delom triglice� ridi (98�99 %) pri čemu je najveći udeo masnih kiselina (92�95 %), a ostatak je glicerol. Preostali uneti deo lipida sačinjavaju: holesterol, fosfolipidi, digliceridi, monogliceridi, liposolubilni vitamini, steroidi, terpeni. itd. U sastav triglicerida ulaze i zasićene i nezasićene masne kiseline. Putem hrane u vidu triglicerida unose se i esencijalne masne kiseline koje organizam ne može da sintetiše, a koje su neophodne za funkciju organizma i u koje spadaju: linolna, linolenska i arahidonska kiselina.
Varenje i apsorpcija lipida Apsorpcija lipida se odvija u tri faze: (1) intraluminalna ili faza varenja u kojoj dolazi do hemijske i fizičke modifikacije unetih lipida pre apsorpcije; (2) celulama ili apsorptivna faza u kojoj svareni materijal ulazi u intestinalne mukozne ćelije i u njima dolazi do remodifikacije svarenih lipida u postapsorp� tivnu formu; (3) transportna faza u kojoj se apsorbovani lipidi prenose iz mukoznih ćelija u druga tkiva putem limfe ili krvi. 1. Intraluminalna faza ili faza varenja Varenje masti započinje još u želucu gde dolazi do mehaničke emulzifikacije i delovanja ekstra� hepatične lipaze. Lipaza u želucu je kiselo stabilna i smatra se da uglavnom potiče iz lingvinalnih žle� zda (lingvinalna lipaza). Varenje lipida se u želucu odvija vrlo sporo jer lipidi još uvek nisu u potpunosti emulgovani, a i enzim lipaza isključivo deluje na međusloju lipid�voda. Molekuli triglicerida sa masnim kiselinama kratke ili srednje dužine lanaca (prisutne u mleku) razlazu se dejstvom želudačne lipaze. Ovaj enzim je aktivan isključivo pri neutralnom pH tako da je vrlo ograničeno njeno delovanje u želucu odraslih jer je pH nizak. Kod dece pH želuca je blizu neutralnog, a pošto se ishrana prvenstveno bazira na lipidima mleka, želudačna lipaza ima značajnu ulogu u varenju lipida. Kod odraslih nema varenja lipida u ustima i želucu tako da oni uglavnom nepromenjeni dospevaju do tankog cre� va. Masti se najvećim delom vare u intestinumu delovanjem enzima, pankreasa (prevashodno lipa� zom) i intestinuma, kao i delovanjem žučnih soli. Lipidi su nerastvomi u vodi i njihovo razlaganje pre vashodno triglicerida se dešava na površini lipidnih micela � zapravo na međusloju lipidnih micela i vodenog sloja koji ga okružuje. Emulzifikacija povećava površinu lipidnih kapi tako da enzimi deluju efikasnije. Proces emulgovanja omogućen je sa dva komplementarna mehanizma: korišćenjem emulgatorskih osobina žučnih soli i mehaničkim pokretima creva u vidu peristaltike. Žučne soli, deri vati holesterola se luče putem žuči i vrše emulzifikaciju lipida iz hrane zahvaljujući tome što su to po vršinski aktivne supstance koje grade micele sa lipidima veličine od 1 um. Ovi emulgatori intereaguju sa lipidnim česticama i vodenim sadržajem duodenuma, stabilišu male čestice i sprečavaju njihovo spajanje. Na ove čestice sada deluju enzimi. Trigliceridi, estri holesterola i fosfolipidi enzimski se hidrolizuju dejstvom uglavnom pankreasnih enzima čija je sekrecija hormonski kontrolisana. Stimulans za lučenje hormona je prisustvo hrane i to su: holecistokinin�pankreozimin i sekretin. • Pankreozimin�holecistokinin Prisustvo lipida i parcijalno razloženih proteina iz hrane stimuliše ćelije jejunuma i donjeg duodenuma da luče mali peptidni hormon holecistokinin�pankreozimin. Ovaj hormon ima dvostruko dejstvo: (a) na žučnu kesu � dovodi do kontrakcije i oslobađanja žuči i (b) na acinarne ćelije pankreasa � oslobađa enzime. Ovaj hormon ima i druge funkcije, između ostalog i to da dovodi do usporavanja oslobađanja sadržaja želuca u tanko crevo. • Sekretin je peptidni hormon koga luče ćelije intestinuma, kao odgovor na nizak pH. Sekretin deluje na pankreas i uslovljava lučenje velike količine pankreasnog soka bogatog bikarbonatima ko ji neutrališe pH intestinalnog sadržaja, tako da se postiže optimalni pH za dejstvo enzima.
4�3
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
Molekuli triacilglicerola (triglicerida) su suviše veliki da bi se efikasno preuzeli od strane mukoz� nih ćelija intestinalnih resica. Zato se ove velike molekule parcijalno razlazu. U lumenu creva triglice� ridi se razlazu postepeno delovanjem pankreasne lipaze. Najpre nastaju 1,2�digliceridi, a daljim dejstvom ove lipaze 2�monogliceridi i masne kiseline. Samo mali procenat triglicerida se potpuno razlaže do slobodnih masnih kiselina i glicerola. Lipaza ne deluje na 2�monogliceride već se najpre vrši pre� meštanje acil grupe sa položaja 2 na 1 dejstvom izomeraze da bi na kraju opet delovala lipaza (Slika 4�2). Delovanjem lipaze stvara se 75% 2�monoglicerida, 5% 1�monoglicerida i 1,2�diglicerida i 20 % glicerola i masnih kiselina. • Pankreasna triacilglicerol lipaza Lipaza
Trigliceridi
>
1,2�diglicerid + MK
Lipaza
1,2�diglicerid
> 2�monoglicerid + MK Izomeraza 2�monoglicerid > 1�monoglicerid
1�monoglicerid
Lipaza
>
glicerol + MK
Slika 4�2. Hidroliza triacilglicerola u tankom crevu pankreasnom lipazom. Pankreasna lipaza za svoju katalitičku aktivnost zahteva prisustvo kolipaze i žučnih kiselina. Žučne kiseline imaju značajnu ulogu u solubilizaciji lipida jer su to amfipatična jedinjenja koja sadrže hi� drofobno steroidno jezgro i polarne karboksilne i hidroksilne grupe. Za katalitičku aktivnost pankreasne lipaze neophodno je prisustvo kolipaze, proteina koji gradi kompleks sa lipazom u odnosu 1:1. Enzimska aktivnost lipaze značajno se povećava na međusloju lipid�voda (interfascijalna aktivacija). Solubilizaciju triacilglicerola omogućavaju prisutne žučne kiseline i fosfolipidi iz žuči koji su isto tako neophodni za dejstvo pankreasne lipaze. Aktivno mesto lipaze nalazi se bliže N�terminalnom delu proteina i ono je zaklonjeno jednim heliksom kao poklopcem. Vezivanje kolipaze za lipazu i prisustvo micela formiranih od lipida i žučnih soli dovodi do konformacionih promena i eksponiranja aktivnog centra. Stvoreni kompleks lipaza�kolipaza stabiliše otvorenu konformaciju aktivnog centra enzima Ove strukturne promene stvaraju hidrofobnu površinu oko ulaza u aktivno mesto što je preduslov ka� talitičkog dejstva lipaze. Estri holesterola se hidrolizuju dejstvom pankreasne holesterol�esteraze na holesterol i masne kiseline. Fosfolipidi se hidrolizuje dejstvom pankreasne fosfolipaze A 2 koja hidrolizuje acil� ostatak na C2 i nastaje lizofosfolipid koji isto tako ima ulogu emulgatora u procesu varenja (Slika 4�3). fosfolipaza A1
O
|o ^�oi�C�R,
f l
2I
f V
V�C— O— CH 3, 3
H
f "*��OH
O
^
ĆH2�0�P�0�X
7
�^
fosfolipaza A2
o CH2�0�£�Rl I
*� H—0—CH < j;H
L \ \
0
fosfolipaza C
fosfolipaza D
Fosfolipid
O 0
_ ] L 0 _ X
l o "
Lizofosfolipid
Slika 4�3. Hidroliza fosfolipida fosfolipazom A 2. Fosfolipaza A2 kao i pankreasna lipaza katalizuje enzimsku reakciju na međusloju voda�lipid. Mehanizam međuslojne aktivacije fosfolipaze je drugačiji od mehanizma lipaze jer ne dolazi do pro�
4�4
Medicinska biohemija
mene konformacije enzima. Fosfolipaza A2 sadrži hidrofobni kanal koji omogućava direktan kontakt supstrata fosfolipida u miceli i enzima. Mehanizam dejstva fosfolipaze uključuje i kalcijumove jone koji su neophodni za stabilizaciju intermedijera u ovoj enzimskoj reakciji. 2. Faza apsorpcije lipida ili celulama faza Mešavina masnih kiselina, mono i diglicerida koji nastaju u toku varenja lipida apsorbuju se pomoću ćelija koje oblažu tanko crevo (intestinalna mukoza) u procesu koji je olakšan žučnim kiselinama. Micele formirane sa žučnim kiselinama preuzimaju nepolarne lipidne degradacione produkte i tako omogućavaju njihov transport kroz vodeni nepromešani sloj koji oblaže intestinalni zid (vidi Sliku 4�4). Važnost ovog procesa se vidi kod osoba sa opstrukcijom žučnih puteva. One apsorbuju vrlo malo unetih lipida i pre ih eliminišu putem fecesa u hidrolizovanoj formi (steatoreja). Žučne kiseline ne pomažu samo varenje već su esencijalne i za apsorpciju svarenih lipida. Žučne kiseline su potrebne za efikasnu intestinalnu apsorpciju i liposolubilnih vitamina.
Slika 4�4. Apsorpcija lipida u crevima. (TG � trigliceridi; MG � monogliceridi; FL � fosfolipidi; MK � masne kiseline; AK � aminokiseline; ŽK � žučne kiseline; H � holesterol; HE � estri holesterola) Unutar intestinalnih ćelija, masne kiseline stvaraju komplekse sa proteinom koji vezuje intestinal� ne masne kiseline (l�FABP fatty acid binding protein), citoplazmatičnim proteinom, koji služi da po veća efektivnu rastvorljivost ovih u vodi nerastvorljivih supstanci i isto tako da zaštiti ćeliju od njiho vog dejstva kao deterdženta (masne kiseline stvaraju sapune). Masne kiseline dugih lanaca služe za resintezu triglicerida. Postoje dva osnovna puta resinteze triglicerida u enterocitima (vidi Opštu biohemiju): a) monogliceridni put U ovoj biosintezi dolazi do acilacije monoglicerida apsorbovanih iz GIT. b) a�glicerofosfatni put
4�5
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
Masne kiseline sa srednjim i kratkim lancima direktno prelaze u krvotok i vezuju se za albumin. Ovako vezane masne kiseline dospevaju do jetre portalnim krvotokom. U enterocitima dolazi do formiranja hilomikronskih čestica koje se sastoje iz resintetisanih egzogenih triglicerida, holesterola i odgovarajućih apolipoproteina (apo B�48, A�l, A�ll, C�l, C�ll, C�lll i male količine apo E). Apolipoprote� ini se sintetišu u endoplazmatičnom retikulumu, a u Goldžijevom kompleksu se stvaraju hilomikroni. 3. Faza transporta Hilomikroni reverznom pinocitozom iz enterocita prelaze u limfne sudove abdomena i potom transportuju do sistemske cirkulacije gde se dalje odvija metabolizam ovih čestica što će biti detaljno opisano u poglavlju o lipoproteinima. Hilomikroni ostaju u cirkulaciji nekoliko sati posle obroka. Hilomikroni su dosta velike čestice i prelamaju svetlost tako da plazma dobija mlečan izgled.
Trigliceridi Trigliceridi su glavni depo energije u organizmu i njihova primarna funkcija je da obezbede potrebnu energiju. Visoka energetska vrednost triglicerida, pre svega u adipoznom tkivu, proističe iz sadržaja masnih kiselina i oslobođene energije njihovom oksidacijom. Trigliceridi su nerastvorni u vodi i u plazmi se transportuju u vidu lipoproteinskih čestica. Kao hidrofobne supstance trigliceridi su inkorporirani u jezgro ovih čestica. Sinteza triglicerida odvija se u jetri, adipoznom tkivu i intestinumu. Prekurzori i metabolički putevi u ovim organima se delimično razlikuju. U intestinumu, tj. enterocitima resintetišu se egzogeni trigliceridi iz apsorbovanih monoglicerida koji potiču iz hrane i aktiviranih masnih kiselina. Trigliceridi u plazmi mogu biti egzogeni i oni se resintetisani u enterocitima iz gastrointestinalnog trakta transportu ju u limfu pa u cirkulaciju kao lipoproteinske čestice hilomikroni. U plazmi se nalaze i endogeni trigliceridi sintetisani u jetri iz glicerola i masnih kiselina i inkorporirani u lipoproteinske čestice VLDL. Masne kiseline u endogenim trigliceridima potiču iz hrane ili su sintetisane u jetri i adipoznom tkivu. Poreklo masnih kiselina u trigliceridima zavise od individualnog nutricionog statusa. Kod gladovanja masne kiseline se preuzimaju iz adipoznog tkiva i prelaze u jetru, a u stanju posle obroka ugljeni hid� rati se u jetri konvertuju u trigliceride. Veličina i gustina lipoproteinskih čestica zavisi od sadržaja triglicerida u njima i uglavnom je odraz unete hrane. Katabolizam triglicerida i njihovo uklanjanje iz lipoproteinskih čestica u cirkulaciji vezano je za dejstvo enzima lipoproteinske lipaze (LPL) na endotelu krvnih sudova. Dejstvo druge lipaze koja se nalazi u adipoznom tkivu zavisna je od energetskog bilansa u organizmu (Slika 4�5). U stanju energetskog viška masne kiseline preuzima adipozno tkivo i one se rekonvertuju u intracelulame triglice�
Deponovanje
^
c�r>1
Mobilizacija Kapilari
Hilomikroni, VLDL Masne kiseline vezane za albumin Adrenalin + _ Noradrenalin Slobodne "v y ^ Glukagon TSH, masne kiseline *\ hormon rasta / HSL Trigliceridi
_
Insulin
Adipocit
Slika 4�5. Mobilizacija i deponovanje triglicerida.
4�6
Medicinska biohemija
riđe gde predstavljaju najveći depo energije. U slučaju gladovanja i nedostatka energije dolazi do mobilizacije masnih kiselina iz adipoznog tkiva dejstvom hormon�senzitivne lipaze (HSLj čime se tki vima obezbeđuje potrebna energija oksidacijom masnih kiselina. Oslobođene masne kiseline iz adipoznog tkiva najviše se usmeravaju ka mišićnom tkivu koje ima i najveće zahteve za energijom. U slučaju povećanih potreba za energijom i VLDL čestice se više usmeravaju ka mišićnom tkivu. Proces deponovanja i mobilizacije masnih kiselina u adipoznom tkivu zavisi pre svega od aktivnosti lipaze u tom tkivu. Konverzija intracelularne lipaze iz aktivne u neaktivnu formu pod uticajem je nekoliko hormona i zato se naziva hormon�senzitivna lipaza (HSL). Hormoni glukagon, adrenalin, noradrena� lin, adrenokortikotropin, TSH i hormon rasta aktiviraju ovaj enzim, a insulin inhibira.
Holesterol Holesterol je lipidna komponenta, steroidne strukture koja od svih lipidnih komponenti u medicini ima najveći značaj. Holesterol je neophodan za normalnu funkciju ćelije i čitavog organizma sa jedne strane, ali isto tako prekomerna akumulacija holesterola u organizmu je štetna. Holesterol je atero� gena supstanca jer se on direktno taloži u ćelijama subendotelnog prostora koronarnih arterija, cere� brovaskularnih sudova i perifernih sudova i dovodi do aterosklerotskih pramena. Holesterol ima više funkcija u organizmu: 1. Ulazi u sastav plazma membrane ćelije i subcelularnih organela; 2. Prekurzor je u sintezi žučnih kiselina; 3. Prekurzor je svih steroidnih hormona (polnih hormona i hormona nadbubrežnih žlezda). Normalan metabolizam holesterola podrazumeva da se u organizmu unosi i sintetiše holesterola koliko je organizmu potrebno. Brojni su regulatomi mehanizmi u održavanju potrebnog nivoa holesterola u organizmu, ali isto tako postoje i brojni faktori rizika za aterosklerozu koji dovode do akumulacije holesterola i stvaranja aterosklerotskih plakova. Organizam obezbeđuje potreban holesterol na dva načina: unosom putem hrane i endogenom sintezom. Ukupna količina dnevno potrebnog holesterola 1 g. Odnos apsorbovanog i sintetisanog holesterola varira, ali smatra se da se više sintetiše (60�80 %) u organizmu nego što se apsorbuje. Količina apsorbovanog holesterola iz hrane varira i podleže samoregulaciji. Apsorpcija holesterola pod� leže individualnoj varijaciji tako da je i ishranom indukovana hiperholesterolemija dosta podložna varijaciji. Glavni put eliminacije holesterola je putem žuči: kao holesterol ili u vidu žučnih kiselina, a potom fecesom. Nivo holesterola u organizmu se ne može protumačiti jednostavnim procesom apsorpcije, endogene sinteze i eliminacije putem žuči. Mehanizmi održavanja nivoa holesterola u plazmi re� flektuju procese sinteze lipoproteina nosilaca holesterola i efikasnost receptorskog puta metabolizma ovih lipoproteina. Holesterol se sintetiše u svim tkivima u organizmu, ali najviše u jetri i intestinumu. Prekurzor u sintezi holesterola je acetil�KoA. Sinteza holesterola se odvija u više stupnjeva, a kao intermedijeri se javljaju izoprenske jedinice (vidi Opštu biohemiju). Glavni regulatomi enzim ovog biosintetskog procesa je HMG�KoA�reduktaza. Brojni mehanizmi kratkoročne i dugoročne regulacije utiču na nivo i aktivnost ovog enzima. HMG�KoA�reduktaza podleže dejstvu brojnih hormona, hrane i kompetetivnoj inhibiciji hipoholesterolemijskim lekovima. Holesterologeneza je regulisana mehanizmom povratne sprege sa samim proizvodom te sinteze holesterolom. Holesterol se u organizmu nalazi kao slobodan i esterifikovan. Dve trećine holesterola u plazmi je u esterifikovanom obliku. Holesterol je esterifikovan najčešće sa dugolančanom linolenskom kiselinom. Estri holesterola u plazmi i u ćelijama podležu neprekidnim procesima hidrolize i reesterifikaci� je. Esterifikacija holesterola u ćeliji odvija se dejstvom enzima ACAT (acilholesterol�aciltransferaza) i iz aktiviranih masnih kiselina u vidu acil�KoA. Intravaskularna esterifikacija holesterola odvija se dejstvom plazmatskog enzima LCAT (lecitin�holesterol�aciltransferaza) pomoću acil� ostatka iz lecitina. Ovaj enzim uglavnom esterifikuje holesterol u HDL česticama. Holesterol se u plazmi trasportuje u sklopu lipoproteinskih čestica, lako se nalazi u svim lipopro� teinskim česticama glavni transport holesterola u plazmi odvija se putem LDL�a. LDL transportuje ho�
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�7
lesterol iz jetre na periferiju, a HDL uklanja holesterol sa periferije (i iz penastih ćelija) i transportuje ga u jetru gde se metaboliše u žučne kiseline i tako uklanja višak holesterola iz organizma. Holesterol se putem LDL�a transportuje do ćelija i putem LDL�receptora preuzima u ćeliju. Receptorski put je kontrolisan i ne dolazi do prekomerne akumulacije. Alternativni put metabolizma lipoproteinskih čestica i uklanjanje sa receptorima hvatačima nije regulisan i vodi prekomernoj akumulaciji holesterola i stvaranju penastih ćelija (videti metabolizam lipoproteinskih čestica). Povećana apsorpcija holesterola u gastrointestinalnom traktu praćena je povećanom ekskrecijom holesterola putem žuči. Metabolizam holesterola u organizmu odvija se kroz sintezu steroidnog jezgra, ali ne postoji katabolički put koji raskida to steroidno jezgro. Sintetisan holesterol ili unet hranom može samo da se dalje metaboliše u žučne kiseline i u tom obliku eliminiše putem žuči u gastrointes� tinalni trakt. Žučne kiseline se vraćaju najvećim delom u jetru enterohepatičnom cirkulacijom. Povratak žučnih kiselina u jetru iz creva inhibira regulatornu enzimsku reakciju konverzije holesterola u žučne kiseline. Blokada recirkulacije žučnih kiselina u jetru uslovljava povećanu aktivnost ovog enzima i stimuliše se degradacija holesterola u žučne kiseline. Ovaj efekat se koristi i za tečenje hiperholeste� rolemije, primenom odgovarajućih smola, koje vezuju žučne kiseline u lumenu creva i sprečavaju po vratak žučnih kiselina u jetru. Metabolizam lipidnih komponenata triglicerida i holesterola možemo posmatrati odvojeno kao što je to sada i opisano, ali obzirom da se one nalaze u plazmi u sklopu lipoproteiskih čestica njihov normalni metabolizam kao i poremećaji obično se proučavaju u sklopu lipoproteiskih čestica.
Metabolizam lipi da u jetri Jetra je centralni organ u metabolizmu svih biomolekula u humanom organizmu pa i lipidnih komponenti. Metabolizam u jetri objedinjuje metabolizam glukoze, aminokiselina i lipida. U zavisnosti od uzimanja hrane i energetskih potreba organizma dolazi do usmeravanja metabolizma u jetri ka održavanju potrebnog nivoa glukoze u plazmi ili deponovanja viška energije u vidu glikogena i triglicerida. U toku gladovanja, jetra oslobađa glukozu i održava njen nivo u krvi. Metabolizam lipida u jetri posle obroka Posle obroka dolazi do porasta nivoa glukoze, aminokiselina i slobodnih masnih kiselina u portal� noj veni. U jetri se odvijaju dva metabolička procesa vezana za lipide: (1) povećana sinteza masnih kiselina i (2) povećana sinteza triglicerida. Jetra je primarni organ de novo sinteze masnih kiselina koja se uglavnom odvija posle obroka. Ova biosinteza zavisi od raspoloživosti supstrata (acetil�KoA i NADPH) i od aktivnosti enzima acetil� KoA�karboksilaze. Ovaj enzim katalizuje prvu reakciju u biosintezi masnih kiselina, a to je sinteza malonil�KoA iz acetil�KoA koja je i regulatorna reakcija ovog procesa. U hepatocitima dolazi do fosfo� rilacije glukoze dejstvom glukokinaze i nastaje glukoza�6�fosfat (Slika 4�6). U zavisnosti od energetskog stanja dalji metabolizam glukoza�6�fosfata se usmerava ka sintezi glikogena prethodnom kon verzijom glukoza�6�fosfata u glukoza�1�fosfat, čime se deponuje višak energije. Glikogen se sintetiše sve dok se depoi u jetri ne popune. Glukoza�6�fosfat ulazi i u ciklus glikolize i ciklus limunske kiseline čime se obezbeđuje potrebna energija za sve procese u ćelijama jetre. Portalna hiperglikemija povećava nivo acetil�KoA koji čini osnovu za biosintezu masnih kiselina. Višak aminokiselina preko svojih intermedijemih metabolita procesima dezaminacije povećava nivo acetil�KoA i piruvata, a višak ace� til�KoA se usmerava ka biosintezi masnih kiselina. Sintetisane masne kiseline u ćeliji kao i apsorbo� vane masne kiseline kratkih lanaca iz portalnog krvotoka koje se procesima elongacije produžavaju i ulaze u "pool" (rezervu) masnih kiselina. Ovaj "pool" masnih kiselina služi kao osnova za biosintezu triglicerida u ćelijama jetre. Biosinteza triglicerida je favorizovana ukoliko su u višku prisutni acil�KoA koji potiču iz de novo sinteze polazeći od acetil�KoA ili potiču od hidrolize triglicerida iz ostataka hilomikrona dospelih u he� patocite putem krvi. Biosinteza triglicerida odvija se iz glicerola i masnih kiselina sa dva različita metabolička puta u zavisnosti od porekla glicerol�3�fosfata: a) iz glicerol�3�fosfata nastalog fosforilacijom
4�8
Medicinska biohemija
glicerola sa glicerol�kinazom; b) iz intermedijera procesa glikolize. Procesima esterifikacije sa aktiviranim masnim kiselinama u vidu acil�KoA nastaju digliceridi, a potom i trigliceridi. U ćelijama jetre postoji "pool" triglicerida. Iz endogeno sintetisanih triglicerida, holesterola, fosfolipida i odgovarajućih apolipoproteina formiraju se VLDL lipoproteinske čestice čija se količina povećava u sistemskoj cirkulaciji. Masne kiseline iz triglicerida VLDL čestica se koriste kao izvor energije u mnogim tkivima, kao što je srce, mišići i bubreg. U slučaju povećanog stvaranja VLDL čestica one transportuju pre svega endogeno sintetisane trigliceride u masno tkivo gde se deponuju. Sinteza triglicerida u jetri je povećana ukoliko je hrana bogata ugljenim hidratima. Ovo ima za posledicu višak VLDL čestica u cirkulaciji, što objašnjava i uobičajenu prolaznu hipertrigliceridemiju koja se javlja kod zdravih osoba koje hranom unose veliku količinu prostih šećera. U jetru dospeva i deo egzogenih triglicerida putem hilomikronskih čestica. Hrana
Hepatocit
Glikogen Glukoza
t
VLDL>%
*• G�6�P
Trioza�3�P � >Glic erol |NH 3o . I 4 Piruvat Amino.^ kiseline"
t VLDLJ
Holesterol J sistemsku osfolipidi Apolipoprote ini cirkulaciju
Acetil�KoA Oksalacetat
Ketonska tela
SMK Albumin
CO2 energija
Vena
portalna
Hepatična vena
Slika 4�6. Metabolizam lipida u jetri posle obroka. Izvor masnih kiselina u jetri za sintezu triglicerida i dalje stvaranje VLDL čestica su i masne kiseline oslobođene iz masnog tkiva u posebnim metaboličkim stanjima. Oslobođene masne kiseline iz masnog tkiva dospevaju u cirkulaciju i u jetru gde se inkorporiraju u trigliceride VLDL�a. U periodu stresa i nekontrolisanog dijabeta slobodne masne kiseline su glavni prekurzori VLDL�a. Na osnovu izloženih procesa proizilazi da je jetra ključni organ u metabolizmu lipida. Jetra depo� nuje glukozu iz hrane u vidu glikogena i konvertuje višak u trigliceride VLDL čestice. Metabolizam lipida u jetri tokom gladovanja U toku gladovanja koncentracija glukoze u krvi opada i nivo insulina se snižava. Kao odgovor na nizak nivo glukoze, dolazi do glikogenolize u jetri i brze mobilizacije depoa glikogena. Pored ovoga dolazi i do mobilizacije aminokiselina iz mišića i masnih kiselina iz masnog tkiva. Ove molekule se usmeravaju u jetru gde se odvija glukoneogeneza i ketogeneza (Slika 4�7). Glukoza�alaninski ciklus usmerava metabolizam alanina u jetri u pravcu glukoneogeneze. Alanin je svakako glavni prekurzor u procesu glukoneogeneze gde se ona dezaminacijom prevodi u piruvat, a potom nizom reakcija do glukoza�6�fosfata. Jetra sadrži enzim glukoza�6�fosfatazu koja defosforilacijom oslobađa glukozu neophodnu za mnoga tkiva organizma, a pre svega tkivo mozga. Slobodne masne kiseline iz masnog tkiva preuzima jetra i njihov katabolizam je glavni izvor energije za hepatično tkivo u postapsorpcionom stanju. U jetri dolazi do sinteze i oslobađanja keton�
V.
Spasojević�Kalimanovska:
4�9
Lipidi
skih tela (primarno 3�hidroksibutirata) i ona se koriste kao izvori energije u perifernim tkivima. Sinteza ketonskih tela je povećana kada koncentracija oslobođenog acetil�KoA iz masnih kiselina prevazilazi oksidativni kapacitet ciklusa limunske kiseline. Ketonska tela u toku gladovanja služe kao značajan izvor energije, a posebno za tkivo mozga. Ovo ujedno umanjuje i potrebu za ugljenikovim atomima aminokiselina u procesu glukoneogeneze, što znači manji gubitak proteina. Sinteza triglicerida u jetri i količina VLDL čestica u cirkulaciji je smanjena u toku gladovanja.
Hepatocit
Glikogen
Glukoza
I > G�6�P
Glukoza�6�fosfataza
* Glukoza
t Trioza�3�P—>�Glicerol
t Piru vat Am in o kiseline iz mišića
V
Holesterol... Fosfo lip idi •»•>. Ap olipop ro te in K \ ***••>
A cet il� K oA
Pool TG
VLDlj
1
4
Oksalacetat Pool MK
SMK iz ~ adipocita Vena
portalna
@
.
CO2 energija
^Ketonska q tela u periferno tkivo Hepatična vena
Slika 4�7. Metabolizam lipida u jetr i tokom gladova nja.
Metabolizam lipida u adipoznom tkivu Masno tkivo predstavlja glavni depo lipida u organizmu. Ukoliko se masne kiseline ne iskoriste za dobijanje energije u odre đen im periferni m tkivim a, njihov višak predstavlja koncent rova ni oblik energije koji se deponuje u adipocitima. Povećani unos masti i ugljenih hidrata povećava količinu lipopro� teinskih čestica VLDL�a i hilomikrona koje transportuju masne kiseline u vidu triglicerida do adipocita. U adipocitima hidrolizom triglicerida oslobađaju se masne kiseline koje čine intracelulami "pool" slobodnih masnih kiselina, a glicerol se oslobađa u krvotok pošto adipociti ne sadrže glicerol�kina zu ko ja bi refosforilisala glic er ol. Glicerol�3�fosfat se dobija kao in te rm ed ijer u pr oc es u glik olize. He ks ok i� naza fosforiliše glukozu i nastaje glukoza�6�fosfat koji daje glicerol�3�fosfat neophodan za sintezu triglicerida. Uloga masnog tkiva u metabolizmu lipida posle obroka Metabolizam lipida u adipocitima posle obroka usmeren je ka: (1) povećanoj sintezi masnih kiselina; (2) povećanoj biosintezi triglicerida i (3) smanjenoj hidrolizi triglicerida. Unos hrane stimuliše lučenje insulina iz pankreasa koji portalnim krvotokom dospeva u adipocit. Insulin utiče na metabolizam ugljenih hidrata i lipida. Insulin omogućava ulazak glukoze u ćeliju masnog tkiva (Slika 4�8). U adipocitima glukoza se fosforiliše heksokinazom u glukoza�6�fosfat koja u procesu glikolize i CLK vodi ka oslobađanju energije neophodne za sam adipocit. Veliki višak glukoze dovodi do povećanog stvaranja i intermedijera glicerol�3�fosfata koji se koristi u sintezi triglicerida. Višak acetil�KoA se us� merava ka biosintezi masnih kiselina koje ulaze u "pool" slobodnih masnih kiselina u ćeliji ili služe za esterifikaciju glicerol�3�fosfata tj. reesterifikaciju mono i diglicerida u sintezi triglicerida. De novo bio� sinteza masnih kiselina iz acetil�KoA u adipoznom tkivu nije tako veliki izvor masnih kiselina u ovom tkivu izuzev nakon gladovanja. U adipocitima glukoza se metaboliše i u fosfoglukonatnom putu koji obezbeđuje NADPH neophodne za sve biosintetske procese. Najveći deo masnih kiselina u adipoci�
4�10
Medicinska biohemija
tima potiče od unetih masti putem hrane (u formi hilomikrona), a mnogo manje potiče iz jetre dospe� lih u vidu VLDL�a.
lipoeif ^Glukoza—•G�6�P�
Krvni sud
�•Pentoza�P
i . . . . . .
Pentozni šant
Trioza�3�P�
Piruvat Laktat
Acetil�KoA
SMK AlbumJn
Slika 4�8. Metabolizam lipida u adipocitima posle obroka. Mesto dejstva insulina (*) i mesto dejstva hormon�senzitivne lipaze (<£>).
Posle obroka bogatog lipidima povećava se koncentracija hilomikrona čijom hidrolizom triglicerida se obezbeđuju masne kiseline za adipocite. Ove egzogene masne kiseline se oslobađaju dejs� tvom ekstracelularne lipoproteinske lipaze, koja je vezana za endotel krvnih sudova adipoznog tkiva i mišića. Visok nivo masnih kiselina i glicerol�3�fosfata nastalog u metabolizmu glukoze, na ovaj način povećavaju deponovanje triglicerida u adipocitima. Uporedo sa ovim procesima usmerenim ka deponovanju triglicerida, visok nivo glukoze i insulina smanjuje katabolizam triglicerida. Visok nivo insulina dovodi do defosforilacije i inaktivacije hormon� senzitivne lipaze, tako da je degradacija triglicerida inhibirana.
Metabolizam lipida u adipoznom tkivu tokom gladovanja U periodu gladovanja metabolizam lipida se usmerava ka: (1) povećanoj hidrolizi triglicerida; (2) povećanom oslobađanju masnih kiselina i (3) smanjenom preuzimanju masnih kiselina. Hidroliza triglicerida je pod dejstvom hormon�senzitivne lipaze, enzima koji je pod uticajem većeg broja hormona (Slika 4�9). Povećano oslobađanje kateholamina stimuliše hormon�senzitivnu lipazu što povećava hidrolizu triglicerida. Masne kiseline oslobođene povećanom hidrolizom triglicerida, stvaraju "pool" masnih kiselina u adipocitima iz kojih se one oslobođaju u sistemsku cirkulaciju. U krvi se vezuju za albumin i transpor� tuju do raznih tkiva gde služe kao izvor energije. Glicerol se takođe oslobađa hidrolizom triglicerida i on se transportuje do jetre gde se koristi kao supstrat u procesu glukoneogeneze. U periodu glado vanja zbog niskog insulina nema stimulacije lipoproteinske lipaze vezane za endotel krvnih sudova masnog tkiva tako da nema dotoka masnih kiselina u adipozno tkivo tj. masne kiseline triglicerida cir� kulišućih lipoproteina nisu dostupne za sintezu triglicerida adipoznog tkiva.
4�11
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
Adipocit Glukoza�
•>�Glukoza
>G�6�P Trioza�3�P<.
Piruvat
4r Laktat
Krvni sud
v
Acetil�KoA
Hormon senzitivna lipaza (�) insulin (+) glukagon, kateholamini, tiroksin i hormon rasta
Slika 4�9. Metabolizam lipida u adipoznom tkivu tokom gladovanja. Ulazak glukoze u ćeliju je regu� lisan hormonski sa insulinom (*).
LIPOPROTEINI � STRUKTURA I METABOLIZAM Struktura lipoproteinske čestice Obzirom da hidrofobni karakter lipida sprečava njihov direktan transport u plazmi, oni se tran� sportuju između tkiva i organa u formi čestica koje se označavaju kao lipoproteini (vidi Sliku 4�10). Svaki lipoprotein sadrži proteinsku komponentu koja se naziva apolipoprotein. Struktura lipoproteinske čestice je u skladu sa funkcijom koju ona ima u plazmi, a to je da omogući transport lipidnih komponenti u organizmu koje su nerastvome u plazmi. Svaka lipoproteinska čestica sastoji se iz hid� rofobnog jezgra i hidrofilnog omotača. Hidrofobno jezgro lipoproteinske čestice se sastoji od nepolar� nih komponenti: estara holesterola i triglicerida. Hidrofilni omotač sadrži amfipatični fosfolipidni dvos� loj, neesterifikovani holesterol sa polarnom hidroksilnom grupom u položaju tri steroidnog jezgra i apolipoproteine. Apolipoproteini su inkorporirani u taj omotač, a novija saznanja ukazuju da apolipoprotein u vidu polipeptidnog lanca obavija lipoproteinsku česticu. Ovakva lipoproteinska čestica u raznim fazama metabolizma lipida razmenjuje svoj sadržaj, posebno iz jezgra, sa drugim česticama i kao rezultat toga imamo da se u plazmi istovremeno nalaze više različitih lipoproteina. Različiti sadržaj lipida i apolipoproteina u čestici uslovljava različite fizičko� hemijske osobine ovih čestica. Lipoproteinske čestice se karakterišu veličinom, gustinom, flotacio� nom konstantom i elektroforetskom pokretljivošću (vidi Tabelu 4�1). Primenom tehnike ultracentrifugi� ranja lipoproteini se prema svojoj gustini razdvajaju na 5 glavnih klasa i to su: • hilomikroni • lipoproteini vrlo male gustine (VLDL) • lipoproteini intermedijarne gustine (IDL) • lipoproteini male gustine (LDL) i • lipoproteini velike gustine (HDL)
4�12
Medicinska biohemija
Apoprotein
Fosfolipid Slobodan holesterol
Estar
holesterola Trigiicerid
Slika 4�10. Struktura lipoproteinske čestice. Elektroforezom na agaru dobijaju se sledeće frakcije u normalnoj plazmi: pre�(3 (VLDL), p (LDL) i a (HDL) frakcija. Odnos lipida i proteina u lipoproteinima određuje relativnu gustinu i što je veći pro� cenat lipida u njima to im je gustina manja. Na osnovu Tabele 4�1 možemo zaključiti da se gustina čestica povećava od hilomikrona ka HDL, a veličina se smanjuje tj. da su ove dve veličine u obrnutom odnosu. Različite klase lipoproteina ne samo da imaju različit odnos lipida i proteina nego im je i sastav lipidne frakcije različit. Tabela 4�1. Sastav lipoproteinskih frakcija. Hilomikroni
VLDL
IDL
LDL
HDL
Gustina kg/L
<0,095
0,95�1,006
1,005�1,019
1,019�1,063
1,063�1,21
Dijametar nm
80�1200
30�80
23�53
18�25
5�12
Elek pokret
start
Pre�p
Široka (3
P
a
Holesterol
6
8�13
27
45
20
Fosfolipidi
4
6�15
25
25
30
Trigliceridi
87
44�60
30
10
2�5
Proteini
2
8�10
15
20
48
A�l B�48 C�ll E
A�l B�100 C�ll E
A�l B�100 C�ll E
B�100
A�IA�IIC E
1:100
1:9
1:6
1:4
1:1
Parametar
Apoproteini Proteini : lipidi
Hilomikroni su lipoproteini male gustine (<0,95), a vrlo velike čestice koje se posle centrifugira� nja izdvajaju iznad plazme u vidu mlečnog prstena. Oni se sastoje uglavnom iz egzogenih triglicerida (87 %) i njihova uloga u metabolizmu lipida je transport egzogenih triglicerida (vidi Tabelu 4�1). Pri elektroforetskom razdvajanju ostaju na startu. Pored triglicerida koji su najviše zastupljeni, sadrže i manje količine holesterola i fosfolipida, a od apolipoproteina apo B�48, A�l, C�ll i E.
4�13
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
VLDL � (very low densitv lipoproteins) � su lipoproteini vrlo male gustine koji imaju ulogu u transportu endogeno sintetisanih triglicerida. To su čestice vrlo male gustine, ali su relativno velike u odnosu na ostale (manje su od hilomikrona). Pored velikog sadržaja triglicerida i do 60 % sadrže i ostale lipidne komponente, a pre svega holesterol. Najvažniji apolipoprotein je apo B�100. VLDL čestice imaju pre�B elektroforetsku pokretljivost. IDL � (intermediate densitv lipoproteins) � su lipoproteini srednje gustine. Oni imaju podjednak sadržaj holesterola i triglicerida. LDL� (low densitv lipoproteins ) su lipoproteini male gustine koji uglavnom sadrže holesterol u vidu estara holesterola i to je ujedno i glavna funkcija LDL�a, a to je transport holesterola. Sadrže samo apolipoprotein B�100. Imaju (3 elektroforetsku pokretljivost. HDL � (high densitv lipoproteins) su lipoproteini velike gustine. HDL sadrži 50 % apolipoprote� ina i ima najveću gustinu (1,21). Glavni apolipoproteini HDL čestice su apo A�l i apo A�ll. Ovi lipoproteini su najmanji po veličini svega 5�12 nm. Od lipidnih komponenti sadrže holesterol (20 %), fosfoli� pide (30 %) i trigliceride (2�5 %). Pri elektroforetskom razdvajanju najviše putuje anodno jer sadrži najviše proteina i razdvaja se kao a frakcija. Glavna uloga je protektivna jer on uklanja holesterol koji je aterogen iz perifernog tkiva. Apolipoproteini Apolipoproteini su proteini koji imaju trostruku ulogu u metabolizmu lipida: • transportnu ulogu � omogućavaju transport lipidnih komponenti između pojedinih tkiva u organizmu; • omogućavaju vezivanje lipoproteinskih čestica za odgovarajuće receptore jer služe kao ligandi i na taj način kontrolišu količinu lipida koja ulazi u ćeliju i kanališu metabolizam lipoproteina; • služe kao efektori (aktivatori ili inhibitori) enzima koji sudeluju u metabolizmu lipoproteina. Apolipoproteini omogućavaju transport hidrofobnih lipida kroz vodenu sredinu zahvaljujući kon� formaciji koja se označava kao amfibilni heliks, što znači da su na jednoj polovini površine heliksa raspoređeni ostaci hidrofilnih, a na drugoj hidrofobnih aminokiselina. Apolipoproteini su u lipoproteini� ma smešteni na površini čestice tako da je prema vodenoj fazi, odnosno plazmi okrenuta hidrofilna površina, a prema apolarnom jezgru čestice okrenuta je hidrofobna površina proteinskog lanca. Tabela 4�2. Apolipoproteini humane plazme, funkcija i veza sa kardiovaskularnom bolešću (KVB). Apolipoprotein Apo A�l Apo A�ll Apo A�IV Apo(a) Apo B�48 Apo B�100 Apo C�l Apo C�ll Apo C�lll
ApoD Apo E ApoF ApoH ApoJ
Glavna funkcija Strukturni za HDL, ligand za vezivanje HDL�a, kofaktor LCAT Strukturni za HDL, ligand za vezivanje HDL�a, kofaktor LCAT�a, modulator aktivnosti LL i HTGL Ligand za vezivanje HDL�a, aktivator LCAT�a Strukturni za Lp(a), verovatno utiče na fibrinolizu Strukturni za hilomikrone Strukturni za VLDL, IDL i LDL, ligand za LDL�receptor Aktivator LCAT i LPL Aktivator za LCAT i LPL
Inhibitor LPL. Modulator za preuzimanje lipoproteina bogatih trigliceridima pomoću receptora Nepoznata Ligand za LDL �receptore i za druge hepatične receptore Nepoznata Nepoznata Protekcija membrane (?)
Veza sa KVB Da
Ne Ne Da Ne Da Ne Ne Ne Ne Fenotip, da Ne Ne Ne
4�14
Medicinska biohemija
Do sada je opisano pet glavnih apolipoproteina koji se označavaju slovima A,B,C,D i E (ima ih još toliko), tolik o), a svaki svak i od ovih proteina ima manji ili veći broj podgrupa (vidi Tabelu 4�2). Glavne grupe apolipoproteina i njihove podgrupe razlikuju se po strukturi, fizičko�hemijskim osobinama, funkciji i zastupljenosti u pojedinim klasama lipoproteina. Svaki apolipoprotein ulazi u sastav jedne ili više različitih lipoproteinskih čestica gde ima svoju specifičnu ulogu stoje prikazano u Tabeli 4�2. Lipoproteinske čestice su dinamičke i postoji stalna razmena apolipoproteina između pojedinih čestica u metaboličkim procesima. U svakom trenutku, humana plazma sadrži nekoliko lipoproteina koji su u dinamičkoj ravnoteži. Lipoproteini nisu metabolički inertni; njihov metabolizam uključuje brojne enzime poput lipoproteinske lipaze (LPL), hepatične triglicerid�lipaze (HTGL) i lecitin� holesterol�aciltransferaze (LCAT). Ovde treba spomenuti i to da je razmena komponenata između lipoproteinskih čestica olakšana sa holesterol�estar�transfernim proteinom (CETP).
Metabolizam lipoproteina Metabolizam lipida se odvija u više faza, a radi lakšeg tumačenja možemo razdvojiti pre svega egzogeni i endogeni put (vidu Sliku 4�11). Za metabolizam lipida možemo reći da se odvija i kroz procese lipidne kaskade. Lipidi iz hrane se transportuju iz intestinuma intestinuma u jetru egzogenim putem, a li� pidi sintetisani u hepatocitima se transportuju iz jetre u periferno tkivo endogenim putem. Ova dva puta se parcijalno preklapaju u stupnju hidrolize čestica bogatih trigliceridima dejstvom enzima lipoproteinske lipaze i hepatične lipaze. Dodatno još HDL transportuje holesterol iz perifernih tkiva ponovo u jetru. Ovaj deo metabolizma se naziva reverzni transport holesterola. U jetri se holesterol metaboli� še u žučne kiseline i izlučuje iz organizma putem žuči i fecesa iz gastrointestinalnog trakta. Finalna ekstrahepatična tkivna koncentracija holesterola i verovatno stepen njegovog deponovanja u zidu kr vnih sudova, sudo va, rezultat je ravnoteže ravnotež e između ovih procesa. Unos hranom
P e r
Reverzni transport holesterola
i
0—^~\ >o
v O Y
tKSKrecija putem žuči
i
f e r n
"?
0
" ' '
Egzogeni put
Endogeni put
+
i k
i
Ekskrecija
Slika 4�11. Putevi metabolizma lipida u organizmu.
Egzogena faza metabolizma lipoproteina Egzogena faza započinje u enterocitima stvaranjem hilomikrona iz lipidnih komponenti i apolipoproteina koji se sintetišu u endoplazmatičnom retikuiumu enterocita (vidi Sliku 4�12). Holesterol unet hranom, uglavnom kao estar holesterola, se apsorbuje u intestinumu. Estri se hidrolizuju pomoću ho� lesterol�esteraze i oslobađa se slobodan holesterol i masne kiseline. Trigliceridi se hidrolizuju pomo�
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�15
ću pankreasne i intestinalne lipaze i apsorbuju uglavnom kao slobodne masne kiseline i monogliceri� di. Masne kiseline dugih lanaca posle apsorpcije učestvuju u reesterifikaciji holesterola i resintezi tri� glicerida u enterocitima, dok se masne kiseline kratkih lanaca vezuju za albumin i tako transportuju u cirkulaciji. Resintetisani trigliceridi, holesterol i apoiipoproteini se spajaju i grade velike lipoproteinske čestice koje su poznate kao hilomikroni. Hilomikroni se sastoje najvećim delom 90 % od triglicerida, sekretuju se u limfu i ulaze u plazmu kroz torakalni krvni sud. Oni se normalno nalaze u plazmi u postprandijalnom stanju samo, i ukoliko se nalaze u većoj koncentraciji daju mlečan izgled plazmi. Prisustvo hilomikrona reflektuje se na povećanu koncentraciju plazmatskih triglicerida. Porast hilomi� krona je praćen i odgovarajućim porastom plazmatskih triglicerida.
Slika 4�12. Egzogena faza metabolizma lipop rote ina.
Hilomikroni sadrže apo B�48, koji je N�terminalna polovina većeg apo B�100 molekula, glavnog apolipoproteina LDL čestice. Treba naglasiti da se deo koji se vezuje za LDL�receptor nalazi u C� terminalnom kraju apo B�100 molekule, tako da se apo B�48 ne može vezati za LDL�receptore. Nas� centni hilomikroni isto tako sadrže apo A�l, apo A�ll i apo A�IV. U plazmi hilomikroni prihvataju apo C (C�l, C�ll i C�lll) i apo E iz HDL�a i VLDL�a u zamenu za estre holesterola i apo A. Apo C i apo E su važn važnii u narednim narednim procesima jer kontrolišu dalji metabolizam hilomikrona. Apo C�ll aktivira, a apo C�lll inhibira lipoproteinsku lipazu (LPL), enzim koji se nalazi u vaskularnom endotelu ekstrahepatičnog tkiva. LPL hidrolizuje trigliceride hilomikrona na glicerol i slobodne masne kiseline, koje zatim preuzimaju ćelije. Slobodne masne kiseline služe kao izvor energije za ćelije mišića ili se vezuju za albumin i dalje transportuju. Ova hidroliza triglicerida hilomikrona dovodi do značajnog smanjenja veličine hilomikrona koje iznosi čak 20 puta. Neke od komponenti na površini, poput fosfolipida i apo A se sada gube sa čestice i ovo može biti izvor za intravaskularno stvaranje HDL čestica. Na ovom stadijumu hilomikroni se transformišu u ostatke hilomikrona tkz. "remnant" čestice. Ostaci hilomikrona sadrže apo E koji ima sposobnost vezivanja za LDL�receptor ili (B�100:E receptor) i receptore za ostatke hilomikrona. Apo E vodi ostatke hilomikrona prema jetri. Približno 35 % hilomikrona se uklanja pomoću LDL�receptora. Receptor za remnant (ostatak) je u stvari LDL�receptor koji se označava još i kao B�100:E receptor jer se vezivanje za ovaj receptor može vršiti pomoću dva apolipoproteina: apo E i apo B�100. Apo C�l menja vezivanje apo E za receptore jetre i kroz ovo može da se inhibira klirens čestica bogatih trigliceridima. Vezivanjem ostataka hilomikrona za odgovara juće juće recep receptor toree u hepatocitima i njihovom razgradnjom razgrad njom u istim završava se egzogena egzog ena faza metabolizma lipoproteina. Egzogeni metabolizam odgovara metabolizmu hilomikrona, tj. egzogenih triglicerida
4�16
Medicinska biohemija
i traje 4�6 sati. Povećanje hilomikrona i ostataka hilomikrona bogatih trigliceridima posle obroka (6�8 sati posle obroka) može da pređe kritičnu granicu što dovodi do taloženja ovih čestica odnosno njihovih sastojaka u zidu arterija. Postprandijalna lipemija može dovesti do promene u LDL�u i HDL�u čime se tumači aterogenost hilomikrona.
Endogena faza metabolizma lipoproteina Endogena faza metabolizma lipoproteina započinje stvaranjem VLDL čestica u hepatocitima jetre. VLDL čestice nastaju u jetri iz endogeno sintetisanih triglicerida, estara holesterola i apolipoprote� ina koji se sintetišu u endoplazmatičnom retikulumu (apo B�100, apo E i apo C) i sekretuju se putem Goldžijevog aparata u cirkulaciju. VLDL čestice se sastoje iz nekoliko subtipova različitih veličina, koji su iako svi manji od hilomikrona, jako bogati u trigliceridima i odražavaju energetsko stanje u organizmu. Svaka čestica sadrži po jedan molekul apo B�100. Nekoliko subtipova VLDL�a koje imaju različitu veličinu postoje istovremeno u plazmi. Uobičajeno je da VLDL, kao i hilomikroni razmenjuju svoje komponente sa HDL�om. Estri holesterola, apo C (C�l, C�ll i C�lll) i apo E se prenose sa HDL na VLDL u zamenu zame nu za trigliceri trigli ceride. de. VLDL čestica čestic a obogaćena obogaće na apolipoproteinim apolipopr oteinimaa C i E podleže hidrolizi pomoću lipoproteinske lipaze (vidi Sliku 4�13). Po daljoj analogiji sa hilomikronima, trigliceridi se hid� rolizuju, oslobađaju se slobodne masne kiseline i nastaju manje čestice koje se označavaju
Slika 4�13. Endogena faza faza metabolizma lipoproteina.
kao ostaci (remnanti) VLDL�a. Ovi ostaci VLDL�a po svojim fizičko�hemijskim osobinama pripadaju klasi IDL čestica. VLDL i ostaci VLDL�a imaju veći afinitet prema LDL�receptorima nego LDL, i mogu biti preuzeti od strane jetre ili da ostanu u plazmi i dalje da se hidrolizuju i grade IDL i finalno LDL. Vezivanje Veziv anje VLDL čestica za LDL�receptore (B�100:E) je preko apo E iako ova čestica sadrži i apo B� 100, ali zbog veličine i sternih smetnji nije moguće vezivanje putem apo B�100. Hepatična triglicerid� lipaza (HL) uključuje se na ovom stupnju i hidrolizuje trigliceride IDL čestice, smanjujući njihovu veličinu i prevodeći ih u LDL čestice. Deficijencija hepatične lipaze rezultira akumulacijom ostataka VLDL�a VLDL �a u plazmi. plaz mi.
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�17
U bilo kom stupnju VLDL�LDL kaskade, lipoproteinske čestice bogate trigliceridima se mogu ukloniti iz plazme pomoću jetre. Ostaci velikih VLDL se direktno metabolišu, dok ostaci malih VLDL čestica ulaze u IDL�LDL put. U slučaju nekog poremećaja na LDL�receptoru, manje VLDL čestice se direktno uklanjaju i više se transformišu u LDL. Ovo rezultira povećanom koncentracijom LDL�a. Metabolizam IDL čestica i uloga apo E IDL sadrži dva apolipoproteina E i B�100, B�100, tako da se on ili vezuje za za LDL�receptore ili transfor� miše u LDL. Multiple subklase IDL�a postoje. Metabolizam IDL čestica je određen genetskim poli� morfizm morfizmom om apolipoproteina E. Postoje više izoformi apo E (apo (apo E2, apo E3 i apo E4) koje se međusobno razlikuju po svom afinitetu vezivanja za LDL�receptor. Apo E izoforme E2 i E4 su produkti različitih alela na jednom lokusu i razlikuju se od apo E3 u aminokiselinskim ostacima na poziciji 112 i 158 u molekuli apo E. Izoforma E3 sadrži cistein/arginin kombinaciju na ovom položaju dok E4 sadrži arginin/arginin, a E2 cistein/cistein. Uobičajeni fenotip je E3/E3 koji se javlja u oko 60 % populacije. Fenotip E2/E2 ima najmanji afinitet za LDL�receptor. Ovaj fenotip se javlja kod osoba sa familijarnom disbetalipoproteinemijom i vezana je za hiperlipoproteinemije tipa III (vidi hiperlipoproteinemije). Osobe sa ovim fenotipom imaju povećan broj IDL čestica, poremećen metabolizam ostataka hilormi� krona i VLDL�a i visoke koncentracije triglicerida. Ispitivanja su pokazala da su IDL čestice aterogene i da povišeno prisustvo ovih čestica u plazmi dovodi do stvaranja penastih ćelija. Pacijenti sa hiperlipoproteinemijom tipa III su sklone koronarnoj bolesti. Pacijenti dijabetičari imaju isto tako povećane koncentracije IDL�a i odgovorni su za povećanu učestalost koronarnih oboljenja kod dijabetičara. Metabolizam LDL�a i apo B�100 IDL nastavlja sa gubljenjem triglicerida, apo C i apo E, verovatno kroz interakciju sa HDL�om i delovanjem holesterol�estar�transfemog proteina (CETP). Ovo rezultira transformacijom IDL čestice u LDL. LDL čestica je glavni nosilac holesterola u plazmi. LDL sadrži neznatne količine triglicerida i slobodnog holesterola, dok estri holesterola predstavljaju glavnu komponentu ove čestice. Apo B�100 je jedino prisutan apolipoprote apolip oprotein in u LDL�u. Svaka čestica LDL�a sadrži po jedan jed an molekul molek ul apo B�100. Između 75 i 80 % LDL�a se metaboliše u jetri. LDL se metaboliše uglavnom putem receptora. LDL� receptori regulišu količinu LDL�a u plazmi tako što kontrolišu njegov metabolizam. Količina sintetisa� nog LDL�receptora i klirens LDL�a je obrnuto srazmema količini intracelulamog slobodnog holesterola. Kod normolipidemičnih osoba, oko polovine LDL�a se metaboliše kroz sistem LDL�receptora. Sintezu LDL�receptora stimulišu hormoni tiroideje i estrogeni tako da u slučaju smanjenog lučenja ovih hormona dolazi do poremećaja u metabolizmu LDL čestice. Pošto se 90 % plazmatskog apo B�100 nalazi u LDL�u, određivanje apo B reflektuje u potpunosti koncentraciju LDL�a. Povećana koncentracija apo B�100 je signal za povećan broj LDL čestica. Smatra se da je povećana koncentracija apo B najbolji marker povećanog rizika za razvoj ateroskleroze, kao i povećanog rizika koronarne bolesti i infarkta miokarda. Metabolizam LDL�a putem LDL�receptora
Metabolizam LDL�a se odvija najvećim delom u jetri vezivanjem za LDL�receptore i daljom hidrolizom u lizozomima. Oslobođeni holesterol se metaboliše u žučne kiseline i kao takav izlučuje putem žuči. Drugi metabolički put je receptorski put koji se odvija u perifernom tkivu mišića i adipoznog tkiva koji sadrže LDL�receptore. Posebno je veliki broj ovih receptora u endokrinim žlezdama gde se odvi ja sintez sintezaa steroidnih hormona. hormo na. Ovaj metaboličk metab oličkii put omogućava omog ućava kontrolu unošenja unoše nja i akumulaci akum ulacije je holesterola u ćelijama. Treći metabolički put LDL�a je alternativni put koji se odvija u makrofagama reti� kuloendotelnog sistema. Alternativni put nije kontrolisan tako da dovodi do prekomeme akumulacije estara holesterola i transformacije ćelija u penaste ćelije koje su vrlo bogate holesterolom i koje su osnova u formiranju aterosklerotskih plakova (vidi Sliku 4�13). Alternativnom putu metabolizma pod� leže modifikovani LDL, koji je promenio svoje fizičko�hemijske osobine i koji je izgubio osobinu da se
4�18
Medicinska biohemija
preko apo B�100 vezuje za LDL�receptore. Ovaj modifikovani LDL se vezuje za "scavenger recepto� re" (receptore hvatače) na makrofagama. Za kontrolu holesterola u organizmu kao i lečenje hiperho� lesterolemije od izuzetnog je značaja receptorski put razgradnje LDL čestica. Na Slici 4�14. prikazan je metabolizam LDL�a putem receptora. Receptori LDL�a nalaze se na površini ćelijske membrane u specifičnim jamicama koje su prosto obložene tim receptorima (tkz. coated pits). Vezivanjem LDL čestice putem apo B�100 za LDL�receptor u obloženim jamicama, dolazi do endocitoze LDL čestica u citopiazmu i nastaje endozom. Na taj endozom deluje lizozom i stvara se sekundarni lizozom. Dejs� tvom hidrolaza iz lizozoma razlaže se LDL čestica. Najpre se odvaja LDL čestica od receptora i ovi se receptori oslobađaju u citopiazmu. LDL�receptori recirkulacijom ponovo dolaze na površinu ćelijske membrane i mogu se ponovo iskoristiti za metabolizam LDL�a. LDL čestica se razlaže na amino� kiseline, masne kiseline i holesterol. Ovako oslobođeni holesterol u ćeliji ima trostruku ulogu : 1. Utiče na sintezu LDL�receptora, tj. ako su povećane količine holesterola u ćeliji to onda inhibira sintezu LDL�receptora na endoplazmatičnom retikulumu; 2. Povećava aktivnost enzima ACAT (acil�KoA�aciltransferaza) koji esterifikuje slobodan holesterol u estar holesterola i dovodi do stvaranja kapi holesterola u ćeliji; 3. Inhibira HMG�KoA�reduktazu (hidroksimetil�glutaril�KoA�reduktazu), enzim koji ima ključnu ulogu u biosintezi holesterola i koji mehanizmom povratne sprege reguliše nivo sinteze holesterola. Na ovom principu inače deluju i neki lekovi koji se koriste kod hiperholesterolemije. Hipoholesterole� mični lekovi, inhibitori HMG�KoA�reduktaze su statini, za čije dejstvo se često koristi termin "penicilin za aterosklerozu". .
Slika 4�14. Metabolizam LDL�a putem receptora u ćeliji.
Fenotipovi LDL subklasa LDL čestice koje su prisutne u plazmi su heterogene. Postoje četiri subklasa LDL�a, koje se mogu razdvojiti na osnovu gustine. LDL 1 je najveća čestica po veličini, najmanja po gustini i frakcija ko ja najviše pluta, dok su LDL 3 i LDL 4 male i guste. Predominacija LDL1 i LDL 2 u plazmi, se javlja kod 75 % populacije, naziva se još i uzorak A, dok kod onih kod kojih dominira LDL 3 su uzorak B. Fenotipovi subklasa LDL�a su određeni alelima i nasleđivanje je autozomalno dominantno. Individue sa uzorkom B karakterišu se isto tako i visokom koncentracijom triglicerida, višom koncentracijom VLDL�a, povećanom koncentracijom IDL�a i nižom koncentracijom HDL�a. Koncentracija apo Bje viša, a apo A�l niža kod osoba sa fenotipom B. Promene vezane za uzorak B su poznate kao atero� geni lipoproteinski fenotip (ALP).
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�19
Poremećaji u metabolizmu LDL�a dovode do određenih dislipoproteinemija i oboljenja, a oni proi� stiču iz: • defekata u LDL�receptorima što ima za posledicu familijarnu hiperholesterolemiju; • defekta u primarnoj strukturi apo B�100 gde je aminokiselina glutamin zamenjena sa argininom na poziciji 3500 i ovaj poremećaj se označava kao familijarna apo B�3500 hiperholesterolemija; • zbog povećane sinteze apo B ili sekrecije kao familijarna kombinovana hiperlipidemija. Hiperapobetaliporoteinemija, bez obzira na koncentraciju holesterola u plazmi uvek nosi povećan rizik za aterosklerozu i koronarnu bolest, a određivanje koncentracije apo B u plazmi je sigurno jedan od najvažnijih parametara u proceni ovog rizika. Aterogenost LDL čestica
Aterogeni potencijal LDL�a potiče od njegovog svojstva da se akumulira u ekstracelularnom mat� riksu i u ćelijama koje su prisutne u intimi arterija. Dok se metabolički proces ulaženja LDL�a u ćeliju putem receptora dobro kontroliše pre svega regulacijom sinteze receptora, dotle proces koji se odvija pomoću receptora hvatača na makrofagama nije kontrolisan i rezultira prekomernim taloženjem holesterola i transformacijom makrofaga u penaste ćelije. Nativni LDL se ne preuzima od strane makro� faga, već je potrebna modifikacija LDL�a. Najpoznatija modifikacija je oksidacija LDL�a. Proces ne� enzimske glikozilacije LDL�a je isto tako klinički važan. Još uvek ima malo dokaza da se oksidacija LDL�a odvija u plazmi, iako je u njoj dokazano prisustvo autoantitela na ox�LDL. Oksidacija LDL�a se prevashodno dešava ekstravaskularno posle prolaska LDL�a kroz endotel u subendotelnom prostoru. Ovu predpostavku potvrđuje i prisustvo oksidovanog LDL�a u aterosklerotskim plakovima. Koronarna bolest se javlja više kod pacijenata sa gušćim LDL česticama. Fenotip B isto tako više dominira kod dijabetičara i osoba sa hipertrigliceridemijom bez dijabetesa. Postoji hipoteza da male, guste LDL čestice lakše prolaze kroz endotelnu barijeru. Ovo olakšava njihovo deponovanje u intimi arterija jer su male, guste LDL čestice više podložne oksidaciji.
Reverzni transport holesterola � Metabolizam HDL�a HDL je najmanja i najgušća lipoproteinska čestica jer proteini čine 50 % ukupne mase HDL�a. Postoje dve subklase HDL�a: HDL 2 i HDL 3. HDL 2 je veća i sadrži više lipida, dok je HDL 3 manja i gušća. Apo A (A�l i A�ll) je glavni apolipoprotein HDL�a, ali HDL isto tako sadrži i druge apolipoprote� ine: apo C i apo E. Aproksimativno 60 % HDL�a sadrži apo A�l i apo A�ll, a ostatak sadrži samo apo A�l. Uloga HDL�a je transport holesterola iz perifernih tkiva u jetru i ovaj metabolički put se naziva re verzni transport holesterola (vidi Sliku 4�15). Mehanizam reverznog transporta holesterola nije u potpunosti razjašnjen. Postoje četiri faze u reverznom transportu holesterola: I faza. Reverzni transport holesterola započinje vezivanjem HDL čestica za apo A�l receptore na perifernom tkivu. Jetra i intestinum sekretuju nascentni, diskoidalni HDL koji sadrži apo A i apo E. Neke diskoidalne forme sadrže i apo C, a one su nastale iz VLDL�a i hilomikrona nakon hidrolize tri� glicerida. Slobodan holesterol oslobođen iz perifernih ćelija biva preuzet od strane nascentnog HDL� a. Nascentni HDL se vezuje putem apo A�l za odgovarajuće receptore na perifernim ćelijama bogatim holesterolom (između ostalih i za penaste ćelije) i dolazi do transfera slobodnog intracelularnog holesterola najpre do ćelijske membrane, a zatim i do HDL�a. Novija istraživanja pokazuju da u eflu� ksu holesterola iz ćelije u ekstracelularni prostor i u preuzimanju od strane HDL�a važnu ulogu ima ABC1 transporter (ATP�binding cassette protein 1). II faza. U ovoj fazi dolazi do esterifikacije slobodnog holesterola vezanog za HDL u estre holesterola. Kada je slobodan holesterol prenet od perifernih ćelija ili plazme prema nascentnom HDL�u, na njega deluje enzim lecitin�holesterol�aciltransferaza (LCAT) koji se vezuje za ove čestice. Ovaj enzim ima važnu ulogu u rastu i sazrevanju HDL�a. LCAT katalizuje stvaranje estara holestero�
4�20
Medicinska biohemija
Holesterol! 1
i „ . r
, ,..
Periferne ćelije
Apo A�l receptor
Glicerol
/
3 VLDL 7,
Hil , ostaci
Slika 4�15. Reverzni transport holesterola.
la iz slobodnog holesterola i acil� ostataka fosfolipida u HDL�u. Ovo dovodi do konverzije nascentnog diskoidnog HDL�a, siromašnog lipidima u veću formu HDL 3. Apo A�l i apo A�ll su kofaktori LCAT�a. Isto tako LCAT je inhibiran sa estrima holesterola. HDL 3 čestica koja je još uvek diskoidna, ali sve veća i veća obogaćuje se postepeno sa estrima holesterola iz periferije i menja svoj oblik u sfernu HDL 2a formu. Novo formirani estri holesterola se mogu ili transportovati do jetre ili preneti na čestice bogate trigliceridima, tako da postoje dva puta daljeg metabolizma estara holesterola: indirektni i direktni. III faza. Indirektan transport estara holesterola u jetru vrši se putem transfera na lipoproteine koji su bogati trigliceridima. Transfer estara holesterola u zamenu za trigliceride, na VLDL i hilomikronske ostatke vrši se delovanjem holesterol�estar�transfemog proteina (CETP). Aktivnost CETP je visoka u slučajevima gde je koncentracija HDL�a mala što je potvrđeno u dislipidemijama. Ovaj proces rezultira u bogaćenju HDL�a trigliceridima i stvaranju HDL 2b� Proces preuzimanja HDL�a od strane jetre ve� rovatno se odvija putem receptora koji imaju sposobnost vezivanja apo A, ali deo HDL�a zbog sadržaja apo E u njemu mogu se preuzeti i od strane LDL�receptora. IV faza. Direktan transport estara holesterola u jetru i razlaganje pomoću hepatične lipaze. HDL 2b čestica se transportuje do jetre i dejstvom hepatične lipaze dalje razlaže. Hepatična lipaza se sinteti� še u hepatocitima i sekretuje u ekstracelulami matriks endotelijalnih ćelija koje oblažu sinusoide jetre. Hepatična lipaza deluje na HDL 2b i to pre svega na trigliceride tako da nastaju: estri holesterola, glicerol, slobodne masne kiseline, apo A�l i diskoidni HDL 3. Apo A�l odlazi na periferiju i ponovo se uključuje u reverzni transport holesterola. Povezanost HDL�a sa aterosklerozom
Ispitivanja su pokazala da visoke koncentracije HDL�holesterola imaju kardioprotektivnu ulogu dok su niske koncentracije vezane sa povećanim rizikom od ateroskleroze i kardiovaskularnih bolesti. Protektivni efekat HDL�a je primarno vezan za HDL 2 subfrakciju. HDL čestica jedina od svih lipop� roteinskih čestica ima antiaterogena svojstva. Protektivna uloga HDL�a proističe iz svojstva ove čestice da sakuplja holesterol iz perifernih ćelija i na osnovu njene antioksidativne zaštite. Deponovanje
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�21
lipida u aortama je u obrnutom odnosu sa koncentracijom HDL�holesterola. HDL uklanja holesterol iz makrofaga bogatih lipidima na taj način što hvata oslobođene lipide ili kroz receptorski posredovan efiuks holesterola. Mehanizmi koji objašnjavaju ulogu HDL�a u prevenciji stvaranja arterijskih plakova još uvek nisu razjašnjeni. Najnovija otkrića ukazuju da HDL štiti i LDL čestice od oksidacije jer pose� duje antioksidacioni sistem zaštite. U cilju procene protektivnog efekta HDL�a potrebno je određivati koncentraciju HDL�holesterola ili koncentraciju apo A�l. Kontraverzno je da li merenje apo A�l ima veći diskriminacioni efekat za kardiovaskularni rizik od merenja HDL�holesterola. Postoje dokazi da merenje subfrakcija HDL�a (HDL 2 i HDL 3) ima veći značaj za utvrđivanje kardiovaskularnog rizika od merenja ukupnog HDL�holesterola. Postoji obrnuta korelacija između HDL�holesterola i plazmatske koncentracije triglicerida. Debljina, pušenje kao dijabetes tipa II snižavaju HDL�holesterol dok fizička aktivnost i umerena konzumacija alkohola povećavaju HDL�holesterol. Deficijencija apo A�ll ne do vodi do prerane ateroskleroze dok je kod deficijencije apo A�l dokazana asocijacija sa povećanim rizikom od kardiovaskularnih bolesti. Poremećaj u aktivnosti enzima LCAT isto tako je vezan za povećani rizik. Lipoprotein (a) Pored apolipoproteina koji su već opisani, postoji i apolipoprotein koji je označen kao (a). On ne postoji samostalno u plazmi već je vezan za apo B�100 pomoću disulfidne veze i zajedno čine lipoprotein (a) ili Lp(a). Struktura Lp(a) pokazuje homologiju sa plazminogenom jer imaju zajednički prote� azni deo. Sinteza Lp(a) se odigrava u jetri, gde se on vezuje za apo B�100. Metabolizam ovog proteina u plazmi nije u potpunosti razjašnjen i on neučestvuje ni u jednoj fazi metabolizma lipoproteinskih čestica, lako se tačna funkcija Lp(a) ne zna, utvrđeno je da je on nezavisni faktor rizika od ateroskleroze. Homologija koja postoji između Lp(a) i plazminogena, ukazuje na to da lipoprotein (a) povezuje metabolizam lipida sa vaskularnom trombozom i fibrinolizom. Pri elektroforezi Lp(a) migrira kao pre� p lipoprotein. Lp(a) pokazuje polimorfizam i do sada je opisano 11 fenotipova i 19 genotipova. Razlike između pojedinih izoformi uslovljava različitu molekulsku masu apo (a) koja se kreće od 300 000 do 800 000. Manje izoforme su vezane za više koncentracije Lp(a). Koncentracija Lp(a) je viša kod pacijenata sa koronarnom bolešću i dokazano je da je on neza� vistan faktor rizika od ateroskleroze. Lp(a) koncentracija je važna za prognozu kardiovaskularnog rizika kod žena u svim starosnim dobima i kod mlađih muškaraca. Poseban značaj ima određivanje koncentracije Lp(a) u osoba sa porodičnom predispozicijom za rani rizik od koronarne bolesti. Ispiti vanja su pokazala da se Lp(a) deponuje u intimi arterija i aterosklerotskim plakovima. Sposobnost Lp(a) da se deponuje u ekstracelulamom matriksu, zajedno sa potencijalnom interferencijom sa fibri� nolitičkim mehanizmom, sugerira njegovu direktnu ulogu u aterogenezi. Enzimi i receptori koji sudeluju u metabolizmu lipoproteina Na osnovu dosada izloženih mehanizama metabolizma lipoproteina vidimo da je on kontrolisan pre svega enzimima i receptorima. Regulacijom aktivnosti ovih enzima putem aktivatora i inhibitora, kao i regulacijom sinteze enzima i receptora, metabolizam lipoproteina se usmerava u određenom pravcu. Posebnu ulogu ima hormonska regulacija aktivnosti i kocentracije enzima. Najvažniji enzimi i receptori u metabolizmu lipoproteina su: 1. Lipoproteinska lipaza (LPL) je ekstracelulami enzim koji je vezan sa glikozaminoglikan� heparin�sulfatom za endotelne ćelije kapilara i koji je prisutan u velikim količinama u kapilarima adipoznog tkiva i mišića. LPL zahteva prisustvo apo C�ll za regulaciju njegove aktivnosti. Rezultat LPL aktivnosti je parcijalna hidroliza jezgra lipoproteinske čestice tj. triglicerida kod čestica bogatih trigliceridima na monogliceride i masne kiseline. Masne kiseline preuzima tkivo i reesteri� fikuju se ili deponuju u adipozno tkivo ili služe kao izvor energije u mišićima. Monogliceridi se dalje sukcesivno hidrolizuju do glicerola i masnih kiselina. 2. Hepatična lipaza (HL) se sintetiše u hepatocitima i deluje na površini endotela hepatičnih kapilara uklanjajući trigliceride iz HDL 2 i HDL 3. On isto tako može da deluje na I DL i da oslobodi LDL. 3. Lecitin�holesterol�aciltransferaza (LCAT) se sintetiše u jetri i oslobađa u cirkulaciju gde katali� zuje esterifikaciju slobodnog holesterola na površini gušćih HDL 3 čestica. Ovako stvoreni estri
4�22
Medicinska biohemija
holesterola se pomeraju u jezgro, i omogućavaju da HDL stekne više slobodnog holesterola od drugih lipoproteina i ćelijske membrane. Na ovaj način HDL čestice postaju veće i manje gustine, i prelaze u klasu HDL 2. Proučavanjem LCAT deficijentnih osoba zaključeno je da je LCAT esencijalan za normalno sazrevanje, interkonverziju i reorganizaciju svih lipoproteinskih klasa i uključen je u procese gde se holesterol vraća iz perifernog tkiva u jetru, tj. reverzni transport holesterola. 4. Holesterol�estar�transferni protein (CETP) Aktivnost CETP u reverznom transportu holesterola je od centralne važnosti. Estri holesterola stvoreni sa LCAT�om inicijalno su lokalizovani u ok viru hidrofobnog jezgra HDL�a, ali CETP olakšava njihov transfer na VLDL i hilomikronske ostatke. Kao rezultat daljeg katabolizma VLDL�a, ovi estri holesterola se mogu pojaviti u LDL�u. Estri holesterola produkovani dejstvom LCAT na HDL, se vraćaju u jetru putem LDL�a i ostataka hi� lomikrona. 5. Ćelijski površinski receptori imaju ključnu ulogu u metabolizmu lipoproteina. Lipoproteinski(re� ceptori su važni u održavanju homeostaze lipoproteina i za ćelijski metabolizam lipoproteina. Postoji veći broj različitih receptora, ali najviše izučavan je LDL�receptor (apo B�100:E). Ovaj recep� tor su prvo opisali naučnici Brown i Goldstein.
ATEROSKLEROZA I METABOLIZAM LIPOPROTEINA Ateroskleroza je dugotrajan, hroničan patofiziološki proces koji se odvija u zidovima krvnih sudo va i dovodi do taloženja holesterola i stvaranja aterosklerotskih plakova. Obzirom da se holesterol taloži u tim plakovima odavno se zna da je ateroskleroza posledica poremećaja u metabolizmu lipida. Novija ispitivanja su ukazala da je ateroskleroza posledica ne samo poremećaja u metabolizmu lipida već i poremećaja u procesu hemostaze, kao i da je to inflamatorni proces jer je u subendotelnom prostoru uočeno prisustvo brojnih medijatora inflamacije. Proces ateroskleroze ne može se objasniti samo sa stanovišta ova tri patofiziološka procesa već je to kompleksan proces koji je pod uticajem brojnih faktora rizika. Faktori rizika za pojavu ateroskleroze mogu se podeliti na promenljive (varijabilne) i nepromenljive (nevarijabilne) i oni su prikazani u Tabeli 4�3. Tabela 4�3. Faktori rizika za pojavu aterosklerozu.
Promenljivi Lipidni
Nepromenljivi Nelipidni
Holesterol t Trigliceridi t LDL�holesterol T
Dijabet Hipertenzija Pušenje
Starost Pol
HDL�holesterol 4
Nepravilna ishrana Alkohol Gojaznost (BMI) kg/m2 Fizička neaktivnost Trombogeni faktori
Genetske predispozicije
Rasa
Na promenljive faktore rizika možemo uticati i smanjiti rizik za aterosklerozu, ali na nepromenljive ne možemo deiovati, ali moramo biti svesni njihovog postojanja u tumačenju rizika. Poznato je da su muškarci u periodu od 35 do 45. godine izloženi većem riziku od kardiovaskularnih bolesti u odnosu na žene što se tumači pre svega nepovoljnijim lipidnim statusom. Promenljive faktore rizika možemo podeliti na lipidne i nelipidne. Imajući u vidu sam proces ateroskleroze i ulogu holesterola u formira�
4�23
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
nju aterosklerotskog plaka u faktore rizika spadaju lipidni parametri koji se najčešće određuju u bio� hemijskim laboratorijama, a to su: visok ukupan holesterol, još bolji pokazatelj je visok LDL�holesterol obzirom da je LDL čestica najaterogenija jer je glavni nosilac holesterola u cirkulaciji. Potom triglice� ridi koji su posredno aterogeni jer se razmenjuju između lipoproteinskih čestica i time doprinose po većanoj aterogenosti LDL čestice i smanjenoj protektivnoj ulozi HDL čestice. Nizak HDL�holesterol je vezan za povećan rizik od ateroskleroze. Ateroskleroza je dugotrajan proces koji se odvija u fazama, a histološki se ateroskleroza odraža va na endotel krvnih sudova gde dolazi do deponovanja holesterola. Na Slici 4�16. su prikazane Prodor monocita kroz endotel
Stvaranje penastih ćelija
r**^
£
t
�
Jf
Stvaranje masnih pruga
Stvaranje ateroma sa fibroznom kapom
Slika 4�16. Faze u razvoju aterosklerotskog plaka.
faze u razvoju ateroskleroze. U ovom procesu sudeluje niz faktora koje produkuju ćelije endotela i subendotelnog prostora, poput monocita i makrofaga. U početnoj fazi zbog disfunkcije endotela dolazi do prodora monocita u subendotelni prostor i njihove diferencijacije u makrofage. U sledećoj fazi makrofage nekontrolisano preuzimaju holesterol prevashodno iz LDL čestica i nastaju depoi lipida koji daje penast izgled ćelijama. Daljom akumulacijom holesterola nastaju masne pruge jer se holesterol akumulira ne samo u penastim ćelijama već i ekstracelularno. U ovoj fazi ne dolazi do kliničkih simptoma. Makrofage luče razne faktore poput citokina, faktora rasta koji dovode do proliferacije ćeli ja glatkih mišića iz intime u mediju. Ćelije glatkih mišića produkuju ekstracelularni matriks�kolagen što vodi ka stvaranju fibrozne kape i aterosklerotskog plaka. Deponovanje lipida i stvaranje aterosklerotskog plaka postepeno sužava lumen krvnog suda i time otežava cirkulaciju. Na preseku vidimo da se aterosklerotski plak sastoji iz jezgra, sa penastim ćelijama koje vremenom izumiru i ostaju naslage lipida koje čine lipidni bazen ili jezgro oko koga se nalazi fibrozna kapa koju formiraju aktivirane ćelije glatkih mišića prema lumenu krvnog suda (Slika 4�17). Ćelije glatkih mišića produkuju matriks i stvaraju fibroznu kapu različite debljine koja utiče na stabilnost aterosklerotskog plaka. Ukoliko je omotač debeo plak je stabilan u odnosu na plak sa tankom opnom koja lako može da prsne, pogotovu na krajevima i da dovede do izlivanja sadržaja plaka u cirkulaciju i da inicira proces tromboze. U početku smo rekli da je ateroskleroza dugotrajan proces. Masne pruge se mogu uočiti još u detinjstvu i njihova transformacija u kompletne lezije obično traje četiri do pet dekada pre nego što se klinički manifestuje bolest u vidu koronarne bolesti (angine pec� toris, infarkta miokarda ili iznenadne smrti), cerebrovaskularnih oboljenja i perifernih vaskulamih oboljenja.
Medicinska biohemija
4�24
Intim
\�^'J
penasta ćelija �"Aktivna" GMCintime � Normal GMĆ medie
Slika 4�17. Anatomija aterosklerotskog plaka. Uloga oksidovanog LDL�a u procesu ateroskleroze Povećana koncentracija plazmatskog LDL�holesterola predstavlja glavni faktor rizika za pojavu i razvoj ateroskleroze. Kliničke, epidemiološke i genetske studije nedvosmisleno ukazuju da LDL� čestice dovode do ateroskleroze. Precizan mehanizam kojim LDL dovodi do ranog stvaranja masnih naslaga još je u fazi istraživanja. Preuzimanje holesterola pomoću klasičnog LDL�receptorskog puta ne može dovesti do značajne akumulacije holesterola, zbog toga što je LDL�receptor regulisan mehanizmom feedback inhibicije intracelularnim sadržajem holesterola. Suština ateroskleroze leži u modifikaciji lipoproteinskih čestica, zapravo u njihovim fizičko�hemijskim promenama koje menjaju funkciju ovih čestica odnosno njihov normalan metabolizam. U razvoju ateroskleroze najvažnija je modifikaci ja LDL�a kao nosioca najveće količine holesterola u organizmu. Modifikacija LDL�a može biti: a) he� mijska � oksidativna modifikacija kao najvažnija, zatim acetilacija i glikozilacija; b) fizička � agregaci� ja. Modifikovane forme LDL�a se preuzimaju alternativnim putem (mehanizam "scavanger" recepto� ra), što rezultira akumulacijom holesterola i stvaranjem penastih ćelija, pošto "scavanger" receptori nisu regulisani sa sadržajem holesterola u ćeliji. U aterosklerotskim lezijama dokazano je prisustvo oksidovanog LDL�a. Modifikacija LDL�a se dešava u subendotelnom prostoru gde postoji mnogo veći broj štetnih agenasa pre svega oksidanasa. LDL čestica lako prelazi u subendotelni prostor u slučaju disfunkcije endotela (Slika 4�18). Ovo stanje se javlja kod hipertenzije, u slučaju jako visokih vrednosti holesterola u krvi pod uticajem genetskih faktora ili unosa hranom, kao i kod prisustva malih, gustih LDL čestica koje lakše prolaze kroz endotelnu barijeru. Oksidativna modifikacija LDL čestica najčešće se odvi ja slobodnim radikalima koje oslobađaju prisutne ćelije endotela, monociti, makrofage, pa i ćelije glatkih mišića. U subendotelnom prostoru imamo mnogo manje antioksidanasa za razliku od plazme ko ja je dosta dobro puferovana antioksidansima. Oksidovani LDL je dokazan u subendotelnom prostoru i on pokazuje određene osobine. Oksidovani LDL pokazuje citotoksičnost, hemostatičnost i hemotak� tičnost u odnosu na ćelije endotela i ovo dovodi do oslobađanja mnogih citotoksičnih faktora, aktivira adhezione molekule koje omogućavaju adheziju monocita za endotel i njihov prodor kroz endotel u subendotelni prostor. Dejstvom ovih faktora dolazi u subendotelnom prostoru do diferencijacije monocita u makrofage. Modifikovani, oksidovani LDL se vezuje za receptore hvatače na makrofagama i oni preuzimaju LDL čestice u velikim količinama. Akumulacija velikih količina holesterola u makrofagama stvara penaste ćelije. Pored ovoga makrofage stvaraju određene faktore inflamacije, ali i faktore proliferacije ćelija glatkih mišića poput faktora rasta i citokina. Pod uticajem tih faktora ćelije glatkih
4�25
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
mišića proliferišu iz medie u intimu i sintetišu ekstacelulami matriks (kolagen) koji stvara fibroznu kapu aterosklerotskog plaka.
Lipoprotein
Adhezioni molekuli Hemotaktični faktori MCP�1 CSFs
Cirkulacija
Monocit
Tkivni faktori PAI�1 Endotelne ćelije Subendotelni prostor
Ćelije glatkih mišića: citokini i faktori rasta
Makrofaga
Slika 4�18. Efekti oksidovanih lipoproteina u procesu ateroskleroze. Oksidativna modifikacija se odvija prooksidansima koji se stvaraju u subendotelnom prostoru i to su: •
metalni joni gvožđa i bakra;
•
enzimi lipoksigenaze (najvažnija je 15�lipooksigenaza); membranski enzimi � NADPH�oksidaza; produkti dejstva mijeloperoksidaze; • reaktivne vrste kiseonika � slobodni radikali superoksid�anjon; • reaktivne vrste azota. Fiziološki tačan mehanizam oksidacije LDL�a in vivo još uvek nije tačno ustanovljen. Mnoge studije ukazuju da je superoksid�anjon jedan od glavnih agenasa koji dovodi do oksidacije LDL�a. Postavlja se pitanje zašto LDL čestica lako podleže oksidativnoj modifikaciji. Svakako zbog sadržaja lipi� da, ali promene se ne dešavaju samo na lipidnoj komponenti LDL čestice nego i na apoproteinima. Najpre se odigravaju hemijske promene, zatim fizičke i na kraju funkcionalne promene. Dejstvom ok� sidanasa dolazi do oksidacije polinezasićenih masnih kiselina koje ulaze u sastav estara holesterola, fosfolipida i prisutnih triglicerida, ali isto tako i do oksidacije samog holesterola. Lipidna peroksidacija stvara lipidne perokside koji dovode do stvaranja štetnih aldehida (malondialdehida). Ovi aldehidi hemijski modifikuju apolipoprotein B dovodeći do njegove fragmentacije. Rezultat lipidne peroksidaci� je je pramena fizičkih karakteristika LDL čestice: gustine, naelektrisanja, a na kraju i funkcije LDL čestice tj. sposobnost vezivanja za LDL�receptore putem apolipoproteina B. Smanjenje afiniteta za LDL�receptore i povećanje afiniteta za receptore hvatače na makrofagama dovodi do stvaranja pe� nastih ćelija. Slobodni radikali nastaju u većini metaboličkih procesa, ali organizam ima svoju antioksidacionu zaštitu. Štetno dejstvo slobodnih radikala neutrališe se antioksidansima. Plazma je dobro puferovana u odnosu na slobodne radikale (pre svega zaštitu pruža albumin), pa zato LDL podleže mnogo lakše
4�26
Medicinska biohemija
oksidativnoj modifikaciji u subendotelnom prostoru. Ali i u ovom prostoru postoji zaštita od oksidana� sa. Antioksidantna zaštita postoji u samoj ćeliji i nju sačinjava: glutation i enzimi poput superoksid� dismutaze, katalaze i glutation�peroksidaze. Ekstracelularni antioksidansi su: a�tokoferol i karoteni koji su prisutni u tkivima, ali ulaze kao lipofilne komponente i u samu LDL česticu. Hranom se isto tako unose antioksidansi: vitamin C, likopen iz paradajza i polifenoli � flavonoidi. Flavonoidi su prisutni u crvenom vinu, pa Francuzi svoj manji morbiditet od kardiovaskularnih bolesti objašnjavaju svakodnevnom umerenom konzumacijom vina. Antioksidacionu ulogu ima i HDL koji sadrži enzim paraok� sonazu koja uklanja perokside. U stvari u organizmu pa i subendotelnom prostoru postoji ravnoteža između prooksidanasa i antioksidanasa i ako se ona naruši dolazi do svih opisanih modifikacija lipop� roteinskih čestica.
POREMEĆAJI U METABOLIZMU LIPOPROTEINA Klasifikacija dislipoproteinemija Poremećaji u metabolizmu lipoproteina mogu se klasifikovati na više načina. Klasična podela je po Fredericksonu koji je hiperlipoproteinemije podelio na pet tipova (l�V) na osnovu toga koja je frakcija lipoproteina koja sadrži apo B, povećana pri elektroforetskom razdvajanju plazme. Ova podela je kasnije proširena uvođenjem dva podtipa u sklopu tipa II prema klasifikaciji Svetske zdravstvene organizacije (VVorld Health Organization, VVHO). Drugi naziv ove klasifikacije je beta klasifikacija. Klasifikacija Svetske zdravstvene organizacije je deskriptivna za odgovarajući fenotip, ali ne ukazuje na pravi uzrok dislipoproteinemije tj. ne razlikuje primarnu od sekundarne hiperlipidemije. Klasifikacija na osnovu VVHO ne daje genetsku osnovu i mehanizam tog poremećaja. VVHO klasifikacija se zasniva na povećanju samo lipoproteina koji sadrže apo B, dok o poremećajima lipoproteina koji sadrže apo A nema objašnjenja. Poremećaji u HDL�u nisu uključeni, tako da ovo nije kompletan pristup. Novija podela se zasniva na genetskoj klasifikaciji koja ujedno opisuje i mehanizam poremećaja. U daljem tekstu navedene su i druge podele u dislipoproteinemijama koje se koriste: • primarne i sekundarne; • hiperlipoproteinemije i hipolipoproteinemije; • disbetalipoproteinemije i disalfalipoproteinemije; • poremećaji u egzogenom, endogenom metabolizmu ili u reverznom transportu holesterola. Sve ove podele imaju prednost u odnosu na podelu po Fredericksonu, jer ukazuju na uzrok poremećaja, ali se ova osnovna još uvek široko primenjuje, jer opisuje sve promene biohemijskih parametara kod određenog fenotipa. Hiperlipoproteinemije imaju veći značaj od hipolipoproteinemija jer su one praćene povećanim rizikom od ateroskleroze i kardiovaskularnih poremećaja. U ovom tekstu dislipoproteinemije su prikazane u zavisnosti od poremećaja u određenoj lipoproteinskoj čestici, a u zagradi je uvek naznačen i fenotip po Fredericksonu.
Hiperlipoproteinemije Povećanje hilomikrona (Tip I) Hiperhilomikronemija se karakteriše sa visokim vrednostima triglicerida i može se jednostavno postaviti dijagnoza na osnovu mlečnog prstena od hilomikrona koji se nalazi u uzorku plazme posle gladovanja. Deficijencija enzima lipoproteinske lipaze ( LPL) je glavni uzrok poremećaja u klirensu hilomikrona. LPL je odgovorna za inicijalnu hidrolizu triglicerida i njegova neaktivnost sprečava uklanjanje egzogenih triglicerida iz cirkulacije. Hiperhilomikronemija može biti prouzrokovana i deficijenci� jom ili potpunim odsustvom apo C�ll, kofaktora LPL u hilomikronima koji je odgovoran za aktivaciju
4�27
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
ovog enzima. Odsustvo apo C�II je genetski defekt koji se nasleđuje recesivno i može se detektovati određivanjem koncentracije apo C�II u plazmi. Dijagnoza hiperhilomikronemije postavlja se na osno vu određivanja enzima LPL. Ovaj enzim se najpre mora osloboditi sa zida endotela krvnog suda da vanjem heparina intravenozno. Ukoliko se ovo oboljenje javi u mladosti to je primarni ili urođeni poremećaj. Ovaj tip se javlja i kod starijih ljudi, obolelih od akutnog pankreatitisa, nekontrolisanog dijabetesa i hipotiroidizma. Sekundarno hiperhilomikronemija se javlja kod imunoloških oboljenja kao što su disglobulinemija ili sistemski lupus eritromatosus. Pravilna dijagnoza se u ovom slučaju može postaviti na osnovu istorije bolesti i fizičkog pregleda. U Tabeli 4�4 date su osnovne biohemijske promene koje prate ovaj poremećaj. Iz tabele vidimo da su trigliceridi vrlo visoki i da su prisutni hilomikroni koji pri elektroforetskom razdvajanju ostaju na startu. Tabela 4�4. Biohemijski profil u hiperhilomikronemiji. Parametar
Holesterol Trigliceridi LDL�holesterol HDL�holesterol Apolipoproteini Izgled plazme Elektroferogram Aterogenost
Tip 1 (hilomikroni T) Nilit
TTT N Nilil B�48T A� IVt C�II ti Mlečni prsten Hilomikroni T
Povećanje LDL�a ( Tip lia i tip llb) Hiperlipoproteinemija tipa II je metabolički poremećaj od najvećeg kliničkog interesa u poremeća jima metabolizma lipida. Primarna hiperlipoproteinemija II ili familijarna hiperholesterolemija karakte� riše se pojavom ateroskleroze vrlo rano i dolazi do ranog oboljevanja, pa čak i smrti. Familijarna hiperholesterolemija se nasleđuje autozomalno�dominantnim genom. Kod homozigota sa familijarnom hiperholesterolemijom, vrednosti ukupnog holesterola i LDL�holesterola su vrlo visoke (vidi Tabelu 4� 5) i pored dijetalne ishrane bez masti i holesterola. Smrt homozigotnih osoba koji se ne lece se javlja čak pre tridesete godine. Ispitivanja familijarne hiperholesterolemije pokazala su da kod ovih osoba postoji greška u metabolizmu LDL čestica, pre nego višak sinteze. Ćelije homozigotnih osoba pokazuju deficijenciju u bro ju funkcionalnih LDL�receptora i rezistentne su na biohemijske procese u kojima sudeluje LDL, kao stoje supresija aktivnosti HMG�KoA�reduktaze. Zbog nepreuzimanja LDL�a putem receptora, LDL se značajno povišava. Za razliku od ovog receptorskog puta, alternativni put koji ne zavisi od LDL� receptora normalno funkcioniše. U makrofagama ne postoji mehanizam kontrole deponovanja holesterola i on se taloži u velikim količinama i vodi ka stvaranju penastih ćelija. Osobe koje su homozigoti imaju velike naslage holesterola u makrofagama slezine, hepatičnim Kupferovim ćelijama i histiociti� ma kostne srži. Na Slici 4�19 prikazan je metabolizam lipoproteina kod familijarne hiperholesterolemi je gde možemo videti da se zbog nedostatka LDL�receptora, pre svega u ćelijama jetre, nagomilava velika količina LDL�holesterola u plazmi. Familijarnu hiperholesterolemiju su najviše proučavali naučnici Goldstein i Brovvn. Njihova istraživanja su se pre svega odnosila na receptorski put metabolizma LDL�holesterola zašto su dobili i Nobelovu nagradu. Proučavanja Goldsteina i Brown�a su pokazala da homozigotni pacijenti mogu da se klasifikuju u dve kliničke subgrupe prema aktivnosti LDL�receptora. Osobe sa nedetektabilnom
4�28
Medicinska biohemija
a
t 1 LDL�C
Genetski defekt u sintezi LDL�receptora
Normalan ,�£0° x metabolizam ° ©©f Q0
Slobodne masne kiseline
Kapilar
J IDL
VLD L
VLD L
o
0A 0n '
Slobodne masne kiseline Lipoproteinska lipaza
Lipoproteinska lipaza
Slika 4�19. Metabolizam lipoproteinskih čestica u normalnom metabolizmu (a) i primarnoj hiperho� lesterolemiji (b).
receptorskom LDL aktivnošću (receptor negativne) imaju ranu pojavu kardiovaskularnih bolesti i visoku učestalost smrtnosti u odnosu na osobe homozigotne kod kojih postoji izvesna rezidualna akti vnost (2�25 % od normalne) i to su (receptor defektne). Kod trećeg tipa abnormalnosti, jedan receptor negativan alel se kombinuje sa normalno vezujućim receptorom, tako da je ovo slučaj da receptor nema sposobnost da uvuče vezani LDL. Svaka od ovih mutacija u LDL�receptorima oštećuje sposobnost ćelije da preuzme i degradira LDL. Brown i Goldstein su opisali strukturu LDL�receptora, njegovu sintezu i post�translacione modifikacije. Ovo omogućava detaljniju klasifikaciju abnormalnosti u LDL�receptoru prema mestu gde dolazi do mutacije (Slika 4�20). Postoje četiri mesta gde može doći do mutacije: na mestu sinteze, transporta od endoplazmatičnog retikuluma do Goldžijevog kompleksa, na mestu vezivanja receptora za ćelijsku membranu i za migraciju prema obloženim jamicama (coated pits). Ovi defekti su klasifikovani kao 1, 2, 3 i 4. I u okviru ovih klasa opisane su mnoge mutacije tako da je izuzetno veliki broj tih mutacija (preko 150) koje dovode do familijarne hiperholeste� rolemije. Endoplazmatski retikulum
Goldžijev kompleks
***
Tip mutacije
Sinteza 1
»
Transport sa ER do Goldži kompleksa 2
Vezivanje LDL�čestice 3
Uvlačenje u jamice 4
Slika 4�20. Tipovi mutacija u familijarnoj hiperholesterolemiji.
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�29
U Tabeli 4�5 su date promene pojedinih lipidnih parametara kod ove hiperlipoproteinemije. Familijarna hiperholesterolemija se karakteriše pre svega jako visokim vrednostima LDL�holesterola, pa i ukupnog holesterola i širokom p elektroforetskom trakom. Kliničke manifestacije primarne hiperholesterolemije se manifestuju vrlo rano aterosklerotskim promenama na krvnim sudovima i velikim rizikom od kardiovaskularnih poremećaja, ali usled visokih koncentracija holesterola u plazmi, dolazi do njegovog taloženja u potkožnom tkivu i tetivama i stvaraju se specifične izrasline oko očiju ksantaleme i na zglobovima ksantomi. Kada se uzima istorija bolesti, važno je ispitati postojanje neke druge bolesti ili uticaj faktora okoline koji utiču na povećanje nivoa LDL�holesterola. Uzimanje detaljne medicinske, socijalne, dijetalne, familijarne istorije kao i podataka o konzumiranju alkohola i pušenja je neophodno za pravu dijagnozu. Radi diferenciranja primarne od sekundarne hiperholesterolemije, potrebno je odrediti odgovara juće biohemijske parametre za ispitivanje funkcije bubrega, jetre i endokrinih žlezda, kako bi elimini� sa)i sekundarnu dislipidemiju. Ako se ne otkrije primamo oboljenje nekog od ovih organa posle ovak vih detaljnih ispitivanja još uvek se ne može pouzdano tvrditi da se radi o primarnoj hiperholestero� lemiji već treba sprovesti dijetu i razdvojiti poligenske osobe od monogenskih individua. Blago snižene holesterola 5�15 % u ukupnom holesterolu i u LDL�holesterolu se obično sreće kod nasledne familijarne hiperholesterolemije, dok kod bolesti izazvane ishranom ovaj procenat je mnogo veći. Pra vilna dijagnoza ovog oboljenja zahteva i familijarna izučavanja. Tabela 4�5. Biohemijski profil k od familijarne hiperholesterolemije.
Parametar
HotesteroJ Triglceridi LDL�tiolesterol HDL�hotesterol Apolipoproteini Izgled plazme Elektroferogram Aterogenost
Tip Ha (LDL t)
Tip ilb (LDLT, VLDLt)
T N
f
t t t
N ili i
Nilil
B�100 t Bistar P traka t
B�100 T Bistar ili zamućen P i pre�p traka t
TTf
t
U klasifikaciji po Fredriksonu postoje dva tipa ove hiperlipoproteinemije: tip lla sa normalnim VLDL�om i trigliceridima i tip Ilb sa povišenjem VLDL�om i trigliceridima. Tačna dijagnoza Ilb zahteva ispitivanje svih faktora koji utiču na nivo triglicerida. Obzirom da se trigliceridi normalno povećavaju sa starošću, veća je onda učestalost tipa Ilb kod starijih i debljih osoba. Kod osoba sa povećanim i holesterolom i trigliceridima, potrebno je primeniti ultracentrifugiranje lipoproteina plazme i ispitivanje fenotipa apo E radi diferencijacije tipa Ilb od tipa III. Hiperholesterolemije tipa II se može javiti i sekundarno kod nekih oboljenja. Uzroci povišenih vrednosti LDL�holesterola su: ishrana bogata mastima i zasićenim masnim kiselinama, hipotiroidi� zam, hronična renalna oboljenja, nefrotski sindrom, disgamaglobulinemija, multipli mijelom, hepatič� na opstrukcija i druga hepatična oboljenja, porfirije, trudnoća, anoreksija, nervoza, dijabetes, lekovi: estrogeni, androgeni, p blokatori, karbamazepin, progestini, itd . Povećanje IDL
(Tip III)
Hiperlipoproteinemija tipa III se karakteriše povišenim vrednostima triglicerida i holesterola, kao i abnormalnim lipoproteinom koji pliva sa VLDL frakcijom pri preparativnom ultracentrifugiranju. Ovaj plivajući p lipoprotein ili p migrirajući VLDL obično se spaja sa normalnom pre�p trakom na elektro� ferogramu, tako da daje jednu široku p traku specifičnog izgleda. Za pravilnu dijagnozu tipa III, potrebno je izvršiti ultracentrifugiranje i merenje izdvojenih frakcija. Posle izolacije VLDL frakcije (d<1,006
4�30
Medicinska biohemija
g/dL) preparativnim ultracentrifugiranjem, treba odrediti sadržaj holesterola i triglicerida u toj frakciji. Na tip III treba posumnjati kada je odnos VLDL�holesterola/VLDL�triglicerida veći od 0,35 ili kada odnos VLDL�holesterol/ukupni trigliceridi prelazi 0,25 (vidi Tabelu 4�6). Ovaj odnos je važan u preliminarnoj diferencijaciji tipa III od tipa llb i tipa IV. Definitivna metoda za potvrdu hiperlipoproteinemije tipa III je fenotipizacija apolipoproteina E. Fenotip apo E 2/E 2 je potvrda dijagnoze ovog oboljenja. Tabela 4�6. Biohemijski profil kod disbetalipoproteinemije.
Parametar
Holesterol Trigliceridi LDL�holesterol HDL�holesterol Apolipoproteini Izgled plazme Elektroferogram Aterogenost VLDL�hol/VLDL�TG VLDL�hol/ TG
Tip III (IDL t ) T
t N ili i Nilii fenotip E2/E2 zamućen široka p traka
t >0,35 >0,25
Pacijenti sa hiperlipoproteinemijom tipa III tj. disbetalipoproteinemijom, imaju u plazmi povećane dve vrste "remnant" čestica: ostatke (remnante) hilomikrona i ostatke VLDL (IDL). Smatra se da se oni povećavaju zbog parcijalno degradiranih hilomikrona i VLDL�a. Katabolizam ovih ostataka hilomi� kronskih čestica i IDL�a se odvija pomoću hepatičnih receptora, uglavnom putem LDL�receptora za koje se vezuju pomoću apo E. Obe lipoproteinske čestice koje se javljaju u tipu III bogate su u apo E, koji je se naziva i argininom bogat apolipoprotein. Apolipoprotein E je genetski polimorfan protein, ko ji ima tri izoforme E2, E3 i E4 označene redom prema rastućim izoelektričnim tačkama. Izoforme se karakterišu različitim afinitetom za receptore i to njihovo svojstvo usmerava metabolizam lipoprotein� skih čestica (vidi normalan metabolizam). Detaljnom analizom strukture izoformi apo E uočeno je da u disbetalipoproteinemiji, hepatični LDL�receptori, koji obično imaju visok afinitet i specifičnost za apo E, ne vezuju i ne uklanjaju lipoproteine normalnim postupkom. Za normalno vezivanje ostataka hilomikrona i IDL�a za receptore, utvrđeno je da je neophodno prisustvo izoformi apo E3 ili apo E4. Izo� forma E2 ima smanjen afinitet prema receptom. Kod samo 1 % populacije, nađen je E2/E2 fenotip, i ovaj fenotip je vezan za pojavu kliničkih manifestacija disbetalipoproteinemije. Brojne studije su ukazale da i heterozigotni fenotipovi E4/E2 i E3/E2 imaju dvaput veću verovatnoću da imaju hipertriglice� ridemiju nego individue sa fenotipom E 4/E4, E 4/E 3 i E 3/E 3. Pacijenti sa disbetalipoproteinemijama imaju karakteristično niske nivoe LDL�a jer je pretvaranje VLDL�a u LDL�a poremećeno tj. lipidna kaskada VLDL�LDL je blokirana. Hiperlipoproteinemija tipa III je još jedna lipoproteinska abnormalnost vezana za receptore u kojoj je normalna VLDL katabolička kaskada koja vodi ka LDL�u, poremećena. Pored izoforme E2 za koju je definitivno utvrđeno da je uzrok disbetalipoproteinemije, novija ispitivanja su utvrdila da i izoforma E4 ima klinički značaj. Izoforma E4 karakteriše se većim afinitetom za LDL�receptore, nishodnom regulacijom sinteze ovih receptora i povećanom koncentracijom LDL� holesterola, a samim tim i faktorom rizika za koronarnu bolest. Apo E se sintetiše i u ekstrahepatič� nom tkivu: mozgu, bubrezima, adrenalnim žlezdama i slezini i može biti prisutan u amiloidnim plako� vima. Novija ispitivanja su ukazala da je izoforma E4 učestalija kod obolelih od Alchajmove bolesti. Učestalost hiperlipoproteinemije tipa III se razlikuje zavisno od tehnike koja je primenjena i dijagnostičkih kriterijuma, ali se smatra da se klinička manifestacija javlja kod 1:10 000 individua. Neka
4�31
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
proučavanja ukazuju da 1 % populacije ima fenotip E 2/E2 koji je vezan za disbetalipoproteinemiju tj. povećani nivo IDL�a. Nasleđivanje je autozomalno recesivno. Kliničke manifestacije ove hiperlipoproteinemije zavise od mnogih faktora poput: starosti, pola, debljine i prisustva neke druge bolesti. Populaciona ispitivanja su pokazala da je većina pacijenata asimptomatski. Fizičke promene se odnose uglavnom na pojavu lezija na koži, ksantome, itd. U tipu III hiperlipoproteinemije javljaju se cerebralna i periferna vaskulama oboljenja, kao i kardiovaskularne bolesti. Tip III ili disbetalipoproteinemija se javlja i sekundarno kod hipotiroidizma, nekontrolisanog diabetes mellitusa i sistemskog eritematoznog lupusa. Unazad nekoliko godina analiza izoformi apo E je postala definitivni test za dijagnozu disbetali� poproteinemije, ali većina laboratorija ne može da primeni tehniku izoelektrofokusiranja za proučavanje izoformi apo E pa se još uvek koriste alternativni parametri za dijagnozu ovog poremećaja (vidi Tabelu 4�6). Povećanje VLDL�a
(Tip IV)
Povećanje VLD L�a ili endogenih triglicerida obično se javlja sekundarno kod raznih oboljenja, uzimanja lekova i određene ishrane. Zbog velikog broja stečenih hipertrigliceridemija vrlo je važna diferencijacija primarnog i sekundarnog tipa IV hiperlipoproteinemije. Najvažnije je pravilno odrediti tri� gliceride posle 12 časovnog gladovanja, uobičajene ishrane i stabilne telesne težine. Uzroci sekundarne hiperlipoproteinemije tipa IV su: alkoholizam , gojaznost, slabo kontrolisani dijabet, hipotiroidi� zam, nefrotski sindrom, uremija, trudnoća, itd. Hiperlipoproteinemija tipa IV se karakteriše povećanim vrednostima triglicerida i VLDL� holesterola. Nivo plazmatskog holesterola je normalan ili blago povišen (vidi Tabelu 4�7). LDL� holesterol je normalan ili nizak i HDL�holesterol je obično niži nego kod normotrigliceridemijske populacije. Hilomikroni nisu prisutni u plazmi osoba koje su gladovale. Elektroferogram pokazuje povećano bojenje pre�p lipoproteina kao rezultat povišenih VLDL vrednosti. Tačna dijagnoza hiperlipoproteinemije tipa IV se ne može postaviti na osnovu elektroforeze. Kod izvesnog broja osoba sa normalnim trigliceridima povišeni koncentracije Lp (a) mogu dovesti do intenzivnijeg bojenja zone pre�p lipoproteina. Tabela 4�7. Biohemijski profil h iperlipoproteinemije tipa IV.
Parametar
Holesterol Trigliceridi LDL�holesterol HDL�holesterol Apolipoproteini Izgled plazme Elektroferogram Aterogenost
Tip IV (VLDL T) Nilit
ttt N ili i Nilii Cll t, B100T zamućen pre�p traka
T
Zasada tačan uzrok primarne hipertrigliceridemije se ne zna, samo može da se pretpostavi. Neka proučavanja pokazuju da je povećana produkcija VLDL�a u jetri dominantan faktor u razvoju primarne hipertrigliceridemije, ali s druge strane postoje ispitivanja koja dokazuju da su povećane količine VLDL čestica, posledica smanjenog uklanjanja VLDL�a tj. sniženog intravaskulamog kataboliz� ma VLDL�a. Uzrok povišenih vrednosti triglicerida i poremećenog metabolizma VLDL�a može biti i višak apolipoproteina C�lll, koji je inače inhibitor lipoproteinske i hepatične lipaze. Drugi razlog endogene hipertrigliceridemije je hiperinsulinemija. Pozitivna korelacija između insulina i nivoa triglicerida, može biti uzrok, ali i ne mora. Mehanizam hipertrigliceridemije izazvane hiperinsulinemijom, objaš�
4�32
Medicinska biohemija
njava se delovanjem insulina na promotorski region apo C�lll regulišućeg gena koji stimuliše sintezu apo C�lll. Treći uzrok hipertrigliceridemije je sposobnost ugljenih hidrata da indukuju hipertrigliceri� demiju. Ali i ovo je kontradiktorno, jer uticaj ugljenih hidrata je varijabilni pojann koji može da utiče na pacijente sa hiperlipoproteinemijom tipa IV. Povećanje VLDL�a i hilomikrona
(Tip V)
Hipertrigliceridemija je najčešći uzrok hiperlipoproteinemije. Većina pacijenata sa povišenim tri� gliceridima ima IV tip hiperlipoproteinemije. Tip V ili kombinovana (endogeno�egzogena) hipertrigliceridemija se rede javlja. Vrlo često tip V je sekundarno oboljenje i pacijenti se obično nalaze između IV i V tipa hiperlipoproteinemije. Ova dva tipa pored značajnog porasta u vrednostima VLDL�a imaju ili hilomikrone (tip V) ili nemaju hilomikrone (tip IV). Precizno genetsko tumačenje primarne hiperlipoproteinemije tipa V se ne zna, kao što se ne može tačno protumačiti ni familijarni tip IV. Tip V hiperlipoproteinemije je obično sekundarno oboljenje u odnosu na veliki broj oboljenja, uzimanje lekova i nepravilnu ishranu. Postoje mnoge stečene hiperlipoproteinemije tipa V, tako da se mora izvršiti precizna identifikacija svih sekundarnih uzroka. Uzroci su uzimanje alkohola, estrogena i uopšte steroi� da. Radi diferencijalne dijagnoze mora se analizirati urin, glukoza, ispitati funkcija jetre, tiroideje i bubreg. Vrlo često kod pacijenata sa IV tipom, ako uzimaju alkohol, steroide, slabo regulišu dijabetes, javlja se V tip. Promene u biohemijskim parametrima izražene su kroz povišene vrednosti triglicerida u VLDL frakciji i hilomikronima (vidi tabelu 4�8). Hilomikroni se uočavaju kao mlečni prsten iznad plazme ukoliko se plazma ostavi da stoji na + 4° C preko noći (frižiderski test). Nekad je teško uočiti ovaj mlečni prsten iznad zamućene plazme, pa je potrebno uraditi elektroforezu. Zamućenost plazme je zbog prisustva endogenih triglicerida, velike količine VLDL čestica. Holesterol je normalan ili blago povišen. LDL�holesterol i HDL�holesterol su normalni. Kod nekih pacijenata uočena je redukcija u aktivnosti lipoproteinske lipaze. Tabela 4�8. Biohemijski profil hiperlipoproteinemije tipa V. Parametar Holesterol Trigliceridi LDL�holesterol HDL�holesterol Apolipoproteini Izgled plazme Elektroferogram Aterogenost
Tip V (VLDL ti hilomikroni) t ttt N ili i N ili i C�ll t B�48 t B�100T zamućen sa mlečnim prstenom pre�P traka t i hilomikroni t
Prisustvo hilomikrona i VLDL�a u plazmi nakon gladovanja ukazuje da je normalni mehanizam uklanjanja lipoproteina bogatih trigliceridima poremećen. Obično je postheparinska aktivnost lipoproteinske lipaze normalna, što omogućava razdvajanje od tipa I. Postoje tri hipoteze o uzrocima nastanka ove hiperlipoproteinemije: 1. Sinteza endogenih triglicerida i sekrecija VLDL�a su abnormalno povećane tako da dolazi do saturacije metaboličkih puteva razlaganja VLDL�a koji su zajednički sa metabolizmom hilomikrona, što prouzrokuje povećanje oba lipoproteina (i hilomikrona i VLDL�a); 2. Sinteza triglicerida je normalna, a poremećaj je u klirensu VLDL�a i hilomikrona. Ovaj mehanizam je specifičan za osobe sa deficijencijom apo C�ll kod kojih nedostatak aktivacije lipoproteinske lipaze rezultira poremećajem u hidrolizi triglicerida i iz hilomikrona i iz VLDL�a.
4�33
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
3. Finalno, tip V može biti posledica oba ova abnormaliteta ili pak viška apo O�lII koji inhibira hidrolizu lipoproteina bogatih trigliceridima. Familijarna kombinovana hiperlipidemija
(povećani LDL i VLDL lipoproteini)
Familijarna kombinovana hiperlipidemija se ranije klasifikovala kao tip llb ili tip IV, ali sada se sve više izdvaja kao specifična podgrupa. Klinički je ova podgrupa najučestalija hiperlipoproteinemija i u ovoj podgrupi je najveći broj pacijenata koji dozive infarkt miokarda (oko 30 %). Nasleđuje se auto� zomalno dominantno. Klinički simptomi ove kombinovane hiperlipidemije javljaju se uglavnom kod odraslih. Biohemijski profil ove hiperlipidemije dosta varira kod pojedinih osoba i karakteriše se sa povišenim LDL ili VLDL česticama ili sa oba lipoproteina, a kod nekih pacijenata fenotip dosta varira i u zavisnosti od drugih faktora: pušenja, alkohola, telesne težine i fizičke aktivnosti. Kao rezultat ovih poremećaja u lipopro� teinima, pacijenti imaju pre svega povišeni holesterol i apo B, a trigliceridi (iz VLDL�a) variraju tako daje diferencijacija od sekundarne hiperlipoproteinemije otežana. Osnovna karakteristika ove familijarne kombinovane hiperlipidemije je povećan apo B, sa povišenim ukupnim holesterolom i LDL�holesterolom. Vrlo često su i trigliceridi povišeni, a HDL�holesterol snižen. Primenom gradijent gel elektroforeze u okviru LDL frakcije, može se uočiti veće prisustvo malih, gustih LDL čestica koje su aterogenije od normalnog LDL�a. Ovaj tip hiperlipoproteinemije nema povišene vrednosti IDL i nije povezan sa različitim izoformama apo E. Smatra se da je ova hiperlipoproteinemija posledica viška hepatične produkcije lipoproteina. Katabolički procesi vezani za VLDL i klirens LDL�a su jako smanjeni. Ovakav poremećaj u sintezi i katabolizmu lipoproteina dovodi do izrazito aterogenog profila lipida u plazmi i povećanog rizika pre svega od kardiovaskularnih bolesti. Povećani HDL
(Hiperalfalipoproteinemije)
Familijarna hiperalfalipoproteinemija je relativno novo uočena genetska abnormalnost. Statistička analiza familija koje dugo žive dokazale su da se ova hiperlipoproteinemija prenosi autozomalno dominantno. Ovo stanje se može otkriti već kod dece. Do sada nije bilo epidemioloških studija ove hiperlipoproteinemije. Sekundarna hiperalfalipoproteinemija je detektovana kod terapije estrogenima i uzimanja alkohola. Dijagnoza ove hiperlipoproteinemije je otežana zato što nema kliničkih pokazatelja ovog poremećaja. Za sada nije pouzdano dokazana veza HDL�holesterola sa dužinom života, pri čemu duži ži vot podrazumeva produženje od 8 do 12 godina. Kod osoba sa povećanim HDL�om smanjena je učestalost oboljevanja od infarkta i samim tim je smanjen mortalitet od kardiovaskularnih i cerebro� vaskulamih bolesti. Ukoliko se kod dece uoči viši HDL�holesterol, proučavanjima u okviru familije može se postaviti dijagnoza ovog poremećaja. Ovaj sindrom se karakteriše pre svega povišenim vrednostima HDL�holesterol, slabo povišenim holesterolom i normalnim trigliceridima. U okviru HDL frakcije vidljive su samo čestice koje sadrže apo A�l (LpA�l) koje su povećane i odgovorne su za zaštitu od ateroskleroze. HDL čestice koje sadrže apo A�l i apo A�ll (LpA�l: A�ll) su znatno promenjene. Tačan mehanizam ove hiperlipoproteinemije se još ne zna, ali pretpostavka je da je vezana za pro� mene u klirensu lipoproteina bogatih trigliceridima i aktivnosti lipoproteinske lipaze, kao i povećane sinteze apo A�l.
Hipolipoproteinemije U poslednjih nekoliko godina hipolipoproteinemije su dobile u značaju pošto su do sada uglavnom ispitivane hiperliproteinemije. Hipolipoproteinemije imaju klinički značaj jer dovode do abnormalnosti u nekom od metaboličkih puteva. Na primer poremećaj u metabolizmu hilomikrona dovodi do promene u apsorpciji triglicerida, holesterola i liposolubilnih vitamina. Deficijencija u VLDL�u do vodi do poremećaja u dostavljanju endogenih triglicerida iz jetre u periferne ćelije. Abnormalnosti u HDL�holesterol ili u LCAT sistemu se odražavaju na uklanjanje holesterola iz perifernog tkiva i smanjenu protektivnu ulogu HDL čestica u aterosklerozi.
4�34 Redukovani LDL
Medicinska biohemija
(Hipobetalipoproteinemija)
Familijarna hipobetalipoproteinemija se nasleđuje autozomalno�dominantno. Ranije je smatrano da je ovaj poremećaj izuzetno redak, ali novija proučavanja su ukazala da je hipobetalipoproteinemi ja učestalija. Obično se ovom poremećaju ne posvećuje dovoljno pažnje, jer osobe sa nižim ukupnim holesterolom i LDL�holesterolom nemaju povećani rizik za aterosklerozu. Kao u slučaju povišenog HDL�holesterol, redukovana koncentracija LDL�holesterol je vezana za značajan porast u dužini života i kod muškaraca i kod žena. Ova dugovečnost je vezana i za snižen morbiditet i mortalitet od kardiovaskularnih bolesti kod ovih osoba. Smanjena učestalost infarkta miokarda i sniženi LDL� holesterol kod ovih osoba su u direktnoj korelaciji. Ovo stanje se ne srne mešati sa abetalipoproteinemijom tj. potpunim odsustvom apo B, što je praćeno malapsorpcijom masti i mentalnom retardacijom. U hipobetalipoproteinemijama, LDL� holesterol iako nizak, se može uvek detektovati, dok nivoi ostalih lipoproteina poput HDL mogu biti < niski, normalni ili povećani. Proučavanja metabolizma LDL�a, preciznije apo B kod pacijenata sa hipobetalipoproteinemijom ukazuju da ovi pacijenti sintetišu samo polovinu LDL�a, ali dalji katabolički procesi ove čestice ostaju normalni. Pošto je LDL proizvod razlaganja VLDL�a, pacijenti sa hipobetalipoproteinemijom isto tako imaju niske vrednosti triglicerida što ukazuje na sniženu produkciju VLDL�a. Ispitivanja pojedinih porodica pokazala su da postoje takve forme apo B koje rezultiraju ekstremno visokim klirensom LDL�a u metabolizmu putem receptora. Odsustvo LDL
(abetalipoproteinemija)
Abetalipoproteinemija je retko oboljenje, koje se karakteriše potpunim odsustvom lipoproteina koji sadrže apo B. Nasleđivanje je autozomalno recesivno. Abetalipoproteinemija se manifestuje potpunim odsustvom LDL�a sa vrlo niskim koncentracijama plazmatskog holesterola. Heterozigoti nemaju kliničke i biohemijske abnormalnosti, ali imaju snižene vrednosti LDL�a. U plazmi homozigotnih osoba nema hilomikrona, VLDL�a, LDL�a, a imunofluorescentna bojenja nisu dokazala prisustvo apo B u intestinalnoj mukozi. Kao posledica odsustva apo B, vrednosti triglicerida, holesterola i fosfolipida su niske. Ukupan plazmatski holesterol je vrlo nizak i sav taj holesterol je vezan za HDL frakciju. Nivo HDL�holesterola je blago snižen, a sastav lipida u HDL čestici je abnormalan, sa povećanim slobodnim u odnosu na esterifikovani holesterol i sfingomijelinom u odnosu na fosfatidilholin. Drugi apolipo� proteini A�l, A�ll i C su normalno prisutni. Tačan mehanizam se sada zna i to je abnormalnost u sintezi ili sekreciji lipoproteina koji sadrže apo B. Rezultat je teška malapsorpcija lipida zbog poremećaja u stvaranju hilomikrona i restrikcija u dostavi endogeno sintetisanog holesterola do perifernog tkiva putem LDL�a. Produkcija kortizola je snižena kod abetalipoproteinskih osoba. Ove promene ukazuju da se poremećaj u metabolizmu holesterola dešava na nivou sinteze pre nego na preuzimanju holesterola putem receptora. Proučavanja lipoproteina koji sadrže apo E ukazuju da deo holesterola može biti dostavljen perifernom tkivu i pomoću lipoproteina koji sadrže apo E. Klinički simptomi ovog oboljenja dosta variraju i zavise od težine oboljenja. Malapsorpcija masti iz hrane se javlja već kod dece, a posledica je mala telesna težina. Kod pacijenata koji uzimaju normalnu hranu javlja se steatoreja. Retardacija u rastu se javlja, pre svega zbog nedostatka liposolubil� nih vitamina. Malapsorpcija masti je praćena i sa teškom malapsorpcijom vitamina rastvorljivih u masti. Bez davanja vitamina E rastvorljivog u vodi, pacijenti boluju od progresivne degeneracije centralnog nervnog sistema. Ovo obično postaje vidljivo u prvoj dekadi života, sa ataksijom i slabošću mišića. Većina pacijenata ne može da hoda do sredine dvadesetih godina. Druga abnormalnost vezana za abetalipoproteinemiju je verovatno posledica nedostatka karotena i vitamina A koji se ne apsorbu� ju i javlja se noćno slepilo, ali ovo se može izbeći davanjem formi vitamina koje su u vodi rastvorljive. Protrombinsko vreme može biti produženo kao rezultat loše apsorpcije vitamina K, ali abnormalno krvarenje se uglavnom ne javlja.
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�35
Redukovani HDL (hipoalfalipoproteinemija) Ispitivanja ukazuju da je kod osoba sa sniženim HDL�om povećan rizik od ateroskleroze. Uzroci primame hipoalfalipoproteinemije su na nivou apo A�l, lecitin�holesterol�aciltransferaze, ABC1 transportera i neki drugi nepoznati genetski faktori. Poremećaj na nivou apo A�l mogu biti posledica kompletne deficijencije apo A�l ili promena u strukturi ovog apolipoproteina kao posledica mutacija u genu zaVapo A�l. Genetska deficijencija apo A�l posledica je delecije gena ili "nonsense" mutacije koje dovode do inhibicije sinteze apo A�l što rezultira odsustvom plazmatskog HDL�a. Neke osobe sa deficijencijom apo A�l pokazuju simptome rane koronarne bolesti. Strukturne mutacije apo A�l dovode do značajnog sniženja koncentracije HDL� holesterola i apo A�l. Smanjenje nivoa apo A�l kod strukturnih promena ovog apolipoproteina rezultat su brzog katabolizma apo A�l. Najpoznatija mutacija je apo A�l MMano koja dovodi do sniženja apo A�l za 40 % i HDL�holesterola za 67 %. Osobe sa strukturnim mutacija apolipoproteina su retko vezane za povećan rizik od aterosklerotskih promena. Deficijencija enzima LCAT može biti parcijalna ili potpuna deficijencija. Usled nedostatka enzima LCAT dolazi do poremećaja u esterifikaciji holesterola u plazmi i kao posledica javlja se akumulacija slobodnog holesterola u svim lipoproteinskim česticama. Lipoproteinske čestice su abnormalne veličine, oblika ili sastava. HDL čestice su uglavnom diskoidnog oblika ili jako male sferičnog oblika. Na elektroferogramu se vidi lipoprotein X. Parcijalna deficijencija dovodi do bolesti koju karakteriše specifičan izgled ribljeg oka. Oba oblika deficijencije LCAT snižavaju nivo HDL�holesterola, apolipoproteina, sa varijacijama u koncentraciji triglicerida i sa promenama na rožnjači (corneal opacities). Bez obzira na niže vrednosti HDL�holesterola i apo A�l nema preranih aterosklerotskih promena. Potpuna deficijencija LCAT se karakteriše težim simptomima i promenama u funkciji bubrega sa proteinurijom. Deficijencija LCAT dovodi do sledećih poremećaja u metabolizmu HDL�a: (1) relativnog odsustva apo A�l i (2) brzog katabolizma HDL čestica što dovodi do sniženih vrednosti HDL�holesterola. Odsustvo HDL�a (Tangierovo oboljenje, analfalipoproteinemija) Poremećaj u metabolizmu HDL čestice najčešće dovodi do Tangierovog oboljenja. Ovo retko au� tozomalno kodominantno oboljenje se karakteriše akumulacijom estara holesterola u retikuloendotel� nom sistemu i drugim tkivima. Novija istraživanja ukazuju da se preuzimanje holesterola iz perifernih ćelija, pa i penastih ćelija vrši olakšanim transportom sa ABC1 transporterom. Tangierovo oboljenje je posledica mutacija u ABC1 genu što ukazuje da je ovaj protein ključan u transportu holesterola iz ćelije na HDL česticu. Mutacije u ABC1 dovodi do defekta u efluksu holesterola iz makrofaga, sa brzim katabolizmom HDL�a i povećanim klirensom apolipoproteina A�l. Oboljenje se karakteriše pre svega odsustvom HDL�a u plazmi. Dijagnoza se postavlja na osnovu niskih vrednosti HDL� holesterola u plazmi određenih konvencionalnim precipitacionim tehnikama i to potvrdi odsustvom a lipoproteinske frakcije pri elektroforezi. Homozigotne osobe se otkrivaju pomoću ekstremno niskih vrednosti HDL�holesterola i apolipoproteina A�l i A�l I. Plazmatski ukupan i LDL�holesterol su obično niski i blaga hipertrigliceridemija se javlja. Kliničke manifestacije su dosta ozbiljne. Pacijenti se mogu prepoznati po uvećanim, žuto�naranđastim krajnicima. Akumulacija holesterola u retikuloendotelnom sistemu rezultira hepatosplenomegalijom, a zbog deponovanja lipida dolazi i do periferne neuropati� je, ali svakako najvažnije promene su akumulacija holesterola u makrofagama, transformacija u pe� naste ćelije i povećan rizik od aterosklerotskih promena.
Stečene hiperlipoproteinemije Stečena ili sekundarna hiperlipidemija se javlja zbog poremećaja u metabolizmu lipoproteina, a kao posledica: • određenog patološkog stanja; • primene terapije određenim lekovima; • egzogenih faktora (određene socijalne ili stečene navike).
4�36
Medicinska biohemija
Pravilno lečenje primarnog oboljenja ili korekcija terapije drugim lekovima je dovoljno za korekci ju hiperlipidemije. U nekim slučajevima, kao što je recimo oštećenje bubrega, kada je simptomatsko lečenje, lečenje ne utiče na metabolizam lipida pa hiperlipidemija opstaje. Početna ispitivanja svakog hiperlipidemičnog pacijenta podrazumevaju isključivanje sekundarnih uzroka. Forma u kojoj se iskazuje sekundarna hiperlipidemija zavisi od patološkog stanja i kako se ono odražava na metabolizam lipoproteina. Određena patološka stanja koja dovode do sekundarnih hiperlipidemija su metabolički poremećaji (dijabetes), oboljenja bubrega (nefrotski sindrom, hronična renalna insuficijencija, pacijenti na di jalizi), bolesti jetre (akutni i hronični hepatitis, holestaza, primarna bilijarna ciroza), pankreatitis, endokrini poremećaji (hipotiroidizam) i disproteinemije (multipli mijelom, makroglobulinemija). Mehanizmi nastanka sekundarnih hiperlipoproteinemija su specifični kod svake patologije. Dijabetes je usko povezan sa poremećajima u metabolizmu lipida. Postoje nekoliko mehanizama koji ob jašnjavaju ovu povezanost. U dijabetesu je obično prisutna hipertrigliceridemija. U obe forme dijabetesa postoji nedostatak insulina, bilo da se radi o apsolutnom kao što je to slučaj kod insulin zavisnog dijabeta ili o relativnom kod insulin nezavisnog dijabetesa. Insulin utiče na dva ključna enzima u metabolizmu triglicerida. Insulin aktivira lipoproteinsku lipazu i povećava brzinu klirensa lipoproteina bogatih trigliceridima u plazmi. Insulin ima suprotan efekat na hormon�senzitivnu lipazu adipoznog tki va, redukujući brzinu kojom se oslobađaju slobodne masne kiseline jer ima inhibitomo dejstvo na ovaj enzim. Zbog deficijencije insulina i redukovanog klirensa, povećan influks slobodnih masnih kiselina u jetru dovodi do povećane hepatičke sinteze triglicerida i povećanja VLDL čestica. U insulinskoj rezistenciji koja se obično javlja kod insulin nezavisnog dijabetesa ili dijabetesa tipa II, kao posledica poremećaja u regulaciji lipolize triglicerida u adipocitima i krvnim sudovima dolazi do (Slika 4�21):
Kapilari
H @
©
o
HSL�hormon senzitivna lipaza; LPL� lipoproteinska lipaza; SMK� slobodne masne kiseline Slika 4�21. Mehanizam dislipidemije kod rezistencije na insulin. 1) intenzivne lipolize triglicerida u adipoznom tkivu što uslovljava vrlo visoke vrednosti slobodnih masnih kiselina koje se transportuju u jetru i iz kojih se sintetišu endogeni trigliceridi. Indukovana je i sinteza apo B što povećava sadržaj VLDL�a u krvi. Zbog smanjene aktivnosti lipoproteinske lipaze smanjuje se razgradnja ovih endogenih triglicerida iz VLDL�a. 2) visoke koncentracije triglicerida u VLDL česticama uslovljavaju razmenu triglicerida sa estrima holesterola iz LDL�a i HDL�a što utiče na snižavanje HDL�holesterola i povećanje aterogenih malih gustih LDL čestica koje imaju veliku aterogenost jer lako prolaze u subendotelni prostor i podležu modifikaciji.
V. S pasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�37
U insulinskoj rezistenciji imamo aterogenu trijadu a to je visoki trigliceridi, nizak HDL�C i povećane male guste LDL čestice. Druga po značaju stečena hiperlipidemija se javlja kod hipotiroidizma. Ova hiperlipidemija je posledica smanjenog efekta hormona tiroideje, obzirom da tiroidni hormoni stimulišu sintezu LDL� receptora u slučaju hipotiroidizma smanjena je sinteza LDL�receptora, smanjena je eliminacija LDL�a receptorskim putem i kao posledica toga povećava se LDL�holesterol u krvi. Tiroidni hormoni utiču na brojne faze u metabolizmu lipida, a pre svega holesterola tako što povećavaju obim sinteze kao i eliminacije holesterola. Ako je stepen eliminacije više izražen, ukupni efekat dejstva tiroidnih hormona je pad koncentracije ukupnog holesterola i LDL�holesterola. Tiroidni hormoni stimulišu sintezu ključnog enzima u biosintezi holesterola, p�hidroksi�P�metil�glutaril�KoA�reduktazu, koji katalizuje konverziju p�hidroksi�p�metil�glutaril�KoA u mevalonat. Pored ovoga tiroidni hormoni stimulišu kon verziju mevalonske kiseline u holesterol. Važniji efekat tiroidnih hormona je uticaj na sintezu LDL� receptora i na pojačanu eliminaciju holesterola putem žuči i fecesa. Tiroidni hormoni utiču na sintezu apo A�l i apo C�ll i tako utiču na nivo HDL�a, dok je njihov efekat na trigliceride neznatan. Tako u hi� potiroidizmu, iako je smanjena sinteza holesterola, efekat usporene eliminacije je više izražen te imamo visoke koncentracije ukupnog holesterola. Hiperlipidemija kod nefrotskog sindroma podrazumeva povećan ukupan holesterol, ali i LDL� holesterol i trigliceride. Povišen VLDL i LDL u nefrotskom sindromu posledica su hepatične hiperprodukcije apo B�100 kao posledica povišene sinteze proteina u jetri. Usled masovnog gubitka proteina, a prevashodno albumina u nefrotskom sindromu organizam reaguje povećanom sintezom proteina u jetri, a samim tim i povećanom sintezom apolipoproteina, holesterola i triglicerida. Nivo porasta LDL� a zavisi od stepena hipoalbuminurije, dok je porast VLDL�a verovatno rezultat redukovanog uklanjanja. Aktivnost lipoproteinske lipaze je umanjena zbog gubitka albumina koji ne može da vezuje slobodne masne kiseline i kao posledica toga imamo inhibiciju aktivnosti enzima. HDL se može izgubiti urinom, i shodno tome koliki je odnos sintetisanog u odnosu na gubitak, HDL može biti nizak ili visok. U uremiji dolazi do vrlo visokih vrednosti triglicerida jer je spor katabolizam lipoproteina bogatih trigli� ceridima jer je aktivnost lipoproteinske lipaze snižena. Dolazi do značajne modifikacije LDL čestice tj do strukturnih i funkcionalnih promena usled dejstva uremijskih toksina (sijalinizacija, glikozilacija, karbamilacija) i do povećanja njihove aterogenosti. Prisustvo abnormalnih imunoglobulina koji se javljaju kod multiplog mijeloma, benigne monoklo� nalne gamapatije i lupusa mogu dovesti do poremećaja u metabolizmu lipoproteina. Kod ovih oboljenja dolazi do vezivanja imunoglobulina za lipoproteine, enzime ili receptore i na taj način dolazi do abnormalnog metabolizma lipoproteina. Uticaj lekova na pojavu hiperlipoproteinemije Određeni lekovi imaju neželjeno dejstvo (interferenciju) na metabolizam lipida i dovode uglavnom do povišenja LDL�holesterola i sniženja HDL�holesterola. U ovu grupu lekova spadaju diuretici, p� blokatori, ACE inhibitori, ciklosporin i fenobarbiton. Neželjeni efekat fenobarbitona na lipidne parametre posledica je indukcije hepatičnih mikrozomalnih enzima. Dejstvo estrogena Efekat estrogena na metabolizam lipida treba posmatrati sa tri aspekta: 1. Normalan metabolizam lipida u organizmu žene je pod značajnim uticajem estrogena što se može videti i u nivou pre svega LDL�holesterola kod žena u odnosu na muškarce. Estrogeni povećavaju hepatičnu sekreciju VLDL, ali ujedno utiču i na dalji katabolizam ovih čestica u LDL i njihovo efikasno uklanjanje putem LDL�receptora (Slika 4�22). Estrogeni utiču na pojačanu sintezu LDL�receptora i efikasno uklanjanje LDL čestica putem jetre. Pored stumulacije sinteze LDL�receptora, estrogeni pojačavaju i izlučivanje holesterola u vidu žučnih kiselina putem žuči. Efekat estrogena na metabolizam HDL čestica ispoljava se kroz stimulaciju sinteze ovih čestica i na njihov povoljan efekat uklanjanja holesterola iz perifernog tkiva. Efekat estrogena se ispoljava na lipidni status kod žena koje imaju zbog ovoga povoljniji lipidni status, manji rizik od ateroskleroze i od kardiovaskularnih bolesti pogotovu u reproduktivnom
4�38
Medicinska biohemija
periodu. Žene imaju niži ukupni i LDL�holesterol, dok je HDL�holesterol viši u periodu do me� nopauze. U postmenopauzi zbog prestanka lučenja estrogena, dolazi do rasta u vrednostima LDL�holesterola i ukupnog holesterola, dok HDL�holesterol kod žena i po prestanku lučenja estrogena ostaje viši za 20 % u odnosu na muškarce.
r Zuč Holesterol Žučne kiseline VL DL
(+) ^""""""N F A A
T
TGt
Ka
Pilar
m
© Lipoproteinska lipaza
Slika 4�22. Mehanizam dejstva estrogena. 2. Terapija oralnim kontraceptivima Efekat kontraceptivne terapije na lipidni status žene zavisi od oblika, odnosa estrogena i pro� gestena u primenjenim preparatima. Efekat progestena je suprotan efektima estrogena tj oni povećavaju LDL� i ukupan holesterol. Progesteni stimulišu sintezu lipoproteina u jetri, ali ne i njihovu eliminaciju. Noviji kontraceptivni preparati nemaju nepovoljan efekat na lipidne parametre. 3. Hormonska supstituciona terapija. Uticaj načina života na lipidni status Određene stečene navike nepovoljno deluju na lipidni status i spadaju u varijabilne faktore rizika za nastanak ateroskleroze. Epidemiološke studije su ukazale na nepovoljan efekat pušenja i alkohola na lipidni status. Ove navike pokazuju dozno zavisni efekat. Utvrđeno je da umerene doze alkohola povoljno deluju na lipidni status i povećavaju HDL (zbog indukcije u sintezi apolipoproteina A). Smanjena fizička aktivnost i gojaznost dovodi do sekundarne hiperlipidemije. Aterogena ishrana (visok sadržaj životinjske masti) u svakom slučaju nepovoljno deluju na lipidni status i povećani rizik od ateroskleroze.
ODREÐIVANJE LIPIDNOG STATUSA U kliničkoj praksi lipidi i lipoproteini se određuju u cilju: • postavljanja dijagnoze poremećaja lipida � dislipidemija; • utvrđivanja rizika od kardiovaskularnog oboljenja; • utvrđivanja terapije. Koronama bolest je vodeći uzrok morbiditeta i mortaliteta u razvijenim zemljama. Epidemiološke studije su pokazale da postoji direktna veza između povećane koncentracije holesterola u plazmi i
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�39
razvoja ateroskleroze. Nasuprot ovome utvrđeno je da postoji obrnut odnos između visoke koncentracije HDL�holesterola i rizika za pojavu koronarne bolesti. Najveći broj epidemioloških podataka koji se odnose na vezu između koncentracije lipida u plazmi i kardiovaskularnog rizika se zasnivaju na osnovnim merenjima lipidnog statusa poput određivanja ukupnih triglicerida ili merenja ukupnog holesterola u plazmi, lako su ova merenja zadovoljavajuća za epidemiološke studije, za tačnu dijagnozu poremećaja lipida potrebna su mnogo tačnija određivanja lipida i lipoproteina, kako bi kliničar utvrdio subgrupu pacijenata koji su pri podjednakoj koncentraciji holesterola ili triglicerida izloženi većem ili manjem riziku od kardiovaskularnih bolesti. Postavljanje dijagnoze dislipidemije, povećanog rizika od ateroskleroze i mogućnosti lečenja hi� perlipidemije podrazumevaju da se pravilno odredi lipidni status pacijenta. Postoji veliki broj metoda za ispitivanja lipidnog statusa i one mogu biti biohemijske ili metode molekularne biologije za ispitivanja na nivou gena. Biohemijske metode obuhvataju kvantitativne metode određivanja i metode razd vajanja lipoproteinskih čestica. Zbog multikomponentne strukture lipoproteina, rutinske laboratorijske metode ne mogu da mere koncentraciju ovih čestica. Umesto toga izabrana komponenta (lipidna ili proteinska) se meri i koristi kao marker za koncentraciju odgovarajućeg lipoproteina. Biohemijska ispitivanja dislipoproteinemija zasnivaju se na kvantitativnom određivanju: • lipidnih komponenti lipoproteinskih čestica (holesterola i triglicerida) • apolipoproteina U kliničko�biohemijskoj laboratoriji uglavnom se lipidni status ispituje na osnovu holesterola i triglicerida, mada je mnogo bolje, ukoliko je to moguće odrediti koncentraciju apolipoproteina. Apolipo� proteini su bolji pokazatelji poremećaja jer ne podležu toliko varijacijama recimo zavisno od ishrane kao što su tome podložni trigliceridi. Apolipoproteini kao proteini odraz su genetskih varijacija i više odražavaju specifičan fenotip određene osobe. Oni se mogu koristiti kao markeri koncentracije lipoproteina u stanjima kada koncentracija apolipoproteina reflektuje broj lipoproteinskih čestica. Na pri� mer apo B�100 je dobar marker za VLDL, LDL i IDL koncentraciju. Ipak određivanja apolipoproteina u laboratorijama nije široko primenljivo zbog složenijih i skupljih metoda određivanja ovih proteina. U sklopu lipidnog statusa najčešće se vrši određivanje: • ukupnog holesterola • HDL�holesterola • LDL�holesterola • triglicerida Ovo spada u osnovni nivo određivanja i dovoljan je za dijagnozu postojanja dislipidemije i povećanog rizika od ateroskleroze. Otkrivanje pravog uzroka dislipoproteinemije zahteva i druga ispitivanja: • određivanje apo A�l, apo B, Lp(a); • kvantitativna elektroforeza lipoproteina; • ispitivanje polimorfizma apolipoproteina apo E, apo B�100, itd • određivanje oksidovanog LDL�a, malih gustih LDL, itd • određivanja aktivnosti enzima (LPL, LCAT, CETP, itd) Lipidni status se mora pravilno odrediti kako bi izbegli sve faktore okoline ili socijalne navike koje utiču na metabolizam lipida i dovode do sekundarnih hiperlipoproteinemija. Postoje određena pravila u ispitivanju lipidnog statusa kojih se pacijent, biohemičar i lekar moraju pridržavati: • određivanje triglicerida, LDL�holesterola i HDL�holesterola isključivo na tašte posle 12 sati glado vanja; • uobičajena ishrana bez promene telesne težine najmanje 2 nedelje pre uzimanja krvi; • bez intenzivnog vežbanja najmanje 24 sati pre uzimanja krvi; • pre donošenja odluke o terapiji lipidni status ispitati najmanje u dva navrata u razmaku od 1 ne� delja do 2 meseca.
V. Spasojević�Kalimanovska: Lipidi
4�39
razvoja ateroskleroze. Nasuprot ovome utvrđeno je da postoji obrnut odnos između visoke koncentracije HDL�holesterola i rizika za pojavu koronarne bolesti. Najveći broj epidemioloških podataka koji se odnose na vezu između koncentracije lipida u plazmi i kardiovaskularnog rizika se zasnivaju na osnovnim merenjima lipidnog statusa poput određivanja ukupnih triglicerida ili merenja ukupnog holesterola u plazmi, lako su ova merenja zadovoljavajuća za epidemiološke studije, za tačnu dijagnozu poremećaja lipida potrebna su mnogo tačnija određivanja lipida i lipoproteina, kako bi kliničar utvrdio subgrupu pacijenata koji su pri podjednakoj koncentraciji holesterola ili triglicerida izloženi većem ili manjem riziku od kardiovaskularnih bolesti. Postavljanje dijagnoze dislipidemije, povećanog rizika od ateroskleroze i mogućnosti lečenja hi� perlipidemije podrazumevaju da se pravilno odredi lipidni status pacijenta. Postoji veliki broj metoda za ispitivanja lipidnog statusa i one mogu biti biohemijske ili metode molekularne biologije za ispitivanja na nivou gena. Biohemijske metode obuhvataju kvantitativne metode određivanja i metode razd vajanja lipoproteinskih čestica. Zbog multikomponentne strukture lipoproteina, rutinske laboratorijske metode ne mogu da mere koncentraciju ovih čestica. Umesto toga izabrana komponenta (lipidna ili proteinska) se meri i koristi kao marker za koncentraciju odgovarajućeg lipoproteina. Biohemijska ispitivanja dislipoproteinemija zasnivaju se na kvantitativnom određivanju: • lipidnih komponenti lipoproteinskih čestica (holesterola i triglicerida) • apolipoproteina U kliničko�biohemijskoj laboratoriji uglavnom se lipidni status ispituje na osnovu holesterola i triglicerida, mada je mnogo bolje, ukoliko je to moguće odrediti koncentraciju apolipoproteina. Apolipo� proteini su bolji pokazatelji poremećaja jer ne podležu toliko varijacijama recimo zavisno od ishrane kao što su tome podložni trigliceridi. Apolipoproteini kao proteini odraz su genetskih varijacija i više odražavaju specifičan fenotip određene osobe. Oni se mogu koristiti kao markeri koncentracije lipoproteina u stanjima kada koncentracija apolipoproteina reflektuje broj lipoproteinskih čestica. Na pri� mer apo B�100 je dobar marker za VLDL, LDL i IDL koncentraciju. Ipak određivanja apolipoproteina u laboratorijama nije široko primenljivo zbog složenijih i skupljih metoda određivanja ovih proteina. U sklopu lipidnog statusa najčešće se vrši određivanje: • ukupnog holesterola • HDL�holesterola • LDL�holesterola • triglicerida Ovo spada u osnovni nivo određivanja i dovoljan je za dijagnozu postojanja dislipidemije i povećanog rizika od ateroskleroze. Otkrivanje pravog uzroka dislipoproteinemije zahteva i druga ispitivanja: • određivanje apo A�l, apo B, Lp(a); • kvantitativna elektroforeza lipoproteina; • ispitivanje polimorfizma apolipoproteina apo E, apo B�100, itd • određivanje oksidovanog LDL�a, malih gustih LDL, itd • određivanja aktivnosti enzima (LPL, LCAT, CETP, itd) Lipidni status se mora pravilno odrediti kako bi izbegli sve faktore okoline ili socijalne navike koje utiču na metabolizam lipida i dovode do sekundarnih hiperlipoproteinemija. Postoje određena pravila u ispitivanju lipidnog statusa kojih se pacijent, biohemičar i lekar moraju pridržavati: • određivanje triglicerida, LDL�holesterola i HDL�holesterola isključivo na tašte posle 12 sati glado vanja; • uobičajena ishrana bez promene telesne težine najmanje 2 nedelje pre uzimanja krvi; • bez intenzivnog vežbanja najmanje 24 sati pre uzimanja krvi; • pre donošenja odluke o terapiji lipidni status ispitati najmanje u dva navrata u razmaku od 1 ne� delja do 2 meseca.
4�40
Medicinska biohemija
Specifičnost tumačenja rezultata ispitivanja lipidnog statusa je što ne postoje referentne ili normalne vrednosti za lipidne parametre već preporučene vrednosti. Referentne vrednosti se uglavnom dobijaju određivanjem ispitivanog parametra u određenoj populaciji. Preporučene vrednosti su date od strane određenih nacionalnih odbora za lipide, a zasnivaju se na vrednostima lipidnih parametara koje imaju najmanji rizik za pojavu kardiovaskularnih bolesti. Preporučene vrednosti za lipidne parametre: Holesterol: < 5,19mmol/l Optimalan: 5,2�6,19 mmol/L Umeren rizik: > 6,2 mmol/L Visok rizik: Trigliceridi: < 1,7 mmol/L Optimalni: 1,70�2,25 mmol/L Granični: 2,26 � 5,64 mmol/L Vi so ki : > 5,65 mmol/L Vrlo visoki: LDL�holesterol: Optimalan: Graničan: Visok rizik: Vrlo visok rizik: HDL�holesterol Visok rizik: Optimalan: Nizak rizik:
< 2,59 mmol/L 2,6�3,34 mmol/L 3,35 �4,89 mmol/L > 4,9 mmol/L < 0,9 mmol/L 1,0�1,54 mmol/L > 1,55 mmol/L
Poglavlje 5. Voda
FUNKCIJA I METABOLIZAM VODE Osnovne biološke funkcije vode proizilaze iz njenih fizičko�hemijskih osobina, tako da je voda: � strukturni sastojak makromolekula, � rastvarač za niskomolekulska jedinjenja, � supstrat, odnosno proizvod enzimskih reakcija i � termoregulator. 1. Nukleinske kiseline, proteini, polisaharidi i mnogi kompleksni makromolekuli, zahvaljujući svo joj hemijskoj strukturi imaju sposobnost da deponuju vodu u uređenom ("semikristalnom") stanju. Stvaranje vodoničnih mostova između makromolekula i "uređene vode" omogućava hidratizovanje makromolekula. Mera za količinu vode koju može da veže jedan makromolekul je efektivni hidrodinamički volumen, čije su dimenzije mL vode/g supstance. Efektivni hidrodinamički volumen većine proteina leži između 5 i 10 mL vode/g, mada mnogi proteini i polisaharidi imaju vrlo veliku sposobnost vezivanja vode (miozin � 50 mL vode/g, hijaluronat �10 0 do 400 mL vode/g). 2. Voda je rastvarač za mnoge supstance i u njoj se odigravaju brojne reakcije intermedijernog metabolizma, transport supstrata i proizvoda ćelijskog metabolizma, kao i eliminacija proizvoda metabolizma u rastvornom obliku. 3. U mnogim reakcijama intermedijernog metabolizma učestvuje voda kao reaktant: hidrolaze i hidrataze zahtevaju vodu kao kosupstrat, a u reakcijama koje katalizuju oksidaze i hidroksilaze, kao i u reakcijama disanja nastaje voda kao proizvod reakcije ("oksidaciona voda"). 4. Zbog tendencije molekula vode da se asociraju, za njeno isparavanje se troši velika količina toplote. To znači da se isparavanjem neznatnih količina vode iz organizma (putem kože i pluća) gubi relativno velika količina toplote, što predstavlja važan mehanizam regulacije temperature tela. Funkcionalna raspodela vode Ukupna voda u organizmu čini prosečno 65% telesne mase kod muškaraca, odnosno 55% mase kod žena, a ova razlika je posledica različite količine masnog tkiva kod jednih i drugih. Pošto je mršava masa u organizmu konstantna veličina, procentualni sadržaj vode zavisi od količine masti i može da se kreće od 50% telesne mase kod vrlo gojaznih osoba, do 70% mase kod vrlo mršavih.
Medicinska biohemija
5�2
Deo telesne mase koji predstavlja vodu ne ostaje konstantan tokom života. Tokom intrauterinog života i ranog detinjstva stalno se smanjuje sadržaj vode i u trećoj godini života dostiže procenat koji odgovara sadržaju vode kod odraslih osoba. Tokom života smanjuje se ekstracelulama voda (izražena kao udeo od ukupne telesne mase), a povećava se intracelularna voda (izražena na isti način). Plazma ostaje konstantna i iznosi tokom celog života 4 � 5% od ukupne telesne mase. Ukupna voda u organizmu ulazi u sastav tečnosti unutar i izvan ćelija, kao i tečnosti u gastrointe� stinalnom i renalnom traktu. Ukupna tečnost u organizmu može da se podeli u dva glavna prostora: ekstracelularni i intracelularni. Ekstracelulama (ECT) ili vanćelijska tečnost obuhvata svu tečnost iz van ćelijske membrane i predstavlja medijum u kome se odvijaju sve metaboličke izmene. Intracelularna (ICT) ili ćelijska tečnost se nalazi unutar ćelijske membrane i u njoj se odvijaju sve hemijske reakcije ćelijskog metabolizma. Ekstracelulama tečnost je fiziološki podeljena na fiziološku ekstracelularnu tečnost i transcelular� nu tečnost, a fiziološka ekstracelulama tečnost obuhvata intravaskularnu vodu (plazmu) i intersticijal� nu tečnost (IST), koja se nalazi između ćelija (u kojoj ćelije "plivaju"). Kao deo intersticijalne tečnosti smatra se i tečnost tzv. potencijalnih prostora (perikardijalni, peritonealni, pleuralni i sinovijalni) u ko jima se normalno nalazi nekoliko mililitara viskozne, lepljive tečnosti, ali u nekim situacijama u tim prostorima može da se zadrži velika zapremina tečnosti. Transcelularna tečnost se nalazi u prostorima uz epitelnu membranu i njena zapremina i sastav zavise od ćelijske aktivnosti ove membrane. U transcelulamu tečnost spada očna vodica, cerebrospinalna tečnost i voda unutar gastrointestinalnog, genitourinamog i nazorespiratomog trakta. Tabela 5�1. Raspodela vode u različitim telesnim prostorima procenat procenat od zapremina kod UT osobe od 70 kg tel. mase 42 L
Ukupna tečnost (UT)
60%
ECT
20%
33%
14 L
plazma
5%
8%
3,5 L
IST
15%
25%
10,5 L
ICT
40%
67%
28 L
Sastav vode u različitim telesnim prostorima Plazma je sastavljena od vode i makromolekula, tako da je koncentracija jona u plazmi manja od koncentracije jona u vodenoj fazi plazme, jer su joni rastvoreni samo u vodi, a ne i u makromolekuli� ma. Kako je sadržaj vode u plazmi oko 93%, proizilazi da je koncentracija jona u plazmi 93% od koncentracije tih jona u vodenoj fazi plazme. Suma svih pozitivno nalektrisanih jona mora biti jednaka sumi svih negativno naelektrisanih jona da bi se održala električna neutralnost plazme. U laboratorijama nije moguće odrediti sve katjone i anjone prisutne u plazmi, a oni koji se najčešće određuju označavaju se kao merljivi katjoni (natrijum, kalijum), odnosno merljivi anjoni (hloridi, bikarbonati). Suma merljivih katjona je veća od sume merlji� vih anjona i ta razlika je poznata kao anjonski gap ili anjonska praznina. Anjonski gap se izračunava kao (Na + + K+ � Cl" � HC0 3") ili kao (Na + � Cl" � HC03"), pošto je koncentracija kalijuma uglavnom konstantna i može da se izuzme iz računa. Vrednost anjonskog gapa normalno iznosi 15 mmol/L, odnosno 12 mmol/L ako se ne uzima u obzir koncentracija kalijuma. Intersticijalna tečnost se od plazme razlikuje uglavnom po tome što gotovo uopšte ne sadrži proteine, lako bi bilo realno očekivati da u plazmi i intersticijalnoj tečnosti bude jednaka koncentracija di� fuzibilnih čestica, zbog Gibbs�Donnan�ove ravnoteže u plazmi (u vodi) je koncentracija katjona nešto viša nego u intersticijalnoj tečnosti.
5�3
S. Spasić: Voda Tabela 5�2. Raspodela elektrolita u različitim telesnim tečnostima
plazma (mEq/L)
IST (mEq/L)
ICT (mEq/L)
katjoni
153
153
195
Na +
142
145
10
K+
4
4
156
Ca 2+
5
2�3
3,2
Mg�
2
1�2
26
anjoni
153
153
195
Cl"
103
116
2
HC03 "
28
31
8
proteini
17
�
55
fosfat
2,1
2.5
125
ostali
2,9
3,5
5
294,6
294,6
294,6
758,1
758,1
osmolalnost mOsm/kg)
teorijski osmotski pritisak (kPa)
Mala razlika u koncentraciji pojedinih sastojaka u ECT i IST posledica je prisustva proteinskih molekula u plazmi. Proteini su makromolekuli, koji pri telesnom pH imaju više negativnih naelektrisa� nja i za koje je zid kapilara nepropustljiva. Kako je kapilarna membrana propustljiva za druga jedinje� nja i jone, prisustvo polianjonskih makromolekula sa jedne strane membrane uslovljava karakterističnu raspodelu jona sa obe strane membrane: � koncentracija katjona je viša, a koncentracija anjona niža u prostoru koji sadrži makromolekule, � suma koncentracija difuzibilnih jona je veća u prostoru koji sadrži makromolekule, � osmotski pritisak je veći u prostoru koji sadrži makromolekule. Intracelularna voda nije dostupna za direktnu analizu, a osnovna karakteristika joj je da se razlikuju sadržaji vode u pojedinim tipovima ćelija. U celini gledano, sadržaj intracelularne vode je različit od ekstracelularne, bez obzira 0 kom tipu ćelija se radi. Glavni katjoni ćelijske tečnosti su kalijum i magnezijum, a glavni anjoni su proteini, organski fosfati i sulfati, dok su natrijum, hloridi i bikarbonat uvek u niskim koncentracijama. Sastav ćelijske vode koji je prikazan u tabeli odnosi se na mišićne ćelije. Prelazak vode i supstanci koje su u njoj rastvorene iz IST u ICT i obrnuto zavisi od propustljivosti ćelijske membrane i osmotskih i elektrohemijskih sila. Ćelijska membrana je propustljiva za vodu ali je selektivno propustljiva za supstance koje su u njoj rastvorljive; propustljivost za te supstance je veća ukoliko je veća njihova rastvorljivost u mastima. Osim toga, ćelijska membrana je više propustljiva za anjone nego za katjone. Vrsta i koncentracija supstanci koje su rastvorene u ICT zavise od ćelijskog metabolizma, kod koga su normalno katabolički procesi u ravnoteži sa anaboličkim. Prisustvo nepropustljivih polianjonskih molekula (proteini, organski fosfati i organski sulfati) u ICT dovodi do uspostavljanja Gibbs� Donnan�ove ravnoteže. Zbog toga se uspostavlja osmotski gradijent između IST i ICT, koji mora biti savladan, pa se neke supstance zadržavaju ekstracelulamo kako bi se uspostavila osmotska ravnoteža prema intracelularnom osmotskom pritisku. Ovo se ostvaruje uz pomoć energetski zavisnog transportnog sistema u ćelijskoj membrani, Na +�K+�ATP�aza pumpe, koja transportuje natrijum iz ćeli je u zamenu za kalijum. Zbog ovakvog kretanja jona u IST se pojavljuje relativni višak jona za koje je ćelijska membrana propustljiva, a ovo povećanje u difuzibilnim jonima u IST uspostavlja osmotski pritisak u IST koji je u ravnoteži sa koloidno osmotskim pritiskom u ćelijama. Sve ovo zavisi od normalnog ćelijskog metabolizma.
5�4
Medicinska biohemija
Održavanje raspodele vode između telesnih prostora Raspodela vode između plazme, intersticijalnog i intracelularnog prostora zavisi od količine i koncentracije nedifuzibilnih čestica i jona u ovim prostorima. Apsolutna zapremina intracelulame i eks� tracelulame vode zavisi od količine kalijuma i natrijuma u telu, a sadržaj vode u ovim prostorima je tako regulisan daje u njima osmolalna koncentracija 275�295 mosmol/kg. U ekstracelularnoj tečnosti oko 90% osmotske aktivnosti potiče od jona natrijuma, hlorida i bikarbonata. Kako je koncentracija polivalentnih anjona i drugih katjona relativno niska, koncentracija natrijuma je približno jednaka sumi koncentracija hlorida i bikarbonata i zapremina ekstracelularne tečnosti je određena količinom natri juma u telu. U intracelularnoj tečnosti glavni katjon je kalijum čija se koncentracija održava tako da je, zajedno sa polivalentnim anjonima, organskim, fosfatima i proteinima osmolalnost intracelulame tečnosti jednaka ekstracelularnoj. Razmena tečnosti između plazme i intersticijalnog prostora zavisi primarno od zapremine ekstracelularne vode (sekundarno od koncentracije natrijuma) a odvija se u kapilarima. Prolazak vode i elektrolita kroz zid kapilara zavisi od: � hidrostatskog pritiska krvi u kapilarima, � propustljivosti kapilara, � razlike između osmotskog pritiska plazme i intersticijalne tečnosti, � limfatične drenaže i � pritiska u tkivima. Hidrostatski pritisak krvi u arterijskom delu kapilara je veći od pritiska u venskom, zbog čega dolazi do izlaska vode u intersticijalni prostor. Kroz zid kapilara zajedno sa vodom prolaze i mali molekuli, ali ne i veći molekuli kao što su proteini koji se nalaze u obliku koloida. U nekim situacijama (uti� caj bakterijskih toksina, delovanje otrova, hipoksija, alergijske reakcije) može da se poveća propust� Ijivost kapilarnog zida. Zbog specifične propustljivosti kapilara intersticijalna tečnost predstavlja ultrafiltrat plazme, a kako je u obe tečnosti koncentracija soli ista, njihovi osmotski pritisci se razlikuju samo za koloidno� osmotski pritisak koji potiče od proteina plazme. Osmotski pritisak plazme (na 0°C) iznosi 660 kPa, a koloidno osmotski pritisak proteina 3,24 kPa. Za osmotski pritisak proteina plazme mnogo je važniji albumin, nego globulini i to iz dva razloga: a. molekulska masa albumina manja je nego masa globulina (veći broj molekula po gramu albumina nego po gramu globulina); b. izoelektrična tačka albumina udaljenija je od normalnog pH krvi pa je albumin više disosovan nego globulini. Prolazak vode kroz zid kapilara regulisan je ravnotežom sila koje teže da isteraju vodu iz krvnih sudova (filtracione sile) i sila koje teže da vrate vodu u kapilare (reapsorpcione sile) (slika 5�1). Naj važnija filtraciona sila je hidrostatski pritisak u kapilarima (p p i), a mnogo slabija filtraciona sila je kolo� idno�osmotski pritisak IST (TI | ST), jer je koncentracija proteina u IST mala, i on iznosi 0,5 kPa. Druga slaba filtraciona sila je negativni hidrostatski pritisak IST (PIST) koji iznosi �0,9 kPa. Glavna reapsorpciona sila je koloidno osmotski pritisak proteina plazme (n pi ) koji iznosi 3,7 kPa. Neto efekat ove četiri sile može da se izrazi Starling�ovom jednačinom: filtracioni pritisak = (p p, + n IST) � (TT p! + p , S T) ili filtracioni pritisak = (p p, � p , ST ) � (TI p) � n )ST ) Kada je filtracioni pritisak pozitivan dolazi do prelaska vode iz plazme u IST, odnosno kada je filtracioni pritisak negativan voda se reapsorbuje iz IST i prelazi u plazmu. Kako su hidrostatki pritisak IST i koloidno�osmotski pritisak IST vrlo mali, njihov učinak na vrednost filtracionog pritiska je neznatan, pa neto filtracioni pritisak zavisi od odnosa hidrostatskog i koloidno�osmotskog pritiska plazme. Hidrostatski pritisak u arterijskom delu kapilara je 3,3 kPa, zbog čega je neto filtracioni pritisak poziti van (3,3 + 0,9 � 3,7 + 0,5 = 1,0 kPa) i voda prelazi u intersticijalni prostor. Zbog izlaska vode iz kapilara smanjuje se hidrostatski pritisak plazme i u venskom delu iznosi svega 1,2 kPa, tako da je neto filtracioni pritisak negativan (1,2 + 0,9 � 3,7 + 0,5 = �1,1 kPa) i voda se vraća u kapilare. Zapremina tečnosti u ćelijama zavisi od osmolarnosti IST, jer je ćelijska membrana jako propust� Ijiva za vodu. Osmolarnost unutar ćelija mora biti jednaka osmolarnosti IST. Smanjenje osmolarnosti
5�5
S. Spasić: Voda
IST dovodi do prelaska vode u ćelijski prostor i time do povećanja zapremine ćelija, i obrnuto, povećanje osmolamosti IST kao posledicu ima smanjenje zapremine ćelija.
kapilar
(P P i" PIST) ~ Kl
neto filtracioni pritisak (+)
�7I
IST)
neto filtracioni pritisak (�)
Slika 5�1. Razmena tečnosti u mikrocirkulaciji
Osmolalnost telesnih tečnosti Osmolalnost je koligativna osobina rastvora koja zavisi od broja rastvorenih čestica prisutnih u rastvoru. U biološkim tečnosti na osmolalnost utiču tri tipa čestica: elektroliti, organski molekuli i kolo� idi. Kako se broj rastvorenih čestica povećava, tako se snižavaju tačka mržnjenja i pritisak pare a po većavaju osmotski pritisak i tačka ključanja. Na koligativne osobine utiče moiarna, a ne masena koncentracija, tako da u biološkim tečnostima ne� osmolalnost utiču mnogo više koncentracija soli i nis� komolekulskih jedinjenja (kao što su glukoza i ureja), nego albumin, koji je prisutan u velikoj količini, ali maloj molamoj koncentraciji (zbog velike molekulske mase). Tako moiarna koncentracija NaCI u serumu, koga ima oko 9 g/L, iznosi oko 150 mmol/L, a albumin, koga ima oko 40 g II, iznosi samo oko 0,6 mmol/L. Pored toga, na koligativne osobine utiče i da li je supstanca jonizovana u rastvoru ili ne, jer se jonizacijom povećava broj čestica u rastvoru. Osmotska koncentracija može da se izražava kao osmolamost (ukupan broj rastvorenih čestica u jedinici zapremine rastvora) ili kao osmolalnost (ukupan broj rastvorenih čestica u jedinici mase rastvora). Kako su tečnosti humanog organizma razblaženi vodeni rastvori u njima su osmolamost i osmolalnost jednake.
REGULACIJA VODE Unošenje vode Između unošenja i izlučivanja vode postoji stalna dinamička ravnoteža, koja je strogo kontrolisa� na kako bi se održala osmolalnost plazme između 285 i 298 mOsm/kg. Dnevni promet vode kod odrasle osobe iznosi prosečno 2500 mL, ali može da se poveća ili smanji, zavisno od uslova u kojima se čovek nalazi ili od aktivnosti kojima se bavi (tabela 5�3). U balansu vode je važna uloga mehanizma žeđi; osećaj žeđi se javlja kada se osmolalnost plazme poveća za 2 do 3%, odnosno kada je osmolalnost plazme 290 do 295 mOsm/kg, mada se ova vrednost individualno menja. Pored osmolalnosti plazme osećaj žeđi izaziva smanjenje zapremine ECT i smanjenje krvnog pritiska. Na ove promene reaguju regulatomi centri koji se označavaju kao osmoreceptori i baroreceptori. Osmoreceptori leže u nucleusu supraopticusu i paraventricularisu prednjeg dela hipotalamusa, u blizini centra za žeđ. Baroreceptori koji reaguju na smanjenje hidros� tatskog pritiska nalaze se u levoj pretkomori srca, u inferior veni cava i plućnoj veni, a receptori koji reaguju na povećanje pritiska nalaze se u aorti i karotidnoj veni.
Medicinska biohemija
5�6
Osmoreceptori stimulisani su povećanjem ili smanjenjem osmolalnosti, pri čemu u tome nemaju ulogu glukoza i ureja. Povećanje osmolalnosti ECT, a time i IST izaziva smežuravanje osmorecepto� ra (povećanje osmolalnosti IST u kojoj plivaju sve ćelije izaziva izlazak vode iz njih), a smanjenje osmolalnosti dovodi do suprotnog efekta, odnosno do bubrenja ćelija. Ravnoteža između unošenja i izlučivanja vode se postiže kod 288 mOsm/kg. Egzaktni nivo osmolalnosti zavisi od: neosetljivog gubitka vode kroz kožu i pluća, unošenja vode putem hrane i napitaka i intenziteta metabolizma. Tabela 5�3. Balans vode u različitim uslovima
unošenje vode (mL/dan) normalno
visoka spoljašnja temperatura
intenzivan rad
napici
1200
2200
3400
hrana
1000
1000
1150
oksidaciona voda
300
300
450
ukupno
2500
3500
5000
izlučivanje vode (mL/dan) urin
1400
1200
500
perspiratio insensibilis koža
400
400 600
pluća perspiratio sensibilis
400
400 300
znoj
100
1400
3300
feces
200
200
200
ukupno
2500
3500
5000
Apsorp cij a vod e u dig esti vnom tr ak tu U digestivnom traktu izluči oko 7000 ml_ različitih sokova (pljuvačka, želudačni sok, pankreasni sok, žuč, tečnost u tankom crevu), ali sva ta količina resorbuje i putem fecesa se izgubi samo oko 100�200 ml_. Zajedno sa vodom izlučenom u digestivnom traktu resorbuje se i voda uneta pićem i hranom, što ukupno iznosi oko 9000 mL/dan, odnosno oko 400 mL/sat. Voda se kroz membranu tankog creva prenosi prostom difuzijom, koja se pokorava zakonima obične osmoze; kada je sadržaj u crevu razređen voda prelazi u plazmu. Voda ima sposobnost da prelazi i u suprotnom smeru, što se dešava kada u duodenum stigne hiperosmotska tečnost, ili kada zbog brze digestije makromolekula sadržaj u crevu postane hipertoničan, tako da je sadržaj u duo� denumu uvek izotoničan sa plazmom. Prolaskom himusa kroz tanko crevo apsorbuju se natrijum, monosaharidi i aminokiseline, tako da sadržaj u tankom crevu postaje hipotoničan, a to za posledicu ima brzu difuziju vode kroz zid tankog creva. Voda brzo difunduje zahvaljujući velikom prostoru između ćelija na mestima tzv. tesnih veza. Na ovaj način se u tankom crevu apsorbuje gotovo 99% vode. Mikrocirkulacija u tankom crevu može da reapsorbuje 4�5 L tecnosti u toku dana i to kada je u tankom crevu prisutna hrana, ali reapsorbuje vodu i kada u tankom crevu nema apsorpcije hranljivih sastojaka. Ostatak vode se apsorbuje u proksimalnom delu kolona, kao posledica apsorpcije natrijuma pod uticajem aldosterona. U tom delu kolona postoji i sekrecija kalijuma zahvaljujući uticaju aldosterona. Natrijum prelazi ćelije epitela kolona, iz njih u međućelijski prostor, zbog čega se povećava osmolal� nost međucelijske tecnosti. Kako su tesne veze među ćelijama epitela kolona mnogo tešnje nego
5�7
S. Spasić: Voda
među ćelijama epitela tankog creva, joni natrijuma ne mogu da se vraćaju u lumen kolona, već voda prelazi u međućelijski prostor. Izlučivanje vode Iz gore prikazane tabele se vidi da su putevi kojima se gubi voda različiti, kao i da količine izlučene vode zavise od uslova u kojima se organizam nalazi, lako količine izgubljene vode mogu biti u nekim situacijama vrlo velike, jedino mesto na kome organizam može da reguliše izlučivanje vode su bubrezi. Bubrezi imaju dve vrste nefrona, superficijalne i jukstamedularne, i ova anatomska organizacija igra važnu ulogu u stvaranju urina, odnosno omogućava ili koncentrovanje ili razblaživanje urina, zavisno od osmolalnosti plazme.
I TL
J rastvore««
aktivno ******** at
m £»
supstance VOd2l
Slika 5�2. Izoosmotska reapsorpcija vode u proksimalnim tubuiima
U proksimalnim tubuiima se reapsorbuje oko 2/3 od 180 L glomerulamog filtrata, a reapsorpcija se obavlja izoosmotski. Na taj proces utiče više činilaca: � Voda prolazi kroz epitelne ćelije na osnovu osmotskog gradijenta koji postoji u intracelularnom prostoru ili između lumena tubula i intersticijalne tečnosti. � Osnovni činilac koji omogućava izoosmotsku reapsorpciju vode je izuzetno visoka osmotska propustljivost proksimalnih tubula za vodu. Zbog tako visoke propustljivosti za vodu, dovoljna je samo mala razlika u osmolalnosti (2 do 3 mOsm/kg) da bi voda počela da difunduje.
NaCt /
R,0
Slika 5�3. Reapsorpcija vode u bubrezima (koncentracioni mehanizam)
� Aktivnim transportom supstanci koje određuju efektivnu osmolalnost (Na +, glukoza, aminokiseli� ne, bikarbonat) smanjuje se njihova koncentracija u tubularnoj, a istovremeno povećava u interstici� jalnoj tečnosti, čime se uspostavlja osmotski gradijent.
Medicinska biohemija
5�8
� Na uspostavljanje osmotskog gradijenta naročito utiču glukoza, aminokiseline i bikarbonat, jer ova jedinjenja imaju viši reflekcioni koeficijent od Na + , što znači da brže prolaze kroz ćelijsku membranu. Zbog izoosmotske reapsorpcije u proksimalnom delu tubula, tubularna tečnost na početku silaznog dela Henleove petlje tečnost ima istu osmoialnost kao plazma (280�290 mOsm/kg). Daljim prolaskom tečnosti kroz Henleovu petlju reapsorbuje se još oko 15% vode (25 L/dan), pa osmoialnost tu� bularne tečnosti naglo raste i na kraju silaznog dela Henleove petlje tečnost je hiperosmolama. U uzlaznom delu Henleove petlje nema reapsorpcije vode, već samo reapsorpcije natrijuma, osmoialnost se smanjuje za oko 100 mOsm/kg vode i u distalne tubule stiže hipoosmolama tečnost. U distalnim tubulima i sabirnim cevčicama reapsorbuje se natrijum pod uticajem aldosterona i voda pod uticajem ADH (slika 5�3.). U ovom delu tubula osmoialnost tubulame tečnosti zavisi od ADH; u prisustvu ADH apsorbuju se velike količine vode i izlučuje se koncentrovan urin, odnosno u odsustvu ADH nema apsorpcije vode i izlučuje se razblažen urin. Reapsorpcija vode pod uticajem antidiuretičnog hormona Glavna komponenta fiziološke regulacije izlučivanja vode je antidiuretični hormon (ADH, vazop� resin). ADH se sintetiše u ćelijama supraoptičkog i paraventrikularnog jezgra hipotalamusa kao pre� kursor velike molekulske mase (pre�pro�vazopresin, 164 AK), a zatim se sekretira u zadnji režanj hipofize u obliku neurosekretomih granula zajedno sa neurofizinom II (vezujući protein) i glikoprotei� nom. ADH je protein od 9 aminokiselina sa strukturom cikličnog heksapeptida i repom od 3 aminokiseline (slika 5�4). Brzo se metaboliše u jetri i bubrezima, a poluživot mu je 15 do 20 min.
Slika 5�4. Struktura ADH
Glavni stimulans za lučenje ADH je hiperosmolalnost ECT. Pošto je glavna osmotska supstanca u ECT Na +, efektivna osmoialnost primarno zavisi od koncentracije Na+ u plazmi. Na povećanje ili smanjenje osmoialnost ECT reaguju osmoreceptori, što dovodi do stimulisanja, odnosno supresije lučenja ADH. Granična vrednost osmolalnosti kod koje reaguju osmoreceptori u odnosu na lučenje ADH je 280 do 290 mosm/kg, a ceo sistem je vrlo osetljiv na promenu osmolalnosti. Kada je osmoialnost ECT ispod granične vrednosti prestaje lučenje ADH, a kada se poveća za samo 1�2% reaguju osmoreceptori i odmah počinje lučenje ADH. Treba naglasiti (a to se vidi i na slici 5�5.) da je osmotski prag za lučenje ADH niži nego što je za žeđ, što znači da organizam reaguje na gubitak vode lučenjem ADH i kada čovek još uvek nema osećaj žeđi. Neosmotski faktori koji utiču na sekreciju ADH su: efektivna zapremina arterijske krvi, povraćanje, bol, stres, hipoglikemija, trudnoća i brojni lekovi. Hemodinamski odgovor na ove pojave je stimu� lisanje baroreceptora, ali je osetljivost ovih receptora značajno niža nego osetljivost osmoreceptora. Da bi se stimulisali baroreceptori potrebno je da smanjenje u zapremini krvi bude toliko da se to odrazi na krvni pritisak, što iznosi oko 10% zapremine (slika 5�6.). Kada je prisutna hipovolemija, nema
S. Spasić: Voda
5�9
promene u osmotskoj regulaciji, ali je u toj situaciji smanjen prag, odnosno vrednost osmolalnosti kada počinje lučenje ADH, pa ceo sistem postaje osetljiviji.
270
280
290
300
310
osmolalnost plazme (mOsm/kg) Slika 5�5. osmotski prag za lučenje ADH i pojavu osećaja žeđi
50�
© izotono smanjenje zapremine ECV o izovolemijsko povećanje osmolalnosti ECV
40 O)
o.
x" Q < n E
30� 20�
N
J2
a 10
0 � 10 15 plazma, %
20
Slika 5�6. Osmotska i neosmotska regulacija sekrecije ADH
Posle stimulacije lučenja, ADH se vezuje V2 receptore na bazolateralnoj membrani distalnih tu� bula i sabirnih cevčica (slika 5�7). Ova interakcija dovodi do povećanja aktivnosti adenilat�ciklaze (preko stimulatornog G proteina), koja katalizuje stvaranje cikličnog adenozin�3',5'�monofosfata (cAMP) iz ATP, a cAMP aktivira protein kinazu A (PKA). Kao odgovor na ovaj proces fosforilacije, dolazi do pomeranja citoplazmatičnih vezikula koje nose proteinske kanale za vodu i vezivanja ovih kanala za luminalnu membranu, čime se povećava propustljivost ove membrane za vodu. Kada prestane delovanje ADH, kanali za vodu se recikliraju endocitozom. Kanali za vodu na luminalnoj membrani označavaju se kao akvaporini�2 (AQP�2) i pripadaju grupi proteinskih kanala koji se nazivaju akvaporini. Na bazolateralnoj membrani se takođe nalaze kanali za vodu (akvaporin�3 i akvaporin�4) kroz koje voda izlazi iz ćelije, ali prolazak vode kroz ove kanale ne zavisi od delovanja ADH, već predstavlja pasivnu reapsorpciju u pravcu osmotskog gradijenta u hipertonu sredinu medulamog intersticijuma.
Medicinska biohemija
5�10
AOf»�3
vez iku le za recikliranje ulazak u vezikule AQP�2 AOP�2
AQP�2
izlazak iz veziku la
AVP
vezikule za recikliranje
AQP«4
lumi na Irto
bazolaieralno
Slika 5�7. Intraceluiarno delovanje ADH
Ak va por in i (v od en i ka na li )
Akvaporini transportuju kroz ćelijske membrane vodu bez rastvorenih supstanci, pa se stoga smatraju vodenim kanalima. Oni su otkriveni relativno skoro, ali na njihovo postojanje se sumnjalo i ranije, jer je osmotska propustljivost nekih epitelnih ćelija bila tako velika, da nije mogla biti rezultat proste difuzije. Kod sisara je do sada identifikovano šest vrsta akvaporina, ali ima dokaza da postoje i druge. Svi akvaporini imaju šest segmenata koji su integralni deo membrane i pet petlji za povezi vanje (obeležavaju se sa A do E), kao s to je to prikazano na slici 5�8. na primeru akvaporina�1, koji je do sada najbolje proučen. eksiracel ufamo
i rttracc lut amo HOOC
Slika 5�8. Shematski prikaz strukture akvaporina�1 i njegove lokalizacije u membrani
5�11
S. Spasić: Voda
Funkcionalno važni domeni su petlje B i E čijim se ukrštanjem formira kanal prečnika 0,3 nm, kroz koji mogu da prođu molekuli vode, ali ne i supstance koje su u njoj rastvorene. U ovom kanalu se nalaze i naelektrisani ostaci koji omogućavaju prolazak malih naelektrisanih čestica, kao što su protoni, koji se u vodi nalaze u obliku H 3 0 + . Akvaporini su vrlo široko rasprostranjeni i imaju raznovrsne i specifične funkcije. Mutacije u ak� vaporin genima dovode do različitih bolesti. Na primer, mutacija u akvaporin�2 genu ima kao posledi� cu nefrogeni diabetes insipidus, jer kod tih osoba nema efekta ADH. Drugi primer je nasledna katarakta, koja je posledica mutacije u akvaporin�0 genu.
POREMEĆAJI U METABOLIZMU VODE Poremećaji u metabolizmu vode mogu da se ispolje kao dehidracija i hiperhidracija a posledica su poremećene ravnoteže između unošenja i izlučivanja vode i unošenja i izlučivanja natrijuma.
Dehidracija Dehidracija zbog gubitka vode Dehidracija zbog gubitka vode karakteriše se smanjenom ukupnom količinom vode u organizmu sa relativno normalnim sadržajem ukupnog natrijuma u organizmu. Kod ovog oblika dehidracije po većana je koncentracija natrijuma u.plazmi, a time i osmolalnost plazme, kao posledica negativnog balansa vode i normalnog balansa natrijuma. Zbog povećane osmolalnosti ECT dolazi do izlaska vode iz ćelija, pa je smanjena zapremina i ECT i ICT. Dehidracija zbog gubitka vode može da nastane zbog poremećaja u unošenju vode i poremećoja u izlučivanju vode. a. Dehidracija zbog poremećaja u unošenju vode javlja se iz sledećih razloga: � nemogućnost unošenja vode (zbog nedostatka vode za piće), � adipsija (odsustvo žeđi), najčešće kao posledica neuroloških defekata u hipotalamusu i � jatrogeni efekti, obično kada se kod davanja infuzija ne daje dovoljno tečnosti. b. Dehidracija zbog poremećaja u izlučivanju vode može biti izazvana pituitamim ili nefro� genim diabetes insipidusom. Pituitarni diabetes insipidus je sindrom koji nastaje zbog nemogućnosti neurohipofiznog sistema da sintetiše ili oslobađa odgovarajuće količine ADH, a nefrogeni diabetes insipidus je sindrom u kome su renalni tubuli potpuno neosetljivi na delovanje ADH. U oba slučaja bubrezi nisu u mogućnosti da zadržavaju vodu i dolazi do njenog prekomemog gubitka. Kod ovog tipa dehidracije postoje sledeće promene u zapremini i raspodeli vode i sadržaju i koncentraciji natrijuma: ukupna voda
ECT
ICT
ukupni Na
Na u plazmi
1
j i l i N
i
Niti |
t (relativno)
Nadoknada izgubljene tečnosti mora da se izvrši hipotonim rastvorom jer se na taj način uspostavlja osmotski gradijent između ECT i ICT i voda prelazi u ćelije. Posle redistribucije vode, normali� zuje se zapremina ECT i ICT, kao i koncentracija natrijuma u plazmi. Ako bi se izgubljena tečnost nadoknadila izotonim rastvorom, celokupna količina bi se zadržala u ECT, jer nema osmotskog gradijenta koji bi omogućio prelazak vode u ćelije. Dehidracija zbog gubitka vode i natrijuma Dehidracija je najčešće posledica gubitka ne samo vode, nego i natrijuma. U tim slučajevima gubitak vode i natrijuma ne mora biti isti, odnosno balans vode može biti negativniji, jednak ili manje negativan nego balans natrijuma. Kada je gubitak vode veći nego gubitak natrijuma, odnosno balans
5�12
Medicinska biohemija
vode negativniji nego balans natrijuma, govorimo o hipematremijskoj, odnosno hiperosmolamoj de� hidraciji; kada su gubici vode i natrijuma jednaki dehidracija je normonatremijska ili normoosmolarna, a kada je gubitak vode manji nego gubitak natrijuma, odnosno balans vode manje negativan nego balans natrijuma rezultat je hiponatremijska ili hipoosmolarna dehidracija. Hipernatremijska ili hiperosmolarna dehidracija nastaje kod: � pojačanog znojenja, � osmotske diureze (kod dijabeta ili kod davanja manitola), � davanja tubularnih diuretika, � povraćanja i � dijareje. Normonatremijska ili normoosmolarna dehidracija se javlja kada se kod predhodnog tipa de� hidracije izgubljena voda nadoknadi rastvorom sa niskim sadržajem natrijuma, ali pri čemu zapremi� na date tečnosti nije dovoljna, pa i dalje postoji dehidracija. Međutim, ako se gubi izoosmotska teč� nost, onda nema redistribucije vode, već je sav gubitak iz ECT. Hiponatremijska ili hipoosmolarna dehidracija pojavljuje se kod bolesti bubrega u kojima se gube soli, kao i kod insuficijencije kore nadbubrega (nedostatak aldosterona). Kod ovog oblika dehid� racije smanjena je osmolalnost ECT, pa voda iz ovog prostora prelazi u ćelije. Zbog toga je gubitak vode iz ECT mnogo veći nego gubitak iz ICT. Pramena u zapremini i raspodeli vode i sadržaju i koncentraciji natrijuma kod ova tri tipa dehidra� cijeje sledeća: ukupna voda
ECT
ICT
ukupni Na
Na u plazmi
1 1 1
1 1
1
N ili 4,
T
N
N
11
T
1 U
hipematremija normonatremija hiponatremija
1
Hiperhidracija Hiperhidracija zbog viška vode Hiperhidracija zbog viška vode nastaje ili zbog prekomemog unošenja vode (intoksikacija vodom) ili zbog smanjenog izlučivanja vode. a. Intoksikacija vodom je retka i javlja se kod osoba koje nekontrolisano uzimaju vodu, a razlozi su psihogene prirode (psihogena polidipsija). U tim slučajevima je premašen kapacitet bubrega za izlučivanje urina i dolazi do zadržavanja vode u organizmu. Zbog viška vode pojavljuje se diluciona hiponatremija i hipoosmolarnost, pa voda ulazi u ćelije. Promena u zapremini i raspodeli vode i sadržaju i koncentraciji natrijuma je sledeća: ukupna voda
ECT
ICT
ukupni Na
T
t
T
N
Na u plazmi '
b. Smanjeno izlučivanje vode se javlja zbog neodgovarajućeg, odnosno povećanog lučenja ADH. Razlozi za povećano lučenje ADH mogu biti različiti: � poremećaji centralnog nervnog sistema, koji kao posledicu imaju nedostatak odgovarajućeg stimulansa iz osmo� i baro receptora (povećani intrakranijalni pritisak, meningitis, encefalitis, povrede lobanje, cerebrovaskulama tromboza, tumori mozga itd.);
S. Spasić: Voda
5�13
� uticaji tekova (morfin, barbiturati, karbamazepin itd.); � kao odgovor hipotalamusa na "regionalnu hipovolemiju" koja se javlja u slučajevima kada je smanjeno vraćanje krvi u srce, čija je posledica neravnomema raspodela krvi unutar vaskulamog sistema. U tom slučaju baroreceptori reaguju kao da postoji smanjenje zapremine krvi i šalju impuls hi� potalamusu za lučenje povećanih količina ADH. Do ovakvog efekta dolazi kod astme, hroničnih obs� truktivnih bolesti pluća, pneumonije, pneumotoraksa, zatajivanja desnog srca itd. � autonomna sekrecija ADH iz različitih, uglavnom tumorskih tkiva. Hiperhidracija zbog viška vode i natrijuma
Ovaj oblik hiperhidracije nastaje zbog različitih poremećaja ekstrakapilarnog krvotoka ili zbog zadržavanja natrijuma i vode u bubrezima. a. Poremećaji ekstrakapilarnog krvotoka kao posledicu imaju stvaranje edema, a nastaju iz sledećih razloga: Hipoproteinemija se javlja zbog nedovoljne sinteze proteina (gladovanje ili bolesti jetre), velikog gubitka proteina (nefrotski sindrom u kome se gubi i do 30 g albumina dnevno) ili zbog pojačanog ka� tabolizma proteina. Kod ovog poremećaja nema promene u propustljivosti kapilara, ali je smanjen koloidno�osmotski pritisak plazme, pa dolazi do poremećaja u odnosu filtracionih i reapsorpcionih sila. Voda izlazi iz krvnih sudova, povećava se zapremina IST, što kao posledicu ima povećanje hidros� tatskog pritiska IST i dodatno izlaženje vode iz krvnih sudova. Povećana propustljivost kapilara za proteine se javlja u alergijskim reakcijama, usled delovanja nekih bakterijskih toksina, kod opekotina vodenom parom, u zapaljenskim reakcijama, kod celulitisa itd. U tim slučajevima proteini iz plazme prelaze u IST, smanjuje se koloidno�osmotski pritisak plazme, a povećava koloidno�osmotski pritisak IST, voda iz krvnih sudova prelazi u intersticijalni prostor, što sada izaziva povećanje hidrostatskog pritiska IST i dalje izlaženje vode iz krvnih sudova. Povećanje kapilarnog pritiska (zbog popuštanja srca i zastoja u venama, zbog venske tromboze ili proširenja arteriola) dovodi do povećanja propustljivosti kapilara za proteine, u prvom redu zbog anoksije i nagomilavanja metabolita, zbog čega dolazi do izlaska vode iz krvnih sudova. Istovremeno je vraćanje vode u venski deo kapilara smanjeno jer je povećan hidrostatski pritisak na venskom delu kapilara. Začepljenje limfotoka zbog tumora, posle operativnih zahvata u kojima se uklanja deo limfnih sudova ili zbog prisustva parazita (filarijaza) onemogućava normalnu limfatičnu drenažu, pa voda prelazi u intersticijalni prostor i povećanje hidrostatskog pritiska IST. Edemi su poremećaji u ravnoteži vode u kojima dolazi do prelaska vode iz vaskulamog u ekstra� vaskularni prostor i mogu da se detektuju kada se zapremina IST poveća za najmanje 10%. Zbog smanjenja zapremine ECT smanjuje se minutni volumen srca i perfuzija bubrega, što kao posledicu ima pokretanje sistema renin�angiotenzin�aldosteron i dodatno zadržavanje vode i natrijuma u bubrezima, čime se stanje pogoršava. b. Zadržavanje vode i natrijuma se javlja kod nefrotskog sindroma, kongestivnih bolesti srca (smanjen minutni volumen srca, smanjena perfuzija bubrega, sekundarni hiperaldosteronizam), ciroze jetre i primarnog hiperaldosteronizma. Ovaj oblik hiperhidracije može biti sa normonatremijom i normoosmolarnošću, odnosno hiponatremijom i hipoosmolamošću. Zapremina i raspodela vode i sadržaj i koncentracija natrijuma u ovom obliku hiperhidracije su sledeći:
normonatremija hiponatremija
ukupna voda
ECT
ICT
ukupni Na
Na u plazmi
T T
T T
N
t
N
T
T
i
5�14
Medicinska biohemija
POREMEĆAJI U OSMOLALNOST! TELESNIH TEČNOSTI Hipoosmolalnost Hipoosmolalnost seruma/plazme (<275 mOsm/kg) je po pravilu praćena hiponatremijom, a najčešće se javlja kada se izgubljena so i voda iz organizma nadoknade samo vodom. Kod insuficijenci� je bubrega može da se desi da bubrezi nisu u stanju da izlučuju hipotoni urin, već se sa vodom gubi i natrijum, što dovodi do hiponatremije i hipoosmolalnosti. Hipoosmolalnost može da se javi i kod smanjene funkcije nadbubrega (nedostatak aldosterona) ili kod sindroma neodgovarajućeg lučenja ADH (prekomema reapsorpcija vode u tubulima).
Hiperosmolalnost Hiperosmolalnost seruma/plazme (>300 mOsm/kg) je najčešće prouzrokovana gubitkom tečnosti i u većini slučajeva je prouzrokovana hipematremijom. Povećana koncentracija ureje može da poveća osmolalnost čak za 50�100 mOsm/kg, ali kako ureja slobodno prolazi kroz membrane, sa povećanjem njene koncentracije povećava se osmolalnost i ECT i ICT. Hiperosmolalnost prouzrokovana povećanjem koncentracije glukoze (kod dijabetesa) dovodi do teških poremećaja balansa telesnih tečnosti. Osim toga, važno je napomenuti da i alkohol može da izazove hiperosmolalnost zato što vrlo sporo ulazi u ćelije (1 promil alkohola povećava osmolalnost za oko 22 mOsm/kg), tako da prisustvo alkohola u krvi i njegova približna koncentracija mogu da se odrede merenjem osmolalnosti seruma.
Poglavlje 6. Elektroliti
Natrijum Natrijum je element koji je na šestom mestu po zastupljenosti u prirodi. Kod zdravih odraslih osoba u organizmu se nalazi 55�60 mmol/kg telesne težine. Od te količine oko 30% je vezano u kristalnoj strukturi kostiju i predstavlja neizmenljivu frakciju natrijuma u organizmu. Ostala količina natrijuma (oko 40 mmol/kg tel. težine) je raspoređena u različitim delovima organizma i predstavlja izmenljivu frakciju, odnosno natrijum koji može da difunduje iz jednog telesnog prostora u drugi. Najveći deo ove frakcije natrijuma (97�98%) nalazi se u ECT, a u ICT je preostalih 2�3%. U tabeli 6�1 prikazana je raspodela natrijuma u raznim delovima ekstracelularnog prostora. Tabela 6�1. Raspodela natrijuma u različitim telesnim tečnostima
% ukupnog natrijuma
% izmenljivog natrijuma
plazma
11
16
intersticijalna tečnost
29
41
IST gustog vezivnog tkiva
12
17
intracelulama tečnost
2,5
3
transcelularna tečnost
2,5
3
izmenljivi deo kostiju
13
20
neizmenljivi deo kostiju
30
�
telesni prostor
Mala razlika u koncentraciji natrijuma u plazmi i IST posledica je prisustva polianjonskih proteinskih molekula (sa više negativnih naelektrisanja) u plazmi, koji ne mogu da prođu kroz kapilarnu membranu. Zbog toga se uspostavlja Gibbs�Donnan�ova ravnoteža, odnosno polianjonski nedifuzi� bilni makromolekuli prisutni sa jedne strane membrane uslovljavaju karakterističnu raspodelu difuzi� bilnih jona sa obe strane membrane. Pri elektrohemijskoj ravnoteži koncentracija difuzibilnih katjona je nešto viša, a koncentracija difuzibilnih anjona nešto niža u prostoru koji sadrži polianjonske ma� kromolekule, odnosno u plazmi.
Medicinska biohemija
6�2
Velika razlika u koncentraciji natrijuma u IST i ICT je rezultat aktivnog transporta natrijuma iz ćeli je u zamenu za kalijum. Od sadržaja natrijuma u telu direktno zavisi zapremina ECT, tako da su poremećaju u ravnoteži natrijuma obavezno praćeni i poremećajima u zapremini ECT. Organizam mora da održava zapremi� nu ECT u okviru određenih granica, jer je zapremina plazme direktno proporcionalna zapremini ECT, a od toga zavisi brzina perfuzije tkiva. Zapremina ECT se održava u okviru uskih granica i kada se menja količina natrijuma koja se unosi hranom, ali kada se naglo poveća unošenje natrijuma, zapremina ECT može da se poveća i do 18%.
UNOŠENJE I IZLUČIVANJE NATRIJUMA Količina natrijuma u organizmu rezultat je ravnoteže između unošenja i izlučivanja natrijuma. Unošenje natrijuma u organizam zavisi od navika u ishrani, odnosno od vrste i količine hrane. Normalnom prosečnom ishranom odrasla osoba unosi dnevno od 50 do 200 mmol natrijuma. Apsorpcija natrijuma iz lumena intestinuma ostvaruje se uz pomoć tri mehanizma: 1. Prolaskom natrijuma kroz kanale za natrijum zahvaljujući koncentracionom gradijentu, jer je u lumenu creva koncentracija Na oko 140 mmol/L, a u citozolu enterocita samo oko 14 mmol/L. Izves� na količina natrijuma (oko 10% od ukupne količine koja se apsorbuje) prođe paracelulamo kroz tesne spojnice i to zajedno sa hloridnim jonom. 2. Uz pomoć Na +/H+�antiportera; H + u lumenu intestinuma reaguje sa bikarbonatom iz pankreas� nog i žučnog soka, zbog čega se smanjuje pH intestinalne tečnosti. 3. Uz pomoć kotransportera zajedno sa glukozom, galaktozom, aminokiselinama i drugim mole� kulima. Na bazolateralnoj membrani enterocita nalazi se Na +�K +�pumpa koja izbacuje natrijum u intersti� cijalnu tečnost i tako održava gradijent natrijuma. Kalijum koji ulazi u enterocit, vraća se skoro istovremeno u intersticijalnu tečnost kroz kanale za kalijum, što omogućava Na +�K +�pumpi da nesmetano radi. Mala količina natrijuma apsorbuje se i u kolonu i to difuzijom kroz kanale za natrijum ili uz pomoć + Na /H+�antiportera; u kolonu nema kotransporta natrijuma sa drugim molekulima. Za kolon je takođe karakteristično da je Na +�K +�pumpa koja izbacuje natrijum u intersticijalnu tečnost osetljiva na aldos� teron. Iz organizma se natrijum gubi putem gastrointestinalnog trakta, kože i urina. Gastrointestinalnim traktom, odnosno fecesom odrasle osobe izlučuju vrlo malo natrijuma, svega 1 do 2 mmol/dan. Gas� trointestinalni sekreti se izlučuju u velikim zapreminama i sadrže značajne koncentracije natrijuma (tabela 6�2), mnogo veće nego što sadrži feces. Zbog toga se kod poremećaja reapsorpcije ovih se� kreta, kao i kod dijareja mogu da izgube velike količine ne samo natrijuma (do 100 mmol/dan), nego i vode i drugih elektrolita. Tabela 6�2. Raspodela elektrolita u različitim sekretima koncentracija elektrolita (mmol/L)
zapremina (mL/dan)
Na +
K+
Cl"
HC0 3"
2500
8�120
1�30
8�100
0�20
700�1000
134�156
4�6
83�110
38
pankreasni sok
>1000
113�153
2�7
54�95
110
intestinum
3000
72�120
3,5�7
69�127
30
100
<10
<10
<15
<15
sekret želudačni sok žuč
I feces
s
S. Spasić: Elektroliti
6�3
Putem kože se natrijum normalno gubi znojem, ali kod oštećenja kože zbog opekotina ili različitih lezija može da se izgubi velika količina natrijuma (zajedno sa vodom). Količina natrijuma koja se gubi znojem je vrlo promenljiva, jer zapremina znoja koja se dnevno izlučuje zavisi od spoljašnje temperature, fizičkog napora i telesne temperature. Znoj prosečno sadrži 50 mmol Na/L, tako da gubitak natrijuma može biti do 250 mmol/dan (u ekstremnim uslovima kada se izluči 5 L znoja/dan), ili zanemar� Ijiv kada je zapremina znoja mala (kod niskih spoljašnjih temperatura). Glavni put kojim se gubi natrijum su bubrezi, ali su oni istovremeno i mesto regulacije natrijuma da bi se održala njegova stalna koncentracija. Natrijum se u glomerulima slobodno filtrira (dnevno se izluči oko 25 mol Na u 180 L filtrata), a u tubulima aktivno reapsorbuje. Od celokupne količine natri juma filtriranog u glomerulima u proksimalnom delu tubula reapsorbuje se 60%, u Henleovoj petlji 25%, u distalnim tubulima 5�7% i u sabirnim cevčicama 3�5%. Neto izlučena količina natrijuma iznosi normalno 1% od natrijuma koji je filtriran u glomerulima, ali količina natrijuma u urinu može da se menja u širokom rasponu zavisno od toga koliko se natrijuma unosi hranom, a sve u cilju da se održi stalna koncentracija natrijuma u organizmu. Sve ćelije tubula imaju na bazolateralnoj membrani Na+�K+�ATP�azu, koja omogućava izlazak natrijuma iz ćelija tubula. Reapsorpcija natrijuma iz tubularne tečnosti i prolazak natrijuma kroz luminal� nu membranu odvija se različitim mehanizmima u različitim delovima tubula. Reapsorpcija natrijuma u proksimalnim tubulima
Na+�K+�ATP�aza pumpa, koja se nalazi na bazolateralnoj membrani održava nizak sadržaj Na+ i visok sadržaj K+ u ćeliji. Ulazak Na + kroz luminalnu membranu odvija se različitim putevima, a najvažniji je put izmene Na+ i H+. Aktivnost Na+/H+�antiportera se povećava stimulacijom renalnog nerva, kao i povećanjem koncentracije angiotenzina II u cirkulaciji (At II). Povećanje nivoa dopamina inhibira aktivnost Na+/H+�izmenjivača, a takođe i aktivnost Na+�K+�ATP�aza pumpe. Na + i Cl" prelaze u inter� sticijalnu tečnost i paracelularnim putem, a voda prolazi kroz kanale za vodu (slika 6�1.).
Slika 6�1. Celularni mehanizam i regulacija reapsorpcije natrijuma u proksimalnim tubulima (At II � angiotenzin II; AtR � receptor za At II; DpR � receptor za dopamin)
Reapsorpcija natrijuma u Henleovoj petlji
Natrijum, hloridi i kalijum ulaze u ćeliju uz pomoć Na+/K+/2CI"�simportera koju su osetljivi na bu� metidin, a nalaze se na luminalnoj membrani. Kalijum se vraća nazad u lumen tubula kroz kanale za
6�4
Medicinska biohemija
kalijum, što omogućava kontinuiranu aktivnost transportera. S druge strane na bazolateralnoj membrani se nalaze kanali za hloride, kroz koje hloridi prelaze u intersticijum, a to zajedno sa vraćanjem kalijuma u lumen generiše transepitelno naelektrisanje, koje je na strani okrenutoj ka lumenu pozitivno. Ovo naelektrisanje omogućava paracelularnu apsorpciju natrijuma.
Slika 6�2. Celularni mehanizam i regulacija reapsorpcije natrijuma u uzlaznom delu Henleove petlje (V2 � receptor za ADH; PR � receptor za PGE2; C�P450 � citohrom P450) ADH nema direktnog uticaja na reapsorpciju natrijuma, ali se njegov efekat ostvaruje posredno preko cAMP, koji stimuliše transporter. Prostaglandin E 2 (PGE2) i metaboliti arahidonske kiseline [20� HETE (20�hidroksi�eikozatetraenoična kiselina) i 20�COOH�AA (20�karboksi�arahidonska kiselina)] inhibiraju Na+/K+/2Cr�simporter i time smanjuju transepitelni transport NaCI. PGE 2 takođe inhibira transport natrijuma stimulisan antidiuretičnim hormonom, tako što inhibira adenilat�ciklazu (stimulaci jom inhibitornog proteina G) (slika 6�2). Reapsorpcija natrijuma u distalnim tubulima
Kao i u drugim delovima tubuli, i u ovom segmentu se niska koncentracija natrijuma u ćeliji održava uz pomoć Na +�K+�ATP�aza pumpe koja se nalazi na bazolateralnoj membrani. Natrijum ulazi u ćeliju zajedno sa hloridima uz pomoć Na +/CI"�simportera (osetljivog na tiazid) koji se nalazi na lumi� nalnoj membrani. Aktivnost ovog transportera stimulišu aldosteron i angiotenzin II, a takođe i simpa� tički nerv preko a�receptora. Distalni tubuli su nepropustljivi za vodu (slika 6�3.). Reapsorpcija natrijuma u sabirnim cevčicama
U kortikalnim cevčicama natrijum ulazi u ćeliju kroz kanale za natrijum. Prelazak natrijuma iz lumena u ćeliju generiše transepitelni električni gradijent, pa je luminalna strana membrane negativnija u odnosu na intersticijum. Ovaj električni gradijent omogućava da kalijum izlazi iz ćelije kroz kanale za kalijum. Transport natrijuma u ćeliju stimuliše aldosteron i to tako što povećava broj kanala za natrijum sa luminalne strane i broj Na +�K+�ATP�aza pumpi sa bazolateralne strane. ADH stimuliše reapsorpciju vode, a posredno i reapsorpciju Na preko cAMP. PGE 2 smanjuje reapsorpciju Na tako što inhibira adenilat�ciklazu (slika 6�4.).
S. Spasić: Elektroliti
6�7
simpatičkf nerv
depolartzacija membrane
skupljanje m membrane < MDNaCI
arterijski pritisak
Slika 6�6. Sekrecioni mehanizam za renin Renalni baroreceptori reaguju na perfuziju i signaliziraju da je došlo do promene pritiska. Granična vrednost krvnog pritiska u renalnim arterijama je oko 80 mmHg i kada je on iznad ove vrednosti nema promene u lučenju renina. Međutim, kada pritisak padne ispod ove vrednosti stimuliše se lučenje renina. Pošto lučenje renina zavisi od arterijskog pritiska, svako njegovo povećanje stimuliše izlučivanje natrijuma, jer nema lučenja renina. Sekreciju renina takođe stimuliše smanjenje koncentracije natrijuma i hlorida u maculi densi. Medijatori ovog procesa još uvek nisu poznati, ali neka istraživanja pokazuju da je efekat natrijuma i hlorida mnogo veći nego što je onaj koje se postiže mehanizmom baroreceptora. Jukstaglomerularne ćelije su inervisane simpatičkim neuronima i kada dođe do njihove stimulaci je pojačava se lučenje renina. Neuralni efekat na sekreciju renina je posredovan lokalnim oslobađanjem norepinefrina, koji deluje na p �adrenergičke receptore. Oni aktiviraju adenilat�ciklazu, zbog čega se povećava koncentracija intracelualmog cAMP, a on inhibitomo deluje na oslobađanje kalciju� ma. Lučenje renina kao posledica stimulacije simpatikusa ima značaja kod krvarenja, dugotrajnog stajanja i intenzivnog vežbanja, jer pomaže da se u tim situacijama održi krvni pritisak. Na oslobađanje kalcijuma inhibitomo deluju i prostaglandini E 2 i fe. Na sekreciju renina inhibitomo deluju angiotenzin II i atrijalni natriuretični peptid. Hernija renin�angiotenzin sistema
Angiotenzinogen je glikoprotein koji se sintetiše u jetri i na svom N�terminalnom delu ima ostatak od 14 aminokiselina koji je važan za dalji niz reakcija u kojima nastaje angiotenzin II (slika 6�7). De� lovanjem renina na angiotenzinogen nastaje dekapeptid (čepa se veza između 10�te i 11�te aminoki� seline) angiotenzin I. Na angiotenzin I deluje konvertirajući enzim koji odvaja dve aminokiseline i ostaje oktapeptid pod nazivom angiotenzin II. Konvertirajući enzim se nalazi na luminalnoj membrani vaskularnog endotela. Angiotenzin II ima vrlo kratak poluživot (manje od jednog minuta) i u cirkulaciji ga razlazu enzimi pod nazivom angiotenzinaze. Metaboliti angiotenzina II nemaju biološku aktivnost. Sistem renin�angiotenzin igra ključnu ulogu u regulaciji ravnoteže tečnosti i elektrolita, kao i arterijskog krvnog pritiska, jer angiotenzin II deluje na nekoliko mesta u organizmu: 1. na zonu glomerulozu u kori nadbubrega deluje tako što stimuliše sintezu aldosterona;
6�8
Medicinska biohemija 2. u bubrezima izaziva vazokonstrikciju, povećava reapsorpciju natrijuma u proksimalnim tubuli�
ma i inhibira sekreciju renina; angiotenzinogen
(oktapeptid)
peptidni fragmenti Slika 6�7. Shematski prikaz hernije renin�angiotenzin sistema
3. u centralnom nervnom sistemu povećava krvni pritisak, stimuliše centar za žeđ i povećava sekreciju antidiuretičnog hormona i ACTH; 4. izaziva kontrakciju glatkih mišića u arteriolama što izaziva povećanje krvnog pritiska, ali pritisak povećava i delovanjem na mozak i autonomni nervni sistem. Aldosteron
Aldosteron je hormon kore nadbubrega i ubraja se u grupu mineralokortikoida. Mineralokortikoid� ni efekat ima i deoksikortikosteron, takođe hormon kore nadbubrega, ali je oko 100 puta slabiji od al� dosterona. Aldosteron deluje u distalnim tubulima na sledeći način: povećava reapsorpciju natrijuma, povećava reapsorpciju vode, što je direktna posledica reapsorpcije natrijuma i povećava sekreciju kalijuma. Ove efekte aldosteron ispoljava tako što se posle ulaska u ćeliju vezuje za receptore i, mehanizmom koji još uvek nije poznat povećava broj kanala za natrijum na luminalnoj membrani, odnosno broj Na+�K+�ATP�aza pumpi na bazolateralnoj membrani. Zbog svega ovoga se povećava tran� sepitelni transport natrijuma (i kalijuma). Aldosteron deluje i na znojne i pljuvačne žljezde, kao i na kolon gde ispoljava identičan efekat kao u distalnim tubulima. Prema tome, glavni neto efekat aldosterona je čuvanje natrijuma, a samim tim i vode. U ćelije distalnih tubula pored aldosterona ulazi i kortizol (glukokortikoidni hormon) koji se vezuje za odgovarajuće receptore, ali može da se vezuje i za receptore za mineralokorikoide. Afinitet korti� zola i aldosterona za mineralokortikoidne receptore je jednak, uz napomenu da je koncentracija kor� tizola u cirkulaciji 100 do 1000 puta veća od koncentracije aldosterona. Međutim, u ćelijama distalnih tubula postoji enzim 11(3�hidroksisteroid�dehidrogenaza (11p�HSD) koji brzo razlaže kortizol, pa tako ostaje samo efekat aldosterona. Kod nasledne deficijencije ovog enzima (bolest koja se naziva prividni višak mineralokortikoida � AME) ili kod inhibicije enzima (kada se uzima velika količina slatkiša sa likviricijom) dolazi do hronične stimulacije transporta natrijuma u distatne tubule, što kao posledicu ima hipertenziju. Kontrola sekrecije aldosterona je multifaktorska i vrlo usko povezana sa drugim faktorima koji učestvuju u regulaciji vode i elektrolita, ali i krvnog pritiska. Posmatrano u odnosu na glavne efekte aldosterona, najznačajniji regulatori sekrecije aldosterona su:
6�9
S. Spasić: Elektroliti
� koncentracija jona kalijuma u ekstracelularnoj tečnosti: vrlo malo povećanje koncentracije kali� juma u krvi snažno stimuliše sekreciju aldosterona. � angiotenzin II: smanjenje renalnog protoka krvi (što je obično povezano sa smanjenjem zapre� mine krvi), aktivira sistem renin�angiotenzin, oslobađa se angiotenzin II, koji stimuliše sekreciju aldosterona. Drugi faktori koji stimulišu sekreciju aldosterona su adrenokortikotropni hormon (kratkotrajna stimulacija) i deficit natrijuma. Faktori koji supresiraju sekreciju aldosterona su atrijalni natriureticni hormon, visoka koncentracija natrijuma i deficit kalijuma. Natriureticni faktor
Atrijalni natriureticni peptid (ANP) je hormon sagrađen od 28 aminokiselina koji se sintetiše u atri� jalnim miocitima i sekretira se kao odgovor na povećani atrijalni pritisak, odnosno njegova sekrecija se smanjuje kada se smanji atrijalni pritisak. Na shemi (slika 6�8) su prikazani putevi kojima se oslobađa ANP i njegovo dejstvo direktnim i indirektnim mehanizmima na povećanje izlučivanja natrijuma. ANP povećava izlučivanje natrijuma povećanjem brzine glomerularne filtracije i smanjenjem reapsor� pcije natrijuma direktnim i indirektnim delovanjem na tubule. Direktan efekat ANP na tubule je taj što smanjuje propustljivost za natrijuma, a indirektan efekat je inhibira stvaranje angiotenzina II i time sekreciju aldosterona. ANP igra važnu ulogu u izlučivanju natrijuma u situacijama kada je zapremina ECT jako povećana, što se dešava kod teških kongestivnih bolesti srca i na taj način štiti organizam od stvaranja velikih edema. t zapremina ECT 1 t atrijalni pritisak t oslobadjanje atrijalnog natriuretičnog peptida i oslobadjanje renma
TGFR
I angiotenzin II
i aldosteron
i tubularna reapsorpcija Na
H T izlučivanje Na Slika 6�8. Mehanizam delovanja ANP kao odgovor na povećanje zapremine ECT Az ot�m onok sid Azot�monoksid (NO) se sintetiše iz aminokiseline L�arginina u endotelu tubula uz delovanje NO� sintaze. NO povećava izlučivanje natrijuma povećanjem filtracije u glomerulima i inhibicijom reapsor� pcije natrijuma u tubulima. Reapsorpciju natrijuma u tubulima NO inhibira tako što direktno smanjuje transport natrijuma, a deluje i kao antagonist angiotenzinu II (slike 6�9). Neke studije su pokazale da se sinteza NO povećava kada je unošenje soli veliko, tako da se uz njegovu pomoć eliminiše taj višak natrijuma.
6�10
Medicinska biohemija
t zapremina ECT t renalna sinteza NO t oslobadjanje atrijalnog) natriuretičnog peptida
T renalni intersticijelni hidrostatski pritisak i tubularna reapsorpcija Na
Slika 6�9. Delovanja NO kao odgovor na povećanje zapremine ECT Balans natrijuma kod povećanog unošenja Unošenje natrijuma u velikim količinama izaziva homeostatski odgovor koji ima cilj da uskladi izlučivanje sa takvim unosom. Međutim, izlučivanje natrijuma u tim situacijama ne počinje odmah, već tek kada dođe do malog povećanja njegove koncentracije u plazmi, a time i do povećanja zapremine ECT. Malo povećanje zapremine ECT aktivira sisteme koji podstiču izlučivenja, a suprimira sisteme koji zadržavaju natrijum. Pod normalnim uslovima, progresivno povećanje unošenja natrijuma smanjuje sekreciju renina, stvaranje angiotenzina II i sekreciju aidosterona, a povećava stvaranje ANP i NO, što sve uslovljava da se izlučivanje natrijuma poveća (slika 6�10).
t volumski receptori baroreceptori i anti�natriuretični sistemi angiotenzin aldosteron renalni simpatikus
t natriuretični sistemi ANP NO
arterijski pritisak i reapsorpcija Na
T izlučivanje Na Slika 6�10. Održavanja balansa natrijuma kod povećanog unošenja natrijuma
S. Spasić: Elektroliti
6�11
POREMEĆAJI U BALANSU NATRIJUMA Poremećaji u balansu natrijuma mogu da se ispolje kao višak ili nedostatak natrijuma u organizmu, što može biti praćeno i promenom koncentracije natrijuma u plazmi.
Nedostatak natrijuma u organizmu Nedostatak natrijuma u organizmu se pojavljuje kada je unošenje natrijuma manje od izlučivanja, a to se dešava iz različitih razloga: Poremećaji u gastrointestinalnom traktu, kao što su teške dijareje ili povraćanja dovode do gubitka velikih količina natrijuma, obzirom da je koncentracija natrijuma u sekretima (kao i njihova zap� remina) koji se ovde luče velika. Ukoliko se u ovakvim slučajevima natrijum ne nadoknadi, bilo oralno ili intravenski, dolazi do smanjenja ukupne količine natrijuma u organizmu. Gubitak natrijuma putem kože se povećava kada se poveća količina znoja koja se izlučuje, a to se dešava kod izuzetnog fizičkog napora, kada je spoljašnja temperatura visoka ili u febrilnim stanjima, zatim kada se poveća koncentracija natrijuma u znoju (kod cistične fibroze) ili kada se putem kože gubi velika količina transudata (kod opekotina). Hipoaldosteronizam izazvan bolestima nadbubrežne žljezde ili poremećajima u sistemu kojim se reguliše lučenje aldosterona, dovodi do smanjene reapsorpcije natrijuma u distalnim tubulima. Osim toga, do povećanog izlučivanja natrijuma dolazi i kod terapije diureticima, kod osmotske di� reze (diabetes mellitus) i kod nedovoljnog lučenja ADH.
Višak natrijuma u organizmu Količina natrijuma u organizmu se povećava kada je unošenje natrijuma veće od njegovog izluči vanja kao posledica poremećaja u mehanizmu za regulaciju natrijuma. Kako je natrijum prisutan u ECT povećanje njegove količine u organizmu obično je praćeno i povećanjem volumena ECT, posebno IST, što kao posledicu ima nastajanje edema. Uzroci koji dovode do povećanja količine natrijuma u organizmu su sledeći: insuficijencija srca, bolesti jetre, bolesti bubrega, hiperaldosteronizam i trudnoća. Insuficijencija srca kao posledicu ima povećanje količine natrijuma u organizmu iz sledećeg razloga: zbog smanjenog minutnog volumena srca smanjuje se perfuzija bubrega, a time i filtracija natri juma uz istovremeno povećanje reapsorpcije natrijuma u proksimalnim tubulima. Krajnji rezultat je smanjeno izlučivanje natrijuma. Otežano vraćanje krvi iz vena (kao posledica slabosti srca) dovodi do povećanja pritiska u venama i zadržavanja vode u intersticijalnom prostoru, zbog čega se smanju je efektivni volumen krvi, posebno u arterijskom delu. Hipovolemija stimuliše lučenje aldosterona i ADH, koji dalje povećavaju retenciju natrijuma i vode, što sve dovodi do povećanja količine natrijuma u organizmu. Bolesti jetre koje su praćene venskom opstrukcijom kao posledicu imaju stvaranje velikih količina hepatične limfe, zbog čega se povećava portalno venski i sinusoidalni pritisak. Zbog povećanja pritiska dolazi do izlivanja tečnosti u peritonealni prostor (asciti), smanjuje se volumen arterijske krvi, a hipovolemija izaziva zadržavanje natrijuma i vode. Bolesti bubrega kod kojih je smanjena glomerulama filtracija praćene su smanjenim izlučivanjem natrijuma. Do ovakvih poremećaja dolazi kod bubrežne ishemije, delovanja nefrotoksina, hronične bubrežne infekcije, glomerulonefritisa ili opstrukcije bubrežnih puteva. Osim toga, kod nefrotskog sindroma kod koga se gubi velika količina albumina, dolazi do preraspodele vode između vaskular� nog i intersticijalnog prostora i povećanja zapremine IST. Zbog toga se smanjuje volumen arterijske krvi i zadržavanja natrijuma i vode.
6�12
Medicinska biohemija
Trudnoća je stanje kod koga dolazi do povećanja ukupne količine natrijuma za 500 do 800 mmol. Razlozi za ovu pojavu nisu sasvim poznati, ali je moguće da su posledica poremećaja u mehanizmu za održavanje koncentracije natrijuma.
Poremećaji u koncentraciji natrijuma u plazmi Promene u količini natrijuma u organizmu ne moraju uvek biti praćene i promenama u koncentraciji natrijuma u plazmi, koje inače kada postoje mogu biti snižene (hiponatremija ili hiponatrijemija) ili povišene (hipernatremija ili hipernatrijemija). Hiponatremija Pod hiponatremijom se smatra stanje u kome je koncentracija natrijuma u serumu <135 mmol/L. Kada se ustanovi hiponatremija potrebno je prvo isključiti pseudohiponatremiju koja se javlja kod hi� perlipidemije i hiperglobulinemije (velika količina lipida odnosno proteina zauzima veliku zapreminu u plazmi, tako da se natrijum razređuje). Hiponatremija može da nastane ili zbog gubitka natrijuma ili zbog razblaživanja natrijuma u organizmu. a. Hiponatremija zbog gubitka natrijuma praćena je ili normalnom zapreminom ECT ili dehid� ratacijom, kod koje je veći deficit natrijuma nego deficit vode. Natrijum može da se gubi ekstrarenal� nim putevima i to: � poremećaji u gastrointestinalnom traktu (povraćanje, dijareja, intestinalne opstrukcije), � opekotine, � krvavljenja. Natrijum takođe može da se gubi i bubrezima iz sledećih razloga: � kod teške osmotske diureze ne reapsorbuju se anjoni (ketokiseline kod dijabetesa ili bikarbonat kod alkaloze), zbog čega je poremećena reapsorpcija tečnosti u tubulima, tako da se voda gubi u većim količinama a sa njom i natrijum (i kalijum). � kod hipoaldosteronizma (Adisonova bolest) je smanjena reapsorpcija natrijuma (uz smanjenu sekreciju kalijuma). Blaža hiponatremija se sreće kod adrenogenitalnog sindroma (enzimski defekti u sintezi gluko� i mineralokortikoida) gde je gubitak natrijuma manje ili više izražen. � kod hronične insuficijencije bubrega kod koje je smanjen broj funkcionalno sposobnih nefrona, tako da velika količina različitih supstanci (u prvom redu ureja) ostaje nereapsorbovana, što dovodi do osmotske diureze, odnosno povećanog izlučivanja natrijuma. Pored toga, oštećeni bubrezi nisu u stanju da regulišu izlučivanje natrijuma. � kod oštećenja tubula je poremećena funkcija tubula, pa oni nisu u stanju da odgovore na aldos� teron i dolazi do gubitka natrijuma. Takođe kod renalne tubularne acidoze nema izlučivanja vodonič� nog i amonijum jona, već se izlučuju natrijum i kalijum. � lekovi takođe mogu da dovedu do pojačanog renalnog gubitka natrijuma: diuretici (tiazidi, furo� semid, spironalakton, amilorid, triamteren), litijumove soli (kod dugotrajne terapije), hlorpropamid, in� dometacin, paracetamol. b. Hiponatremija zbog razblaživanja natrijuma u organizmu praćena je najčešće hiperhidra� tacijom, a dijagnoza ne može da se postavi samo na osnovu laboratorijskih nalaza, već prvenstveno na osnovu kliničke slike. Uzroci zbog kojih nastaje ovaj tip hiponatremije su sledeći: � kod insuficijencije srca dolazi do smanjene perfuzije bubrega, što pokreće sistem renin� angiotenzin�aldosteron (senzori u bubrezima reaguju kao u slučaju hipovolemije) i dolazi do zadrža vanja vode i natrijuma. U ovom slučaju se najčešće zadržava više vode nego natrijuma tako da je krajnji rezultat diluciona hiponatremija, ali je ukupna količina natrijuma u organizmu povećana. � akutna ili hronična insuficijencija bubrega dovodi smanjenog klirensa vode, a time i do hiponatremije. � primena infuzija ili ishrana sondom
S. Spasić: Elektroliti
6�13
� hipoalbuminemija izaziva smanjenje onkotskog pritiska plazme i prelazak vode iz vazalnog u in� tersticijalni prostor, zbog čega baro�receptori stimulišu sekreciju aldosterona i ADH, a sve to dovodi do zadržavanja vode i natrijuma u tubulima (najčešće više vode nego natrijuma). Hipoalbuminemija se javlja kod hroničnih bolesti jetre (smanjena sinteza) ili kod nefrotskog sindroma (povećan gubitak). � redak, ali karakterističan uzrok za nastajanje ovog tipa hiponatremije je sindrom neodgovarajućeg lučenja ADH (SIADH), kod koga dolazi do prekomernog zadržavanja vode. � lekovi takođe mogu da povećaju sekreciju ADH, i time dilucionu hiponatremiju: hipnoti� ci/narkotici (morfin, barbiturati), hipoglikemici (hlorpropamid, tolbutamid), antineoplastici, antikonvul� zanti (karbamazepin), klofibrat, izoprenalin, derivati nikotina. Hipernatremija Kod hipernatremije je koncentracija natrijuma > 145 mmol/l, a koncentracije iznad 155 mmol/L ugrožavaju život i mora odmah da se interveniše. Hipernatremija može da nastane zbog nedostatka vode, zbog viška natrijuma, zbog poremećene endokrine regulacije, kao posledica delovanja nekih lekova ili iz nepoznatih razloga. a. Hipernatremija zbog nedostatka vode javlja se u slučajevima kada se u organizam ne unosi dovoljno vode ili se voda pojačano gubi, što odgovara stanju hipertone dehidratacije: smanjen je volumen plazme, povećana koncentracija proteina u plazmi i povećan hematokrit. Ovoj tip hipernatremije može da nastane iz sledećih razloga: � kod debilnih, stuporoznih ili komatoznih pacijenata koji ne unose dovoljne količine vode, a takođe i kod pacijenata koji nemaju osećaj žeđi (psihogeni razlozi). � kod pacijenata koji gube velike količine vode znojenjem: febrilna stanja, rad na visokoj spoljaš� njoj temperaturi, težak fizički napor, � kod pacijenata sa pituitarnim ili nefrogenim diabetes insipidusom gube se velike količine vode uz relativno mali gubitak natrijuma, tako da se razvija hipernatremija sa vrednostima natrijuma >160 mmol/L, � kod pacijenata sa glomerularnom ili tubularnom acidozom, � kod pacijenata sa osmotskom diurezom koji gube više vode nego natrijuma, � kod gastrointestinalnih gubljenja velikih količina vode: gastroenteritis, dizenterija, kolitis, kolera, dugotrajna povraćanja. b. Hipernatremija zbog viška natrijuma nastaja zbog povećanog unošenja ili smanjenog izluči vanja natrijuma, što odgovara stanju hipertone hiperhidratacije: zapremina plazme je normalna ili po većana, smanjena koncentracija proteina i smanjen hematokrit. Ovaj tip hipernatremije se retko javlja, obično kada se pacijentima sa smanjenom funkcijom bubrega daju u obliku infuzionih rastvora velike količine natrijumovih soli ili kod pacijenata sa teškom laktatnom acidozom. c. Hipernatremija zbog poremećene endokrine regulacije javlja se u sledećim stanjima: � kod hiperaldosteronizma, primarnog i sekundarnog, � kod hroničnih bolesti bubrega kod kojih su oštećeni receptori za ADH u tubulima, pa se gubi velika količina vode (cistični bubreg, intersticijalni nefritis, terminalna faza bubrežne insuficijencije). d. Hipernatremija zbog delovanja lekova nastaje kod primene mineralokortikoida, anaboličkih steroida, androgena, holestiramina, kortikotropina, kortizola, zatim kod pacijenata kojima se daju velike količine rastvora natrijum bikarbonata kao terapija dijabetične ketoacidoze. e. Hipernatremija sa nepoznatim mehanizmom nastanka javlja se: � kod akutnih i hroničnih leukoza, � kod plivača na kratke staze kod kojih postoji izrazita laktatna acidoza (u ovim slučajevima hipernatremija ne može da se objasni nijednim od poznatih mehanizama).
Medicinska biohemija
6�14
Kalijum Organizam odraslog čoveka sadrži oko 50 mmol K/kg telesne težine i od te količine oko 98% se nalazi u ćelijama. Kalijum je glavni intracelulami katjon i održavanje njegove konstantne koncentraci je je esencijalno za održavanje života ćelija. Koncentracija kalijuma u ICT iznosi 150 � 160 mmol/L, a u ECT je 3,5 � 5 mmol/L. Sadržaj kalijuma u organizmu zavisi od starosti, pola i mišićne mase, zato što je najveći deo kalijuma lokalizovan u mišićima. Razlika između koncentracije kalijuma u plazmi i intersticijalnoj tečnosti je posledica Gibbs� Donnan�ove ravnoteže (kako je objašnjeno kod natrijuma), a razlika između koncentracije kalijuma u IST i ICT posledica je aktivnog transporta (natrijum izlazi iz ćelije aktivnim transportom, a kalijum ulazi u ćelije). Koncentracija kalijuma u ECT zavisi od ukupnog sadržaja kalijuma u organizmu, kao i od relativne raspodele kalijuma između ECT i ICT.
UNOŠENJE I IZLUČIVANJE KALIJUMA Ukupan sadržaj kalijuma u organizmu zavisi od unošenja kalijuma i njegovog izlučivanja, a kod zdravih osoba se ravnoteža postiže tako što je količina kalijuma koja se izluči jednaka količini kalijuma koja se unosi. Količina kalijuma koja se unosi hranom zavisi od navika u ishrani, a u prošeku iznosi 50�100 mmol/dan.
Slika 6�11. Ekstrarenalna homeostaza kalijuma
6�15
S. Spasić: Elektroliti
Velike promene u koncentraciji kalijuma u ECT sprečavaju se ekstrarenalnim mehanizmom u kome učestvuju insulin i kateholamini (slika 6�11). Vezivanje insulina za receptore izaziva hiperpola� rizaciju ćelijske membrane (1), kao i aktivaciju Na +�K+�ATP�aza pumpe (2). Oba ova procesa omogućavaju ulazak kalijuma u ćeliju. Kateholamini stimulišu ulazak kalijuma u ćeliju tako što njihovo vezi vanje za (32�receptore ubrzava sintezu cAMP, koji aktivira Na +�K+�ATP�aza pumpu (3). teofilin inhibira degradaciju cAMP, čime se potencira efekat kateholamina, a to može da dovede do hipokalemije. Iz organizma se kalijum gubi gastrointestinalnim traktom, kroz kožu i urinom. Gastrointestinalnim traktom se normalno gubi manje od 5 mmol/dan, a količina kalijuma koja se gubi znojem je manja od količine natrijuma. Glavni put izlučivanja a i regulacije nivoa kalijuma su bubrezi. Međutim, odgovor bubrega na promene u količini kalijuma koji se unosi hranom nije trenutan, već je potrebno nekoliko sati ili čak nekoliko dana da se izlučivanje uravnoteži sa unošenjem. Kod unošenja velikih količina kalijuma, nagli porast koncentracije kalijuma u ECT sprečava se tako što kalijum brzo ulazi u ćelije jetre, skeletnih mišića i adipoznog tkiva. U toku nekoliko sledećih sati kalijum postepeno izlazi iz ovih depoa i izlučuje se bubrezima. Nagli gubitak kalijuma, npr. posle uzimanja nekih diuretika može da dovede do smanjenja njegove koncentracije u ECT, a to se sprečava premeštanjem kalijuma iz tkiv� nih depoa u ECT. Izlučivanje kalijuma bubrezima Bubrezi izlučuju različite količine kalijuma, ali ako ima potrebe u stanju su da izluče vrlo velike količine, tako da se kod zdravih ljudi retko sreće značajna hiperkalemija. S druge strane, bubrezi imaju mnogo manju sposobnost da čuvaju kalijum, pa hipokalemija može da se javi ako je smanjeno unošenje kalijuma. filtriranje 600�700 mmol/d
ekskrecija urinom * 00 mmol/d Slika 6�12. Funkcija bubrega u homeostazi kalijuma (PT � proksimalni tubul, SHP � silazni deo Henleove petlje, UHP � uzlazni deo Henleove petlje, DT � distalni tubul, SC � sabirna cevčica) Proces renalnog izlučivanja kalijuma započinje potpunom filtracijom u glomerulima. Više od polo vine filtriranog kalijuma pasivno se reapsorbuje do kraja proksimalnih tubula i ovaj proces nije posebno regulisan. Količina reapsorpbovanog kalijuma je uglavnom konstantna, što znači da proksimalni tubuli ne učestvuju značajno u regulaciji izlučivanja kalijuma. Reapsorpcija kalijuma u proksimalnim tubulima uglavnom je proporcionalna količini reapsorbovanog natrijuma i vode.
6�16
Medicinska biohemija
Glavno mesto aktivne reapsorpcije kalijuma je uzlazni deo Henleove petlje, tako da do kraja dis� talnih tubula u tubulamoj tečnosti ostane 10�15% od ukupne količine filtriranog kalijuma. Zbog reapsorpcije kalijuma u ovom delu tubula, povećava se koncentracija kalijuma u intersticijalnoj tečnosti, što favorizuje pasivnu sekreciju kalijuma u proksimalnim tubulima i silaznom delu Henleove petlje (slika 6�12). U uzlaznom delu Henleove petlje kalijum se reapsorbuje uz pomoć Na +/K+/2CI"� simportera, a ovom procesu pogoduje niska intracelulama koncentracija natrijuma i hlorida. U isto vreme, zbog pozitivnog naelektrisanja u lumenu tubula jedan deo kalijuma se reapsorpbuje paracelu� larnim putem. Kanali za kalijum na luminalnoj membrani omogućavaju recikliranje kalijuma u tubular� noj tečnosti čime se obezbeđuje supstrat za Na +/K+/2Cr�simportere (slika 6�13).
K+ *
_J
Slika 6�13. Reapsorpcija kalijuma u uzlaznom delu Henleove petlje
U sabirnim cevčicama se kalijum sekretira, ali ako je koncentracija kalijuma u ECT snižena u ovom delu tubula može kalijum i da se reapsorbuje. Ova dva transportna mehanizma su locirana u različitim ćelijama. Zbog mogućnosti i sekrecije i reapsorpcije, ovaj deo tubula je mesto gde se određuje ukupna količina kalijuma koja će biti izlučena putem bubrega.
3Na*
7 —"T
"3 ( ATPaza)
Slika 6�14. Sekrecija kalijuma u glavnim ćelijama sabirnih cevčica
Sekrecija kalijuma u glavnim ćelijama sabirnih cevčica je aktivan proces koji je povezan sa reap� sorpcijom natrijuma: sekrecija se odvija u dva stupnja: prvo kalijum ulazi u ćeliju kroz bazolateralnu membranu uz pomoć Na+�K+�ATP�aze, a zatim prelazi u lumen tubula pasivnom difuzijom kroz kanale za kalijum na luminalnoj membrani i to zahvaljujući elektrohemijskom gradijentu koji postoji između ćelije i lumena tubula (slika 6�14). Jedan deo kalijuma može da se vrati u krv kroz kanale na bazola� teranoj membrani (čime se reciklira kalijum koji je ušao u ćeliju kroz Na +�K +�pumpu), a koliko kalijuma će ići u lumen tubula, odnosno nazad u krv zavisi od propustljivosti luminalne i bazolateralne membrane i elektrohemijskog gradijenta za kalijum. U normalnim uslovima je luminalna membrana više propustljiva za kalijum od bazolateralne membrane. U uslovima kada je količina kalijuma u organizmu smanjena, kalijum može da se reapsorbuje u sabirnim cevčicama, a reapsorpcija se dešava u interkaliranim ćelijama (pod normalnim uslovima re�
S. Spasić: Elektroliti
6�17
apsorpcije gotovo da i nema). Kalijum se iz lumena reapsorbuje uz pomoć K+�H+�ATP�aze, čija je aktivnost regulisana, odnosno smanjena količina kalijuma u organizmu aktivira pumpu čime se poveća va reapsorpcija kalijuma (slika 6�15). Aktivnost K+�H+�ATP�aza pumpe može biti odgovorna za održa vanje metaboličke alkaloze u uslovima smanjene količine kalijuma u organizmu.
Slika 6�15. Reapsorpcija kalijuma u interkaliranim ćelijama sabirnih cevčica
REGULACIJA IZLUČIVANJA KALIJUMA Sekreciju kalijuma u distalnim tubulima i sabirnim cevčicama, a time i ukupno izlučivanje kalijuma regulise nekoliko faktora: kalijum u hrani, koncentracija kalijuma u plazmi, aldosteron i brzina protoka tečnosti kroz tubule. Kalijum u hrani. Količina kalijuma koja se izluči urinom u ravnoteži je sa količinom kalijuma u hrani. Kada se poveća unošenje kalijuma, poveća se i sekrecija u tubulima zbog povećanog prelaska kalijuma u ćelije (uz pomoć Na +�K+�ATP�aza pumpe), što je opet posledica promene u nivou aldoste� rona. S druge strane, kada se unošenje kalijuma smanji, smanjuje se i prelazak kalijuma u ćelije, opet kao odgovor na promenu nivoa aldosterona. Kalijum u plazmi. Kada se poveća koncentracija kalijuma u plazmi, povećava se i sekrecija u tubulima i ona dostiže svoj maksimum kada je koncentracija u plazmi 6 mmol/L. Pošto povećanje koncentracije kalijuma u plazmi stimuliše lučenje aldosterona, povećana sekrecija u tubulima je jednim delom vezana za povećan prelazak kalijuma u sekretome ćelije pod uticajem aldosterona. Pored toga, povećana koncentracija kalijuma u plazmi smanjuje vraćanje kalijuma iz sekretornih ćelija u krv, što takođe povećava izlučivanje kalijuma. Hormoni. Najvažniji hormon koji regulise sekreciju kalijuma u tubulima i sabirnim cevčicama je aldosteron. Aldosteron stimuliše sekreciju kalijuma tako što povećava prelazak kalijuma u ćelije uz pomoć Na+�K+�ATP�aza pumpe i povećava propustljivost luminalne membrane u sekretonim ćelijama. Pored toga, u ovom delu nefrona aldosteron stimuliše reapsorpciju natrijuma zbog čega se po većava razlika u transepitelnom potencijalu, što dodatno stimuliše sekreciju kalijuma. Brzina protoka kroz tubule. Kada se poveća brzina protoka tečnosti kroz tubule, poveća se i sekrecija kalijuma, jer se na taj način održava povoljan koncentracioni gradijent kalijuma između lumena tubula i ćelija. Pošto količina kalijuma koja se sekretira zavisi od ovog gradijenta, brzi protok tečnosti sprečava povećanje koncentracije kalijuma u tubulamoj tečnosti, pa se koncentracioni gradi jent održava na povoljnom nivou.
POREMEĆAJI BALANSA KALIJUMA Kao i kod natrijuma i kod kalijuma može da bude povećana ili smanjena ukupna količina kalijuma organizmu, sa ili bez promene koncentracije kalijuma u plazmi.
6�18
Medicinska biohemija
Nedostatak kalijuma u organizmu Kao i kod zadržavanja kalijuma i gubljenje kalijuma iz organizma je posledica poremećene ravnoteže između unete i izlučene količine kalijuma iz organizma, ali u suprotnom smeru. a. Smanjeno unošenje kalijuma: nizak sadržaj u hrani, u alkoholizmu, anorexia nervosa. b. Povećan gubitak gastrointestinalnim traktom: povraćanje, dijareja, preterana upotreba lak� sativa, malapsorpcija. c. Povećan gubitak urinom: hiperaldosteronizam (primarni, hiperplazija kore nadbubrega ili uzimanje kontraceptivnih pilula), adrenogenitalni sindrom, bolesti bubrega (renalna tubularna acido� za, Fanconi sindrom), primena diuretika (tipa tiazida, inhibitora karboanhidraze, etakrinska kiselina, furosemid), alkaloza.
Višak kalijuma u organizmu Do zadržavanja kalijuma u organizmu dolazi kada se poremeti odnos između količine kalijuma koja se unosi i izlučuje iz organizma, a to se dešava iz dva razloga: a. Kod povećanog unošenja kalijuma, koje se javlja u sledećim situacijama: visok sadržaj u hrani, unošenje u obliku oralnih preparata, intravensko davanje preparata kalijuma, kalijum penicilin u velikim dozama, transfuzija stare krvi. b. Kod smanjenog izlučivanja, a razlozi su: insuficijencija bubrega, hipoaldosteronizam, diureti� ci koji blokiraju sekreciju kalijuma u tubulima, primarni defekti u tubularnoj sekreciji.
Poremećaji koncentracije kalijuma u plazmi Poremećaji u koncentraciji kalijuma u plazmi nastaju zbog poremećaja u ukupnoj količini kalijuma u organizmu ili zbog poremećaja u preraspodeli kalijuma između ECT i ICT. Promene u koncentraciji kalijuma u plazmi mogu da se ispolje kao smanjenje (hipokalemija ili hipokalijemija) ili povećanje (hi� perkalemija ili hiperkalijemija). Hipokalemija Kada se dobije snižena vrednost kalijuma u plazmi (<3,5 mmol/L) prvo treba isključiti pseudohi� pokalemiju koja može da se javi kod hiperlipidemije i hiperglobulinemije, kao i prolaznu hipokalemiju koja je posledica stresa, a može da se javi i posle obroka bogatog ugljenim hidratima ili posle fizičkog napora. Do stvarnog smanjenja koncentracije kalijuma u plazmi dolazi zbog smanjenog unošenja, zbog gubitka kalijuma iz organizma ili zbog njegove preraspodele između ECT i ICT. a. Hipokalemija zbog gubitka gastrointestinalnim traktom javlja se kod dugotrajnih povraćanja, dijareja i fistula. b. Hipokalemija zbog gubitka urinom javlja se kod osmotske diureze, gde se zajedno sa vodom gubi i kalijum i natrijum. Osim toga, kod poremećene tubulame sekrecije vodoničnog jona, ako i kod poremećene reapsorpcije bikarbonata u tubulima izlučuju se povećane količine kalijuma u urinu. Urinom se kalijum izlučuje u velikim količinama i kod svih oblika hiperaldosteronizma. Na isti način kao u tubulima, aldosteron deluje i u tankom crevu, na pljuvačne i znojne žljezde, pa se gubitak kalijuma povećava. Brojni diuretici takođe mogu da dovedu do teške hipokalemije. c. Hipokalemija zbog prelaska kalijuma iz ECT u ICT dešava se kod metaboličke i respiratorne alkaloze gde je koncentracija vodoničnog jona u plazmi snižena, pa kalijumovi joni ulaze u ćelije u zamenu za vodonične. Osim toga, na sniženu koncentraciju vodonika bubrezi reaguju tako što pojačano sekretiraju kalijum, što pojačava hipokalemiju.
S. Spasić: Elektroliti
6�19
Kod terapije insulinom u ćelije ulazi kalijum zajedno sa glukozom, tako da može da dođe do teške hipokalemije, ako se u terapiju ne uvede kalijum; u celini gledano kod ovog tipa hipokalemije može biti povećan ukupni kalijum u organizmu. Hiperkalemija
Hiperkalemija (u plazmi >4,6 mmol/L, u serumu >5 mmol/L) dovodi do promena u potencijalu na membrani mišićnih ćelija, kao i do ekstrasistola i treperenja komora srca. EKG je najbolji indikator in� tracelulane koncentracije kalijuma. Hiperkalemija se javlja zbog povećanog unošenja, zbog smanjene eliminacije kalijuma iz organizma ili zbog povećanog izlaska kalijuma iz ćelija. Kada se utvrdi hiperkalemija treba prvo proveriti da nije u pitanju pseudohiperkalemija. a. Pseudohiperkalemija se javlja kod hemolizovanih uzoraka, zatim kod pacijenata koji imaju leukocitozu (izlazak kalijuma iz leukocita i kada je podveska pri uzimanju krvi bila jako čvrsta. b. Hiperkalemija zbog povećanog unošenja kalijuma sreće se kod pacijenata koji dugotrajno uzimaju diuretike i izgubljeni kalijum nadoknađuju preparatima kalijuma, čija doza nije dobro određena ili im je poremećena funkcija bubrega pa se kalijum ne gubi u onim količinama koje se očekuju. U ovu grupu hiperkalemija dolaze i one koje su prouzrokovane transfuzijom stare krvi u kojoj je povećana koncentracija kalijuma, a ako pri tome pacijenti imaju poremećenu funkciju bubrega pa taj višak kalijuma ne može da se izluči, završetak može biti fatalan. c. Hiperkalemija zbog preraspodele kalijuma između ECT i ICT. U postoperativnim, posttraumatskim i stanjima posle opekotina može doći do prelaska velikih količina kalijuma iz ćelija u cirkulaciju, što dovodi do hiperkalemije. Svaka acidoza, bilo respiratorna ili metabolička dovodi do izlaska kalijuma iz ćelija, zbog čega se njegova koncentracija u ćelijama smanjuje, a u plazmi povećava. d. Hiperkalemija zbog smanjenog renalnog izlučivanja. Teška bubrežna insuficijencija sa velikim smanjenjem glomerularne filtracije dovodi do oligurije, što izaziva hiperkalemiju. Međutim, ovde treba imati na umu da se hiperkalemija javlja tek kada se funkcija glomerula smanji na ispod 20% od normalne, jer tubuli imaju veliki rezervni kapacitet za sekreciju kalijuma. Nedostatak aldosterona i drugih mineralokortikoida dovodi do smanjene sekrecije kalijuma u tu� bulima, što kao posledicu ima hiperkalemiju. e. Hiperkalemija zbog uticaja lekova. Mnogi diuretici, kao što su spironolakton, triamteren i amilorid mogu kod nekih pacijenata da dovedu do hiperkalemije. Takođe neki mišićni relaksanti (suk� cinildiholin) koji se koriste u anesteziji mogu da dovedu do hiperkalemije.
6�20
Medicinska biohemija
Hloridi Hloridi su glavni anjon ECT i kao nosioci negativnog naelektrisanja zaduženi su *za održavanje elektroneutralnosti između ECT i ICT. Kod zdravih odraslih osoba prosečan sadržaj hlorida je 33 mmol/kg telesne težine, od čega se 88% (oko 2 mol) nalazi u ECT, a 12% u ćelijama, pri čemu eritrociti imaju najveći, a mišićne ćelije najniži sadržaj hlorida. U različitim telesnim prostorima hloridi raspoređeni na sledeći način: plazma 14%, IST 27%, IST gustog vezivnog tkiva 17%, IST kostiju 15%, transcelulama voda 5%, ICT 12%. Ovde treba naglasiti daje koncentracija hlorida u IST veća nego u plazmi (za razliku od natrijuma i kalijuma), što je prouzrokovano Glbbs�Donnan�ovom ravnotežom. Razlika između koncentracije hlorida u IST i ICT posledica je razlike u elektrohemijskom potencijalu na ćelijskoj membrani (unutrašnja strana membrane je negativnija od spoljašnje). Sadržaj hlorida u organizmu je rezultat ravnoteže između unete i izlučene količine, a metabolizam hlorida je usko povezan sa metabolizmom natrijuma. Količina hlorida koja se unosi hranom uglavnom je ista kao i količina natrijuma, a zavisi od navika u ishrani. Iz organizma se hloridi izlučuju gastrointestinalnim traktom, kožom i urinom. Kod zdravih osoba se gastrointestinalnim traktom izlučuje vrlo malo hlorida, svega 1 do 2 mmol/dan. Međutim, kod teških dijareja i dugotrajnih povraćanja može dnevno da se izgubi i više od 100 mmol/L. Prosečan sadržaj hlorida u znoju je 30 � 40 mmol/L, a smanjuje se pod uticajem aldosterona. Koncentracija hlorida u znoju je povećana kod cistične fibroze. Pod normalnim uslovima znojem se gubi malo hlorida, ali kod intenzivnog znojenja može da se izgubi i preko 200 mmol/dan. Glavni put gubitka hlorida iz organizma su bubrezi. Hloridi se filtriraju u glomerulima, a reapsor� buju se pasivno prateći natrijum. Od ukupne količine hlorida koja je profiltrirana u glomerulima oko 60 � 65% se reapsorbuje u proksimalnim tubulima, 20 � 25% u Henleovoj petlji, oko 10 �1 5% u distal� nim tubulima, tako da je neto izlučna količina oko 1%.
POREMEĆAJI BALANSA HLORIDA Nedostatak hlorida u organizmu Kao i kod povećanja sadržaja hlorida, do smanjenja njegovog sadržaja u organizmu dolazi kada se poremeti ravnoteža između unošenja i izlučivanja ovog jona. To se dešava u svim slučajevima u kojima postoji gubitak natrijuma, izuzev metaboličke alkaloze u kojoj je smanjen sadržaj hlorida bez promene sadržaja natrijuma. U metaboličkoj alkalozi postoji višak bikarbonata uz normalan sadržaj natrijuma, što zahteva veće izlučivanje hlorida, kako bi se održala elektroneutralnost između ECT i ICT.
/
S. Spasić: Elektroliti
6�21
Višak hlorida u organizmu Do povećanja sadržaja hlorida u organizmu dolazi kada je količina unetih hlorida veća od količine izlučenih, što je posledica poremećaja u homeostatskom mehanizmu. U najvećem broju slučajeva do retencije hlorida dolazi u svim slučajevima u kojima postoji retencija natrijuma. Jedini izuzetak je metabolička acidoza u kojoj postoji retencija hlorida bez retencije natrijuma. Do ove pojavi dolazi zbog toga što je koncentracija bikarbonata (drugi po važnosti anjon ECT) smanjena, pa da bi se održala elektroneutralnost između ECT i ICT u tubulima se reapsorbuje više natrijuma sa hloridom, nego sa bikarbonatom.
Poremećaji u koncentraciji hlorida u plazmi Kao i kod natrijuma, promena u sadržaju hlorida u organizmu nije obavezno praćena i promenom u koncentraciji hlorida u plazmi. Stanje u kome je koncentracija hlorida u plazmi smanjena naziva se hipohloremija, a kada je povećana označava se kao hiperhloremija. Hipohloremija
Hipohloremija može biti posledica nagomilavanja vode (diluciona) ili gubitka hlorida. a. Diluciona hipohloremija se javlja zbog nagomilavanja vode u organizmu. Voda se u organizam unosi oralno, a pri tome se ne izlučuje normalno. Ova pojava se sreće u sledećim stanjima: kod akutne ili hronične insuficijencije bubrega, kod insuficijencije srca ili kod akutne intermitentne porfirije (u ovom slučaju nije poznat tačan mehanizam. b. Hipohloremija zbog gubitka hlorida se sreće u sledećim patološkim stanjima: kod brojnih gastrointestinalnih bolesti (ulcus, dugotrajne dijareje, kolitis, gastroenteritis itd), kod osmotske diure� ze, kod hiperaldosteronizma i Cushing�ovog sindroma, kod febrilnih stanja zbog izlučivanja znoja. c. Hipohloremija zbog uticaja lekova može da se javi kod primene nekih diuretika (furosemid, hidrohlortiazid), kortikosteroida ili preparata bromida. Hiperhloremija
Hiperhloremija ide najčešće paralelno sa hipematremijom, a razlozi za njeno nastajanje mogu biti sledeći: a. Hiperhloremija zbog nedovoljnog unošenja ili gubitka vode: kod debilnih, stuporoznih ili komatoznih pacijenata, kod gubitka vode kroz kožu (febrilna stanja), kod pituitarnog ili renalnog dia� betes insipidusa, kod osmotske diureze. b. Hiperhloremija zbog prekomernog unošenja ili nedovoljne eliminacije soli: kod davanja infuzionih rastvora sa natrijum hloridom pacijentima koji imaju poremećenu funkciju bubrega, kod hronične insuficijencije bubrega. c. Hiperhloremija zbog poremećene endokrine regulacije: kod hiperaldosteronizma (primarnog i sekundarnog), kod primarnog hiperparatiroidizma.
Poglavlje 7. Acido�bazna regulacija Vrlo važna funkcija organizma je održavanje konstantne koncentracije H + jona, jer i najmanja pramena u njegovoj koncentraciji može da dovede do znatne promene u brzini metaboličkih reakcija u ćelijama. Pod normalnim uslovima pH arterijske krvi je prosečno 7,4 (što odgovara koncentraciji H + od 40 nmol/L) sa rasponom od 7,36 do 7,44 i sve vrednosti izvan ovog raspona smatraju se patološkim. Raspon pH koji je spojiv sa životom je 7,30 do 7,52, a vrednosti izvan ovog raspona potencijalno ugrožavaju život. Raspon pH od 7,30 do 7,52 odgovara rasponu koncentracija H + od 50 do 30 nmol/L, odnosno 40 nmol/L ± 25%.
POREKLO KISELINA U ORGANIZMU Ugljeni hidrati, masti i proteini metabolišu se u oksidativnim reakcija u kojima se stvaraju kiseline, koje moraju da se neutrališu kako ne bi došlo do promene pH ekstracelulame tečnosti. U anaerob� nim uslovima (koji se sreću kod teškog fizičkog napora ili otežanog disanja) ugljeni hidrati se metabolišu do laktata i piruvata koji se akumuliraju. Kada se postigne normalna oksigenacija ove kiseline se dalje metabolišu do krajnjeg proizvoda, ugljendioksida. Trigliceridi se razlazu do masnih kiselina, a one dalje pod anaerobnim uslovima do ketonskih tela. Krajnji proizvod razgradnje masnih kiselina je CO2, jer se ketonska tela takođe dalje oksidišu. Proteini se razlazu na aminokiseline, a one se dalje metabolišu do C0 2 , a aminokiseline koje sadrže sumpor (metionin i cistein) kao krajnji proizvod daju soli sumporne kiseline. U metabolizmu nukleoproteina nastaje mokraćna kiselina, a proizvod metabolizma organskih fosfata i fosfora su H + i neorganski fosfat. Kiseline koje se stvaraju u metaboličkim procesima mogu da se podele na "neisparljive" i "ispar� Ijive". U "neisparljive" se ubrajaju neorganske kiseline fosforna i sumporna i organske kiseline mleč� na, acetosirćetna i beta�hidroksibuterna. Fiziološki važna "isparljiva" kiselina je ugljena kiselina, a njena isparljivost dolazi otuda što disosuje na vodu i C0 2 , koji potom može da se eliminiše kao gas. Kompletna reakciona šema ugljene kiseline može da se prikaže na sledeći način: C 0 2 + H 2 0 <�> H 2 C0 3 <�> H+ + HCCV
Na jednom kraju ove reakcije je C0 2 koji može da se posmatra kao anhidrovani oblik H 2 C0 3 , a na drugom je HCO3", koji predstavlja konjugovanu bazu H 2 C0 3 . Reakcija između C0 2 i vode može da se odvija i spontano, ali se u organizmu odvija uglavnom enzimski u prisustvu karboanhidraze. U organizmu se kiseline stvaraju kontinuirano i za 24 sata se "proizvede" oko 20000 mmol/L H + koji je poreklom iz "isparljivih" kiselina (u obliku ugljene kiseline) i oko 80 mmol/L H + iz "neisparljivih" kiselina. Vodonični jon se izlučuje iz organizma putem pluća i bubrega, a pre izlučivanja se neutrali� zuje puferima koji su prisutni u cirkulaciji da bi se sprečila promena pH ekstracelulame tečnosti. Za�
7�2
Medicinska biohemija
hvaljujući tome koncentracija H+ u ekstrace lula moj tečnosti se održava u vrlo uskom opsegu od 35 do 45 nmol/L, u prošeku 40 nmol/L, što odgovara pH vrednosti od 7,4.
ODRŽAVANJE KONSTANTNOG PH TELESNIH TEČNOSTI Pod pojmom acido�bazna ravnoteža podrazumeva se održavanje konstantnog pH telesnih tečnosti, što se postiže vrlo efikasnim mehanizmima. Za održavanje konstantne koncentracije vodoničnog jona esencijalni su: � fiziološki puferi koji neutrališu višak vodoničnog jona, � pluća koja eliminišu C0 2 i � bubrezi koji izlučuju vodonični jon i kontrolišu nivo bikarbonata korišćenjem CO2 i vode.
Fiziološki puferi Najvažniji fiziološki puferi su hemoglobinat/hemoglobin (pKa između 5,4 i 9,4), proteinat/proteini (pKa između 5,4 i 9,4), bikarbonat/ugljena kiselina (pKa 6,12) i dibazni fosfat/monobazni fosfat (pKa 6,7). Ovi puferi nisu podjednako zastupljeni u svim telesnim tečnostima; u plazmi se nalaze bikarbo� natni pufer i proteini, u intersticijalnoj tečnosti samo bikarbonat, a u eritrocitima svi navedeni puferi. Bikarbonatni pufer. Ravnoteža C0 2 , ugljene kiseline i bikarbonata može da se prikaže slede� ćom jednačinom: C 0 2 + H 2 0 ^ � > H 2 C0 3 <
Kz
> H + + HCO3"
gde su K1 i K 2 konstante ravnoteže za reakciju hidracije, odnosno disocijacije. Iz ove jednačine možemo da napišemo: : 1
[H2CQ3] [H 20][CQ>]
= 2
[ H + j [ H C Q ] [H 2CC^]
Iz jednačine za K1 možemo da izračunamo H 2 C0 3 ; H 2 C 0 3 = K l X [ H 2 0 ] x [ C 0 2 ] i da zatim izvršimo zamenu u jednačini za K2: K2
[H + ][HCQj K 1 x [H 2 0 ] x [ C 0 2 ]
Ako pođemo od toga da je [H 2 0] konstantna vrednost i ako konstante K1 i K2 kombinujemo u treću konstantu K/, onda dobijamo izraz: K
. _[H + ][HCCy 1 [COt,]
koji u obliku negativnog logaritma glasi: pHFpK^+log
[HCCS]
[Cpzl
Kako je količina rastvorenog gasa proporcionalna parcijalnom pritisku, a konstanta proporcionalnosti je koeficijent rastvorljivosti a, onda veličinu [C0 2 ] možemo da zamenimo sa apC0 2 , pa će prethodni izraz da glasi: 1 p H = p K 1 + l o g L Zl apC02
S. Spasić: Acido�bazna regulacija
7�3
Ovaj izraz predstavlja Henderson�HasseIbalch�ovu jednačinu koja je osnova za procenu homeostaze vodoničnog jona. U normalnim uslovima koncentracija bikarbonata u plazmi je oko 24 mmol/L, pC0 2 je 40 mm Hg a a je 0,03. Ako ove vrednosti zamenimo u Henderson�Hasselbalch�ovoj jednačini dobićemo: pH = 6,1 + log — — = 6,1 + log 20 = 6,1 +1,3 = 7,4 * 0,03x40 Uloga pufera je da održavaju pH oko vrednosti 7,4, a ako znamo da je pK=6,1, onda lako možemo da saznamo koji su uslovi potrebni za održavanje stalnog pH: y
7,4 � 6,1 + log I" « * ' [H 2 CQ,] 1,3 = log
[HCC5] [H2CO,J
20�logl"«*
1
^[H 2 CC^]
Iz jednačine se vidi da je za održavanje normalnog pH potrebno da odnos HC0 3 " i H 2 C0 3 bude 20:1 i organizam može da koriguje svaku promenu u ovom odnosu kako bi pH ostao nepromenjen. Bikarbonatni pufer je najvažniji puferski sistem u organizmu iz nekoliko razloga: a. Bikarbonatni pufer je vrlo efikasan jer se promena u koncentraciji jedne komponente kompen� zuje pramenom koncentracije druge komponente. b. Drugi puferski sistemi su u ravnoteži sa bikarbonatnim puferom. c. Ugljendioksid vrlo lako difunduje kroz membranu, što znači da se efekat pufera brzo reflektuje na intracelularni prostor. Hemoglobin. Kompleksni puferski efekat proteina, pa time i hemoglobina zavisi od polarnih grupa aminokiselina, na čije pKa vrednosti utiču susedne grupe. Imidazolska grupa u hemoglobinu vezuje slobodan H + tako da je sledeća reakcija usmerena na desnu stranu: HbK + H + =H b H + K+
Ova reakcija se odigrava u tkivima gde je velika koncentracija H + a niska koncentracija 0 2 ) a i zato što je deoksihemoglobin bolji pufer od oksihemoglobina. Puferski kapacitet hemoglobina se povećava i zbog toga što on deluje kooperativno sa bikarbonatnim puferom (kako će kasnije biti objašnjeno). Hemoglobin je bolji pufer pri pH 7,4 od većine proteina i zbog relativno velike koncentracije imi� dazolske grupe (pKa oko 7,3) u molekulu histidina, koji ulazi u sastav globina. Značajna količina C0 2 transportuje se kroz ekstracelularnu tečnost vezana za aminogrupe proteina, pa i hemoglobina. Ugljendioksid se vezuje neenzimski za aminogrupu proteina kao karbamino grupa: 0 2 C + H 2 N � protein �> 0 2 C � N � protein Proteini. Proteini u plazmi su prisutni u manjoj molarnoj koncentraciji nego hemoglobin u eritrocitima, tako da im je puferski kapacitet mnogo manji. Njihov puferski kapacitet u intersticijalnoj tečnosti jezanemarljiv jer ih u tom prostoru i nema, ali su zato mnogo značajniji kao pufer u ćelijama u kojima puferuju H+ pre nego što izađe iz ćelije. Proteini ostvaruju svoj puferski efekat preko prostetičnih grupa koje vezuju H +, kao i preko aminokiselina lizina, histidina, arginina, glutamata i aspartata. Fosfat. Mono� i dihidrogenfosfat obrazuju pufer čija je pKa oko 6,8 a izražen je sledećom Hen� derson�Hasselbalchovom jednačinom:
Medicinska biohemija
7�4
pH = 6,8 + tog
[ H P Q
^
3
LH2PO�4] Ekstracelularna koncentracija fosfata je samo oko 2 mmol/L, tako da fosfat i pored odgovarajuće pKa ima mali puferski kapacitet. Međutim, fosfat je važan pufer u urinu jer mu se koncentracija povećava prolaskom kroz tubule (u distalnim tubulima je oko 20 mmol/L), a kao i hemoglobin u eritrocitima deluje zajedno sa bikarbonatnim puferom.
Regulacija acido�bazne ravnoteže respiratornim sistemom Respiratorni sistem ima ulogu da održava stalan pH tako što zadržava ili eliminiše C0 2 , zavisno od potreba organizma. Ovaj proces se odvija u sadejstvu sa bikarbonatnim puferom. Respiracija je kontrolisana respiratornim centrom u hipotalamusu koji reaguje na promene u pH i održava pC0 2 na oko 5,3 kPa (40 mmHg), što odgovara oko 1,2 mmol C0 2 . Respiratorni sistem reaguje odmah na pramenu pH krvi, ali se maksimalni efekat postiže tek kada su stimulisani i periferni i centralni hemo� receptori, za šta je potrebno 3�6 sati. Mehanizam izmene 0 2 i C 0 2 u tkivima i plućima Kiseonik se transportuje do tkiva u dva oblika: reverzibilno vezan za hemoglobin u ertitrocitima (Hb0 2 ) i u obliku rastvorenog gasa (d0 2 ) u tečnosti eritrocita i plazme. Hemoglobin u eritrocitima nije samo prenosilac kiseonika, već predstavlja dinamički puferski sistem koji sarađuje sa bikarbonatnim puferom eritrocita i plazme u toku otpuštanja i preuzimanja kiseonika. Ugljendioksid difunduje slobodno iz plućnih kapilara u alveolarni vazduh. Normalne alveole imaju vrlo veliki kapacitet da eliminišu ugljendioksid, zahvaljujući tome što se alveolarni prostor stalno prazni čime se održava koncentracioni gradijent između krvi i alveola. Brzina eliminacije ugljendioksida zavisi od brzine i dubine disanja. Ćelije tkiva u svom metabolizmu koriste kiseonik a stvaraju ugljendioksid i kisele organske meta� bolite biohemijskih supstrata. Ugljendioksid difunduje u krv zahvaljujući razlici u parcijalnim pritiscima između tkiva, intersticijalne tečnosti i krvi. U krvi se ugljendioksid transportuje u nekoliko oblika: � najviše i fiziološki najvažnije u obliku bikarbonatnog jona (HCO3") u plazmi i eritrocitima � kao karbaminohemoglobin u eritrocitima i malim delom kao karbaminoproteini u plazmi i � kao rastvoreni gas (dC0 2 ) u tečnosti eritrocita i plazme. Ovi oblici nisu samo transportni, već predstavljaju dinamički sistem koji puferuje promene pH u ekstracelularnoj tečnosti i učestvuje u otpuštanju kiseonika i uklanjanju ugljendioksida u tkivnim ćeli jama, odnosno uzimanju kiseonika i eliminaciji ugljendioksida na membrani alveola. Uloga eritrocita i hemoglobina u respiratornoj regulaciji ABR Eritrociti imaju veliki značaj u održavanju konstantnog odnosa [C0 2 ] i [HC0 3~], a time i konstantnog pH arterijske i venske krvi. Eritrociti stvaraju vrlo malo C0 2 jer u njima ne može da se odvija ae� robni metabolizam. Kada C0 2 difunduje iz tkivnih ćelija u ekstracelulamu tečnost, smanjuje se odnos [HCO3"] i [C0 2 ], a time i pH ekstracelularne tečnosti. Povećavanjem pC0 2 u venskoj krvi stvara se koncentracioni gradijent između plazme i eritrocita, tako da C0 2 difunduje u eritrocite gde reaguje sa voddm uz katalitičko delovanje karboanhidraze (CA). Hemoglobin (uglavnom u deoksi�obliku posle otpuštanja kiseonika) puferuje H+ nastao u ovoj reakciji i stimuliše dalje oslobađanje kiseonika. Po većanje [C0 2 ] u ćelijama i eliminacija H + pomoću hemoglobina pomera reakciju na desnu stranu i povećava se [HC0 3"] u eritrocitima. Zbog toga dolazi do difuzije [HCO3"] iz eritrocita u plazmu a to dovodi do povećanja odnosno do normalizovanja odnosa [HC03"] i [C0 2 ], a time i pH plazme. Da bi se održala elektroneutralnost, negativno naelektrisani HC0 3 � zamenjuje se hloridnim jonom koji difunduje iz plazme u eritrocite; ovaj proces se naziva hloridni "shift" (slika 7�1).
7�5
S. Spasić: Acido�bazna regulacija
Ovaj proces se u suprotnom smeru odvija u plućima. Iz deoksihemoglobina oslobađa se H + je r je oksihemoglobin jača kiselina, a postoji tendencija stvaranja ovog oblika hemoglobina pošto kiseonik difunduje iz alveolarnog prostora u kapilare (zbog razlike u parcijalnim pritiscima). Oslobođeni H + se vezuje sa HC0 3" i nastaje ugljena kiselina koja se razlaže na C0 2 i H 2 0. Ugljendioksid difunduje u ekstracelularnu tečnost a zatim u alveolarni prostor zbog razlike u parcijalnim pritiscima i eliminiše se iz organizma. tkivo
plazma
eritrociti
CO* (rastvoren)
NHCOO" C02
T
X
COs
CA
HCQ»� Cl—
H*
HbOj
X
»*Cr
02
I
Slika 7�1. Shematski prikaz transporta C0 2 iz tkiva u krv
Difuzija C0 2 u alveolarni prostor stimuliše reakciju između vodoničnog jona i bikarbonata, a gubitak vodoničnog jona stimuliše oksigenaciju hemoglobina. Utrošeni bikarbonatni jon nadoknađuje se bikarbonatnim jonom iz plazme koji difunduje u eritrocite, a zbog nastalog elektrohemijskog gradijenta hloridni jon difunduje iz eritrocita u plazmu (slika 7�2). alveole
plazma
eritrociti
CO» (rastvoren)
coj
«* * _ • "
_ COj%— R�NHCOO
CO,
HCCV —
X" •#• HCO3* Cl*
H*
X
Hb O j
K*Hb + O*
o*
\
Slika 7�2. Shematski prikaz transporta C 0 2 iz krvi u pluća
7�6
Medicinska biohemija
Renalna regulacija acido�bazne ravnoteže Prosečna vrednost pH glomerularnog filtrata je oko 7,4 (kao i plazme), a urina oko 6,0, sa normalnim rasponom od 4,8 � 7,8. Ovo smanjenje pH urina u odnosu na plazmu je posledica izlučivanja kiselina koje se stvaraju u metaboličkim procesima. Bubrezi imaju sposobnost da u acidozi izlučuju višak kiseline i istovremeno čuvaju bazu, odnosno u alkalozi izlučuju višak baze i čuvaju kiseline, tako da pH urina može da se kreće od 4,5 do 8,2. Ova sposobnost bubrega da izlučuju različite količine kiselina ili baza je od esencijalnog značaja za održavanje ne samo stalnog pH nego i stalne koncentracije katjona i anjona. Renalno izlučivanje kiselina i čuvanje baza ostvaruje se sledećim procesima: 1. reapsorpcijom filtriranog bikarbonata, 2. sintezom i izlučivanjem NH 4 + jo na , koji obezbeđuje regeneraciju bikarbonata i 3. sekrecijom i puferovanjem H + jona. Reapsorpcija bikarbonata Bikarbonat iz ekstracelulame tečnosti može da se izgubi iz organizma na jedan od sledećih načina: 1. Bikarbonat filtriran u glomerulima (normalna koncentracija u plazmi oko 24 mmol/L) ne mora sav da se reapsorbuje; ako je koncentracija u plazmi veća od ove vrednosti reapsorpcija bikarbonata neće biti potpuna i obrnuto, ako je koncentracija bikarbonata manja, onda će se reapsorbovati sav filtrirani bikarbonat; 2. Bikarbonat u ekstracelulamoj tečnosti može da se utroši za puferovanje vodoničnog jona koji se stvara u metaboličkim procesima; 3. Bikarbonat koji se sekretira u intestinumu ne mora da se potpuno reapsorbuje.
ćelij© proksNualnih tubula
lumen
krv
>
HC0 3 *H *
^
HCOg"
M 7" H^CT*� 7 ^ CO
Na*
|CAH(3) COg+H^O
,x v NH4*�*~ giutajmin
m
x
i
_^ CI*
ATP
Slika 7�3. Reapsorpcija bikarbonata u proksimalnim tubulima Glavna funkcija proksimalnih tubula u održavanju acido�bazne ravnoteže je reapsorpcija bikarbonata. Luminalna ćelijska membrana je relativno nepropustljiva za jone, pa HC0 3 " ne može direktno da se reapsorbuje, ali u tubularnim ćelijama može da se obrazuje ekvivalentna količina bikarbonata onoj koja se profiltrira i da se vrati u ekstracelularnu tečnost kroz bazolateralnu membranu koja je propustljiva za jone. Ključni enzim u ovom procesu je Na +�K+�ATP�aza na bazolateralnoj membrani, koja obezbeđuje nisku intracelularnu koncentraciju Na + i negativnu razliku u potencijalu na luminalnoj membrani (slika 7�3, reakcija 1). Zahvaljući ovome povećava se efikasnost Na +/H+�antiportera na lu�
S. Spasić: Acido�bazna regulacija
7�7
minalnoj membrani koji omogućava reapsorpciju Na + u zamenu za sekreciju H + u lumen tubula (reakcija 2). Karboanhidraza izoenzim IV, koja je prisutna u četkastoj prevlaci katalizuje oslobađanje C0 2 iz filtriranog HC03~ (reakcija 3). Oslobođeni C0 2 difunduje u ćeliju, reaguje sa vodom što katalizuje karboanhidraza izoenzim II, a HC0 3~ koji nastaje u toj reakciji prelazi u intersticijalnu tečnost, a zatim u sistemsku cirkulaciju u zamenu za Cl" (reakcija 4); vodonični jon se sekretira u tubulamu tečnost. Povećanje parcijalnog pritiska C0 2 u tubularnoj tečnosti stimuliše difuziju C0 2 u ćelije, a povećanje koncentracije C0 2 u ćelije dalje podstiče reakciju koju katalizuje karboanhidraza II. Sekreciju H + stimuliše i H+�ATP�aza (reakcija 5), ali je njen značaj mnogo veći u distalnim tubuli� ma i sabirnim cevčicama. Jedan mmol filtriranog HC0 3" reaguje sa jednim mmol H +, a u isto vreme jedan mmol H + zame� njuje se sa jednim mmol Na + iz tubulame tečnosti koji se vraća u ekstracelulamu tečnost, a sa njim i jedan mmol HC03~; dakle, u tubulamim ćelijama se stvara bikarbonat u istoj količini koja je profiltrira� na u glomerulima. Reakcija u kojoj se stvara bikarbonat odvija se i u eritrocitima, ali između njih i tubularnih ćelija postoji ključna razlika. Naime, vodonični jon koji na ovaj način nastaje u eritrocitima zadržava se u organizmu, a vodonični jon nastao u tubulocitima sekretira se u tubulamu tečnost i izlučuje urinom. Sve dotle dok proces sekrecije vodonika neometano ide, bikarbonat će se kontinuirano stvarati u tubulocitima i reakcija ne ide u reverzibilnom smeru. Proces "reapsorpcije" bikarbonata ne dovodi do promene koncentracije ni bikarbonata ni vodonika u organizmu, jer se ciklično odvija. Nadoknađivanje bikarbonata u ekstracelularnoj tečnosti koji je utrošen za pufersko delovanje obavlja se postoje sav filtrirani bikarbonat "reapsorbovan". Kada tubu� larna tečnost dođe u distalni deo u njoj nema više bikarbonata, ali se povećava koncentracija fosfata jer se reapsorbuje voda, uz dodatnu sekreciju fosfata iz distalnih tubulocita. Kako se smanjuje koncentracija bikarbonata, povećava se kapacitet fosfatnog pufera ne samo zbog veće koncentracije fosfata, nego i zbog smanjenog pH. Sekretirani H + sada reaguje sa monohidrogen fosfatom, a mehanizam koji katalizuje karboanhidraza nastavlja da deluje i da vraća bikarbonat u plazmu. Neto efekat ovog procesa je da se za svaki mmol H+ koji reaguje sa fosfatom u plazmu vrati mmol HC0 3". Brzinu stvaranja HC0 3 " u tubulocitima mogu da ubrzaju ili da uspore neki faktori. Stimulativno de� luju sledeći faktori: 1. Povećanje parcijalnog pritiska C0 2 u ekstracelularnoj tečnosti ili luminalnoj tubularnoj tečnosti. C0 2 iz tubulocita može da difunduje u ekstracelulamu tečnost kao i u tubulamu tečnost, zbog čega se povećava koncentracija C0 2 u ovim tečnostima, a to smanjuje koncentracioni gradijent. Smanjeni koncentracioni gradijent usporava difuziju C0 2 , što dovodi do povećanja intracelulamog [C0 2 ] koji je jedan od reaktanata u gore navedenoj reakciji. 2. Smanjenje koncentracije ekstracelularnog HC0 3". Bikarbonat ne može da difunduje kroz lumi� nalnu tubulamu membranu u tubulamu tečnost, ali može da difunduje u ekstracelulamu tečnost u pravcu koncentracionog gradijenta. Smanjenje koncentracije bikarbonata u ekstracelularnoj tečnosti povećava koncentracioni gradijent, pa bikarbonat difunduje iz ćelije, zbog čega se smanjuje njegova kocentracija u tubulocitima, a to stimulativno deluje na reakciju koju katalizuje karboanhidraza. 3. Povećana brzina sekrecija H + u tubularni lumen smanjuje koncentraciju H + u ćelijama, što ta� kođe deluje stimulativno na reakciju koju katalizuje karboanhidraza. Brzinu stvaranja bikarbonata usporavaju: 1. Smanjenje parcijalnog pritiska C0 2 u ekstracelularnoj tečnosti, 2. Povećanje ekstracelularnog [HC0 3"] i 3. Smanjenje brzine sekrecije H + u tubularni lumen. Stvaranje amonijaka i izlučivanje amonijum jona
Kada tkiva stvaraju velike količine vodoničnog jona, mehanizam koji katalizuje karboanhidraza nije dovoljan da zameni sav bikarbonat koji se izgubi u puferskim procesima. U ovom slučaju reaguje
7�8
Medicinska biohemija
pufer koji čine amonijak i amonijum jon, a on deluje u saradnji sa sistemom karboanhidraze, da bi se nadoknadio bikarbonat u plazmi. glutaminaza glutamin glutamat"+ N H 4 glutamat
glutamat �dehidrogenaza
2�ketoglutaraf"2� + NH 4
Amonijum jon se obrazuje u tubulamim ćelijama iz dve amino grupa glutamina, tokom dve reakci je dezaminacije koje katalizuju glutaminaza i glutamat�dehidrogenaza. Neto efekat je stvaranje dva mola amonijum jona i jednog mola 2�ketoglutarata iz mola glutamina. Stvaranje NH 4 + ima centralnu ulogu u acido�baznoj regulaciji, a povećava se u metaboličkoj acidozi i hipokalemiji. Nasuprot tome, nedovoljna sinteza amonijum jona javlja se u hiperkalemiji, ili kada je smanjena renalna masa, što kao posledicu ima smanjeno izlučivanje kiselina. Sintetisani NH 4 + transportuje se u lumen tubula u zamenu za Na + uz pomoć Na+/H+�antiportera (slika 7�3, reakcija 2a). Oko 70% sekretiranog NH 4 + reapsorbuje se u debelom uzlaznom delu Henleove petlje; proces ide aktivnim transportom uz pomoć Na +/K+/2CI"�simportera u kome je K + zamenjen sa NH 4 + (slika 7� 4). Razlika u koncentraciji NH 4 + koja se pojavljuje duž uzlaznog dela Henleove petlje stimuliše sekre� ciju NH 4 + u sabirnim cevčicama. Ova sekrecija ide tako što NH 4 + disosuje na NH 3 i H+, NH 3 difunduje kroz membranu (H + se sekretira) i u lumenu tubula se vezuje za H +. Apsorpciju NH 4 + u uzlaznom delu Henleove petlje reguliše nivo kalijuma u tubulamoj tečnosti, jer se i K + i NH 4 + reapsorbuju uz pomoć istog transportera. Ukoliko je nivo kalijuma u tubulamoj tečnosti visok, reapsorpcija NH 4 + će biti manja i obrnuto. Reapsorpcija NH 4 + se povećava u acidozi. distalni tubuf
tanki silazni deo
Henieova petlja
sabirna cevčica
Slika 7�4. Transport NH 4 + i N H 3 u tubulima
Sekrecija H +
Jake kiseline kao što su sumporna, hlorovodonična i fosforna potpuno su jonizovane pri pH urina i izlučuju se posle reakcije sa sekundarnim fosfatom ili sa amonijakom. Reakcijom vodoničnog jona sa sekundarnim fosfatom nastaje primarni fosfat, a ove dve soli čine pufer koji se protivi promeni pH. Izlučivanje anjona jakih kiselina praćeno je izlučivanjem jednakog broja katjona, kao što su Na +, K+ ili NH 4 +, da bi se održala elektrohemijska ravnoteža. Neke kiseline, kao što su acetosirćetna i beta� hidroksibuterna kiselina prisutne su u serumu u skoro potpuno jonizovanom obliku, ali su pri pH urina velikim delom nedisosovane, što ne utiče mnogo na promenu pH urina. Reakcija vodoničnog jona sa sekundarnim fosfatom zavisi od količine fosfata koja se profiltrira u glomerulima i od pH urina. Pod normalnim uslovima dnevno se izluči približno 30 mmol/L H + u obliku
7�9
S. Spasić: Acido�bazna regulacija
primarnog fosfata. Kod unošenja većih količina proteina hranom povećava se stvaranje fosfata, a time i njihova filtracija, odnosno koncentracija u urinu. Ekskrecija fosfata urinom povećava se u acido� zi, čime se obezbeđuje veća količina fosfatnog pufera za reakciju sa vodoničnim jonom. ćeli|e distalnih tubula
lumen
j
krv
Slika 7�5. Sekrecija H+ u glavnim ćelijama distalnih tubula i sabirnih cevčica
lumen j
ć«1Qe distafnih tubula
krv
M20+C02 | CA li (3)
> •
H*
^
3
HCO3�
Slika 7�6. Sekrecija H + u a�interkaliranim ćelijama distalnih tubula i sabirnih cevčica U proksimalnim tubulima sekretira se vodonični jon nastao u reakciji koju katalizuje karboanhid� raza II. Ova sekrecija ide u zamenu za Na +, a uz pomoć Na +/H+�antiportera. Sekrecija vodonika je aktivan proces i može da se odvija nasuprot koncentracionom gradijentu. Osim toga, luminalni ćelijski zid je nepropustljiv za H +, tako da gradijent može da se održava. Sekretirani vodonični jon reaguje sa sekundarnim fosfatom ili sa amonijakom, na isti način kao u glomerulima profiltriran vodonični jon koji potiče od jakih kiselina. Reakcija vodoničnog jona sa fosfatnim jonom kao posledicu ima neznatno smanjenje pH urina, čime se stvara prostor za dalju sekreciju H + i reapsorpciju novih količina Na +, što
7�10
Medicinska biohemija.
je vrlo važno jer postoji ograničenje u smanjenju pH urina. U proksimalnim tubulima pH može da se promeni za samo 1 pH jedinicu, a u distalnim još za 2 pH jedinice. Reapsorpcija preostalog filtriranog bikarbonata (oko 20%) i sekrecija H+ koji nastaje u ovom procesu odvija se u distalnim tubulima i sabirnim cevčicama. U distalnim tubulima i sabirnim cevčicama razlikujemo dve vrste ćelija: glavne i interkalirane ćelije, koje se dalje dele na a i (3. Glavne ćelije su primarno odgovorne za reapsorpciju Na+ i vode i sekreciju K+, a ovi procesi su regulisani hormonski. Niska koncentracija intracelularnog Na + održava se uz pomoć Na+�K+�ATP�aza pumpe i Na+/H+� antiportera na bazolateralnoj membrani (slika 7�5, reakcije 1 i 2). Ovi procesi stvaraju razliku u potencijalu unutar ćelije (od �5 do 30 mV) koja favorizuje sekreciju H+ uz pomoć H+�K+�ATP�aze (reakci ja 6). U a�interkaliranim ćelijama odigrava se sekrecija H + koja je regulisana H+�ATP�azom (slika 7�6, reakcija 5) i H+�K+�ATP�azom (reakcija 6) na luminalnoj membrani. Važna karakteristika ovih ćelija je mogućnost ekspresije H+�ATP�aze, odnosno povećanja broja ovih pumpi u slučajevima teške sistemske acidoze. Kalijumov jon kompetira sa sekrecijom vodoničnog jona, tako da svako povećanje koncentracije + K u ekstracelulamoj tečnosti povećava sekreciju kalijuma u tubulima uz istovremeno smanjenje se� krecije H+ i vraćanja natrijuma, što dovodi do smanjenja kiselosti urina i povećavanja kiselosti plazme, odnosno do acidoze. Suprotno ovome, kod smanjene koncentracije kalijuma u plazmi povećava se sekrecija H + jona u tubulima, a posledica je smanjenje kiselosti plazme, odnosno alkaloza.
POREMEĆAJI ACIDO�BAZNE RAVNOTEŽE Pošto pH krvi zavisi od odnosa koncentracija HC0 3 " i C0 2 , Henderson�Hasselbalch�ova jednači� na može da se napiše u jednostavnijem obliku:
Bubrezi su odgovorni za održavanje koncentracije HC0 3~ i promene u njihovoj koncentraciji kompenzuju relativno sporo (od nekoliko sati do nekoliko dana), za razliku od pluća koja održavaju stalan parcijalni pritisak C0 2 , ali na promene u pritisku ovog gasa reaguju relativno brzo (od nekoliko minuta do nekoliko sati). Koncentracija HC0 3" se posmatra kao metabolička, a koncentracija C0 2 kao respiratorna komponenta u održavanju stalnog pH, a kada se poremeti kontrola jedne od ove dve komponente dolazi do promene u acido�baznom statusu. Kada se govori samo o promeni pH krvi, postoje stanja koja se označavaju kao acidemija (pH manji od 7,36) i alkalemija (pH veći od 7,44), Nasuprot njima, termini acidoza i alkaloza podrazume� vaju fiziološke procese koji se dešavaju kod pacijenata; dijagnoza acidoze i alkaloze ne može da se postavi samo na osnovu pH krvi, već su (pored istorije bolesti) potrebne i vrednosti elektrolita u serumu, kao i drugi laboratorijski podaci. U odnosu na uzrok koji je doveo do poremećaja acido�bazne ravnoteže i acidoze i alkaloze se dele na metaboličke i respiratorne. Metabolička i respiratorna acidoza se posmatraju kao poremećaji nastali zbog nedostatka baze (HC03"), a metabolička i respiratorna alkaloza kao poremećaji nastali zbog viška baze.
Poremećaji nastali zbog nedostatka baze 1 . Metabolička acidoza (primarni nedostatak bikarbonata)
Metaboličku acidozu izazivaju sledeći procesi: 1. Povećano stvaranje ili smanjeno izlučivanje metaboličkih kiselina, što dovodi do trošenja bikarbonata za neutralizaciju ovih kiselina, uz istovremeno nedovoljan kapacitet tubula da regenerišu bikarbonat.
i
o
S. Spasić: Acido�bazna regulacija
7�11
2. Masivan ekstrarenalni gubitak bikarbonata i to brzinom koja prevazilazi kapacitet tubula za regeneraciju bikarbonata. 3. Poremećen tubularni mehanizam za regeneraciju bikarbonata. a. Povećan utrošak bikarbonata za pufersko delovanje Stvaranje intermedijarnih anjonskih metabolita praćeno je stvaranjem ekvivalentne količine H +, što se normalno eliminiše daljim metaboličkim putevima, a višak vodoničnog jona se puferuje bikar� bonatom. Ako je stvaranje vodoničnog jona suviše brzo i u velikoj količini, premašuje se kapacitet tubula za sekreciju vodonika i regeneraciju bikarbonata, što kao posledicu ima smanjenje koncentracije bikarbonata u plazmi. Bikarbonat se nadoknađuje drugim neorganskim (hlorid, sulfat, fosfat) ili organskim anjonima. pH se delimično kompenzuje eliminacijom C0 2 , ali ekstracelularni puferski kapacitet i dalje ostaje smanjen. Najčešći uzroci koji dovode do prekomemog stvaranja vodoničnog jona su dijabetična ketoacido� za i hipoksična laktatna acidoza kod odraslih i urođene greške metabolizma ugljenih hidrata, masnih kiselina ili aminokiselina kod dece. Ketoacidoza je posledica prekomemog stvaranja acetosirćetne i beta�hidroksibuterne kiseline iz viška acetil�CoA. Ovaj tip acidoze se sreće kod dijabeta ili kod gladovanja zbog nedostatka glukoze u ćelijama, pa acetil grupa iz acetil�CoA ne može da se oksidiše u ciklusu limunske kiseline. Laktatna acidoza može da nastane iz sledećih razloga: 1. Kod prekomemog stvaranja piruvata u anaerobnom metabolizmu, što se dešava kod teškog mišićnog napora kada se glikogen brzo razlaže i glukoza brzo metaboliše u procesu glikolize. U ovom slučaju je brzina stvaranja piruvata veća od mogućnosti da se on metaboliše u procesima koji zahtevaju kiseonik, tako da se piruvat prevodi u laktat. Laktat se kasnije prevodi u piruvat i dalje metaboliše. 2. Kod nedovoljnog iskorišćavanja piruvata što se sreće kada je poremećen ciklus limunske kiseline (kao posledica delovanja nekih lekova, na pr. salicilata ili u stanju šoka). 3. Kod povećanog prevođenja piruvata u laktat, na pr. kod alkoholičara. b. Ekstrarenalni gubitak bikarbonata Pankreasni i duodenalni sok sadrže veliku količinu bikarbonata i normalan gubitak bikarbonata iz intestinalnog trakta nadoknađuje se regeneracijom ovog anjona u tubulima ili ćelijama crevne muko� ze. Kod teških dijareja gube se velike količine bikarbonata (zajedno sa vodom), a zbog smanjene za� premine ekstracelulame tečnosti smanjuje se glomerularna filtracija, pa tubularni mehanizam ne može punim kapacitetom da regeneriše bikarbonat. S druge strane, ako se izgubljen natrijum nadoknađuje tečnošću sa niskim sadržajem natrijuma, i dalje se smanjuje količina filtriranog natrijuma. c. Renalna tubuiarna acidoza (RTA) Renalne tubularne acidoze su poremećaji koji su posledica nesposobnosti renalnih tubula ili da sekretiraju H+ ili da zadržavaju HC03". Renalne tubularne acidoze se klasifikuju kao distalne (RTA tip I), proksimalne (RTA tip II) i sekundarne koje su posledica nedostatka aldosterona ili rezistencije na aldosteron (RTA tip IV). Primarni poremećaj kod distalne RTA (tip I) je nesposobnost distalnih tubula da sekretiraju H +, a prema uzroku koji je doveo do ovog poremećaja dele se u četiri podgrupe: � Defekt ili potpuni nedostatak H +�ATP�aze koja omogućava sekreciju H+ , zbog čega je pH urina uvek veći od 5,5. Pored toga, smanjeno je izlučivanje NH 4 + je r nema dovoljno H+ koji bi se u sabirnim cevčicama vezao sa NH 3. � Nedovoljan električni gradijent: sekrecija H + u distalnim tubulima je praćena reapsorpcijom Na +, zbog čega je u lumenu negativno naelektrisanje. Svi oni faktori koji smanjuju gradijent natrijuma, smanjuju i sekreciju vodonika, a to su teške dehidraciji ili lekovi kao što su amilorid i triamteren. Poš�
7�12
Medicinska biohemija
to ovi faktori utiču i na sekreciju K+, kod ovog tipa RTA prisutna je i hiperkalemija. pH urina kod paci jenata sa ovim poremećajima je uglavnom veći od 5,5. � Poremećaj u propustljivosti tubularne membrane: ako se sekretirani H + vraća u tubularne ćelije, onda se ne održava gradijent koji je neophodan za kontinuiranu sekreciju H+ . Ovaj poremećaj se javlja kod osoba koje uzimaju amfotericin, jer on stvara kanale za vodu u lipidnoj membrani, kroz koje može da se vraća H + . � Nedovoljna količina NH 3 koja je posledica nedovoljne sinteze ili poremećene reapsorpcije i transporta NH 4 + odnosno NH 3. Zbog ovog poremećaja premašuje se kapacitet drugih pufera, u prvom redu fosfatnog, pa je smanjeno puferovanje sekretiranog H+ i pH urina je kiseo. Kod proksimalne RTA (tip II) primarni poremećaj je nesposobnost tubula da reapsorbuju HC0 3", uz prateću smanjeno izlučivanje amonijaka, a posledica je disfunkcije Na +/H+�antiportera ili Na+�K+� ATP�aze. Ovaj tip acidoze se često javlja kod Fanconi sindroma, kod koga u proksimalnim tubulima nema reapsorpcije glukoze, kalcijuma, fosfata i drugih elektrolita, kao i organskih kiselina. Za ove acidoze je karakteristično da je da je granična vrednost za reapsorpciju bikarbonata 15 mmol/L, umesto 24 mmol/L koliko je kod zdravih osoba. Kada je nivo HC0 3" manji od 15 mmol/L, reapsorpcija HC0 3" je potpuna i pH urina je manji od 5,5, a ako je nivo HC0 3 " veći od 15 mmol/L, HCO3" se gube i pH urina je veći od 5,5. Renalna tubularna acidoza tip IV je specijalan oblik distalne RTA i karakteriše je poremećaj u sekreciji H+ i K+, što je posledica nedostatka aldosterona, rezistencije na aldosteron ili prisustva antagonista aldosterona, kakav je spironolakton. Molekularna osnova je verovatno nedostatak direktne stimulacije H+�ATP�aze. Zbog izostajanja efekta aldosterona kod ovog tipa RTA povećana je aktivnost renina, a prisutna je hiponatremija, hiperkalemija i dehidracija. Anjonski "gap" (praznina) Najvažniji joni koji određuju elektrolitni profil plazme su Na +, K+, Cl' i HC0 3", a razlika između sume katjona i sume anjona naziva se anjonski "gap" (praznina) (AG). AG (mEq/L) = (Na + + K+) � (Ci" + HCO3") Pozitivno naelektrisanje mora biti uvek izbalansirano prisustvom negativnog naelektrisanja, a pored gore navedenih katjona i anjona koji se smatraju merljivim, u plazmi postoje i nemerljivi. Njihove prosečne koncentracije su sledeće: glavni katjoni(mEq/L) +
Na K+ *Ca' + *Mg' +
140 4 4,5 1,5
ukupno * nemerljivi joni
150
glavni anjoni (mEq/L) 100 Cl' HC0 3" 27 * proteini n" 15 2 * PO/ 1 * S0 4"" *org.kiseline n" 5 ukupno 150
U plazmi su ukupni katjoni jednaki ukupnim anjonima: Na + + K+ + N k a t j = OT + H C0 3 ' + N an j " gde su N kat j � nemerljivi katjoni, a Nan j � nemerljivi anjoni. Dakle, anjonski "gap" je jednak razlici između nemerljivih anjona i nemerljivih katjona. AG = (Na + + K+) � (Cl" + HC03") = N an j � N katj
S. Spasić: Acido�bazna regulacija
7�13
Kako je vrednost K + relativno konstantna, AG može da se izračuna i bez kalijuma, odnosno prema izrazu: AG = Na+ � (Cl" + HC03")
Normalna vrednost AG je 16 mmol/L kada se za izračunavanje uzima vrednost K +, odnosno 12 mmol/L ako se AG računa bez K +. Najvažnija primena anjonskog "gap"�a je u tome što se na osnovu njega metaboličke acidoze mogu podeliti u dve grupe: acidoze sa normalnim anjonskim gap�om i acidoze sa visokim anjonskim gap�om. Metaboličke acidoze sa visokim anjonskim "gap"�om Kod ovog tipa metaboličkih acidoza povećani anjonski gap je rezultat povećanja koncentracije nemerljivih anjona koji mogu biti endogenog ili egzogenog porekla. Endogeni nemerljivi anjoni su organske kiseline: aminokiseline, piruvat, laktat i ketokiseline. Višak aminokiselina u serumu se javlja kod nekih urođenih grešaka metabolizma (defekt izoleucina ili "marple syrup urine disease") i to odmah po rođenju ili posle prvog hranjenja. U acidoze sa visokim anjonskim gap�om spadaju laktatna acidoza (višak mlečne kiseline), ketoa� cidoza (višak ketoakiselina), kao i acidoze koje su posledica unošenja paraldehida, metanola, etano� la, etilen�glikola i salicilata. Kod insuficijencije bubrega može da postoji višak sulfata i fosfata, ako bubrezi nisu u stnju da izluče ove neorganske kiseline. Metaboličke acidoze sa normalnim anjonskim "gap"�om Acidoze sa normalnim anjonskim gap�om nazivaju se još i hiperhloremijskim acidozama, jer se nedostatak bikarbonata kompenzuje viškom hlorida. Ove metaboličke acidoze se javljaju kod teških dijareja (veliki gubitak bikarbonata), kod uzimanja inhibitora karboanhidraze (smanjena reapsorpcija bikarbonata u tubulima), kod renalne tubulame acidoze različitih tipova i kod primene metaboličkih ekvivalenata HCL, kao što su amonijum�hlorid, arginin�hidrohlorid, lizin�hidrohlorid itd. Kompenzatorni mehanizmi u metaboličkoj acidozi Kod metaboličke acidoze primarni poremećaj je smanjena koncentracija bikarbonata, pa je odnos [HC03~]/[C02] manji od 20:1, odnosno pH je ispod 7,4. kako se koncentracija bikarbonata smanjuje, tako pada pH.
ipH =^a PCQ, Smanjenje pH stimuliše centar za disanje koji izaziva hiperventilaciju čiji je rezultat eliminacija C0 2 . Smanjenjem koncentracije C0 2 povećava se odnos [HC0 3 "]/[C02 ], ali se ne vraća na vrednost 20:1, već se manje ili više približava ovom odnosu. ^p H =
^HCOj
IpCO,
Kao primer može da se navede ono što se dešava kod pacijenata u šoku, kod koji se zbog stvaranja mlečne kiseline smanjuje koncentracija bikarbonata skoro na pola, odnosno 12 mmol/L. U početku je u tom stanju parcijalni pritisak C0 2 normalan (40 mm Hg), odnos HC0 3 7C0 2 je 10:1, pa je pH jednak: pH= pK + log — = 6,1 + log — = 6,1 + log 10 = 7,1 M y b 0,03 x 40 1,2 Kada se uključe pluća kao kompenzatorni mehanizam, parcijalni pritisak C0 2 se smanjuje (30 mm Hg), što kao posledicu ima povećanje odnosa HC0 3 7C0 2 na 13,3:1 i zbog toga povećanje pH:
7�14
Medicinska biohemija
pH= pK+ loga — — — = 6,1 + log — = 6,1 + log 13,3 = 7,3 H 0,03 x 30 0,9 Ovaj proces se naziva kompenzacija acidoze, a samo stanje kompenzovana acidoza (zato što i dalje postoji primarni nedostatak bikarbonata, samo je manje ili više kompenzovan pH). U metaboličkoj acidozi bubrezi intenzivno sekretiraju vodonični jon (i do 500 mmol/L), povećavaji stvaranje amonijaka i reapsorpciju bikarbonata i u stanju su da potpuno kompenzuju pH. 2. Respiratorna acidoza (relativni nedostatak baze)
Poremećaji u kojima je smanjena eliminacija ugljendioksida dovode do povećanja parcijalnog pritiska C0 2 , zbog čega se odnos [HC0 3"]/[C0 2 ] smanjuje. U ovom slučaju postoji primarni višak C0 2 a relativni nedostatak HC0 3". Razlozi za nastajanje ovih poremećaja mogu biti sledeći: a. Direktna depresija centra za disanje: � delovanje lekova kao što su narkotici i barbiturati, � traume CNS, tumori i degenerativne promene, � infekcije CNS (encefalitis i meningitis), � komatozna stanja (na pr. kod intrakranijalnih krvavljenja), � primarna centrala hipoventilacija. b. Uticaji na respiratorni sistem: � hronične opstruktivne bolesti pluća, � fibroza pluća, � teški oblici statusa asthmaticusa, � bolesti gornjih disajnih puteva (laringospazam, tumori), � poremećen motilitet pluća (pneumotoraks), � deformiteti grudnog koša (skolioza), � neurološki poremećaji vezani za mišiće koji učestvuju u respiraciji. Kompenzatorni mehanizmi u respiratornoj acidozi
Primarni poremećaj u respiratornoj acidozi može da se izrazi jednačinom:
lpH =
tpCQ>
Višak C0 2 u plazmi puferuje se hemoglobinom i proteinima. Smanjen pH stimuliše centar za disanje (ako poremećaj nije na nivou centra za disanje), ali ubrzana respiracija nema velikog efekta obzirom da je poremećaj koji je izazvao acidozu na ovom nivou. Bubrezi reaguju na isti način kao u metaboličkoj acidozi, odnosno sekretiraju vodonični jon i reapsorbuje bikarbonat. Kompenzacija se postiže tako što se zadržavanjem bikarbonata povećava odnos [HC0 3"]/[C02 ] i približava vrednosti 20 :1, odnosno pH se približava normalnom. Kompenzatorni efekat bubrega u respiratornoj acidozi može da se prikaže jednačinom: ^
TpCQ> Bubrezi svoj kompenzatorni efekat pokazuju tek posle 6�12 sati, a potpunu kompenzaciju pH postižu za 2�3 dana.
S. Spasić: Acido�bazna regulacija
7�15
Poremećaji Poremećaji zbog viška baze baze 1. Meta bolička alkaloza (primarni višak baze) Metaboličku alkalozu izazivaju sledeći faktori: 1. Terapijska primena baznih soli u višku (natrijum citrat u krvi za transfuziju ili antacidna sredstva). 2. Intenzivan gubitak hlorovodonične kiseline iz želuca (dugotrajna povraćanja, pilorična ili intes� tinalna opstrukcija). 3. Snižene vrednosti kalijuma (hiperaldosteronizam, primena adrenokortikalnih hormona ili ACTH, ACT H, smanjeno smanj eno unošenje unoše nje kalijuma). kalijum a). Snižene vrednosti vredn osti kalijuma kalijum a stimulišu stimul išu sekreciju sekre ciju H + i reapsorpciju Na +, a takođe i sintezu amonijaka, da bi se vodonični jon izlučivao kao NH 4 + . Povećana sekrecija vodonika stimuliše reapsorpciju bikarbonata, tako da sve to uslovljava alkalozu. S druge strane, hipoka� lemija uslovljava smanjeno lučenje aldosterona, čime se smanjuje njegov stimulatorni efekat na sekreciju H +. 4. Dugotrajna primena diuretika koji deluju na proksimalne tubule (inhibitori karboanhidraze) i na uzlazni deo Henleove petlje. Svi ovi lekovi blokiraju reapsorpciju natrijuma što izaziva pojačanu sekreciju aldosterona, a posledica je pojačana sekrecija i gubitak kalijuma. 5. Kod dugotrajne primene laksativa. Kompenzatomi mehanizmi kod metaboličke alkaloze Pošto je kod metaboličke alkaloze primarno povećan bikarbonat, odnos [HC0 3"]/[C02] je veći od 20:1, a može da se prikaže jednačinom:
PCQ> Povećan pH izaziva depresiju centra za disanje i time zadržavanje ugljendioksida, ali i hipoksiju. Povećanjem koncentracije C0 2 smanjuje se odnos [HC0 3"]/[C02], odnosno pH plazme. t pH =
THCO£
t pCO,
Međutim, ovaj kompenzatomi efekat nije potpun jer depresija disanja ne može da ostvari u velikoj meri. Glavni kompenzatomi efekat postižu bubrezi inhbicijom sekrecije vodonika, sinteze amonijaka i reapsorpci reapsorpcije je bikarbonata. 2. Respiratorna alkaloza (relativni višak bikarbonata) Povećana brzina i dubina disanja mogu da izazovu smanjenje parcijalnog pritiska C0 2 , odnosno njegove koncentracije u plazmi. Rezultat je povećan odnos [HC0 3"]/[C0 2] i pH plazme. Kao i kod kod respiratorne acidoze i ovde razlozi za povećanu eliminaciju ugljendioksida mogu biti dvojaki: a. Stimulacija centra za disanje � uzbuđenost, histerija, � febrilna stanja, i � infekcije CNS, � hipoksija (na pr. kod teške anemije), �trudnoća u III trimestru (verovatnozbog povećanog progesterona), � hipertiroidizam.
7�16
Medicinska biohemija
b. Uticaji na respiratorni sistem � pneumonija, � astma, � plućna embolija, � kongestivne bolesti srca. Kompenzatorni mehanizmi u respiratornoj alkalozi
Kompenzacija respiratorne alkaloze ide u dve faze. Prvo puferi u eritrocitima i plazmi daju vodo� nični jon koji vezuje višak bikarbonata, a zatim potpunije reaguju bubrezi na isti način kao kod metaboličke alkaloze (smanjuju sekreciju vodonika, sintezu amonijaka i reapsorpciju bikarbonata). Primarni poremećaj u respiratornoj alkalozi može da se izrazi jednačinom: TpH =
HCO5
IpCO,
a posle kompenzacije, jednačina dobija oblika.
tPH=VS
•Ipco,
Poglavlje Poglavlje 8. Enzimi Svi enzimi prisutni u humanom organizmu sintetišu se u ćelijama i većina od njih svoju funkciju obavlja u ćelijama u kojima su sintetisani. Neki enzimi se sekretiraju, uglavnom u neaktivnom obliku, i posle aktivacije obavljaju svoju funkciju u ekstracelulamoj tečnosti. U ove enzime spadaju proteaze i druge hidrolaze koje se sekretiraju u gastrointestinalni trakt, od kojih neke (kao što su enzimi pankreasa) mogu da se nađu i u krvi. U sekretome enzime spadaju i enzimi koagulacije i fibrinolize, koji su funkcionalno aktivni u plazmi. Međutim, od dijagnostičkog značaja su uglavnom enzimi koji funkcionišu intracelulamo i u plazmi se nalaze u vrlo niskoj aktivnosti, a merenjem promene njihove aktivnosti u plazmi može da se odredi mesto i priroda patološke promene koja do toga dovodi. Zbog toga je važno da se znaju faktori koji utiču na brzinu oslobađanja enzima iz ćelija u kojima se sintetišu, kao i brzina kojom se enzimi elimi� nišu iz cirkulacije, kako bi promena u njihovoj aktivnosti mogla korektno da se interpretira. Aktivnost enzima u krvi je rezultat ravnoteže u brzini kojom enzimi ulaze u cirkulaciju i brzine kojom se inaktivi� raju raju ili uklanjaju iz cirkulacije. cirkulacije . O
Ulazak enzima u krv Faktori koji utiču na ulazak enzima u krv mogu da se podele u dve glavne grupe: oni koji utiču na brzinu kojom se enzimi oslobađaju iz ćelija i oni koji utiču na brzinu stvaranja enzima, bilo da povećavaju sintezu enzima ili stimulišu proliferaciju ćelija koje sintetišu enzime. Oslobađanje enzima iz ćelija. ćelija. Enzimi ostaju unutar ćelije zahvaljujući ćelijskoj membrani koja je nepropustljiva za tako velike molekule, a čiji integritet zavisi od energetskih procesa unutar ćelije. Kada dođe do promena u tim procesima, narušava se integritet membrane i ona postaje propustljiva, prvo za male molekule, a kasnije i za velike, kakvi su enzimi. Pošto su enzimi prisutni u ćelijama u vrlo visokim koncentracijama, koje su nekada i desetine hiljada puta veće od koncentracija u ekstracelulamoj tečnosti, jasno je da i najmanja oštećenja ćelija mogu da dovedu velike promene u aktivnosti enzima u ekstracelulamoj tečnosti ili plazmi. Zbog toga je promena aktivnosti enzima u ovim tečnos� tima vrlo osetljiv indikator oštećenja ćelija. Brzina i intenzitet procesa kojim enzimi izlaze iz ćelija zavise od više faktora. Jedan od faktora je veliči veličina na molekula: moleku la: manji molekuli molek uli prolaze kroz membranu memb ranu brže, a veći sporije, spor ije, tako tak o da se manji molekuli pojavljuju u ekstracelulamoj tečnosti ranije nego veliki molekuli. Drugi faktor koji utiče na pojavu enzima u krvi je brzina kojom oni prelaze iz intersticijalne tečnosti u krv, što nije isto u svim tkivima. Direktan transfer enzima iz intersticijalne tečnosti u kapilare dešava
8�2
Medicinska biohemija
se u dobro prokrvljenim tkivima, kao što je jetra, čiji su kapilari vrlo propustljivi. U tkivima u kojima su kapilari relativno nepropustljivi, kao što su skeletni mišići, enzimi dospevaju u krv putem limfe. Intracelulama lokalizacija enzima takođe utiče na brzinu kojom će se oni pojaviti u krvi. Najoset� Ijiviji indikator oštećenja ćelija su enzimi koji se nalaze u citozolu jer oni dospevaju u krv i kod najmanjeg oštećenja. Enzimi koji se nalaze u subcelulamim strukturama oslobađaju se iz ćelija tek kada dođe do njihove destrukcije, tako da pojava ovih enzima u krvi ukazuje na teža oštećenja ćelija, a često i na nekrozu ćelija. Povećana produkcija enzima. enzima. U nekim situacijama može doći do indukcije sinteze enzima, zbog čega se njihova količina u ćeliji povećava, a to dovodi do povećanog prelaska ovih enzima u krv. Ova pojava može biti normalna, kao što se dešava u periodu intenzivnog rasta kada se poveća va broj i aktivnost aktivn ost osteoblasta osteo blasta koji sintetišu alkalnu fosfatazu, fosfata zu, pa se u krvi povećava aktivnost aktivno st ovog enzima. Kod nekih bolesti takođe dolazi do indukcije sinteze nekih enzima. To se dešava na primer, kod opstrukcije žučnih puteva koja stimuliše sintezu alkalne fosfataze u jetri i njeno povećanje u krvi. I neki drugi agensi, kao što su lekovi i alkohol mogu da stimulišu sintezu enzima; primer za to je povećana sinteza gama�glutamiltransferaze, čija se aktivnost povećava kod uzimanja barbiturata i fenitoi� na, kao i kod unošenja velikih količina alkohola. Proliferacija nekih ćelija može za posledicu da ima povećanu sintezu enzima. Primer za to je po većana sinteza sintez a kisele fosfataze fosfataz e u prostati u svim slučajevima slučajevi ma kancera. kancer a. Smetnje u sekreciji enzima. enzima. Aktivnost enzima u krvi može da se poveća i zbog smetnji u oticanju sekreta. Sekreti gastrointestinalnog trakta sadrže veliki broj enzima i nešto od tih enzima normalno dospeva u krv. Međutim, kada dođe do smetnji u odvodnim vodovima kojima se sekreti izlivaju, veće količine enzima enzim a prelaze u krv.
Eliminacija enzima iz krvi Pošto dospeju u krv enzimi se iz nje eliminišu na dva načina: izlučivanjem putem urina ili degradacijom. Putem urina se eliminiše samo nekoliko enzima koji imaju malu molekulsku masu i mogu da prođu kroz membranu glomerula, kao što su amilaza (45000), lizozim (18000) ili pepsin (39000). Enzimi velike molekulske mase prolaze kroz membranu glomerula samo kada ona u nekim patološkim stanjima postane propustljiva za veće molekule i tada se u urinu pored enzima nalaze i drugi proteini. U tim slučajevima u urinu može da se nađe čak i ceruloplazmin čija je molekulska masa 132000. Glavni put eliminacije enzima iz krvi je degradacija u retikuloendotelnom sistemu i u manjoj meri, u drugim ćelijama organizma. Mehanizam ovog procesa je endocitoza uz učestvovanje receptora; proces počinje prepoznavanjem molekula, zatim sledi preuzimanje proteina uz pomoć specifičnih receptora na površini ćelije, fuzija sa lizozomom, razgradnja proteina i recikliranje receptora nazad na površinu ćelije. Polu�život enzima u plazmi varira od nekoliko sati do nekoliko dana, ali kod većine enzima on se kreće od 24 do 48 sati. Enzimi se ne eliminišu putem žuči, a aktivnost enzima u žuči potiče od enzima iz jetre i žučnih puteva.
Specifičnost enzima za pojedine organe (enzimska slika organa) Neke enzimi su široko rasprostranjeni u većini tkiva, a neki su više specifični za pojedina tkiva ili organe. Prema rasprostranjenosti u organizmu enzimi mogu da se podele u tri grupe: Enzimi nespecifični za pojedine organe. organe. U ovu grupu spadaju enzimi koji učestvuju u procesima u kojima se stvara energija i to su enzimi glikolize, ciklusa limunske kiseline i respiratornog lanca. Ovi metabolički procesi se odvijaju na isti način u svim organima, ali različitim intenzitetom, pa enzimi koji pripadaju ovim procesima nisu prisutni u svim organima u istim količinama.
8�3
S. Spasić: Enzimi
Enzimi specifični za pojedine organe. organe. Neki metabolički procesi su specifični samo za pojedine organe, pa se i enzimi koji učestvuju u ovim procesima nalaze samo u tim organima. Za takve enzime kažemo da su organski specifični enzimi. Izoenzimi specifični za pojedine organe. organe. Mnogi enzimi se javljaju u više izoenzima koji su različito raspoređeni po organima, pa tako i organski nespecifični enzimi mogu imati organski specifične izoenzime. Izbor enzima čija aktivnost može da se određuje u dijagnostičke i prognostičke svrhe zavisi od brojnih faktora. Najvažniji faktor kod odabiranja enzima je njihova raspodela po organima i tkivima. Za većinu organa i tkiva moguće je odabrati jedan broj organski specifičnih enzima i izoenzima, kao i organski nespecifičnih nespecifičnih enzima, koji predstavljaju njihovu enzimsku sliku i koji mogu da se koriste u dijagnostici različitih oboljenja tih organa, odnosno tkiva. Pored raspodele u tkivima i organima, na odabir enzima utiče vreme za koje se oni degradiraju u krvi. Enzimi koji imaju kratak poluživot nisu od velike dijagnostičke koristi, jer se za kratko vreme eli� minišu. Takođe treba naglasiti, da se rezultati koji se dobiju određivanjem aktivnosti enzima u telesnim tečnostima uvek tumače zajedno sa drugim biohemijskim nalazima, kao i sa kliničkom slikom bolesti. Tabela 8�1. Raspodela po organima dijagnostički važnih enzima
enzim
lokalizacija
dijagnostički značaj
aspartat�aminotransferaza
jetra, jetr a, skeletni skeletn i mišići, m išići, srce, bubre- Ml, parenhimske bolesti jetre, bolesti mišića zi, eritrociti
alanin�aminotransferaza
jetra, jetr a, skeletni skelet ni mišići, srce
parenhimske bolesti jetre
alkalna fosfataza
jetra, jet ra, kosti, placenta, intestinalna intestinal na mukoza, bubrezi
bolesti kostiju, hepatobilijarne bolesti
kisela fosfataza
prostata, eritrociti
karcinom prostate
kreatin�kinaza
skeletni mišići, mozak, srce, glatMl, bolesti mišića ki mišići
glutamat�dehidrogenaza
jetra jetr a
parenhimske bolesti jetre
gama�glutamiltransferaza
jetra, jetr a, bubrezi
hepatobilijarne bolesti, alkoholizam
amilaza
pljuvačne žljezde, pankreas, ova� bolesti pankreasa rijumi
lipaza
pankreas
bolesti pankreasa
tripsin(ogen)
pankreas
bolesti pankreasa
holinesteraza
jetra jetr a
parenhimske bolesti jetre, trovanje organofosfatima
5'�nukleotidaza
hepatobilijarni hepatobilijarni trakt trak t
laktat�dehidrogenaza
srce, jetra, skeletni mišići, eritro- Ml, parenhimske bolesti jetre, he� citi, trombociti moliza
aldolaza
skeletni mišići, srce
hepatobilijarne bolesti
bolesti mišića
8�4
Medicinska biohemija
Aktivno Akt ivnosti sti enzim en zimaa u bolestim bole stimaa različitih različ itih organa org ana Bolesti srca. srca. U srčanom mišiću nema specifičnih enzima, već se nalaze enzimi koji su prisutni i u drugim organima. U infarktu miokarda ovi enzimi izlaze iz oštećenog tkiva i vrlo brzo prelaze u cirkulaciju, tako da je za infarkt miokarda karakterističan nagli porast aktivnosti više enzima. Enzimi koji se određuju u infarktu miokarda su kreatin�kinaza (CK), karakterističan izoenzim kreatin�kinaze (CK� MB), aspartat�aminotransferaza (AST) i laktat�dehidrogenaza (LDH).
�®�CK �OCKMB �*�AST �*�LDH
•i
i
0 0,25 0,5
1
Slika 8�1. Aktivnosti enzima u infarktu miokarda Aktivnos Aktiv nostt CK i AST se povećavaju pove ćavaju već 5�6 sati posle infarkta, infar kta, maksimalna maksim alna aktivnost aktiv nost se dostiže posle 24 sata, a vraća se na normalu posle 3�5 dana. Aktivnost LDH se takođe povećava posle infarkta, ali nešto sporije nego aktivnost CK i AST, maksimum dostiže posle 2�3 dana a vraća se na normalu posle 6�8 dana. Za ove enzime je karakteristično takođe da im se aktivnost ne povećava u istom relativnom odnosu prema normalnim vrednostima. Najviše se povećava aktivnost CK i to 20 do 40 puta u odnosu na normalu, AST oko 10 puta, a LDH raste 5 do 6 puta. Bolesti jetre. Najveća jetre. Najveća primena enzima u dijagnostici je upravo kod bolesti jetre i žučnih puteva, što je i normalno jer se u jetri nalazi veliki broj različitih enzima. Enzimi koji se koriste u dijagnostici bolesti jetre mogu da se podele u tri grupe: 1. Enzimi koji se sintetišu u jetri i luče u cirkulaciju gde obavljaju svoju fiziološku funkciju. U ovu grupu enzima spadaju faktori koagulacije i holinesteraza. U bolestima jetre u kojima se smanjuje njena sintetska funkcija smanjuje se sinteza proteina, pa time i ovih enzima, što dovodi do smanjenja njihove aktivnosti u krvi. 2. Enzimi koji kod oštećenja hepatocita izlaze u cirkulaciju, pa povećanje njihove aktivnosti u krvi ukazuje na postojanje bolesti. Ovi enzimi se nazivaju indikatorskim enzimima i tu spadaju: aspartat� aminotransferaza (AST), alanin�aminotransferaza (ALT), laktat�dehidrogenaza (LDH), sorbitol� dehidrogenaza (SDH), glutamat�dehidrogenaza (GLDH), izocitrat�dehidrogenaza (ICDH), gama� glutamiltransferaza (GGT), alkalna fosfataza itd. Brzina kojom se ovi enzimi pojavljuju u krvi, kao i intenzitet porasta njihove aktivnosti zavise od vrste i stepena oštećenja hepatocita. 3. Enzimi žučnih puteva koji se u krvi pojavljuju kod lezije epitela ili kod opstrukcije žučnih puteva. U ove enzime spadaju gama�glutamiltransferaza (GGT), leucin�aminopeptidaza (LAP) i alkalna fosfataza. Bolesti pankreasa. pankreasa. Za pankreas su specifični enzimi amilaza i lipaza. Lipaza je specifični enzim za pankreas, dok se amilaza nalazi i u pljuvačnim žljezdama. Kod bolesti pankreasa, posebno kod akutnog pankreatita povećava se aktivnost ovih enzima u krvi, ali se povećava i aktivnost amila� ze u urinu. Pored ovih enzima, povećavaju se aktivnosti aminotransferaza i gama�
S. Spasić: Enzimi
8�5
glutamiltransferaze, koje su poreklom iz oštećenog pankreasa ili iz jetre kao posledica sekundarnog oštećenja. Bolesti kostiju. kostiju. U kostima se nalazi alkalna fosfataza, koja može biti povišena u periodu rasta, što predstavlja fiziološko povećanje, ali se takođe povećava i kod različitih bolesti kostiju. Kako se alkalna fosfataza nalazi i u drugim organima (jetri, bubregu, placenti, crevima) za dijagnostiku bolesti kostiju neophodno je da se odredi izoenzim alkalne fosfataze koji je specifičan za kosti. Ako to nije moguće određuju se pored alkalne fosfataze i enzimi koji potiču iz jetre, jer je u praksi najčešće potrebno da se ustanovi da li alkalna fosfataza potiče iz kostiju ili iz jetre. Bolesti mišića. mišića. Skeletni mišići sadrže veliku količinu kreatin�kinaze, aspartat�aminotransferaze, aldolaze i laktat�dehidrogenaze i aktivnost ovih enzima povećava se u različitim bolestima mišića. Posebno je značajno određivanje aktivnosti enzima kod mišićne distrofije, naročito kod tipa Duchen� ne. Skeletni mišići i srčani mišić imaju sličnu enzimsku sliku, ali se razlikuju brzina i intenzitet porasta aktivnosti ovih enzima. Bolesti prostate. prostate. Za prostatu je specifičan jedan izoenzim kisele fosfataze koji se naziva prostatična kisela fosfataza, koja se od ostalih kiselih fosfataza razlikuje po tome što se potpuno inhibira L�tartaratom. Kisela fosfataza se nalazi u eritrocitima, trombocitima i drugim tkivima, ali ni u jednom jednom od njih nema izoenzima izoen zima koji je osetljiv na L�tartarat. L�tartarat.
Amino Aminotr tran ansf sfer eraz aze e U aminotransferaze (koje su ranije označavane kao transaminaze) spadaju enzimi koji katalizuju interkonverziju aminokiselina i 2�oksokiselina prenošenjem amino grupa. U ovim reakcijama iz okso� kiselina nastaju nove aminokiseline zbog čega aminotransferaze imaju važnu ulogu u metabolizmu proteina. U svim reakcijama transaminacije kao akceptor/donor amino grupe služi par 2� oksoglutarat/L�glutamat, a specifičnost pojedinih aminotransferaza određuje aminokiselina koja služi kao drugi donor amino grupe. Piridoksalr5'�fosfat (P�5'�P) i njegov amino�analog piridoksamin�5'�fosfat deluju kao koenzimi u reakcijama transaminacije; piridoksal�fosfat predstavlja pravu prostetičnu grupu jer je vezan za apo� enzim. Mehanizam reakcije transaminacije u kojoj je piridoksal�fosfat koenzim je sledeći: aldehidna grupa iz koenzima reaguje sa amino grupom iz aminokiseline (specifična aminokiselina za enzim) pri čemu nastaje Šifova baza između piridoksal�fosfata vezanog za enzim i aminokiseline. Šifova baza disosuje, dolazi do premeštanja dvostrukih veza i nastaje intermedijemo jedinjenje koje se u prisustvu vode raspada na oksokiselinu i piridoksamin�fosfat. Piridoksamin�fosfat potom reaguje sa drugom oksokiselinom, koja sada ima ulogu akceptora amino grupe u reakciji koja je reverzna u odnosu na prethodnu. Na kraju se dobija nova aminokiselina a kompleks piridoksal�fosfat�enzim se regeneriše. U organizmu se nalazi više aminotransferaza koje prenose aminogrupe sa različitih aminokiselina, ali su najrasprostranjenije i klinički najvažnije dve: aspartat�aminotransferaza (AST, ili kako je ranije nazivana glutamat�oksalacetat�transaminaza, GOT) i alanin�aminotransferaza (ALT, ili ranije glu� tamat�piruvat�transaminaza, GPT). Aspa As parta rta t�am t� amin inot otra rans nsfe fera raza za
Aspartat�aminotransferaza, Aspartat�aminotran sferaza, AST (L�aspartat�2�okso (L�asparta t�2�oksoglutarat�a glutarat�aminotr minotransfera ansferaza, za, EC 2.6.1.1.) kata� lizuje reverzibilnu reakciju transminacije između L�asparaginske kiseline i 2�oksoglutame kiseline, u kojoj nastaju oksal�sirćetna kiselina i glutaminska kiselina: L�asp artat+ 2�oksoglutaart 2�oksoglutaart <
AST
>
oksalacetl + L�gl utam at
8�6
Medicinska biohemija
Najveća aktivnost AST je prisutna u jetri, vrlo visoka je u srčanom i skeletnim mišićima, kao i u bubrezima, relativno je niska u mozgu, plućima, pankreasu, a nema je u kostima. Nalazi se takođe i u telesnim tečnostima. U ćelijama je AST lokalizovan u citoplazmi (rastvorljivi izoenzim AST�1) i u mi� tohondrijama (izoenzim AST�2). Ova dva izoenzima se razlikuju po elektroforetskoj pokretljivosti, osetljivosti prema pH i temperaturi. Elektroforezom u fosfatnom puferu pri pH 7,5 citoplazmatski izoenzim putuje anodno i brže, a mitohondrijalni putuje katodno i sporije. Citoplazmatski izoenzim ima pH optimum oko 9, a mitohondrijalni oko 5,8; mitohondrijalni izoenzim je termolabilniji od citoplaz� matskog. AST je od velikog velik og značaja za dijagnozu, dijag nozu, prognozu i rano otkrivanje otkriva nje bolesti jetre, jet re, ali obavezno u kombinaciji sa drugim enzimima jetre, kao što su ALT, holinesteraza, alkalna fosfataza, laktat� dehidrogenaza, leucin�aminopeptidaza i dr. Takođe je od značaja za dijagnozu i prognozu infarkta miokarda i to u kombinaciji sa kreatin�kinazom. A. Povišene Poviš ene vredn vre dnost ostii AST u serumu ser umu Povišene vrednosti AST u serumu sreću se kod sledećih bolesti: Bolesti jetre 1. Kod akutnog virusnog hepatita dolazi do izrazitog povećanja aktivnosti AST, čak i pre nego što ikterus postane vidljiv. Maksimalne vrednosti se ispoljavaju između prve i druge nedelje bolesti i mogu da budu 20 do 30 puta veće od gornje granice referentnog intervala. Ako je tok bolesti bez komplikacija, vrednosti AST se vraćaju u referentni opseg za 4 do 8 nedelja. 2. Kod hroničnih bolesti jetre, kao što su hronični agresivni hepatitis, hronični perzistirajući hepatitis i ciroza jetre vrednosti AST se neznatno povećavaju. 3. Kod infiltrativnih bolesti jetre, kakve su metastaze, leukoze, limfomi i dr., često se zapaža masivno povećanje aktivnosti AST u serumu. 4. Kod akutne mononukleoze je takođe povećana aktivnost AST u serumu, a maksimalna vred� nost se dostiže krajem druge nedelje. Bolesti pankreasa. Akutni pankreatit po pravilu dovodi do masivnog povećanja aktivnosti AST. Bolesti miokarda. Kod infarkta miokarda se obavezno povećava aktivnost AST a maksimalna vrednost se dostiže dostiž e između 16 i 48 sati od početka bolesti i obično je 5 � 1 0 puta veća od gornje granice referentnog intervala. Povećanje aktivnost AST u ovim slučajevima je u korelaciji sa veličinom tkiva koje je zahvaćeno bolešću: ako je povećanje AST 10 puta veće od gornje granice referentnih vrednosti vrednost i prognoza prognoz a nije povoljna, a ako je povećanje 15 puta veće, onda je kod tog pacijenta prognoza vrlo loša. Ako nema komplikacija ili ponovnog infarkta, aktivnost AST se vraća na normalu posle 3 do 6 dana. Bolesti mišića. Progresivna mišićna distrofija, dermatomiozitis i mioglobinurija različitog porekla dovode do značajnog povećanja aktivnosti AST u serumu. Ovo povećanje aktivnosti je naročito veliko kod male dece. Ostale bolesti. Aktivnost AST se povećava kod stanja šoka svih vrsta, infarkta pluća, embolije pluća, stanja posle velikih operativnih zahvata i dr. Uticaji lekova. Lekovi iz različitih terapijskih grupa i vrlo različitih hemijskih struktura mogu da deluju hepatotoksično i da zbog toga dovedu do povećanja aktivnosti AST u serumu. B. Snižene vrednosti AST u serumu Snižene vrednosti AST nemaju nikakav nozološki značaj i mogu da se jave kod trudnica, uremič� nih pacijenata i nedostatka vitamina B 6. Ako je u potanju nedostatak vitamina B 6 vrednosti AST se vraćaju na normalu posle kratkotrajne kratko trajne terapije ovim vitaminom vitam inom..
S. Spasić: Enzimi
8�7
Ala ni n� am in ot ra ns fe ra za Alanin�aminotransferaza, ALT (L�alanin�2�oksoglutarat�aminotransferaza, EC 2.6.1.2.) katalizuje reverzibilnu reakciju transaminacije između L�alanina i 2�oksoglutarne kiseline u kojoj nastaju piro� grožđana kiselina i glutaminska kiselina: L� ala nin + 2�oksoglutaart
<
AST
>
piruvat+ L�gl utam at
U ćeliji se ALT nalazi najvećim delom u citozolu, a mnogo manje u mitohondrijama, ali u istom obliku. Nalazi se, kao i AST u svim organima: najviše u jetri, a zatim u srčanom i skelektnim mišićima, bubrezima, manje u pankreasu, eritrocitima i drugim tkivima. U jetri se nalazi manja aktivnost ALT nego AST, ali se ALT ipak smatra jetrenim enzimom jer ga u jetri ima mnogo više nego u drugim tkivima. Pošto se nalazi prvenstveno u citozolu, pojavljuje se u krvi i kod manjih oštećenja ćelije. Alanin�aminotransferaza je od velikog značaja za dijagnozu, prognozu i rano prepoznavanje bolesti jetre. Za ove svrhe se ALT kombinuje sa drugim enzimima jetre, kao što su AST, holinesteraza, laktat dehidrogenaza, alkalna fosfataza, glutamat dehidrogenaza, leucin�aminopeptidaza. Kako je ALT relativno specifičan enzim, naročito je korisno njegovo određivanje kod akutnih bolesti jetre, a kod hroničnih bolesti jetre dijagnostički značaj ima odnos aktivnosti ALT prema aktivnosti ostalih enzima jetre. ~~ A. Povišene vrednosti ALT u serumu Povišena aktivnost ALT u serumu sreće se kod sledećih bolesti: Bolesti jetre 1. Kod akutnog virusnog hepatita dolazi do povećanja aktivnost ALT u serumu čak i pre ispolja� vanja kliničkih znakova bolesti, a karakteristično je da je povećanje ALT veće nego povećanje AST, tako da je odnos AST/ALT < 0,7. Kod toka bolesti bez komplikacija aktivnost ALT počinje da pada posle druge nedelje i vraća se na normalu za 6 � 8 nedelja. Kada je u početnoj fazi bolesti odnos AST/ALT > 0,9 to znači da je došlo do dubokog razaranja ćelija i izlaska AST iz mitohondrija, što predstavlja loš prognostički znak. 2. Kod hroničnog agresivnog hepatitisa, hroničnog perzistirajućeg hepatitisa i ciroze jetre povećanje ALT je neznatno ili ga čak uopšte i nema. Kod ovih bolesti po pravilu je povećanje AST veće od povećanja ALT. 3. Kod holestatskih bolesti, naročito kod holelitijaze, nema promene u aktivnosti ALT (kao ni u aktivnosti AST) sve dok ne dođe do sekundarnog oštećenja parenhima jetre. Kod akutnih opstrukcija žučnih puteva dolazi do masivnog povećanja aktivnosti obe transaminaze, ali je povećanje ALT veće od povećanja AST. 4. Kod infiltrativnih bolesti jetre, kao što su primarni i sekundarni karcinomi, odnosno metastaze, leukoze limfomi i druge bolesti promene u aktivnosti ALT su različite, ali uglavnom su povećanja neznatna. 5. Kod akutne mononukleoze povećanje aktivnosti ALT, kao i AST je veoma veliko. Bolesti srca. Povećanje aktivnosti ALT kod bolesti srca je mnogo manje u odnosu na AST, pod uslovom da nema zastoja u funkciji jetre zbog insuficijencije srca. Uticaji lekova. Mnogi lekovi dovode do povećanja aktivnosti ALT u serumu, ali najvažniji toksični agens koji ko ne malog broja osoba dovodi do povećanja aktivnosti ovog enzima je alkohol. B. Snižene vrednosti ALT u serumu Snižene aktivnosti ALT sreću se u trudnoći, kod deficita vitamina B 6, kao i u poslednjim stadiju� mima bolesti jetre kada su snižene aktivnosti i AST. Međutim, snižene vrednosti ALT nemaju dijagnostički značaj.
8�8
Medicinska biohemija
Alkalna fosfataza Alkalna fosfataza (ALP, EC 3.1.3.1.) pripada grupi enzima koji u alkalnoj sredini hidrolizuju mo� noestre fosfatne kiseline, pri čemu se oslobađaju različiti alkoholi ili derivati fenola, zavisno od supstrata koji učestvuje u reakciji. Alkalna fosfataza ima malu supstratnu specifičnost i deluje na veliki broj različitih prirodnih i sintetskih estara fosfatne kiseline, mada nisu poznati prirodni supstrati na koje enzim deluje u humanom organizmu. Činjenica da osobe sa urođenim nedostatkom ovog enzima izlučuju velike količine etanolamin�fosfata ukazuje na to da je ovaj estar (ili možda fosfatidiletanolamin) jedan od fizioloških supstrata. Optimalni pH za alkalnu fosfatazu je oko 10, zavisno od izoenzimskog sastava i reakcione sredine. Enzim je metalo protein jer u svom sastavu ima cink, a u aktivnom centru ostatak serina. Cink je funkcionalno nerazdvojiv od enzima, ali je za punu enzimsku aktivnost potreban i jon magnezijuma. Odgovarajući odnos Mg 2+ /Zn 2+ je neophodan da bi se postigla optimalna aktivnost. Pored toga, pro� mene u koncentraciji jona magnezijuma i supstrata izazivaju promene u pH optimumu. Sam molekul enzima sadrži u sebi velike količine glikoproteina. Alkalna fosfataza se nalazi u gotovo svim organima, a naročito visoka aktivnost je prisutna u će� lijskim membranama organa koji imaju apsorptivnu ili ekskretomu funkciju. Pored membranskog oblika postoji i mikrozomalni oblik ALP, a razlika između njih se bazira na genetskim faktorima i post� translacionoj modifikaciji. Kad se govori o genetskim faktorima poznato je da postoje tri lokusa za ALP: jedan za jetreno�koštanu�bubrežnu, drugi za intestinalnu i treći za placentamu ALP. Ova tri oblika enzima se između sebe razlikuju prema osetljivosti na različite inhibitore. Post�translaciona modifikacija prouzrokuje razlike u jetreno�koštano�bubrežnoj ALP, koje se ogledaju u različitoj količini ugljenih hidrata, posebno sijalinske kiseline u molekulu enzima. Zbog ovih razlika enzimi iz ova tri organa se razlikuju po elektroforetskoj pokretljivosti i temperaturnoj stabilnosti. Koštani enzim je termola� bilan, za razliku od jetrenog i bubrežnog enzima koji su termostabilni. Jetreno�koštano�bubrežne varijante ALP nalaze se u endotelu, četkastoj prevlaci tankog creva i� bubrežnih tubula, u mikrovilima, u žučnim kanalićima i u osteoblastima. Koštana ALP ima ulogu u" sintezi i kalcifikaciji kostiju, dok je fiziološka uloga jetrene i bubrežne ALP prilično nejasna. Intestinalna ALP učestvuje u transportu masnih kiselina, kalcijuma i fosfata kroz ćelijsku membranu enterocita i potom putem limfe dospeva u krv, gde se vezuje za membranu eritrocita. Vezivanje za membranu eritrocita je intenzivno kod krvnih grupa A i AB, a neznatno kod krvnih grupa B i O. Placentama ALP se razlikuje od drugih oblika ALP po tome što pokazuje izuzetnu stabilnost prema visokim temperaturama. Posle zagrevanja na 65°C u toku 5 min placentama ALP ostaje i dalje aktivna, za razliku od ostalih oblika enzima koji se inaktiviraju. Aktivnost placentarne ALP se po većava kod trudnica između 16�te i 20�te nedelje trudnoće i ostaje povišena sve do porođaja. Na normalu se vraća 4�7 dana posle porođaja. Aktivnost alkalne fosfataze u plazmi i serumu se određuje vrlo često, ali značaj rezultata za dijagnozu i prognozu bolesti nije naročito veliki. Kada se dobije povišena aktivnost ALP u serumu nije moguće odgovoriti na pitanje da li je ona koštanog ili jetrenog porekla dok se ne uradi elektroforetsko razdvajanje, a isto tako samo na osnovu povišene vrednosti ALP ne može da se ustanovi da li se radi o intra� ili posthepatičnom poremećaju. Takođe nema kvantitativne zavisnosti između aktivnosti ALP i veličine koštanog tkiva koje je zahvaćeno malignim procesom. A. Povišene vrednosti ALP u serumu Povišene vrednosti ALP sreću se kod sledećih bolesti: Bolesti kostiju. Kod svih procesa razgradnje i obnavljanja kostiju povećana je aktivnost ALP, a to se dokazuje elektroforetskim razdvajanje pri čemu se dobija povećan koštani izoenzim. Ova po java se sreće kod sledećih bolesti: � Metastaze na kostima, kao i osteogeni sarkom kada su vrednosti ALP veće 5 do 30 puta u odnosu na gornju granicu referentnih vrednosti; � Rahitis zbog nedostatka vitamina D;
S. Spasić: Enzimi
8�9
� Primarni i sekundarni hiperparatiroidizam; � Frakture i osteomalacija su praćene neznatnim povećanjem aktivnosti ALP; � Osteoporoza, osteomijelit i mijelom dovode retko do povećanja ALP. Hepatobilijarni procesi. Intra� i ekstrahepatični holestatski procesi uvek dovode do povećanja aktivnosti ALP u serumu, često i pre nego što su povećane vrednosti transaminaza. Elektroforetskim razdvajanjem se dobija povećan jetreni izoenzim, a često se pojavljuje i nova frakcija koja se kreće brzo ka anodi i označava se kao "brzi jetreni" izoenzim. Razlozi za pojavu ove frakcije nisu sasvim jasni i verovatno je da se ne radi o novom izoenzimu, nego o asocijaciji membranskog enzima sa li� pidnim materijalom, kao i fragmentima membrane ćelija žučnih puteva i hepatocita. Prisustvo "brze jetrene" ALP uvek je dokaz postojanja opstruktivne bolesti jetre. Druge bolesti jetre, kao što su hepatomi, granulomi, metastaze u jetri, ciroza jetre i infektivna mononukleoza dovode do masivnih povećanja aktivnosti ALP u serumu. Kod virusnog hepatita je po većanje aktivnosti ALP neznatno i vrlo brzo se vraća na normalu. B. Snižene vrednosti ALP u serumu Nasledno smanjenje aktivnosti ALP (autozomalno recesivno nasleđivanje) praćeno je izuzetno niskim vrednostima ALP u serumu i zbog toga promenama na kostima koje se dokazuju radiološki i histološki. Pored toga, kod ovih osoba su česte spontane frakture, hiperkalcemija i nefrokalcinoza, > kao i visoke koncentracije pirofosfata i fosforiletanolamina u plazmi i urinu.
Kisela fosfataza Kisela fosfataza (KF, EC 3.1.3.2.) pripada grupi enzima koji razlazu monoestre fosfatne kiseline do neorganskog fosfata i alkohola, odnosno fenola. Maksimum aktivnosti ovog enzima je u kiseloj sredini između pH 4 i pH 6. Kisela fosfataza se nalazi u skoro svim organima i telesnim tečnostima, kao i u eritrocitima, leu� kocitima i trombocitima, a najviša aktivnost je prisutna u prostati. Kisela fosfataza ima više izoenzi� ma, koji se razdvajaju elektroforetski, a poreklom su iz prostate, trombocita, eritrocita, kostiju i dr. Ovi izoenzimi se između sebe razlikuju i po osetljivosti prema inhibitorima kao što su etanol, formaldehid, L�tartarat, gvožđe, bakar i fluorid, a dijagnostički je najznačajnija inhibicija sa L�tartaratom na koji je osetljiv prostatični izoenzim. Osim toga, izoenzimi kisele fosfataze se razlikuju i prema pH optimumu. Kisela fosfataza ne pokazuje veliku supstratnu specifičnost i može da deluje na brojne alifatične i fenolne estre fosfatne kiseline. Pojedini izoenzimi KF pokazuju različitu specifičnost prema supstratima. Danas se kao supstrati za određivanje aktivnosti KF najčešće koriste 4�nitrofenil�fosfat, 1�naftil� fosfat i timolftalein�fosfat. Određivanje aktivnosti kisele fosfataze u prvom redu se koristi za dijagnozu i terapijsku kontrolu karcinoma prostate. Ako je aktivnost prostatične kisele fosfataze povišena, sa sigurnošću se može tvrditi da se radi o karcinomu prostate, možda i sa metastazama, čak i u slučajevima kada se palpa� cijom ne pipa tumor. Aktivnost kisele fosfataze je povišena i kod nekih koštanih bolesti i to istovremeno sa alkalnom fosfatazom. A. Povišene vrednosti kisele fosfataze u serumu Povišene aktivnosti kisele fosfataze u serumu sreću se kod mnogih bolesti: Maligne bolesti prostate. Kod većine pacijenata postoji korelacija između stadijuma bolesti i po većanja aktivnosti kisele fosfataze: u stadijum A aktivnost KF je povećana kod oko 15% pacijenata, a u stadijumu D bolesti aktivnost enzima je povećana kod oko 80% pacijenata. U ovim slučajevima je od dijagnostičkog značaja aktivnost prostatične kisele fosfataze.
8�10
Medicinska biohemija
Bolesti kostiju. Kod nekih bolesti kostiju se povećava aktivnost ukupne KF, ali nema promene u aktivnosti prostatičnog izoenzima. Ove promene se uočavaju kod dece i mladih koji rastu, ali i kod hiperparatiroidizma, Paget�ove bolesti i mijeloma. Kod nekih malignih procesa na kostima, naročito kod karcinoma dojke, zajedno sa kiselom fosfatazom povećava se i aktivnost alkalne fosfataze. Trom boem bolijske bolesti. Kako u trombocitima postoji značajna aktivnost kisele fosfataze, kod nekih tromboembolijskih bolesti (kao što su tromboza, arterijska embolija, tromboflebit), kao i posle infarkta miokarda dolazi do masivnog povećanja aktivnosti KF. Aktivnost kisele fosfataze je povećana i kod nekih mijeloproliferativnih bolesti (akutna i hronična limfatična i mijeloidna leukemija), kao i kod hemolitičnih stanja.
B. Snižene vrednosti kisele fosfataze u serumu Nisu poznata fiziološka ili patofiziološka stanja kod kojih je snižena aktivnost kisele fosfataze. Ako se dobije takav rezultat treba proveriti da nije u pitanju greška kod uzimanja i pripreme uzorka, jer postoje brojni faktori uticaja.
Gama�glutamJItransferaza (GGT) Gama�glutamiltransferaza (GGT, EC 2.3.2.2) je enzim ćelijskih membrana koji katalizuje prenos y�glutamil ostatka sa glutationa ili drugog Y�glutamil�peptida na neki oligopeptid ili na aminokiselinu, pri čemu nastaje y�glutamil�dipeptid i cisteinilglicin. GGT katalizuje i autotranspeptidaciju u kojoj se y� glutamil ostatak prenosi sa jednog molekula na isti takav molekul, pa nastaje y�glutamil�y�glutamil� peptid. GGT je integralni deo mnogih ćelijskih membrana kod kojih kontroliše asimilaciju aminokiselina. Ima važnu ulogu u resorpciji aminokiselina iz telesnih tečnosti (npr. iz glomerularnog filtrata), kao i u prenošenju aminokiselina iz ekstracelularne tečnosti u ćelije. Pošto je sastavni deo membrane nalazi se u mnogim tkivima, ali u različitim aktivnostima. Najvišu aktivnost imaju ćelije bubrežnih tubula, a zatim pankreas, u kome je aktivnost samo 10%, i jetra u kojoj je aktivnost 4% u poređenju sa bubrezima. U drugim organima se GGT nalazi samo u tragovima, a u nekima ga uopšte nema (pluća, glatka i poprečno�prugasta muskulatura). U telesnim tečnostima je najveća aktivnost u žuči, zatim u urinu, pankreasnom soku i plodovoj vodi, a u krvi je relativno niska. Kako je GGT membranski enzim, pod određenim okolnostima (kao što je destrukcija ćelija ili in� flamacija) može da pređe u krvi i tada se aktivnost povećava, lako je aktivnost u bubrezima najveća, nema povećanja aktivnosti GGT u serumu kod različitih bolesti, već je povećana aktivnost enzima u serumu uvek poreklom iz jetre. A. Povišene vrednosti GGT u serumu Povišene vrednosti GGT sreću se kod sledećih bolesti: Bolesti jetre. � Holestatska stanja dovode po pravilu do velikog povećanja aktivnosti u serumu, a to je praćeno povećanjem aktivnosti i drugih enzima specifičnih'za holestazu, kao što su alkalna fosfataza i leucin� aminopeptidaza (LAP). � Kod ciroze jetre, naročito kod one koja je izazvana alkoholom, povećanje aktivnosti GGT je vrlo masivno. � Kod akutnog virusnog hepatitis nema značaja određivanje aktivnosti GGT, ali je važno za praćenje hroničnog perzistirajućeg hepatitisa. � Od značaja je određivanje GGT kao markera metastaza u jetri koje su posledica drugih primarnih tumora, jer u tim slučajevima daje manji broj lažno negativnih rezultata nego alkalna fosfataza, ALT ili nukleotidaza.
S. Spasić: Enzimi
8�13
Mijeloidne i limfatične leukoze. Kod akutnih oblika ovih bolesti aktivnost LDH je povećana, dok je kod hroničnih oblika aktivnost u okvirima normalnih vrednosti, ako nema dodatne hemolitične komponente bolesti. Bolesti jetre. Kod akutnog virusnog hepatita povećanje aktivnosti LDH je masivno, dok je samo neznatno kod opstruktivnih procesa i ciroze. Infarkt miokarda. Posle infarkta miokarda aktivnost LDH se sporo povećava i dostiže maksimum posle 1�2 dana, a povećanje vrednosti iznosi 2�4 puta u odnosu na referentne vrednosti. Vrednosti se vraćaju na normalu posle 7�20 dana, odnosno pošto su se vrednosti CK i AST već normalizovale. Kod infarkta miokarda se povećava izoenzim LDH�I, tako da je određivanje njegove aktivnosti od di jagnostičkog značaja.
Alfa�amilaza Alfa�amilaza (EC 3.2.1.1) razgrađuje polimerne ugljene hidrate tako što hidrolizuje 1—>4a� glikozidne veze, posle čega nastaju heksa�, hepta� i okta�saharidi, kao i dekstrini sa više od 12 ostataka glukoze. Iz ovih međuproizvoda relativno brzo nastaju maltotetroze i maltotrioze, a dalja razgradnja do maltoze i glukoze ide sporo. Poznata su dva izoenzima amilaze i to pankreasni (P tip) i salivami (S tip). Ova dva izoenzima imaju sličnu molekulsku masu i slične katalitičke osobine, a razlikuju se po mestu delovanja. Amilaza se filtrira u glomerulima i jednim delom se reapsorbuje u tubulima, a P tip se brže pojavljuje u urinu nego S tip. Iz nepoznatih razloga kod nekih pacijenata se pojavljuje visokomolekulami kompleks enzimski aktivne amilaze, a ova pojava se naziva makroamilazemija. Ovaj kompleks pored amilaze sadrži uglavnom IgA, ali takođe i IgG. makroamilazemija može da bude praćena i povećanom aktivnošću amilaze, ali i ne mora. A. Povišene vrednosti amilaze Bolesti pankreasa. Kod akutnog pankreatitisa dolazi do povećanja aktivnosti amilaze (pankrea� snog izoenzima) već nekoliko sati posle pojave abdominalnog bola. Ovo povećanje aktivnosti je vrlo veliko i iznosi oko 10 puta u odnosu na referentne vrednosti. Povećane vrednosti amilaze se u urinu pojavljuje nešto kasnije, ali se i duže održavaju, za razliku od aktivnosti u serumu koje se vraćaju na normalu već posle nekoliko dana. Bolesti salivarnih žljezda. Kod akutnog parotitisa se povećava aktivnost amilaze i to skoro isključivo samo S tipa. I druge inflamatome bolesti salivarnih žljezda, kao i operativni zahvati u njihovoj blizini dovode do povećanja aktivnosti amilaze S tipa u serumu. Bolesti bubrega. Kod pacijenata sa smanjenom funkcijom bubrega po pravilu je povećana akti vnost amilaze u serumu, dok je u urinu normalna ili čak smanjena (zbog smanjenog izlučivanja).
Poglavlje 9. Kalcijum, fosfat i magnezijum
Kalcijum Kalcijum je dvovalentni katjon koji u fiziologiji kičmenjaka ima strukturnu i metaboličku ulogu. Strukturna uloga se sastoji u njegovom učešću u izgradnji skeleta, a metaboličke funkcije su mu brojne. Odrasla osoba ima oko 1 kg kalcijuma u organizmu, od čega najviše u kostima (99%), a preostala količina je raspoređena u ekstracelulamoj tečnosti i mekim tkivima. U ekstracelulamoj tečnosti se nalazi ukupno oko 25 mmol kalcijuma, a od toga 7,5 mmol je u krvi. Koncentracija kalcijuma u plazmi se održava u uskim granicama koje iznose od 2,20 do 2,60 mmol/L; kalcijum u plazmi je raspodeljen na tri osnovne frakcije: vezan za proteine, jonizovan i kompleksno vezan za anjone. Deo kalcijuma (40%) koji je vezan za proteine je nedifuzibilan, što znači da ne prolazi kroz membranu krvnih kapilara. Najveći deo kalcijuma koji je vezan za proteine vezan je za al� bumin, a samo oko 20% je kompleksno vezano za globuline. Zbog toga se kod svih poremećaja u kojima je snižen albumin, smanjuje i ukupan kalcijum i to uglavnom na račun frakcije koja je vezana za proteine. U prošeku 10 g albumina vezuje oko 0,2 mmol kalcijuma, tako da se kod pacijenata koji imaju hipoalbuminemiju moraju korigovati vrednosti ukupnog kalcijuma Ostatak kalcijuma koji nije vezan za albumin predstavlja difuzibilni kalcijum i od toga je oko 10% kompleksno vezano za različite anjone (bikarbonat, fosfat, sulfat, citrat, laktat), a oko 50% je u joni� zovanom obliku koji je fiziološki aktivan. Jonizovani kalcijum je važan za rad srca, nervnog sistema i formiranje kostiju. Promena koncentracije jonizovanog kalcijuma uglavnom utiče na promenu koncentracije ukupnog kalcijuma, ali u određenim patološkim stanjima dolazi do preraspodele između pojedinih frakcija kalcijuma. Pošto je fiziološki aktivan samo jonizovani kalcijum važno je da se njegova koncentracija održava u određenom opsegu. Opseg normalnih koncentracija jonizovanog kalci juma kod odraslih je od 1,16 do 1,32 mmol/L. Intracelulami kalcijum Kalcijum je uključen u brojne intracelulame procese: mišićnu kontrakciju, provođenje nervnog impulsa, sekreciju hormona, metabolizam glikogena i ćelijsku deobu. Kalcijum ima ulogu prvog i drugog glasnika unutar ćelije, što znači da prenosi informacije u vidu električnih i hemijskih poruka sa
(, 9�2
Medicinska biohemija
ćelijske membrane u unutrašnjost ćelije ili unutar same ćelije. Kalcijum ima prednost u odnosu na druge katjone ili anjone (Na + , K+, Mg 2+ i Cl") u prenošenju informacija zbog toga što se čvrsto i specifično vezuje za proteinske molekule. Koncentracija kalcijuma u ćeliji je od 10' 4 mmol/L do 10~3 mmol/L (oko 10000 puta je manja od koncentracije u ekstracelularnoj tečnosti), a od toga se 90 do 99% nalazi u mitohondrijama, endoplazmatičnom i sarkoplazmatičnom retikulumu, koji predstavljaju depoe kalcijuma. Koncentracija kalcijuma u citozolu precizno je kontrolisana transportom kroz plazma membranu, kao i kroz mitohondrijalnu i mikrozomalne membrane. U tim procesima ulogu imaju vol� tažno�zavisni kanali, receptor�zavisni kanali i depo�zavisni kanali, kao i aktivni transport kalcijuma kroz plazma membranu pomoću Ca2+ �adenozin trifosfataze (Ca2+�ATP�aze) i Na+/Ca 2+�antiport sistema. Unutar ćelije kalcijum se, prema potrebi, odlaže u depoe ili oslobađa iz njih Receptor za kalcijumove jone u ćelijama je protein kalmodulin, a u poprečno�prugastim mišićnim ćelijama ulogu receptora ima još i protein troponin C. Kada se koncentracija kalcijuma unutar ćelije povisi, višak se vezuje za kalmodulin (ima 4 mesta za vezivanje kalcijuma), nagradi se aktivni kompleks Ca2+ �kalmodulin koji se vezuje za različite proteine i tako deluje na njih. Efekti kalcijumovog jo� na će zavisiti od vrste ćelija i one se razlikuju prema proteinu na koji aktivni kompleks deluje. lako su ciljni proteini kompleksa Ca 2+�kalmodulin brojni, može se reći da se najveći broj efekata ostvaruje posredstvom Ca2+�kalmodulin�zavisnih protein�kinaza koje fosforilišu proteine i na taj način im menjaju aktivnost. Tako se fosforilacijom proteina miozina u mišićima izaziva njihova kontrakcija. U nervnim ćelijama aktivirana protein�kinaza izaziva sekreciju kateholamina. Veoma je značajno delovanje akti vnog kompleksa na aktivaciju Ca2+�ATP�aze u plazma membrani ćelija koja izbacuje višak kalcijuma iz ćelije. Ekstracelularni kalcijum Kalcijum izvan ćelije ima nekoliko važnih uloga: izvor je za intracelulami kalcijum, obezbeđuje kalcijum za mineralizaciju kostiju, učestvuje u koagulaciji i obezbeđuje potencijal plazma membrane. Ekstracelularna koncentracija kalcijuma utiče na prag za akcioni potencijal nervnih ćelija. Snižena koncentracija kalcijuma povećava neuro�mišićnu ekscitabilnost, a niska koncentracija kalcijuma ima suprotno dejstvo. Najveća količina kalcijuma je u kostima i čini ih veoma otpornim na pritisak (po svojstvima su slične mermeru). Kosti su izgrađene od čvrstog organskog matriksa (30%) koji je ojačan naslagama neorganskih soli (70%), čiji tačan sastav nije poznat, ali se zna da su slične hidroksiapatitu [Cai0(PO 4)6(OH)2]. U kostima se nalaze i drugi neorganski joni: Mg 2+ , Na +, K+ i karbonati, ali oni ne grade sopstvene kristale već se vezuju za hidroksiapatit. Kristali hidroksiapatita se čvrsto vezuju za svaki segment kolagenog vlakna koji čini organski matriks i na taj način sprečava raslojavanje kosti ju. Takođe se segmenti susednih kolagenih vlakana međusobno preklapaju, a sa njima i kristali hidroksiapatita (podseća na raspored cigli u zidu) što sve doprinosi čvrstini kostiju. U kostima se nalazi i tzv. izmenljivi kalcijum koji čini od 0,4 do 1% ukupnog kalcijuma u kostima. Smatra se da je ovaj kalcijum u obliku soli koje se lako mobilišu (CaHP0 4 ) i predstavlja puferski sistem koji sprečava prome� ne koncentracije kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti.
METABOLIZAM KALCIJUMA Održavanje homeostaze kalcijuma je vrlo kompleksan proces u koji su uključene kosti, intestinal� na apsorpcija kalcijuma unetog hranom i renasno izlučivanje. Paratiroidne žlezde u kojima se stvara paratiroidni hormon i jetra koja učestvuje u metabolizmu vitamina D, takođe su integralni deo održa vanja balansa kalcijuma. Na slici 9�1 prikazana je homeostaza kalcijuma pod idealnim uslovima kada se koncentracija kalcijuma u organizmu ne povećava niti smanjuje. Homeostaza može biti narušena npr. pri intenzivnom rastu dece, kada je apsorpcija kalcijuma pozitivna u odnosu na izlučivanje urinom, a razlika se koristi za rast kostiju. U trudnoći i tokom laktacije apsorpcija kalcijuma je manja od izlučivanja urinom i gubitka majčinim mlekom, a razlika se obezbeđuje razgradnjom kostiju majke.
9�3
A. Topić: Kalciju m, fosfat i mag neziju m
Koncentracija jonizovanog kalcijuma bitno zavisi od acido�bazne ravnoteže u organizmu. Proteini plazme imaju negativno naelektrisane grupe koje mogu vezati vodonikove i kalcijumove jone. U respiratornoj i metaboličkoj acidozi, proteini više vezuju vodonikove jone, a manje, jone kalcijuma i po većava se koncentracija jonizovanog kalcijuma u plazmi. Suprotno, u metaboličkoj i respiratornoj al� kalozi više se jona kalcijuma vezuje za proteine i smanjuje se koncentracija jonizovanog kalcijuma u plazmi. I Meka tkiva i intraceiularni kacljum
Kalcijum Iz hrane *—20"™"
0,3 8,3
Creva
Ekstracelulama tečnost i plazma 250
II
s fc
Kosti
246
Bubreg
Urin
Slika 9�1. Promet kalcijuma u organizmu (prosečan sadržaj kod odrasle osobe u mmol/24 h) Apsorpcija ka lc ij uma u in tes ti nu mu
Potrebe za kalcijumom zavise od starosti i pola, kao i da li je žena trudna ili u fazi laktacije. Preporučuje se da odrasle osobe unose od 800 do 1200 mg/dan (20 � 30 mmol/dan). lako se nivo kalci juma u serumu održava u normalnom opsegu zahvaljujući resorpciji kostiju, jedini način da organizam nadoknadi izgubljeni kalcijum je unošenje kalcijuma hranom. Kalcijum iz hrane se apsorbuje u duodenumu, jejunumu i ileumu i svaki od ovih segmenata ima vrlo visok apsorpcioni kapacitet za kalcijum, ali relativna apsorpcija kalcijuma zavisi od dužine svakog od ovih segmenata, kao i vremena koje hrana provede u njima. Na apsorpciju kalcijuma u intestinumu utiče i prisustvo drugih sastojaka hrane; povoljno utiče prisustvo hidroksi�kiselina (mlečna, vinska, limunska), odgovarajuća količina fosfata, proteini, laktoza i vitamin D, a nepovoljno utiču na apsorpciju (jer smanjuju rastvorljivost kalcijuma) oksalat, fitinska kiselina, višak neorganskog fosfata, višak masnih kiselina i nedostatak vitamina D. Starenjem opada apsorpcija kalcijuma, a povećava se tokom trudnoće i laktacije. U intestinumu kalcijum ne samo da se apsorbuje nego se i sekretira, posebno su žuč i pankreas� ni sekret bogati kalcijumom. Od oko 25 mmol kalcijuma unetog hranom u intestinumu se apsorbuje oko 10 mmol, a sekretira oko 5 mmol, tako da je neto apsorpcija oko 5 mmol. Ako je nedovoljno unošenje kalcijuma, može se desiti da sekrecija kalcijuma premaši apsorpciju i u tom slučaju kažemo da je neto apsorpcija kalcijuma negativna. Kod zdravih osoba je neto apsorpcija pozitivna kada je dnevni unos kalcijuma veći od 5 mmol. Apsorpcija kalcijuma kroz intestinalni epitel odvija se na dva načina: paracelulamim i transcelu� larnim putem. Apsorpcija paracelulamim putem je pasivna i dešava se kada je koncentracija kalcijuma u lumenu vrlo visoka. Ovaj put apsorpcije nema zasićenja i njime se apsorbuje od polovine do dve trećine ukupno apsorbovanog kalcijuma. Na paracelulamu apsorpciju može indirektno da utiče 1,25�dihidroksi�vitamin D3 [1,25(OH) 2D3, kalcitriol] zato što on može da menja strukturu intercelular� nih tesnih spojnica, aktiviranjem protein�kinaze C, pa one postaju propustljive za kalcijum.
9�4
V Medicinska biohemija
Međutim, 1,25(OH)2D3 primarno kontroliše aktivnu apsorpciju kalcijuma (slika 9�2). Kalcijum iz lumena ulazi u apikalni deo mikrovila uz pomoć transportera za kalcijum ili kroz kalcijumove kanale, a kretanje omogućava koncentracioni gradijent. Postoje koncentracija u lumenu intestinuma 10 3 mol, a intracelularna 10"6 mol, veliki koncentracioni gradijent favorizuje pasivno kretanje kalcijuma. Kalci jum se brzo i reverzibilno vezuje za kalmodulin�aktin�miozin�l kompleks i tako vezan se putem mikro� vezikularnog transporta kreće do bazolateralne membrane. Jonizovani kalcijum se kreće kroz ćeliju slobodnom difuzijom. Kada se kalmodulin kompleks zasiti kalcijumom, koncentracioni gradijent koji omogućava ulazak kalcijuma u mikrovile, sada ne olakšava, već usporava apsorpciju kalcijuma. Pod uticajem kalcitriola epitelne ćelije intestinuma povećavaju sintezu proteina kalbindina (kalcijum vezu jući protein) za koji se vezuje kalcijum, čime se rasterećuje kompleks kalcijum�kalmodulin. koji može da preuzima kalcijum iz regiona mikrovila. Posle disocijacije kompleksa kalcijum�kalbindin, oslobođeni kalcijum se iz ćelije eliminiše ili uz pomoć Ca 2+�ATP�aze ili Na+/Ca 2+�antiportera. Kalcitriol može da povećava i sintezu Ca 2+�ATP�aze i time ubrzava eliminaciju kalcijuma iz ćelije. lumen
Slika 9�2. Apsorpcija kalcijuma kroz epitel intestinuma Reapsorpcija i izlučivanje kalcijuma u bubrezima Bubrezi su takođe važan organ za očuvanje ravnoteže kalcijuma. Putem bubrega se izluči ista količina koja se u crevima apsorbovala. U glomerulima se filtrira difuzibilni kalcijum (jonizovani i kompleksno vezani), a reapsorbuje se gotovo celokupna količina filtriranog kalcijuma (98%). U proksi� malnim tubulima se reapsorbuje najveći deo filtriranog kalcijuma, 70%, i to najvećim delom (80%) pasivnim, paracelularnim mehanizmom, dok se preostala količina reapsorbuje aktivnim transcelular� nim mehanizmom. U proksimalnim tubulima reapsorpcija kalcijuma prati reapsorpciju natrijuma i vode. Reapsorpci� jom vode dolazi do povećanja koncentracije kalcijuma u lumenu, što favorizuje paracelularnu reapsorpciju kalcijuma. Količina reapsorbovanog kalcijuma u proksimalnim tubulima je identična količini reapsorbovanog natrijuma (67%) što je dokaz o povezanosti ova dva mehanizma. Kada se menja reapsorpcija natrijuma u proksimalnim tubulima (bilo da je povećanje zapremine tečnosti ili koncen� trisanje) istovremeno se menja i reapsorpcija kalcijuma u istom odnosu.
A. Topić: Kalcijum, fosfat i magnezijum
9�5
U tankom delu Henleove petlje nema reapsorpcije kalcijuma, a u medularnom debelom delu petlje reapsorbuje se mala količina kalcijuma uglavnom pod uticajem kalcitonina. U kortikalnom delu uzlaznog debelog dela Henleove petlje reapsorbuje se oko 20% filtriranog kalcijuma, takođe prateći re� apsorpciju natrijuma. U normalnim uslovima u ovom delu nefrona kalcijum se reapsorbuje paracelu� larno pod uticajem pozitivnog potencijala u lumenu koji nastaje kao posledica funkcionisanja Na +/K+/2Crkotransportera (Slika 9�3). Diuretici, kao što je furosemid, inhibiraju Na +/K+/2CI"� kotransportere, čime se smanjuje pozitivni potencijal lumena i na taj način inhibira reapsorpcija kalci juma, što se koristi u lečenju hiperkalcemije.
Lumen Ca2+, Mg*i 2
Ca *
6 P*�G
PLA^ CaSR
P�450^
A.
4
�20�HETE
2
Ca^.Mg ;
Slika 9�3. Mehanizam reapsorpcije kalcijuma u uzlaznom debelom delu Henleove petlje
Kortikalni uzlazni debeli deo Henleove petlje značajno održava homeostazu kalcijuma smanjenjem ili povećanjem njegove reapsorpcije u slučaju hiperkalcemije ili hipokalcemije. Hiperkalcemija aktivira kalcijum osetljive receptore (Slika 9�3.) na ćelijama kortikalnog uzlaznog dela Henleove petlje i putem G proteina aktiviraju se: fosfatidilinozitolni signalni put i fosfolipaza A 2. Fosfatidilinozitolni put aktivira enzimski sistem P�450, koji povećava sintezu 20�hidroksieikozatetraenoične kiseline (20� HETE) iz arahidonske kiseline koja je oslobođena delovanjem fosfolipaze A2. Jedinjenje 20�HETE, inhibira hormonski stimulisanu sintezu cAMP�a (npr. vazopresin), zaustavlja reapsorpciju natrijuma putem Na+/K+/2CI" kotransporta i inhibira izlazak K + putem kalijumovih kanala. Sve ove promene smanjuju elektrohemijski gradijent kojim se kalcijum i magnezijum paracelularno reapsorbuju pasivnim putem u ovom delu nefrona. Krajnji efekat aktiviranih kalcijum osetljivih receptora jeste smanjenje reapsorpcije kalcijuma u hiperkalcemiji. U hipokalcijemiji ovi receptori su neaktivni i svi procesi se dešavaju suprotno, tako da je na kraju povećana reapsorpcija kalcijuma. Distalni tubuli su glavno mesto reapsorpcije kalcijuma pod uticajem hormona PTH i 1,25(OH)2D3. Na početku distalnih tubula reapsorbuje se oko 10% filtriranog kalcijuma, a na samom kraju distalnih tubula, pre sabirnih cevčica reapsorbuje se od 3 � 10% i na kraju urinom se izluči oko 2% filtriranog kalcijuma. Aktivna transcelularna reapsorpcija kalcijuma u distalnim tubulima odvija se tako da se pod utica jem paratiroidnog hormona aktivira adenilat�ciklaza uz stvaranje cAMP, koji stimuliše ulazak kalcijuma kroz apikalne kanale osetljive na dihidropiridin (DHP, blokator kalcijumovih kanala; preparati za lečenje hipertenzije i angine pektoris). cAMP povećava aktivnost Na +/Ca 2+ �antiportera i Ca 2+�ATP� aze na bazolateralnoj membrani, čime se povećava izlazak slobodnog kalcijuma iz ćelije. Kalcitriol preko svojih receptora stimuliše transkripciju kalbindina koji stimuliše ulazak kalcijuma kroz kanale na apikalnoj strani (osetljive na tiazid i dihidropiridin), zatim povećava brzinu kojom se kalcijum kreće kroz ćeliju ka bazolateralnoj membrani i stimuliše aktivnost Ca2+�ATP�aze na bazolateralnoj membrani (Slika 9�4).
Medicinska biohemija
9�6
Slika 9�4. Mehanizam reapsorpcije kalcijuma u distalnim tubulima
Uloga kostiju u održavanju balansa kalcijuma Između kostiju i ekstracelualrne tečnosti postoji aktivna izmena kalcijuma, pri čemu je količina kalcijuma koja uđe u kosti jednaka količini koja iz kostiju izađe, tako da koštana masa ostaje konstantna. Ovaj proces je posledica remodeliranja kostiju i neka istraživanja su pokazala da se kod zdravih odraslih osoba za jednu godinu remodeiira oko 5% celokupnog skeleta. Precizan mehanizam i faktori koji utiču na ovu izmenu nisu poznati, ali količina kalcijuma koja je uključena u ove izmene govori da ovaj proces igra važnu ulogu u održavanju homeostaze kalcijuma.
REGULACIJA METABOLIZMA KALCIJUMA Veoma niska koncentracija kalcijuma u ćeliji održava se pomoću transportnih sistema na plazma membrani, kao na membranama endoplazmatskog retikuluma, sarkoplazmatičnog retikuluma (za brzu i preciznu promenu koncentracije jona) i mitohondrija (za dugoročnu regulaciju i otklanjanje velikih oscilacija u koncentraciji kalcijuma). Koncentracije kalcijuma i fosfata u ekstracelularnoj tečnosti utiču međusobno jedna na drugu zbog toga što grade soli. Normalno je odnos između kalcijuma i fosfata 1:60, a kada pređe 1:70 postoji opasnost od taloženja kalcijum fosfata u mekim tkivima. Precipitacija u vaskularnom tkivu je veliki rizik za pojavu arteroskleroze. Veliki gubitak kalcijuma (gastrointestinalnim traktom) ili prekomerna apsorpcije (unošenje velikih količina kalcijuma ili povećana aktivnost kalcitriola) mogu da budu uzrok promene koncentracije kalci juma u ekstracelularnoj tečnosti. Nekoliko mehanizama čine prvu liniju odbrane koja sprečava hiper� kalcemiju ili hipokalcemiju i aktiviraju se pre nego što se uključi hormonska regulacija. Prvi mehanizam je puferski sistem izmenljivog kalcijuma u kostima. Ovaj sistem čine izmenljive soli kalcijuma u kostima (0,5�1% od ukupnih soli kalcijuma u kostima), među kojima je najvažniji kalcijum hidrogen fosfat (CaHP0 4), kao i slična jedinjenja koja su slabo vezana u kostima i mogu se re verzibilno izmenjivati sa jonima kalcijuma i fosfata u ekstracelularnoj tečnosti. Povećana koncentraci ja kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti izaziva deponovanje izmenljivih soli, a snižena koncentracija kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti dovodi do oslobađanja ovih soli iz kostiju. S obzirom da su ove soli u obliku malih amorfnih kristala, imaju veliku dodirnu površinu sa kostnom tečnošću pa ovaj pu�
A. Topić: Kalcijum, fosfat i magnezijum
9�7
ferski sistem za oko 70 minuta ukloni polovinu viška kalcijuma koji se pojavi u ekstracelularnoj tečno� sti. Drugi mehanizam za održavanje stalne koncentracije jona kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti su mitohondrije koje sadrže priličnu količinu izmenljivih soli kalcijuma. Glavni regulatori metabolizma kalcijuma (i istovremeno metabolizma fosfata) u ekstraćelijskoj tečnosti su paratiroidni hormon i 1,25(OH)2�vitamin D3, a uloga kalcitonina nije jasno definisana. Promenu koncentracije kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti detektuju kalcijum osetljivi receptori koji su G�zavisni receptori. Osnovna uloga ovih receptora je održavanje homeostaze kalcijuma rea� govanjem na minimalne promene (< 2%) koncentracije ekstracelularnog jona kalcijuma (Ca 0 2+ ). Ovi receptori se nalaze na ćelijama koje su direktno ili indirektno uključene u homeostazu kalcijuma: pa� ratiroidne ćelije, bubrežne ćelije (uzlazni debeli deo Henleove petlje), C�ćelije tiroidne žljezde (kalci� tonin), koštane ćelije kao i ćelije gastrointestinalnog trakta. Novija istraživanja pokazuju prisustvo ovih receptora i u tkivima koja nisu direktno uključena u metabolizam neorganskih jona: mozak, očno tkivo, želudac i pankreas, što ukazuje na njihovu ulogu u lokalnoj kontroli homeostaze jona u ovim tkivima.
Paratiroidni hormon Paratiroidni hormon (parathormon, PTH) je polipeptidni hormon sastavljen od 84 aminokiseline, molekulske mase 9500. Sintetišu ga glavne ćelije paratiroidne žlezde. Sinteza počinje u ribozomima kao pre�pro�parathormon od 115 aminokiselina (Slika 9�5), a zatim se u granuliranom endoplazmat� skom retikulumu od njega odvaja pro�parathormon od 90 aminokiselina koji se transportuje do Gol� džijevog kompleksa. Daljim odvajanjem 6 aminokiselina nastaje polipeptid od 84 aminokiseline koji je biološki aktivan i kao takav se deponuje u sekretornim granulama u citoplazmi iz kojih se oslobađa prema potrebi. Transkripciju gena za PTH inhibiraju vitamin D, kalcitonin i hiperkalcemija, a stimulišu hipokalcemija, glukokortikoidi i estrogeni. Biološka aktivnost PTH potiče od 34 ostatka aminokiselina na N�terminalnom kraju, dok je C�terminalni kraj neaktivan. Intaktni PTH se metaboliše u jetri i bubrezima tako što se razlaže na N�terminalni fragment od 34 aminokiseline, koji je i dalje biološki akti van i nekoliko C�terminalnih fragmenata koji su neaktivni. Glavni regulator sekrecije PTH je koncentracija jonizovanog kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti. Sinteza i sekrecija PTH su pod vrlo preciznom "feedback" kontrolom i to tako što niska koncentracija kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti stimuliše (već za nekoliko minuta), a visoka inhibira sekreciju PTH. Ovakva kontrola sekrecije PTH se ostvaruje putem kalcijum osetljivih receptora. U hiperkalce� miji povećava se vezivanje Ca 2+ za receptor koji se nalazi na paratiroidnoj ćeliji (Ca 0 2+ je prvi glasnik). Aktivira se G protein koji prenosi informaciju pomoću fosfatidilinozitolskog signalnog puta i oslobađanjem iz intracelularnih depoa povećava se koncentracija kalcijuma (Ca2+ je drugi glasnik). Ova pramena dovodi do smanjene translacije za PTH, smanjenja sekrecije PTH i povećanja degradacije PTH u paratiroidnim ćelijama (Slika 9�5). lako PTH reguliše i koncentraciju fosfata u plazmi, fosfat ne kontroliše direktno sekreciju PTH. Međutim, hiperfosfatemija indirektno stimuliše sekreciju PTH jer izaziva prelazak i kalcijuma i fosfata u kosti, smanjuje resorpciju kostiju i povećava stvaranje nedisosovanog kalcij um�fosfata u plazmi. U ovom slučaju je smanjena koncentracija kalcijuma u plazmi stimulans za lučenje PTH. Pored koncentracije jonizovanog kalcijuma na sekreciju PTH utiču 1,25(OH) 2D3 (Slika 9�5.), adrenergični agonisti, prostaglandini i magnezijum. Glavna funkcija PTH je regulacija koncentracije kalcijuma u ekstracelularnoj tečnosti. PTH se vezuje za ciljna tkiva preko receptora na površini ćelije; receptori za PTH su slični receptorima za kalcitonin i imaju sedam transmembranskih domena, od kojih su ekstracelulami zaduženi za vezivanje hormona, a intracelularni domeni učestvuju u regulaciji intracelularne signalizacije. Glavna ciljna tkiva za PTH su kosti i bubrezi, u kojima vezivanje za receptore stimuliše adenilat�ciklazu (sintezu cikličnog AMP) i fosfolipazu C (sintezu inozitol trifosfata), što kao posledicu ima mobilizaciju intracelular� nog kalcijuma.
Medicinska
9�8
biohemija
harati roicfna ćelija Ćefijska membrana / KL.Z>
, Ca2*� osettjfvl receptori
G« protein
1,25(OH)4> ;t
V Degradacija PTH� Setoretome granute \ *
v
0
Granulirani enđoplazrnatićr« retikulurn
Golditjav aparat
Slika 9�5. Sinteza, sekrecija i degradacija PTH u paratiroidnoj ćeliji
Delovanje PTH na kosti Parathormon deluje na sve tri vrste ćelija u kostima: osteocite, osteoblaste (odgovorne za formiranje kostiju) i osteoklaste (odgovorne za resorpciju kostiju), a ukupni efekat PTH na kosti jeste njihova resorpcija i oslobađanje i kalcijuma i fosfata u ekstraćelijsku tečnost. U građi kostiju postoji os� teocitni membranski sistem koji čine međusobno povezani osteoblasti i osteociti, a prostire se preko svih kostnih površina. Ovaj sistem odvaja kost od ekstraćelijske tečnosti, a u prostoru između membrane osteocita i kosti nalazi se kostna tečnost. Membrane i osteocita i osteoblasta imaju receptore za vezivanje PTH�a i smatra se da on snažno aktivira pumpu za kalcijum. Kada se pod uticajem PTH�a ova pumpa za kalcijum aktivira, joni kalcijuma se "ispumpavaju" iz kostne tečnosti i prelaze u ekstracelulamu tečnost; zbog toga opada koncentracija kalcijuma u kostnoj tečnosti, odnosno dolazi do apsorpcije kalcijuma iz kosti. Kada je pumpa inhibirana, koncentracija kalcijuma u kostnoj tečnosti raste i ponovo dolazi do taloženja kalcijumovih soli u matriks kosti. Sporiji mehanizam delovanja PTH na kosti je aktivacija osteoklasta, pri čemu se oslobađaju kalci jum i fosfat u ekstraćelijsku tečnost, što može trajati nedeljama i mesecima. Membrana osteoklasta ne sadrži receptore za PTH, a smatra se da se hormonsko dejstvo na osteoklaste ispoljava preko pa� rakrinih signala sa osteocita i osteoblaste. Delovanje PTH na bubrege PTH deluje na bubrege na dva osnovna načina: stimuliše reapsorpciju kalcijuma i inhibira reap� sorpciju fosfata. Primarni efekat PTH u bubrezima jeste povećanje reapsorpcije kalcijuma u distalnim tubulima, a ovaj hipokalcurijski efekat se dopunjava sa efektom PTH na kosti, što sve zajedno dovodi do povećanja koncentracije kalcijuma u plazmi. Receptori za PTH i kalcitriol su smešteni na bazolateralnoj strani ćelija distalnih tubula, a vezivanje PTH za receptore deluje tako što stimuliše ulazak kalcijuma kroz dihidropiridin�zavisne kanale na luminalnoj strani membrane tubulocita i izlazak kalcijuma uz pomoć Na+/Ca 2+�antiportera i Ca 2+�ATP�aze na bazolateralnoj membrani. Drugi efekat PTH na bubrege je inhibicija reapsorpcije fosfata u tubulima tako što vezivanje PTH za receptore kao krajnju posledicu ima inhibiciju Na +/fosfat�kotransporta u proksimalnim tubulima.
A. Topić: Kalcijum , fosfat i magneziju m
9�9
Rezultat ove inhibicije je povećano izlučivanje fosfata (fosfaturija) i smanjenje koncentracije fosfata u plazmi. Efekat PTH na izlučivanje fosfata je značajan za regulaciju koncentracije kalcijuma, tako što sprečava vezivanje fosfata za kalcijum u ekstraćelijskoj tečnosti. Pored toga što smanjuje reapsorpciju fosfata, PTH smanjuje i reapsorpciju bikarbonata, natriju� ma, kalijuma, vode i aminokiselina u proksimalnim tubulima.
1,25(OH)2�holekaiciferol [1,25(OH)2 �vitamin D3] lako se naziv vitamin D 3 uobičajeno koristi, on nije adekvatan iz dva razloga: prvo, ovo jedinjenje nije esencijalno zbog toga što hrana nije jedini njegov izvor i drugo, vitamin D 3 ima sva svojstva hormona jer se sintetiše u jednom organu, a svoje delovanje ispoljava na drugim organima. Takođe, njegovu sintezu kontrolišu direktno ili indirektno produkti na koje deluje (koncentracija kalcijuma i fosfata). U koži se normalno stvara 7�dehidroholesterol, koji se pod uticajem telesne toplote i UV zračenja prevodi u holekaiciferol ili vitamin D 3. Vitamin D3 se nalazi u mnogim prirodnim proizvodima (riblje ulje je vrlo bogato vitaminom D 3), a može da se dodaje nekim namirnicama u obliku ergokalciferola (vitamin D 2). Kalciferoli imaju sličan metabolizam, rastvorljivi su u mastima i deponuju se u masnom tkivu, a nemaju biološku aktivnost. Vitamin D 3 se transportuje do jetre vezan na proteine i to najvećim delom na vitamin D vezujući protein, zatim na alfa�globulin i vrlo malo vezan na albumin. U jetri se vitamin D3 hidroksiluje u položaju 25 uz pomoć enzima vitamin D 3�25�hidroksilaze. Najveći deo cirkulirajućeg 25(OH)D 3 metaboliše se u jetri preko intermedijera 23,25(OH) 2 D 3 i 25,26(OH)2D 3 u neaktivne metabolite koji se izlučuju putem žuči. Mali deo 25(OH)D 3 podleže daljoj hidroksilaciji u ćelijama proksimalnih tubula i u toj reakciji nastaju 1,25(OH) 2D3 (kalcitriol) ili 24,25(OH)2D3 (sekalciferol). 1,25(OH)2D3 je glavni aktivni metabolit vitamina D; koncentracija 24,25(OH)2D 3 je oko 10 puta veća od koncentracije 1,25(OH) 2D3, ali još uvek nije poznato kakva je njegova fiziološka uloga (slika 9�6). Nasuprot 25�hidroksilaciji u jetri koja nema ograničenje, 1a�hidroksilacija u bubrezima je strogo regulisana, a stimulišu je nizak nivo fosfata i 1,25(OH) 2D3, odnosno visok nivo PTH u plazmi. Visok nivo fosfata i 1,25(OH)2D3, odnosno nizak nivo PTH smanjuju aktivnost 1a�hidroksilaze, a stimulišu aktivnost 24�hidroksilaze, pa se povećava koncentracija 24,25(OH) 2D 3. Direktno ili indirektno na sintezu 1,25(OH)2D3 stimulativno deluju estrogeni, progesteron, testosteron, hormon rasta i prolaktin. 1,25(OH)2D3 ostvaruje svoj hormonski efekat vezivanjem za receptore, koji su po strukturi slični receptorima za steroidne i tiroidne hormone, a nalaze se na jedru ciljnih ćelija i prenose informacije o transkripciji gena za sintezu različitih peptida. Afinitet kalcitriola za ove receptore je oko 1000 puta veći nego afinitet 25(OH)D3. Međutim, kako je koncentracija ovog metabolita mnogo veća nego koncentracija 1,25(OH)2D3, moguće je da i 25(OH )D 3 ima izvestan biološki efekat. U gastrointestinalnom traktu 1,25(OH)2D3 primarno deluje na tanko crevo gde pomaže apsorpciju kalcijuma, tako što indukuje sintezu proteina za vezivanje kalcijuma � kalbindina (Slika 9�2.). Nakon toga kalcijum izlazi iz ćelije kroz bazolateralnu membranu uz pomoć Ca 2+ ATP�aze. Pretpostavlja se da kalbindin ima ulogu intracelulamog šatla za transport kalcijuma od lumena creva u krv ili da ima ulogu pufera, kako bi se održao koncentracioni gradijent između lumena creva i enterocita. U intestinumu 1,25(OH)2D3 stimuliše i apsorpciju fosfata, ali je ovaj efekat nezavisan od stimula� tornog efekta na apsorpciju kalcijuma. 1,25(OH)2D3 deluje na bubrege isto kao i na intestinum, odnosno stimuliše reapsorpciju kalcijuma i fosfata. Reapsorpcija kalcijuma u bubrezima pod kontrolom 1,25(OH) 2D3 je udružena sa delova� njem PTH, ali za razliku od PTH koji inhibira reapsorpciju fosfata u bubrezima, 1,25(OH) 2D3 je povećava. PTH i 1,25(OH)2D3 u kostima pokazuju sinergističko delovanje tako što stimulišu aktivnosti oste� oklasta i resorpciju kostiju. Na prvi pogled ovo delovanje 1,25(OH) 2D3 na kosti može biti paradoksalno, s obzirom da je njegova osnovna uloga u mineralizaciji kostiju. Zapravo, s jedne strane, 1,25(OH)2D3 utiče na resorpciju „starih" kostiju, kada se oslobađaju kalcijum i fosfat u ekstracelular�
Medicinska biohemija
9�10
nu tečnost, a olakšava nastajanje „novih" kostiju što se zajednički označava kao remodeliranje kosti ju .
/
^ w / " " "
Z�hidroksiholesterol
koža . 1 UV zraci
vitamirt D.,
25�hiđroksHaza
2S�hicfroksi�vitamin Cu
l^lfa�hidroksilaza^ff�— 1 3^|bubr;eztj \.� ' "OH
bubrezi, iritestimim. druga tkiva 24«hidrok$ilazaNs OH
•�y
S�hiđrokst�vitamin 0$ O H � " ' v ^ ' ' \ ,
OH | različiti tkivni enzimi
24 3� hid rdks i� vita min D3 OH" ^ ^ '
hidt&ksilovani i konju govani polarni metab eliti Slika 9�6. Metabolizam vitamina D3 1,25(OH)2D 3l takođe deluje na paratiroidne ćelije i reguliše koncentraciju PTH, vezujući se za re� ceptore na jedru (Slika 9�5). Povećanje koncentracije 1,25(OH) 2D3 smanjuje transkripciju gena za pre�pro PTH i inhibira proliferaciju paratiroidnih ćelija, a krajnji efekat je smanjenje koncentracije PTH.
Kalcitonin lako je mehanizam delovanja kalcitonina potpuno poznat, ne zna se kakav je njegov fiziološki značaj, pošto je efekat kalcitonina prolaznog karaktera. U prilog tome govori i to što se zna da hroni� čni nedostatak (kod pacijenata kojima je hirurški uklonjena tiroideja) ili višak kalcitonina ne izazivaju značajne promene u metabolizmu kalcijuma i kostiju uopšte. Kalcitonin je polipeptid od 32 aminokiseline, molekulske mase 3400. Sintetiše se i sekretuje u pa� rafolikularnim ili C�ćelijama tiroidne žljezde, koje se nalaze u intersticijumskom tkivu tiroideje. Prvo se sintetiše pre�pro�kalcitonin, zatim se odvaja signalni peptid pro�kalcitonin i na kraju se odvaja još jedna peptidna sekvenca; preostali peptid predstavlja hormon kalcitonin, koji se deponuje u sekretornim granulama i po potrebi oslobađa.
9�11
A. Topić: Kalcijum, fosfat i magnezijum
Delovanje kalcitonina u odnosu na PTH se slikovito objašnjava kao „odraz u ogledalu". Kalcitonin deluje tako što smanjuje koncentraciju kalcijuma u plazmi direktnim delovanjem na osteoklaste koji na svojoj površini imaju receptore za kalcitonin. Vezivanje kalcitonina za receptore izaziva kontrakciju osteoklasta i akutno smanjenje resorpcije osteoklastične kosti. Kalcitonin takođe deluje i na bubrege gde smanjuje reapsorpciju kalcijuma.
Delovanje drugih hormona na metabolizam kalcijuma Osim tri hormona koji direktno kontrolišu metabolizam kalcijuma (PTH, 1,25(OH) 2D3 i kalcitonin), veliki broj drugih hormona utiče na njegov metabolizam, kako u normalnim uslovima tako i u određenim patološkim stanjima. Deficijencija estrogena u menopauzi izaziva povećanje prometa kalcijuma iz kostiju i povećano izlučivanje bubrezima. Ovi procesi dovode do redukcije koštane mase koja je u početku reverzibilna (prevencija osteoporoze estrogenskom terapijom). Mehanizam kojim estrogen deluje na kosti nije poznat, ali su otkriveni estrogenski receptori na koštanim ćelijama. Takođe je otkriveno da deficijenci ja testosterona izaziva osteoporozu kod muškaraca. Glukokortikoidi mogu izazvati ozbiljnu osteoporozu. Ovi hormoni deluju na više načina: smanjuju aktivnost osteoblasta, redukuju intestinalnu apsorpciju kalcijuma, povećavaju gubitak kalcijuma urinom, a pretpostavlja se i da povećavaju resorpciju kostiju. Kod dece, koja u terapijske svrhe dobijaju velike količine glukokortikoida, zapaža se značajno smanjenje rasta. Tiroidni hormoni su snažni stimulatori resorpcije kostiju. U tireotoksikozi se javlja smanjenje gus� tine kostiju i hiperkalcemija.
POREMEĆAJI U KONCENTRACIJI KALCIJUMA U PLAZMI Koncentracija kalcijuma u plazmi je određena ravnotežom između apsorpcije u tankom crevu i izlučivanja putem bubrega i intestinalnog trakta, kao i izmenom kalcijuma između ekstracelulame teč� nosti i tkiva, uključujući i kosti. Rezultat ovih dinamičkih procesa je vrlo precizno regulisana koncentracija jonskog kalcijuma u plazmi. 4,0� teška hiperkalcemija | 3,5� E
umerena hiperkalcemija
E 3,0� blaga hiperkalcemija 2,5� 3 2,0�
normokalcemija blaga hipokalcemija teška hipokalcemija
Slika 9�7. Normalni i patološki rasponi kalcijum a u serum u
Hiperkalcemija Hiperkalcemija su stanja povećane koncentracije kalcijuma u serumu iznad 2,6 mmol/L, a uglavnom nastaju kada prelazak kalcijuma iz kostiju i intestinuma u ekstracelulamu tečnost prevazilazi izlučivanje putem bubrega.
9�12
Medicinska biohemija
Hiperkalcemija direktno inhibira i sintezu PTH i njegovu sekreciji. Snižena koncentracija PTH i hiperkalcemija smanjuju aktivnost 1�a�hidroksilaze u proksimalnim tubulima što smanjuje sintezu 1,25�dihidroksi�vitamina D3. Kao odgovor na hiperkalcemiju C�ćelije tiroidne žlezde pojačano sinteti� šu kalcitonin. Niska koncentracije PTH i povećana koncentracija kalcitonina inhibiraju osteoklaste što smanjuje resorpciju kostiju. Smanjene koncentracije PTH i 1,25(OH) 2D3 smanjuju reapsorpciju kalci� juma u distalnim tubulima i ovaj efekat prevazilazi efekat kalcitonina koji povećava reapsorpciju kalci� juma u medularnom tankom uzlaznom delu Henleove petlje. Krajnji efekat je povećanje izlučivanja kalcijuma bubrezima. Smanjena koncentracija 1,25(OH)2D3, smanjuje intestinalnu apsorpciju kalci� juma iz hrane. Cilj svih ovih pramena jeste normalizovanje koncentracije kalcijuma u plazmi. Uzroci hiperkalcemije mogu biti sledeći: � Prekomerno unošenje kalcijuma: oralno unošenje soli kalcijuma zajedno sa mešovitom hranom ne dovodi do povećanja kalcijuma u serumu. Međutim, kada se unose velike količine kalcijuma (> 5g/dan) u obliku alkalnih antacida uz istovremeno unošenje većih količina mleka dolazi do merlji� vog povećanja kalcijuma u serumu (ovo stanje se naziva mlečno�alkalni sindrom). Kod ovih pacijenata je aktivnost alkalne fosfataze normalna, a koncentracija neorganskog fosfata je nešto povišena. � Prekomema mobilizacija kalcijuma iz kostiju najčešće je uzrokovana neoplazmama koje deluju na osteoklaste: karcinom dojke i bronhija sa metastazama na kostima, karcinom bubrega sa i bez metastaza na kostima, akutne mijeloidne i limfatične leukoze, mijelofibroze, mijelomi itd. � Poremećaji u endokrinoj regulaciji i to u prvom redu primami i sekundarni hiperpara� tiroidizam, tireotoksikoze, hipoaldosteronizam i hipervitaminoza D. � Dugotrajna imobilizacija često dovodi do hiperkalcemije, a razlog je osteoporoza koja se javlja u imobilizovanom delu skeleta. Ovo je naročito česta pojava kod dece između 9 i 14 godina koja intenzivno rastu. � Uticaji lekova: diuretici (furosemid, hidrohlortiazid, hlortalidon), fenitoin i barbiturati.
Hipokalcemija Hipokalcemija je sniženje koncentracija kalcijuma u serumu ispod 2,2 mmol/L. Hipokalcemija sti� muliše i sintezu i sekreciju PTH, koji povećava aktivnost 1�a�hidroksilaze u proksimalnim tubulima, što za posledicu ima povećanje sinteze 1,25(OH)2D3. PTH povećava resorpciju kostiju (aktivira osteoklaste), a PTH i 1,25(OH) 2D3 zajednički povećavaju reapsorpciju kalcijuma u distalnim tubulima. Pored toga, 1,25(OH)2D3 povećava intestinalnu apsorpciju kalcijuma. Svi ovi mehanizmi imaju za cilj uspostavljanje normalne koncentracija kalcijuma u serumu. Hipokalcemija se javlja iz sledećih razloga: � Smanjeno unošenje kalcijuma: u graviditetu (vrednosti kalcijuma se smanjuju za oko 10% i često mogu da budu ispod donje granice referentnog intervala) i kod malapsorpcija svih vrsta, kada je smanjena apsorpcija kalcijuma u intestinumu. � Teške hipoalbuminemije: kod ciroze jetre i nefrotskog sindroma smanjuje se ukupna koncentracija kalcijuma, ali je koncentracija jonskog kalcijuma normalna. � Poremećaji u endokrinoj regulaciji: kod hipoparatiroidizma, kod prekomerne sinteze kalcitonina (kod tumora) i kod nedostatka vitamina D (smanjena endogena sinteza i nedovoljno izlaganje suncu, smanjeno unošenje, izmenjen metabolizam u jetri zbog bolesti jetre i primene antikonvulzana� ta). � Renalne disfunkcije: kod insuficijencije bubrega zbog nedostatka 1,25(OH)2D3. � Akutna hipokalcemija se javlja kod različitih stanja u kojima se u cirkulaciju oslobađaju sup� stance koje vezuju kalcijum. To su slobodne masne kiseline kod akutnog pankreatitisa, intracelularni fosfat oslobođen pri akutnoj destrukciji prugastih mišića (rabdomioliza) ili sindromu tumora sa lizom ćelija. Infuzija fosfata ili citrata (tokom transfuzije), radiografski kontrasti sa helatorom EDTA takođe dovode do hipokalcemije.
A. Topić: Kalcijum, fosfat i magnezijum
9�13
Neoganski fosfat Humani organizam sadrži oko 20 mol (620 g) fosfora,od čega je oko 85% smešteno u skeletu i zubima (uglavnom u obliku hidroksiapatita), oko 14% u ćelijama mekih tkiva i samo oko 1% u ekstra� celulamoj tečnosti. Zavisno od vrste ćelija sadržaj fosfora u njima može da varira od 300 do 1300 mmol/kg. Od fosfora koji se nalazi u ćelijama najveća količina je kovalentno vezana u organskim je� dinjenjima (fosfoproteini, fosfolipidi itd.). U serumu je oko 85% fosfora u obliku neorganskih soli, a ostatak je nekovalentno vezan na proteine plazme i ne može da prolazi kroz krvne kapilare. Neor� ganski fosfat u plazmi je uglavnom u obliku HP0 42~ i H 2 P0 4 ", čiji je odnos 4:1 pri pH 7,4. U urinu odnos HP0 4 2 ": H2P04~ varira od 1:100 pri pH 4,5 do 9:1 pri pH 9,0. Ukupna koncentracija neorganskog fosfata u plazmi i urinu ne zavise od promena pH krvi ili urina već samo dolazi do preraspodele mono i divalentnog hidrogenfosfata. Intracelularni fosfat Fosfor je neophodan element za metabolizam ćelije. Organofosfatne komponente kao što su adenozin�trifosfat, kreatin�fosfat i difosfoglicerat, NADPH, predstavljaju depoe energije u ćelijama zahvaljujući visokoenergetskim fosfatnim vezama. U mitohondrijama, fosfor je vezan za proteine neophodne za transport elektrona oksidativnom fosforilacijom. Intracelulama fosfatna jedinjenja kao što su ciklični adenozin�monofosfat i inozitol�trifosfat imaju uloge sekundarnih glasnika. Takođe fosfor ulazi u sastav važnih jedinjenja kao što su fosfolipidi ćelijske membrane i membrana organela, nukleinske kiseline, kofaktori enzima i glikolitičkih intermedijera. Veoma je važna fosforilacija i defosforilacija mnogih enzima kojom se usmeravaju metabolički procesi. lako je koncentracija organski vezanog fosfata u ćeliji mnogo veća od koncentracije neorganski vezanog, i ovaj oblik fosfata ima važnu ulogu u energetskom metabolizmu, jer učestvuje u brojnim procesima, kao što su ulazak glukoze u ćeliju, sinteza laktata i utiče na nivo ATP�a, nivo 2,3� difosfoglicerata itd. Neorganski i organski vezani fosfat u citoplazmi su u ravnoteži. Ako se troši organski vezani fosfat, primer je razgradnja kreatin�fosfata u mišićima, onda će se povećati koncentracija citoplazmatskih neorganskih fosfata. Suprotno, ako se poveća koncentracija glikolitičkih intermedijera (organski fosfati) smanjiće se koncentracija citoplazmatskih fosfata. Ekstracelularni fosfat Koncentracije neorganskog fosfata intra� i ekstracelulamo su slične (1�3 mmol/L), ali nisu u jednostavnoj ravnoteži. Fosfati aktivnim transportom ulaze u ćeliju nasuprot negativnom potencijalu membrane i na taj način se održava koncentracija fosfata u citoplazmi. Dugotrajna hipofosfatemija će izazvati nedostatak fosfata u ćeliji i suprotno, obimni izlazak fosfata iz ćelije će povećati koncentraciju ekstracelularnog fosfata.
METABOLIZAM FOSFATA Homeostazu fosfata održavaju unošenje hranom i intestinalna apsorpcija, izlučivanje bubrezima, deponovanje u kostima, kao i raspodela između intracelulamog i ekstracelularnog prostora (Slika 9� 8).
Medicinska biohemija
9�14
Ap so rpci ja fo sf at a u in te st inum u
Fosfat se nalazi u velikom broju namirnica i ishrana koja sadrži sve druge potrebne sastojke, obično ima i dovoljno fosfata. Pored toga, organizam poseduje dobar mehanizam adaptacije na unošenje male količine fosfata, tako da je teško reći koja minimalna količina fosfata mora dnevno da se unosi. U prošeku se hranom dnevno unosi 1400 mg fosfata, fecesom se izluči 490 mg, a urinom 910 mg. U gastrointestinalnim sokovima se izluči oko 210 mg, a od toga se ponovo apsorbuje oko dve trećine. Apsorpcija fosfata je najefikasnija u duodenumu i jejunumu, mada se u ileumu apsorbuje najveća količina s obzirom na njegovu dužinu..U jejunumu i ileumu apsorpcija ide pasivnim mehanizmom, a u jejunumu postoji i aktivna apsorpcija koju stimuiiše 1,25(OH) 2D3. Kada se količina fosfata u hrani smanji na polovinu od prosečne količine, povećava se sinteza 1,25(OH) 2D3, kako bi se apsorbovalo što više fosfata. Pasivna apsorpcija se povećava sa povećanjem količina fosfata u hrani, a smanjuje se ako se hranom unosi mnogo kalcijuma jer se grade nerastvorni kompleksi. Fosfati Iz I L™„_„™J
\ Znoj f
45
^ ~" Creva
s......
II t
^=Z
1,0
I Ekstracelufarna | t e č n o s l j p l a 2 m a j 160
. rj" ~"7 7=1 [ K o s ^ t
135
19
Slika 9�8. Promet fosfata u organizmu (prosečan sadržaj u mmol/24 h kod odrasle osobe) Reapsorpcija i izlučivanje fosfata bubrezima
Najveći deo fosfata se filtrira iz plazme. Oko 75% se reapsorbuje u proksimalnim tubulima, 5 � 20% se reapsorbuje u distalnim tubulima i/ili sabirnom kanalu, a preostala količina se izlučuje urinom. Količina koja se izluči urinom kreće se od 0,2% � 20%. Izlučivanje fosfata urinom je skoro jednaka količini apsorbovanih fosfata i na ovaj način se održava neto ravnoteža. Reapsorpcija fosfata u proksimalnim tubulima ide uz pomoć Na +/P rsimportera koji se nalazi na luminalnoj strani membrane, a ovaj transporter funkcioniše zahvaljujući gradijentu natrijuma. Gradijent natrijuma se održava uz pomoć Na +�K+�ATP�aze koja se nalazi na bazolateralnoj membrani (Slika 9�9). Reapsorpciju u proksimalnim tubulima smanjuju visok sadržaj fosfata u hrani, paratiroidni hormon, glukokortikoidi, hronična metabolička acidoza i akutna respiratorna acidoza, hiperkalcemija i neki diuretici, a povećavaju je nizak sadržaj fosfata u hrani, 1,25(OH) 2D3l hormon rasta, insulin, tiroi� dni hormon, hronična metabolička alkaloza i visok sadržaj kalcijuma u hrani.
REGULACIJA FOSFATA U regulaciji fosfata učestvuju 1,25(OH) 2D3 i paratiroidni hormon. 1,25(OH) 2D3 prvenstveno deluje na apsorpciju fosfata u intestinumu, a zatim i na reapsorpciju u tubulima. Oba mehanizma vrlo brzo
9�15
A. Top ić: Kalc ijum , fos fat i ma gnezijum
deluju kao odgovor na smanjenu količinu fosfata, a nezavisna su od delovanja PTH. Signal nije pro� menjena količina fosfata u plazmi, nego intracelulama koncentracija fosfata, tako da se sinteza 1,25(OH) 2D3 smanjuje kada se poveća intracelulama koncentracija fosfata, bez obzira što se još uvek nije promenila koncentracija fosfata u plazmi. Krv
?An
Gtukoneogeneza GHkoliza
Oksid ativna fosforilac tja ~65rnV -€5fnV
Slika 9-9. Mehanizam reapsorpcije fosfata u proksimalnim tubulima Paratiroidni hormon smanjuje reapsorpciju fosfata u proksimalnim tubulima, tako što inhibira Na /Prkotransport, a posledica je povećano izlučivanje fosfata. Ova inhibicija se ostvaruje tako što se PTH vezuje za receptore na bazolateralnoj membrani tubulocita, što stimuliše sintezu G s proteina koji aktivira adenilat�ciklazu, a ona katalizuje sintezu cAMP�a. Preko sistema protein�kinaza fosforili� še se protein koji inhibira kotransport natrijuma i fosfata na luminalnoj strani tubulocita, a krajnji efe� katje povećano izlučivanje fosfata, ali i cAMP (Slika 9�10). Povećana koncentracija cAMP je marker za povećanu aktivnost PTH. +
Krv
Lumen
f
\
+.„#.. Fosfori!acija
^r� «4 HPO/*
I I
f
Protein klnaza
L.
&<< ATP.. \'>
cAMP^
PTH
JAC;
Slika 9�10. Mehanizam delovanja PTH na reapsorpciju fosfata u proksimalnim tubulima
POREMEĆAJI U KONCENTRACIJI FOSFATA U PLAZMI Koncentracija fosfora u plazmi koja se rutinski određuje u laboratorijama je neorganska frakcija koju čine slobodan fosfor i nekovalentno vezan za proteine, a izražava se kao koncentracija fosfata. Raspon normalnih koncentracija fosfata u serumu je od 0,8 do 1,44 mmol/L. Koncentracija fosfata u
9�16
Medicinska Mohemija
plazmi zavisi od starosti i najviša je u ranom detinjstvu, kada je rast intenzivan, a ostaje viša i tokom adolescentnog doba. Kod dece je koncentracija fosfata za oko 50% viša nego kod odraslih, zbog de� lovanja hormona rasta koji povećava reapsorpciju fosfata u tubulima. Sa starošću se koncentracija fosfata neznatno smanjuje. Nivo fosfata, pokazuje dnevne i sezonske varijacije, najniži je pre podne, a najviši posle podne i uveče. Koncentracija fosfata se povećava posle obroka, a zatim se postepeno smanjuje kako fosfat ulazi u ćelije ili se izlučuje. Takođe je primećena i sezonska varijacija, leti je koncentracija fosfata najviša, a zimi najniža.
Hiperfosfatemija Hiperfosfatemija je stanje povećane koncentracija fosfata u plazmi iznad 1,45 mmdl/L, a uzroci mogu biti sledeći: � Prekomerno unošenje ili apsorpcija fosfata: hrana ne sadrži veliku količinu fosfata, tako postprandijalno ne dolazi do povećanja koncentracije fosfata, ali intravenski rastvori sa visokim sadržajem fosfata, kravlje mleko za nedonoščad sa visokim sadržajem fosfata ili fosfatne klizme mogu da dovedu do hiperfosfatemije; � Prekomerna mobilizacija fosfata iz kostiju kod neoplazmi koje deluju na osteoklaste; � Endogeni porast kod poremećaja addo�bazne ravnoteže (laktatna acidoza, ketoacidoza, respiratorna acidoza, hronična respiratorna alkaloza) ili u slučajevima kada postoji masivna ćelijska smrt (sindrom liže tumora, rabdomioliza, maligna hiperpiretksija, toplotni udar) kada dolazi đ© izlaska fosfe� ta iz ćelija; � Smanjeno izlučivanje bubrezima koje može biti fiziološko zbog povećane reapsofpcije, što $e dešava kod dece u periodu intenzivnog rasta, u periodu laktacije»kod tečenja deficita vitamina D 3, itii patološko kod smanjene koncentracije (ili rezistencije) PTH, intoksikacije vitaminom D*, tirectoksiko� ze i akromegalije; � Uticaj lekova: diuretici (furosemid i hidrohlortiazid), anabolički steroidi, progesteron, anđrogeni, fenitoin, bifosfonati; � Pseudohiperfosfatemija kod hipertrigliceridemije i in vitro hemolize.
Hipofosfatemija Hipofosfatemija je stanje snižene koncentracije fosfata u plazmi ispod 0,87 mmol/L, a javlja se iz sledećih razloga: � Smanjeno unošenje ili poremećena apsorpcija fosfata: kod gladovanja, malapsorpcija svih vrsta, uzimanja antacida sa Al i Mg, kod akutnog i hroničnog alkoholizma, steatoreje, hronične dijare je; � Endokrini poremećaji: primarni i sekundarni hipoparatiroidizam, nedostatak vitamina D; � Renalne disfunkcije: nefrolitijaza, osmotska diureza, Fanconi sindrom; � Preraspodela fosfata između ekstracelularne i intracelularne tečnosti: kod povećanog lučenja insulina, u stanjima posle teških opekotina, kod ekstremnog fizičkog napora (prelazak fosfata u ćelije u kojima se obnavlja kreatin�fosfat). Kad postoji hiperventilacija (respiratorna alkaloza, dijabeti� čna ketoacidoza, u stanjima straha i bola) smanjuje se ugljen dioksid u krvi i ćelijama, što dovodi do snižavanja koncentracije vodonikovih jona u ćeliji. Smanjenje koncentracije vodonikovih jona u ćeliji aktivira glikolitički enzim fosfofrukto�kinazu koji katalizuje fosforilaciju glukoze, a to kao posledicu ima prelazak fosfata iz krvi u ćelije, odnosno hipofosfatemiju.
9�17
A. Topić: Kalcijum, fosfat i magnezijum
Magnezijum U organizmu odrasle osobe magnezijum se nalazi u količini od oko 20 � 28 g. Od toga se najveći deo nalazi u kostima (oko 55%), a ostatak je u mišićima (27%), mekom tkivu (19,2%), eritrocitima (0,5%) i plazmi (0,3%). Magnezijum u kostima je adsorbovan na površinu kristala hidroksiapatita, a samo jedna trećina od te količine magnezijuma je izmenljiva frakcija i stoji na raspolaganju za mobilizaciju kada je potrebno. Od celokupne količine magnezijuma 95% nalazi se u ćelijama i, kao i kalijum, predstavlja tipičan ćelijski katjon. Koncentracija intracelularnog magnezijuma je od 5 do 20 mmol, u zavisnosti od vrste tkiva, a od te količine samo 1�3 % magnezijuma je u obliku slobodnog jona. Najviše magnezijuma imaju ćelije skeletnih mišića i srčanog mišića. Intracelulami magnezijum je kofaktor u oko 300 en� zimskih reakcija, uključujući energetski metabolizam i sintezu proteina i nukleinskih kiselina, regulator je jonskih kanala, važan je intracelulami signalni molekul i modulator oksidativne fosforilacije, uključen je u formiranje nervnog impulsa, mišićnu kontrakciju, transport kalijuma i kalcijuma. Koncentracija magnezijuma u plazmi je od 0,7 do 1,5 mmol/L, ali ona ne odražava stvarni status magnezijuma u organizmu, pa određivanje magnezijuma u plazmi nema veliki klinički značaj. Oko 60% magnezijuma iz plazme se nalazi u jonizovanom obliku, oko 15% je u obliku kompleksa (sa fosfatom, citratom i bikarbonatom) a ostatak je vezan za proteine. Raspodela magnezijuma između ovih frakcija, kao i kod kalcijuma, zavisi cd koncentracije proteina i pH. Ekstracelularni magnezijum je pre svega izvor za intracelulami magnezijum.
METABOLIZAM MAGNEZIJUMA Homeostazu magnezijuma održavaju tri sistema: bubrezi, gastrointestinalni trakt i kosti. Bubrezi su glavni regulatori koncentracije magnezijuma u organizmu. Magnezijum iz hrane 12
I „
Creva
6,2
Eksiraceluteroa teSnost I plazma
0,1 Kosti 0,1
100
Feces 7,3
Slika 9�11. Promet magnezijuma u organizmu (prosečan sadržaj u mmol/24h kod odrasle osobe)
9�18
Medicinska biohemija
Magnezijum je široko rasprostranjen element u hrani, posebno u hlorofilu, tako da je zeleno povrće glavni izvor ovog elementa za čoveka. Dnevno odrasla osoba unese oko 300 mg hranom. (Slika 9�11). Važan izvor su i mineralne vode („tvrde vode") koje mogu imati do 5 mmol/L više iskoristljivog magnezijuma nego iz biljaka Aps orp ci ja magnezij um a u cr evi ma Neto apsorpcija magnezijuma zavisi od apsorpcije u pojedinim segmentima intestinuma, odnosno od njihove dužine i vremena koje hrana provede u njima. Duodenum i jejunum imaju visok kapacitet apsorpcije za magnezijum, ali su relativno kratki i hrana vrlo brzo prolazi, tako da se najveći deo magnezijuma apsorbuje u ileumu. Vitamin D blago povećava apsorpciju magnezijuma, ali je ovaj efekat indirektna posledica povećane resorpcije kalcijuma pod uticajem ovog vitamina. Magnezijum se u intestinumu apsorbuje paracelularnim i transcelulamim mehanizmom. Parace� lularna apsorpcija (kroz uske kanale između enterocita) dolazi do izražaja posle obroka kada je u lumenu intestinuma visoka koncentracija magnezijuma, što utiče na promenu morfologije tesnih spojnica i one postaju propustljive za magnezijuma. Transcelulami transport je energetski zavisan zato što ne postoji značajan hemijski gradijent između lumena creva i sadržaja u enterocitu, ali je prisutan elektrohemijski gradijent kojim se magnezijum izbacuje iz ćelije. Pretpostavlja se da se ovaj proces odvija u dve faze: prva faza je ulazak magnezijuma sa apikalne strane enterocita pasivnim transportom ili olakšanom difuzijom a druga faza je aktivni transport do bazolateralne strane kroz ćeliju kao i izbacivanje iz ćelije. Izvesna količina magnezijuma se apsorbuje i putem debelog creva, a dokaz je hipermagnezemija koja se javlja davanjem magnezijumovih klizmi. Renalno izlučivanje magnezijuma Homeostaza magnezijuma se održava ravnotežom između intestinalne apsorpcije i renalnog izlučivanja. Kada se koncentracija magnezijuma u plazmi smanji, smanjuje se i količina magnezijuma koja se filtrira u glomerulima, čime se smanjuje renalno izlučivanje.U glomerulima se filtriraju frakcije jonizovanog i kompleksno vezanog magnezijum i od te količine se u tubulima reapsorpbuje 90% � 95%. U proksimalnim tubulima se reapsorbuje samo oko 20%, a u debelom uzlaznom delu Henleove petlje oko 65%. Mala količina se apsorbuje u distalnim tubulima, ali nema podataka koliko magnezi juma stigne u sabirne cevčice, i da li u ovom delu nefrona postoji sekrecija. Kada je koncentracija magnezijuma u organizmu normalna urinom se izluči oko 5% profiltriranog magnezijuma, a kada je magnezijum u krvi snižen urinom se izluči samo 1% magnezijuma profiltriranog u glomerulima. Suprotno, kod prekomernog unošenja magnezijuma izlučivanje se povećava. U proksimalnim tubulima se magnezijum reapsorbuje paracelularno pasivnim mehanizmom, a kako je magnezijum veliki hidratisani atom, teže prolazi između ćelija nego natrijum. Zbog toga se u proksimalnim tubulima natrijum reapsorbuje u mnogo većem procentu (50�60%) nego magnezijum. Mehanizam reapsorpcije u debelom uzlaznom delu Henleove petlje se odvija uglavnom paracelularno i to Mg�voltažnim protokom, a transcelulami transport se odvija samo u slučaju metaboličkih potreba ćelije. Formiranje pozitivnog elektrohemijskog gradijenta sa luminalne strane tubulocita koji je potreban za reapsorpciju magnezijuma, odvija se na siedeći način (Slika 9�12): � Na+/K+�pumpa na bazo late ral noj membrani smanjuje intracelularni natrijum, pa se formira negativni električni potencijal sa unutrašnje strane membrane (1); � Intracelularni kalijum se izbacuje iz ćelije elektroneutralnim K +/cr�kotransporterom na bazolate� ralnoj membrani (2), a takođe i hloridi (3); � Na+/2CI7K+�kotransporter na luminalnoj membrani (osetljiv na furosemid) aktivira se pomoću unutrašnjeg negativnog potencijala i smanjenom koncentracijom natrijuma u ćeliji (4); � Kalijumov jon se vraća nazad u lumen kroz luminalni provodni kanal (5) � Paracelularnim putem, kroz tesne spojnice koje su propustljive za katjone, prelaze iz lumena 2Na +, a u lumen se vraća 1CI", što takođe povećava električni gradijent (6); � Zahvaljujući električnom gradijentu koji je ovaj način stvoren (koraci 1, 2 i 6) magnezijum se reapsorbuje pasivno kroz uske spojnice (7).
Poglavlje 10. Gvožđe
METABOLIZAM I REGULACIJA GVOŽÐA Gvožđe je jedan od najrasprostranjenijih elemenata u zemlji, ali se u ćelijama humanog organizma nalazi u tragovima i predstavlja najvažniji mikroelement, koji je uključen u mnoge metabo�ličke procese. Njegova osnovna funkcija je da u sklopu hemoglobina sudeluje u transportu kiseonika do tkiva. Ovaj transport se zasniva na sposobnosti kompleksno vezanog gvožđa da reverzibilno vezuje molekularni kiseonik. Druga važna uloga gvožđa je u ćelijskim oksidacionim mehanizmima tj. sistemu citohroma. Homeostaza gvožđa u organizmu je bitan uslov za zdravlje ljudi, jer i nedostatak i preopterećenje imaju niz ozbiljnih posledica. Nedostatak gvožđa je danas prisutan kao preovlađujući nutricioni problem, koji pogađa oko 500 miliona ljudi u svetu. U normalnim uslovima iz hrane se apsorbuje malo gvožđa, količine koje se izlučuju putem urina su neznatne, dok se istovremeno veliki deo ukupnog gvožđa u telu neprekidno preraspodeljuje u razne delove tela pomoću nekoliko metaboličkih krugova. Dnevne potrebe za gvožđem iznose prosečno 1,7 mg na dan i zavise od pola, uzrasta i fiziološkog statusa. Sadržaj gvožđa u ljudskom organizmu je 50 mg po kilogramu telesne mase kod muškaraca i 40 mg po kilogramu telesne mase kod žena. Ova razlika je uslovljena manjom količinom rezer vnog gvožđa, nižom koncentracijom hemoglobina u krvi žena i manjim vaskularnim volumenom u odnosu na muškarce. Najveći deo, oko 85% gvožđa u telu je sadržano u funkcionalnim komponentama, u formi cirkuli� šućeg hemoglobina (oko 30 mg/kg telesne mase) i mioglobina (oko 5 mg/kg telesne mase). Glavne posledice deficijencije gvožđa su uzrokovane trošenjem ovih funkcionalnih komponenti. Veoma mala količina telesnog gvožđa (0�2%) je dostupna u cirkulaciji za trenutno korišćenje od strane eritrocita i ograničena je transportom odgovarajućim proteinom. Deo koji nije odmah potreban se skladišti u retikuloendotelnom sistemu jetre, slezine i kostne srži u vidu proteinskih kompleksa, fe� ritina i hemosiderina. Ovaj deponovani deo smanjuje potencijalnu toksičnost viška gvožđa i služi kao rezerva iz koje gvožđe, izgubljeno kroz funkcionalne delove, biva nadoknađeno. Deponovani i funkcionalni delovi su povezani pomoću malih transportnih oblika, najviše u formi transferina. Gvožđe u organizmu može biti prisutno u dva oblika: kao Fe (II) � redukovana i Fe (III) � oksido� vana forma, što je osnova mnogih metaboličkih funkcija, posebno hemenzima uključenih u transportne sisteme elektrona, kao što su citohromi a, b i c. Ostali enzimi koji zahtevaju gvožđe su: citohrom P�450, NADH�dehidrogenaza, ksantin�oksidaza i katalaza. Gvožđe koje nije deo hema je esencijalno
10�2
Medicinska biohemija
za funkciju ribonukleotid�reduktaze, ključnog enzima u sintezi DNK, a samim tim za ćelijsku diferenci jaciju i za Krebsov Krebso v ciklus. cik lus. Gvožđe je mikroelemenat koji se unosi u minimalnim količinama i koga organizam strogo čuva. Postoji stalna reciklizacija gvožđa iz eritrocita, tako da su minimalne potrebe za unosom, ali su i gubici mali. Postoje složeni mehanizmi koji kontrolišu svaku fazu u metabolizmu gvožđa i svaki protein, tj. parametar vezan za gvožđe. Procena statusa gvožđa ima za cilj klinička razmatranja nedostatka i viška gvožđa, uz pomoć, danas standardizovanih ispitivanja. Ove analize su poslednjih godina doživele progresivna usavrša vanja u toj meri da obezbeđ obe zbeđuju uju preciznu procenu procen u statusa stat usa gvožđa. gvož đa.
Apsorp Aps orpcija cija gvožđa gvo žđa Količina gvožđa u organizmu je primarno kontrolisana regulacijom procesa apsorpcije. Po ovome se gvožđe razlikuje od svih drugih elektrolita, čija količina u organizmu zavisi od izlučivanja, a ne od apsorpcije. Putem ishrane, i to uglavnom, preko mesa, žitarica i povrća se dnevno unese oko 10�20 mg gvožđa, od čega se apsorbuje samo 5�10%. Unos od 1 mg dnevno je dovoljan za muškarce i žene u po� stmenopauzalnom dobu. Žene u reproduktivnom periodu zahtevaju i do 2 mg gvožđa po danu, zbog krvavljenja u svakom menstrualnom ciklusu. Povećane dnevne potrebe za gvožđem od 3 ili 4 mg kod trudnica i dojilja postoje zbog trošenja gvožđa za rast fetusa tokom trudnoće, krvavljenja u toku porođaja ili zbog laktacije, čime se troši prosečno 900 mg gvožđa. U takvim slučajevima, u kojima su potrebe veće ili depoi smanjeni, proces apsorpcije je povećan. Apsorpcij Apso rpcijaa gvožđa gvož đa se može podeliti u tri osnovna osnovn a koraka (vidi sliku 10�1): • luminalna faza, u kojoj gvožđe sa ili bez hema postaje postaje pristupačno za apsorpciju; apsorpciju ; • apsorpcija i procesi u ćelijama duodenalne mukoze; • transfer dela gvožđa u cirkulaciju. Brzina apsorpcije je kontrolisana složenim fiziološkim faktorima, a zavisi i od sadržaja hrane i prirode gastrointestinalnog izlučivanja. Apsorpcija se odvija u gornjem delu duodenuma i tankog creva kao aktivan proces, a u izuzetnim slučajevima apsorpcija gvožđa je moguća i u drugim delovima cre va. Apsorpcij Apso rpcijaa gvožđa gvož đa se odvija različitim mehanizmim meha nizmimaa u zavisnosti zavisn osti od oblika u kome se nalazi u hrani. Gvožđe se u hrani nalazi kao hemsko (inkorporirano u protoporfirinsko jezgro) ili kao nehem� sko u vidu feri ili fero jedinjenja. Apsorpc Aps orpcija ija nehem neh emsko skog g gvožđa gvož đa
Najveći deo gvožđa u hrani je u obliku Fe(lll). Ovaj oblik gvožđa je rastvorljiv u kiseloj sredini želuca, ali postaje nerastvorljiv u alkalnijoj sredini duodenuma. Crevna mukoza izlučuje glikoprotein gastroferin (Mm gastroferin (Mm 260 000) koji podstiče resorpciju dvovalentnog gvožđa u duodenum. Jedan molekul gastroferina može kompleksno da veže oko 280 atoma gvožđa. Apsorpcija neorganskog gvožđa je jedino moguća ako je ono u Fe(ll) Fe(l l) obliku, oblik u, post po stoj ojee to rastvorljivi rastvo rljivi oblik, koji se može stvoriti stvo riti u gastroin� gast roin� testinalnom lumenu i ćelijama intestinalne mukoze tokom apsorpcije. Nedavno je otkrivena feri� reduktaza u duodenalnom četkastom pokrovu. To je u stvari hem�NADH�reduktaza koja učestvuje u formiranju Fe(ll). Apsorpc Aps orpcija ija hemsko hem skog g gvožđa gvož đa
Hemsko gvožđe, koje potiče uglavnom iz mesa, se apsorbuje drugačije. Posle izdvajanja iz okru� žujućeg polipeptidnog lanca (dejstvom proteaza), hem se apsorbuje intaktan od strane mukoznih ćelija, gde se porfirinski prsten otvora i gvožđe oslobađa. Apsorpcija Apsor pcija male količine količ ine gvožđa gvožđ a se može dogoditi dogo diti i između mukoznih mukozn ih ćelija. Ovaj proces nije re� gulisan, ali može biti značajan u uslovima gde je crevna permeabilnost povećana, kao u slučaju alkoholizma ili pri povećanom unosu gvožđa putem hrane. U transcelulamim prostorima hem, i neor� gansko gvožđe pokazuje različite mehanizme apsorpcije. Prvi mehanizam je prisutan u svim intesti� nalnim ćelijama, a drugi je ograničen na duodenum.
10�3
V. Spasojević�Kalimanovska: Gvožđe
Proces apsorpcije neorganskog gvožđa je nedovoljno razjašnjen, ali se zna da je energetski za visan, kapacitetom kapacitet om ograničen ogranič en proces, olakšan proteinima nosačima koji su locirani u četkastom četk astom pokrovu duodenalnih enterocita i posredovan pomoću koncentracionog gradijenta preko ćelijske membrane. Ovaj proces limitira brzinu apsorpcije gvožđa i visoko je osetljiv na promene u telesnim potrebama za gvožđem. Znači balans gvožđa se reguliše promenom u apsorpciji, jer je gubitak gvožđa kontinuiran i neregulisan. Transportni sistem mukoznih ćelija ima visoku, ali ne i apsolutnu specifičnost za gvožđe. Mangan, kobalt, hrom, cink mogu da se vezuju za isti transportni sistem i kompetetivno inhibiraju resorp� ciju gvožđa. Posle ulaska u mukozne ćelije gvožđe može da pređe direktno u krv, uz pomoć transportnog sistema koji je energetski zavistan (vidi Sliku 10�1). U ćelijama mukoze stvara se prolazni (labilni) "pool" gvožđa iz koga se ono usmerava u cirkulaciju (1), u mitohondrije, gde ulazi u sastav ci� tihroma (2), ili u rezervni oblik gvožđa, feritin (3). Količina gvožđa koja se usmerava u cirkulaciju ili u rezervni depo zavisi od potreba organizma. Gvožđe koje neposredno ne pređe u krv vezuje se u ćeliji za apoferitin. Apoferitin je protein koji ima sposobnost da vezuje gvožđe i tako opterećen gvožđem naziva se feritin. Lumen creva
Fe(ll)
Fe(lll)
Transport u plazmu � Tf (transferin) Fe u citozolu C
3
�•Transport u mitohondrije za sintezu enzima enzima koji sadrže gvožđe gvožđe Transport do apoferitina � F (feritin)
Slika 10�1. Apsorpcija gvožđa u lumenu GIT. Na brzinu apsorpcije gvožđa deluju sledeće dve grupe faktora: 1. Fiziološki regulatorni mehanizmi i 2. Lokalni faktori u gastrointestinalnom traktu 1. Fiziološki regulatorni mehanizmi a) Postojeći telesni depoi gvožđa U slučaju deficita gvožđa u organizmu apsorpcija se povećava, a smanjuje ako postoji povećan nivo gvožđa. Kada su potrebe za gvožđem povećane, ćelije creva mogu preuzimati i znatno više od 5�10% gvožđa, koje eventualno odlazi u cirkulaciju. Smatra se da feritin i transferin, koji su prisutni u apsorpcionim ćelijama intestinalne mukoze, regulišu obim apsorpcije. Kada je visok nivo deponova� nog telesnog gvožđa, zasićenje feritina u mukoznom epitelu je veliko, dok je transferinski sadržaj nizak. Gvožđe koje ulazi u ćelije mukoze vezuje se za feritin i gubi eksfolijacijom mukoznih ćelija u in� testinalni lumen. Ovaj mehanizam smanjuje apsorpciju gvožđa, kada je depo već prepunjen. Kada postoji nedostatak gvožđa, u mukoznim ćelijama opada apoferitinski, a raste transferinski sadržaj pa je apsorpcija apsorpcija gvožđa ubrzana. Kada jedn j ednom om uđe u enterocit, gvožđe se šalje direktno direk tno u krv (energetski zavisnim procesom) ili se inkorporira u feritin za rezervu. Deponovano gvožđe može se nadalje
10�4
Medicinska biohemija
mobilisati ako je neophodno, ali se najveći deo ovog gvožđa gubi eksfolijacijom mukoznih ćelija. No ve ćelije zauzimaj zauz imajuu njihovo mesto i ciklus počinje ponovo. pono vo. b) Brzina eritropoeze U slučaju kada je je povećana eritroidna aktivnost kostne srži povećava sa brzina brzina apsorpcije, čak i ako postoje dovoljne ili povećane količine gvožđa (npr. kod talasemije). 2. Lokalni faktori u gastrointestinalnom gastrointestinalno m traktu a) Hemijski oblik gvožđa Gvožđe se mnogo lakše apsorbuje u fero obliku nego u feri obliku. Sekrecija hlorovodonične kiseline u želucu u kombinaciji sa redukujućim agensima, kao što je askorbinska kiselina, rastvara ne� hemsko gvožđe. Resorpcija gvožđa je znatno otežana posle resekcije želuca, bilo zbog odstranjivanja mesta za sekreciju kiseline, bilo zbog fizičkog odstranjivanja mesta preko kojih se vrši resorpcija. I svi drugi uslovi u kojima postoji nedostatak sekrecije kiseline (kao npr. pri atrofičnom gastritisu), ili stanja u kojima je smanjena površina za apsorpciju (crevne kolike), mogu smanjiti apsorbovanje gvožđa. Duodenalni sadržaj bogat bikarbonatima dovodi do stvaranja nerastvorljivih feri�hidroksi kompleksa, tako da je pri pankreasnoj insuficijenciji apsorpcija gvožđa povećana. c) Formiranje kompleksa Sastojci hrane mogu da pomognu održavanje rastvorljivosti neorganskog gvožđa, kao npr. ami� nokiseline i vitamin C, ili da inhibiraju apsorpciju formirajući nerastvorne komplekse, što čine tanini (iz čaja), fosfati (iz jaja, sira i mleka) i oksalati i fitati (iz biljaka).
Transport gvožđa Posle izlaska iz mukozne ćelije gvožđe prelazi u krv, gde se skoro 100 % vezuje za apotransfe� rin, a dobijeni kompleks gvožđe�apotransferin naziva se transferin (sinonim siderofilin). Samo vrlo mali deo gvožđa vezuje se za druge molekule u plazmi. Pre vezivanja za apotransferin gvožđe se oksiduje u trovalentno uz pomoć ceruloplazmina (fero�oksidaza I). Transferin ima molekulsku masu od oko 78 000, elektroforetski se izdvaja kao p r globulin i vezuje 2 atoma gvožđa po jednom molekulu (odgovara 125 mg Fe/100 g proteina). Transferin sadrži jedan polipeptidni lanac sa promenljivim brojem ugljovodoničnih bočnih lanaca koji čine čak 6% molekulske mase. On ima dva mesta za vezi vanje gvožđa, gvož đa, po jedno jed no na svakom terminalno term inalnom m kraju molekula. molek ula. Transferin Tran sferin se sintetiše u jetri jetr i u količini obrnuto proporcionalnoj telesnom statusu gvožđa (povećana sinteza pri deficijenciji i smanjena u opterećenju). U slučaju ozbiljnog oboljenja jetre, kada je smanjena njena sposobnost za sintezu, koncentracija transferina može biti redukovana bez obzira na telesni status gvožđa. U cirkulaciji su pronađeni aferi, mono i diferične forme transferina, a transferinski receptor u humanom organizmu ima najveći afinitet za diferi oblik. Koncentracija transferina u plazmi kod odraslih osoba iznosi 2,4� 2,8 g/L. Ukupna količina transferina u organizmu iznosi 7�15 g i ravnomerno je raspodeljena na plazmu i ekstracelularni prostor. Normalno je samo jedna trećina vezujućih mesta transferina zauzeta sa gvožđem, pa serumski transferin ima znatan rezervni kapacitet vezivanja gvožđa. Ukupan kapacitet vezivanja vezivan ja gvožđa gvožđ a je mera maksimalne maksim alne koncentracije konce ntracije gvožđa gvožđ a koju serumski serum ski proteini, prote ini, prvenstveno prven stveno transferin mogu da vežu i varira u zavisnosti od metabolizma gvožđa. Ograničena raspoloživost većeg dela gvožđa iz hrane je dovela do razvoja visoko efikasnog sistema za čuvanje telesnog gvožđa pomoću unutrašnjeg recikliranja. Mehanizam za kontrolisanje transfera gvožđa iz enterocita u cirkulaciju nije potpuno objašnjen. Zna se, ipak, da je ovaj proces transferin nezavisan, jer i osobe sa kongenitalnom atransferinemijom mogu u većoj količini apsorbovati gvožđe iz hrane. Glavni efekat ovog kontrolnog mehanizma je održavanje adekvatne količine gvožđa u cirkulaciji, prema potrebama organizma (Slika 10�2). Predaja gvožđa deponovanog u feritinu kao Fe (III), u plazmi uključuje najpre redukciju u Fe (II) da bi se on mogao osloboditi iz feritina. Zatim se Fe (II) oksiduje do Fe (III) da bi mogao da se veže u transferin. Gvožđe se pomoću transferina prenosi iz tri glavna donorska tkiva: retikuloendotelnog, paren� himskih ćelija jetre i kostne srži do tkiva koja ga preuzimaju, zahvaljujuću prisustvu specifičnih tran� sferinskih receptora. Dnevni promet gvožđa je otprilike 30 mg, od čega se oko 85% iskoristi za
V. Spasojević�Kalimanovska: Hemoglobin
11�23
3. Eritrocitoza Zamena aminokiselina u molekulu hemoglobina dovodi do visokog afiniteta hemoglobina za ki� ki� seonik i do hipoksije u tkivu. Hipoksija uslovljava eritropoetičnu stimulaciju. Eritrocitozu izazivaju sle� deći hemoglobini: Hb Chesapeake, Rainier and Ypsilanti. 4. Hipohromne anemije
Anemij Ane mija a srpast srp astih ih ćelija ćel ija Anemija Anem ija srpastih ćelija, ćelija , kod homozigota homo zigota je posledica strukturalno struktu ralno abnormaln abno rmalnog og hemoglob hemo globina ina i jeje dno od najučestalijih genetskih oboljenja sa rasprostranjenošću od šesdeset miliona nosioca ovog gena i sa sto hiljada novorođenih godišnje koji nose ovaj gen. Ovo je prvo oboljenje za koje je poznata molekularna osnova. Pauling i Itano su još pre pola veka utvrdili da se radi o zameni jedne amino� kiseline i definisali odgovarajuću gensku mutaciju. Srpasti hemoglobin polimerizuje pri dezoksigena� ciji pri čemu nastaje srpasti oblik eritrocita, po čemu ova bolest nosi ime. Rezultujuća mikrovaskular� na okluzija i skraćeni životni vek eritrocita utiču na pojavu kliničkog sindroma koji uključuje anemiju, vazookluzivne vazook luzivne krize, oštećenje ošteć enje organa i osetljivost osetlj ivost na infekcije infekci je zbog smanjene sman jene funkcije funk cije slezine. slezin e. Bolest srpastih ćelija je recesivno oboljenje koje se javlja kao homozigotna forma kod osoba koje su nasledile dva mutantna gena (od svakog roditelja po jedan) koji kodiraju sintezu (3�lanaca globin� ske molekule. (Mutantni gen je označen kao (3S, a rezultirajući hemoglobin je a2(3 s2 i HbS). Prisustvo bolesti se ne uočava u detinjstvu sve dok se dovoljno HbF ne zameni sa HbS, pa se onda ispolji efe� kat srpastih ćelija. Bebe sadrže uglavnom HbF koji nema (3�lance kod kojih postoji mutacija. Zamena baznog para (CAG�» CTG) na šestom kodonu gena (3�globinskog lanca određuje supstituciju gluta� mata sa valinom, što rezultira stvaranjem strukturne varijante HbS. Najveći broj osoba sa HbS je afričkog porekla sa manjim brojem obolelih u Mediteranu, Saudijskoj Arabiji i Indiji, ali su migracije populacija uslovile globalnu rasprostranjenost ovog oboljenja. Mutacija koja je dovela do ovog poremeća ja, nezavisno se pojavila pojavil a na pet različitih geografsk geog rafskih ih regiona, regiona , a kao uzrok ovoga je i selektivna selek tivna prednost nosilaca gena srpaste anemije u odnosu na malariju izazvanu sa Plasmodium falciparum. Ovaj mikroorganizam provodi deo svog životnog ciklusa u eritrocitima. Obzirom da ćelije heterozigota kao i homozigota imaju kraći životni vek nego normalno, parazit ne može da kompletira svoj razvoj. Ova činjenica ukazuje na selektivnu prednost heterozigota u preživljavanju u regionima gde je malarija glavni uzrok smrtnosti. Pored homozigotnih oblika anemije srpastih eritrocita (HbSS), postoji nekoliko drugih abnormalnosti (3�lanaca koji dovode do srpastog oboljenja. U okviru heterozigota najvažniji je HbSC, srpasti Hb � (3+ talasemija i srpasti Hb � talasemija (3°. Najteže kliničke simptome imaju HbSS i S(3°� talasemija, sa većim stepenom anemije (Hb približno 60�80 g/L) i mnogo češćim krizama. Molekul HbS sadrži dva normalna a�lanca i dva mutantna (3�lanca ((3S) u kojima je glutamat na poziciji 6 zamenjen valinom. U toku elektroforeze, pri alkalnom pH 8,6, HbS migrira sporije prema anodi u odnosu na HbA. Ova promenjena mobilnost HbS posledica je odsustva negativnog naelektri� sanja glutamatnog ostatka u oba (3�lanca, tako da je HbS manje negativan od hemoglobina HbA. Elektroforeza hemoglobina dobijenog iz liziranih eritrocita se rutinski koristi za dijagnozu bolesti srpastih ćelija i prisustva HbS u tragovima kod heterozigota. Supstitucija naeleKinsanog glutamata sa jednom nepolarnom aminokiselinom, valinom dovodi do smanjenja rastvorljivosti HbS u njegovom dezoksi obliku. Molekuli stvaraju agregate i vlakna koja de� formišu ćeliju eritrocita u srpast oblik. Ovakve srpaste ćelije redovno blokiraju cirkulaciju krvi u kapila� rima manjeg promera. Posledica ovoga je nedostatak u snabdevanju kiseonikom što dovodi do lokalne anoksije, a to proizvodi bol, čak i smrt (infarkt) ćelija. Postoje i neke druge retke varijante hemoglobina koje dovode do ovog stvaranja srpastih ćelija. Proces stvaranja srpastih ćelija se povećava sa povećanim prisustvom bilo kog parametra koji povećava proporciju HbS u dezoksi obliku (tj. koja smanjuje afinitet HbS za kiseonikom). U ove parametre spada snižen pritisak kiseonika na povišenoj nadmorskoj visini ili prilikom letenja, povećan ugljendioksid, smanjen pH i povećana koncentracija 2,3�DFG u eritrocitima.
11�24
Medicinska biohemija
Molekularna osnova anemije srpastih ćelija Lanci HbS su stabilizovani pomoću intermolekularnih kontakata koji uključuju Val (36 i neke druge aminokiseline na globinskim lancima. Elektronskom mikroskopijom je utvrđeno da polimerizovani lanci dezoksi�HbS imaju eliptičan oblik. Sastoje se od 14 heksagonalno postavljenih i heliksno uvijenih niti molekula dezoksihemoglobina koji se vezuju u paralelnim parovima. Strukturni odnos između HbS molekula u parovima paralelnih niti je ustanovljen analizom strukture kristala dezoksi�HbS pomoću X�zraka. Struktura kristala dezoksi�HbS sastoji se od duplih filamenata i nekoliko različitih intermolekularnih kontakata kao stoje prikazano na Slici 11�17.
Slika 11�17. Polimerizacija HbS.
Zapažanje da dezoksi�HbA ne gradi agregate u nitima, čak ni pri vrlo visokim koncentracijama proteina, dokaz je da je veza koju stvara Val 6 (3 esencijalna za stvaranje tih niti. Samo jedan od dva Val 6 3 po molekulu hemoglobina je u kontaktu sa obližnjim molekulom. U ovom kontaktu, dodirna strana sa valinom ulazi u hidrofobnu površinu džepa (3�subjedinice drugog molekula koji se prilago� đava. Ovaj džep ne postoji u oksihemoglobinu i on se ispoljava samo nakon oslobađanja kiseonika u tkivnim kapilarima. Drugi kontakti obuhvataju ostatke koji se nalaze u HbA, uključujući Asp 73 (3� lanca i Glu 23 a�lanca. Polimerizacija HbS u eritrocitima ili u rastvoru ima neobičan vremenski tok. Snižavanje p0 2 i /ili povećanje temperature u rastvoru će stvoriti uslove za polimerizaciju HbS. Po postizanju uslova po�
11�25
V. Spasojević�Kalimanovska: Hemoglobin
limerizacije postoji period odlaganja koji varira (od mili sekundi do jednog dana) u zavisnosti od uslo� va. Tek posle perioda odlaganja, prvi put se pojavljuju niti i onda se završava polimerizacija za otprilike polovinu vremena koliko je trajalo vreme odlaganja. Stvaranje polimera je praćeno sa nekoliko pramena na membrani eritrocita i ona postaje manje sposobna da se savija i više je fragilna (Slika 11�18). Ove promene su uslovljene ne samo interakci jom srpastog hemoglobina i membrane već i oksidativnim oštećenjem fosfolipida membrane pomoću slobodnih radikala, za koje je dokazano da se povećavaju u ovim ćelijama. Ove promene u membranama su u početku reverzibilne, ali posle postaju sve više ireverzibilne i na kraju kulminiraju stvaranjem srpastih ćelija. Poremećena je i katjonska homestaza, uz gubitak kalijuma koji prevazilazi natri� jum , što rezultira gubitkom ćelijske vode i povećanom koncentracijom intracelularnog hemoglobina. Rastvor HbS
Vlakno HbS
P6 Triplet kodon T
t GAG
�* p 6 G l u � > V a l � • H b S
CO Vazooklu zij a
Slika 11�18. Polimerizacija HbS, stvaranje srpastih eritrocita i okluzija krvnih sudova. Polimerizacija HbS i propratne promene ćelijske membrane dovode do značajnog smanjenja sposobnosti ćelija da prolaze kroz mikrovaskularnu cirkulaciju, što ima za posledicu smanjenu dosta vu kiseonika i dalji proces cikličnog stvaranja srpastih ćelija. Postoje dokazi i povećane adhezije eritrocita za vaskularni endotel, koji će povećati dezoksigenaciju i dovesti do opstrukcije protoka eritrocita kroz mikrovaskularne sudove. Klinički simptomi se izražavaju kroz hronične i akutne pojave. Većina simptoma je posledica efekta vaskularne okluzije, obzirom da se anemija dobro toleriše. Bolest srpastih ćelija je multisistemska bolest. Akutne epizode ili krize mogu imati nekoliko formi uključujući bolne, povremene, aplastične i hemolitičke krize. Najkarakterističnija je bolna ili vazookluzivna kriza, koja može biti izazvana infekci jom, dehidratacijom i pri izlaganju hladnoći, iako se često ne može da se identifikuje pravi uzrok. Vazookluzija, koja se ispoljava u kostima dovodi do avaskularne nekroze u kostnoj srži sa propratnom inflamacijom i povećanim intramedularnim pritiskom. Uočljiva je i pojava bolnog znojenja ruku i stopala u ranom detinjstvu. Kod starije dece i odraslih, promene su na dugim kostima i kičmenom stubu. Zbog gubitka funkcije slezine, pacijenti sa srpastom anemijom su izloženi povećanom riziku od bakterijske infekcije, pa je pneumokokna sepsa uglavnom glavni uzrok ranog mortaliteta. Glavni uzrok smrtnosti kod starijih je akutni sindrom u grudima koji je rezultat kombinovane infekcije, infarkta i masne embolije u plućima. Ovi simptomi zahtevaju brzo reagovanje: oksigenaciju, hidrataciju, intra venozno davanje antibiotika i transfuzija krvi u cilju smanjenja nivoa HbS do 30 %. Slog, kao posledica okluzije velikih cerebralnih sudova, zahvata 8 % pacijenata i dešava se primarno u školskom dobu. Dugotrajne transfuzije redukuju šansu za slog, ali nose rizik od hemoside� roze tako da se gvožđe mora helatizovati.
11�26
Medicinska biohemija
Hronično oštećenje organa zbog anemije srpastih ćelija se izražava na nekoliko nivoa: • oštećenja usled ishemije utiče na kosti i zglobove i dovode do progresivne destrukcije koja u slučaju avaskularne nekroze dovode do teških posledica; • hronična oboljenja pluća dovode do stalnih epizoda infekcije i opstrukcije; • u slučaju hroničnih hemolitičkih stanja usled intenzivnog metabolizma hemoglobina stvaraju se žučni kamenci; • retinalna vazookluzija vodi ka proliferitivnoj retinopatiji. Methemoglobinemija
Do pojave methemoglobinemije dolazi zbog povećanog prisustva methemoglobina, koji u hemu sadrži gvožđe u feri obliku. Methemoglobinemija može biti nasledna ili stečena. Nasledna methemoglobinemija se javlja usled deficijencije methemoglobin reduktaze ili zbog strukturnih M varijanti hemoglobina. Fiziološki hemoglobin je kao što je ranije opisano, zaštićen od oksidacije na dva načina: (1) položajem hema u džepu globinske strukture molekula hemoglobina i (2) redukcionim enzimskim mehanizmom zaštite eritrocita (vidi mehanizme zaštite eritrocita). Stečena methemoglobinemija je posledica dejstva raznih lekova i hemikalija (ili njihovih metabolita) koji su sposobni da oksidišu hemoglobin u tom obimu da to prevazilazi redukcioni kapacitet eritrocita. Strukturne varijante koje dovode do methemoglobinemije se označavaju kao hemoglobini M (HbM). Oni se karakterišu supstitucijom aminokiselina u predelu vezivanja hema na a� ili (3�lancu hemoglobina. Ove supstitucije i strukturne promene globina dovode do stvaranja novih intraglobin� skih veza, stabilizacije feri oblika gvožđa u hemu, ali i promene afiniteta HbM za kiseonik. Kod strukturnih M varijanti dolazi do supstitucije aminokiselinskih ostataka histidina sa tirozinom. Ova supstitucija obuhvata zamenu proksimalnih ili distalnih histidina u a� ili p�subjedinicama. Aminokiselina tiro� zin, zahvaljujući svom fenolatnom jonu formira čvrst kompleks sa atomom gvožđa i doprinosi većoj stabilizaciji methemoglobina. Stabilizacija feri atoma u methemoglobinu ima za posledicu stabilizaciju T�oblika, sprečava se prelaz T�forme u R�formu, smanjenje afiniteta prema kiseoniku, odsustvo Bo� hrovog efekta i nedostatak efekta kooperativnosti. M hemoglobini kao i druge varijante hemoglobina pokazuje recesivno nasleđivanje, ali za razliku od ostalih hemoglobinopatija ne dovodi do hemolitičke anemije. Homozigotna forma je inkompatibilna sa životom. U slučaju heterozigota samo jedan par globinskih lanaca je podložan promenama (a ili (3) i nivo methemoglobina ne prelazi 25�30 %. Ako su a�lanci uključeni, cijanoza se javlja već pri rođenju, dok su (3�lanci odgovorni za cijanozu u kasnijim mesecima pošto se ovi lanci kasnije sintetišu. Pacijenti sa naslednom methemoglobinemijom imaju eritrocitozu i karakterističnu sivu cijanotičnu bo ju još od rođenja. Kliničke manifestacije methemoglobinemije zavise od koncentracije methemoglobina, pa tako: • • • •
methemoglobin u koncentraciji od 10�20 % dovodi do cijanoze; 30�40 % methemoglobina dovodi do glavobolje i otežanog disanja; preko 70 % methemoglobina može biti fatalno; kod nekih pacijenata sa deficijencijom methemoglobin�reduktaze može doći i do mentalne retardacije i smrti.
V. Spasojević�Kalimanovska: Hemoglobin
11�27
Talasemije Talasemije su nasledna hemolitička oboljenja u kojima postoji neravnoteža u sintezi globinskih lanaca. Talasemije su svakako najučestalije autozomalno recesivno oboljenje ljudi sa otprilike 100 000 homozigota rođenih godišnje širom sveta. Talasemije su dobile ime od grčke reci "talas" što označava more. Naziv je prvi put upotrebljen za anemije karakteristične za područje Mediterana, lako su taiasemijske anemije zabeležene u svim etničkim grupama i na svim geografskim lokacijama, talasemijski sindromi su bolesti Mediterana i ekvitorijalnih zona Azije i Afrike. Talasemijski pojas se proteže duž obala Sredozemnog mora, preko Arapskog poluostrva, Turske, Irana, Indije i jugoistočne Azije. Frekvencija talasemičnih gena u ovom pojasu je od 2,5 do 15 %. Najučestalije i klinički najvažnije forme su a� i p�talasemije i strukturna varijanta hemoglobina E koja liči na talasemiju. Manje uobičajene forme su 5�p�talasemije, a veoma retke v�5�p�talasemije. Zabeležene su i kombinacije različitih strukturnih varijanti hemoglobina sa talasemijama. U okviru ta� lasemijskih poremećaja izučava se i nasledno prisustvo povećanog fetalnog hemoglobina. Normalno sinteza a� i p�globinskih lanaca je koordinisana tako da svaki a�lanac ima svoj p� globinski lanac u paru. Ovo vodi ka sintezi a 2p2 ili HbA. U talasemiji sinteza a� ili p�lanca je defektna. Osnovna podela talasemija je izvršena prema tome da li je sinteza globinskih lanaca potpuno odsutna (a°� i p°�talasemije) ili je ipak zadržan izvestan nivo sinteze (a + � i p+�talasemije). U slučaju a� talasemija ovo je još komplikovanije jer je dupla ekspresija a�gena. Zbog toga a�talasemija je važna kada su tri ili četiri a�globinska lanca izgubljena. Kliničke posledice talasemija u homozigotima su uzrokovane neuravnotežom sintezom globinskih lanaca što rezultira odsustvom ili redukovanom količinom a� ili p�lanaca. Heterozigoti ne pokazuju kliničke manifestacije. Rezultat defektne sinteze hemoglobina u talasemiji je da su eritrociti karakteristično hipohromni i mikrocitni. Ovo se odražava na re� dukovane vrednosti eritrocitnih indeksa MCH (srednja vrednost koncentracije hemoglobina u eritrocitu) i na MCV (srednju vrednost ćelijskog volumena). Karakteristika talasemijskih sindroma je njihova izražena fenotipska heterogenost. U toku posle� dnje decenije vršena su obimna genetska ispitivanje uzroka talasemija i otkrivene su brojne genetske mutacije. Molekularni mehanizmi talasemija su posledica mutacija koje dovode do: • smanjene transkripcije iRNK (transkripcioni mutanti); • grešaka u procesu translacije iRNK; • poremećaja u funkciji iRNK; • varijacija u posttranskripcionim modifikacijama iRNK (isecanju introna na iRNK, poliadenilaciji i stvaranju 5'�kape na iRNK); •
ekstremne nestabilnosti p�globinskog lanca kod p +�talasemija.
P�Talasemije p�talasemije su klasifikovane kao p°�, p +� i p++�talasemije u zavisnosti od stepena deficijencije sinteze p�lanaca. U p°�talasemiji sinteza p�lanaca je potpuno odsutna i ne može da se dokaže prisustvo HbA. U p+�talasemiji postoji slaba sinteza p�lanaca, a u p ++�talasemiji sinteza ovih lanaca je ume� reno redukovana. Količina HbA u p +� i p++�talasemiji varira u zavisnosti od slučaja. Prema kliničkoj slici talasemije se dele na: talasemiju major (Cooleveva anemija), intermedijarnu, minor i minimu. Prema genetičarima, talasemija se deli na homozigotnu, kada se gen za talasemiju nasledi cd oba heterozigotna roditelja, i na heterozigotnu talasemiju, kada u bolesnika postoji samo jedan gen za bolest. Obično samo homozigoti ispoljavaju kl.ničku sliku talasemije major (vidi Sliku 11�19). Po definiciji, taiasemijske mutacije imaju za posledicu kvantitativno smanjenje sinteze jednog ili više globinskih lanaca. U slučaju p�talasemije, deficit u sintezi p�lanaca se reflektuje na smanjenje produkcije HbA i kao posledica toga eritrociti su značajno hipohromni. lako postoji kompenzacija u određenom stepenu, povećanjem sinteze HbF i HbA 2, ovaj proces nije uvek komplementan i poseb�
11�28
Medicinska biohemija
no u slučaju p°�talasemije, anemija je jako izražena. Drugi faktor u patofiziologiji p�talasemije, pos� ledica je neravnoteže između sinteze a� i ne a�lanaca u eritroidnim ćelijama ovih pacijenata. Ovaj višak slobodnih a�lanaca je visoko nestabilan i doprinosi kompleksu serija oksidativnih procesa, što na kraju dovodi do oštećenja eritrocitne membrane. Ove promene uzrokuju skraćenje životnog veka eritrocita, pojavu hemolize i još izraženiju anemiju. Svaka kopija hromozoma 11 sadrži po jedan gen za (3�globinski lanac
H
B
H
H
�I
B
h
TI.—.B—.�r�
Normalno �I —[
B p
P
�h
p � Talasemija mlnor I� ]—
�C;;_T �{
B.....r�
p � Talasemija major
Normalni gen Mutirani gen
Slika 11�19. p�talasemije: vrste (3�talasemija i nasleđivanje.
Pokazalo se da su eritrociti osoba sa talasemijom osetljiviji na oksidativne procese, zato što ove ćelije sadrže višak slobodnih globinskih lanaca, visoke koncentracije gvožđa (van hema), odnosno niske koncentracije hemoglobina. Višak slobodnih a�globinskih subjedinica kod pacijenata sa p� talasemijom brzo podležu oksidaciji i formiranju methemoglobina, procesom koji dovodi do stvaranja superoksid�anjona i nekiseoničnih radikala. Kiseonični radikali uzrokuju različite destruktivne promene, uključujući stvaranje viška methemoglobina, produkciju reverzibilnih i ireverzibilnih hemihroma, peroksidaciju membranskih lipida i oksidativno oštećenje globina i membranskih proteina. Efekti na ćelijskoj membrani uzrokuju poremećaj u izmeni katjona, što bitno doprinosi smanjenju životnog veka eritrocita kod ovih pacijenata. Lipidna peroksidacija eritrocitne membrane, takođe je faktor doprinosa hemolitičkim procesima kod pacijenata sa (3�talasemijom. Ona dovodi i do povećanja rigidnosti membrane, smanjenje savitljivosti eritrocita, što sprečava njihov protok kroz slezinu. Teška anemija ovih pacijenata zajedno sa uznapredovanom hemolizom, uzrokuje intenzivnu eritropoetinom posredovanu eritropoezu. Kostna srž se veoma proširuje, ispunjavajući kostne šupljine. Ovo povećanje mase erit� ropoetičnog tkiva može dovesti do deformiteta na kostima koje su specifične za talasemiju. Na dugačkim kostima se istanjuje pokosnica koja je podložna patološkim frakturama. Naročito su deformi� sane kosti lobanje uz pojavu ispupčenja svoda i dolazi do maksilame hipertrofije što licu daje mongoloidni izgled. Ekstramedulamo, uključujući jetru i slezinu, može, takođe doći do bujanja hematopoe� znog tkiva. Uvećana i tvrda slezina u p�talasemiji major uslovljena je jednim delom ognjištima eks� tramedularne hematopoeze, a drugim delom je posledica povećane razgradnje eritrocita u slezini. Usled pojačane hemolize, a naročito kod pacijenata koji su na terapiji transfuzijama, javlja se hemo� sideroza. Hemoliza dovodi i do pojave žutice, a i holelitijaza je česta dodatna komplikacija. Hipers� plenizam dovodi do leukocitopenije i trombocitopenije čime je povećana sklonost ka infekcijama i kr varenjima, st oj e čest uzrok smrti ovih bolesnika. Pored poremećaja sinteze polipeptidnih globinskih lanaca u talasemijama postoji i poremećaj sinteze hema. Smanjena sinteza hema je posledica negativne povratne sprege usled nagomilavanja hema neiskorišćenog za sintezu hemoglobina. Poremećena sinteza hema dovodi do taloženja većih količina gvožđa u mitohondrijama eritroblasta, što dovodi do smanjenog metabolizma u tim ćelijama. Zbog neefektivne eritropoeze, povećane apsorpcije gvožđa i zbog čestih transfuzija krvi gvožđe se nagomilava u parenhimu mnogih organa i u retikuloendotelnim ćelijama.
V. Spasojević�Kalimanovska: Hemoglobin
11�29
Klinička slika homozigotne p�talasemije (Cooleyeve anemije) se javlja ubrzo posle rođenja i biva sve teža: otežano je disanje, dolazi do povišenja temperature zbog hipermetaboličkog stanja i sklonosti prema infekcijama. Usporen je rast, dolazi do zastoja u duševnom i polnom razvoju. Hipoksija tkiva, hipertrofija hematopoeznog tkiva i endokrini poremećaji uzrok su zastoja u razvoju i fizičkog propadanja. Vrlo česte transfuzije uzrokuju hemosiderozu. Primarno mesto ispoljavanja toksičnosti gvožđa su srce, jetra i endokrini sistem. Depoi gvožđa se javljaju u miokardu i mogu dovesti do srčane insuficijencije i smrti. Pacijenti sa (3�talasemijom već u petoj godini života imaju značajnu hepatič� nu fibrozu, a u drugoj dekadi života mnogi od ovih pacijenata imaju ispoljenu cirozu jetre. Ciroza jetre vodi do fatalnog ishoda kod relativno malog broja pacijenata. Endokrina disfunkcija ovih pacijenata često postaje primetna u njihovom preadolescentnom dobu, sa odloženim napredovanjem. Naročito je karakteristično odsustvo naglog rasta u pubertetu. Poremećaji su na nivou tiroidne, paratiroidne i nadbubrežne žlezde, ali bez većih kliničkih simptoma. Bolesnici kod kojih je Cooleveva anemija izazvana homozigotnošću p+�globinskog gena imaju klinički oblik talasemije intermedije i tok bolesli je znatno sporiji, jer nisu potrebne tako česte transfuzije. Kod heterozigotnog oblika p�talasemije, uglavnom, ne postoje vidljivi klinički znaci, sem u toku stresnih stanja, kao što su trudnoća i infekcije. Pacijenti sa p�talasemijom major, koji imaju tešku anemiju su zavisni od periodičnih transfuzija krvi i to je jedini vid terapije. Razlozi za ovu terapiju transfuzijom krvi su dvojaki: prvi cilj je da se ko� riguje anemija, a drugi da se suprimira neefektivna eritropoeza i samim tim ublaže posledice širenja kostne srži i uvećanja jetre i slezine. Adekvatnom terapijom većina pacijenata da (3�talasemijom ma jor je bez simptoma anemije i može da vodi normalan život. Međutim, sa nastavkom terapije, hronič� na akumulacija gvožđa postaje značajna sekundarna komplikacija, iako se adekvatno ne sanira, ve� rovatno, dovodi do hemohromatoze, značajnog oštećenja tkiva, i endokrine disfunkcije i fatalnog ishoda u ranom dobu. Da bi se izbegli neželjeni efekti mora se istovremeno vršiti helatizacija gvožđa sa deferoksaminom. Ovakvom terapijom se povećava eliminacija helatizovanog gvožđa urinom. Hematološke promene u krvi kod svih značajnih formi talasemije su pre svega mikrocitoza. Osobe sa homozigotnom ili teškom kombinacijom heterozigotnih formi imaju izmenjene eritrocite sa izraženom hipohromijom i sniženim vrednostima MCH I MCV. U razmazu periferne krvi postoji veliki broj izmenjenih eritrocita (leptocita, anulocita, ciljnih ćelija, itd). Procenat retikulocita znatno prelazi normalne vrednosti. U krvi je prisutan veći ili manji broj eritroblasta, acidofilnih, polihromatofilnih, a najviše bazofilnih. Zbog pojačane eritropoeze javlja se deficit folne kiseline. Slika hemoglobina u krvi odražava kompenzatorne promene udružene sa smanjenom sintezom (3�lanaca. Pacijenti sa homozigotnom p°�talasemijom koji nisu primali transfuzije krvi neće imati HbA. HbF je karakteristično povećan, ali nije ravnomerno raspoređen u svim eritrocitima. Kod onih sa blažim p�talasemijskim sindromom, biće prisutan povišeni nivo HbF sa promenljivim procentom HbA 2. Povišeni nivo HbA2 predstavlja primaran dijagnostički nalaz ovog stanja i ono odražava povećanu sintezu 5�globinskih lanaca kao odgovor organizma na smanjenu sintezu (3�lanaca. Slično ovom mehanizmu povećane sinteze drugih lanaca i nivoi HbF su blago povećani. Povećan HbA2 je važan di jagnostički marker za diferencijaciju heterozigota (3�talasemije od a�talasemija gde je HbA2 normalan ili nizak. Relativna lakoća potvrđivanja dijagnoze heterozigotne forme p�talasemije, čini identifikaciju genetskih nosioca talasemije pouzdanom. Kod blagih formi heterozigotne p�talasemije, dolazi samo do suptilnih promena morfologije eritrocita. Postoje znaci srednje hipohromne anemije. Kod nekih bolesnika postoji izražena anemija, dok je kod drugih teži oblik sličan homozigotnom obliku talasemije. Inkluzije a�lanaca se mogu naći samo u malom broju eritroblasta. Dolazi do povećanja HbA2, kao i HbF. Kod deficita gvožđa vrednosti HbA se smanjuju, ali nakon popravke deficita ponovo povećavaju. Od biohemijskih promena u talasemiji major postoji povećanje bilirubina u serumu. U početku se povećava slobodni bilirubin zbog hemolize, a kasnije se povećava konjugovani bilirubin zbog oštećenja parenhima jetre kao i zbog opstruktivne žutice što je često kod p�talasemije. Uglavnom su bio� hemijske promene posledica funkcionalnog oštećenja jetre i pankreasa kod homozigotne p� talasemije.
11�30
Medicinska biohemija
a�Talasemije Patofiziološki efekti a�talasemija reflektuju stepen oštećenja u produkciji a�gena. Sa razvojem novih shvatanja bazičnog molekularnog defekta u a�talasemiji, postalo je jasno da je većina slučaje va posledica delecije koja uključuje jedan ili oba a�gena (Slika 11�20). Većina a�talasemijskih sindroma se poprilično dobro uklapa u jedan od četiri karakteristična klinička fenotipa, koji se karakteri� šu odsustvom funkcije jednog, dva, tri ili sva četiri a�globinska gena. U odsustvu jednog gena, osobe sa (�, a,/a, a) genotipom su tihi nosioci a�talasemijskog fenotipa. Odsustvo dva gena, odnosno osobe sa genotipom (�, �/a, a) ili (�,a/�, a) oboljevaju od talasemije minor. Odsustvo tri gena (genotip �,�/�, a) dovodi do HbH bolesti, a ako su odsutna sva četiri gena uzrokuje hidrops fetusa. H
al
r—l
a2
h
H
r—I
a2
h
H
al
t—l
a2
r�
�TrilČaZII'—[
tt2
|�
:
Osobe nosioci matiranog gena
Normalne osobe —L___DUL ___i— I
q2
al
h^
~i «i .i—I a 2 1� V Pokazuju neke a� talasemije� heterozigot blage kliničke simptome H al r—I a2 h �L_._aJL.__j—L.__a2__.r�^ a� talasemije �heterozigot
�[___tti___�—I
ol
i.__ai___]—L___a2___r Hemoglobin H teški klinički simptomi
V�
�[___al___]—_.
cčt
i�
�L___OJL____—.___c&_
Hidrops fetusa ( Smrt pri rodjenju)
Slika 11�20. a�Talasemije: vrste talasemije, nasleđivanje i klinički simptomi. Odsustvo jednog gena naziva se i a�talasemija�2 (heterozigotna a�talasemija). Ako su dva gena delirana sa istog hromozoma (tj.cis) onda se za osobe koje su heterozigoti za ovo stanje kaže da imaju a�talasemiju�1. Sličnu kliničku i hematološku manifestaciju imaju osobe sa homozigotnom a� talasemijom�2. Hidrops fetusa predstavlja homozigotnu a�talasemiju�1. Kod svih oblika a�talasemija poremećeno je stvaranje hemoglobina u kom se nalaze a�lanci, a to su: HbA, HbA2 i HbF. Neuravnotežena sinteza globinskih lanaca sa nedostatkom a�lanaca u odnosu na ne a�lance je slika zajednička za sve oblike a�talasemija. Neukombinovane p� i v�subjedinice, kada su prisutne u značajnom višku u eritrocitima, sposobne su da formiraju polustabilne homotetrame� re hemoglobinske molekule. Kada su ove hemoglobinske molekule izložene dejstvu peroksida i slobodnih kiseoničnih radikala, prolaze kroz niz oksidacionih procesa, čiji su krajnji produkti ireverzibilni hemihromi, nalik na one opisane kod (3�talasemijskih eritrocita. (3� i Y�hemihromi se na sličan način precipitiraju u eritrocitima, što uzrokuje oštećenje ćelijske membrane, a to dovodi do smanjenja životnog veka eritrocita. Hemolitički procesi, zajedno sa slabim sadržajem hemoglobina u eritrocitima us� led smanjene sinteze normalnog hemoglobina, prouzrokuju mikrocitozu, tj. krvnu sliku koja karakteri� še ove poremećaje Tihi nosilac a�talasemijskog fenotipa, obično nije udružen ni sa jednim ispoljenim kliničkim ili hematološkim poremećajem. Morfologija eritrocita kod obolelih osoba sa ovim sindromom je karakteristično normalna, kao i struktura njihovih hemoglobina. Može biti prisutna blaga mikrocitoza, ali MCV je gotovo uvek u normalnom opsegu. Fenotip uslovljen gubitkom dva a�gena je udružen sa krvnom slikom koja je veoma slična onoj kod heterozigotne p�talasemije. Blaga anemija sa značajnom mikrocitozom i promenjenom morfologi�
V. Spasojević�Kalimanovska: Hemoglobin
11�31
jom eritrocita su najčešći nalazi. Po rođenju ova forma ct�talasemija karakteriše se prisustvom Y4 tet� ramera u značajnoj količini (obično 4�7 %), koji se označava kao Hb Barts. Ovaj homotetramer, koji je značajno stabilniji od HbH (p 4) se brzo otkriva rutinskom elektroforezom hemoglobina. Međutim, u prvih nekoliko nedelja nakon rođenja, Hb Barts iščezava, i odvaja se od retkih ćelija koje mogu imati inkluzije HbH. Hemoglobinska struktura kod ovih individua je sasvim normalna. HbH bolest, koja nastaje usled odsustva tri a�gena, je srednje težak oblik talasemije, sa kliničkom i krvnom slikom, koja je u osnovj, slična onoj kod prethodno opisanih pacijenata. Pacijenti sa HbH bolešću imaju veoma ozbiljne kliničke simptome anemije, hepatosplenomegalije, zaostalim rastom i generalnom slabošću. Mnogi od ovih pacijenata, takođe pate od hroničnih infekcija i malnutricije, koje značajno doprinose ozbiljnosti njihovih hematoloških poremećaja. U odsustvu ovih komplikacija, HbH bolest se ispoljava umereno teškom anemijom, upadljivom mikrocitozom sa morfološki izmenjenim eritrocitima i blagom hroničnom hemolizom. Akutne infekcije, dejstvo lekova ili hemikalija mogu prouzrokovati akutne hemolitičke epizode, sa naglim padom nivoa hemoglobina, Stanje se potpuno ispoljava odmah po rođenju i novorođenčad ima 20�30 % Hb Barts u svojim eritrocitima. Za vreme prve godine života, kad HbA zamenjuje HbF, kod ove dece, većina ili svi Hb Barts nestaju i bivaju zame� njeni sa HbH. Klinički najteži a�talasemijski fenotip, koji nastaje usled totalnog odsustva sinteze a�globinskih lanaca, je hidrops fetusa. Kako svi normalno prisutni postnatalni hemoglobini (HbA, HbA 2 i HbF) sadrže a�lance, nijedan od ovih hemoglobina ne može se sintetisati u eritrocitima fetusa sa ovim poremećajem. Veliku frakciju njihovih hemoglobina, obično više od 80 % sačinjavaju homotetrameri (3� i y� lanaca. Značajna sličnost hemoglobina p 4 i Y4 je da imaju veoma visok afinitet prema kiseoniku, toliko veliki da pod normalnim fiziološkim uslovima ne oslobađaju kiseonik, i stoga su nesposobni da obavljaju ulogu prenosioca kiseonika in vivo. Fetusi sa ovim poremećajem koji su preživeli intrautereni ži vot, blizu isteka punog termina imali su solidnu količini Hb Portland (£2 Y2), koji normalno nisu prisutni posle prvog trimestra. Pokazalo se da Hb Portland ima normalne funkcionalne sposobnosti, veoma slične sa HbA i smatra se da prisustvo ovog hemoglobina omogućava ovim fetusima da prežive period gestacije. Genotip hidrops fetusa udružen sa ct�talasemijskim delecionom mutacijom kojom su delirani (,� globinski geni daje fenotip koji nije najbolje izučen s obzirom na ranu smrt fetusa u gestaciji. Većina fetusa sa ovim oblikom a�talasemije, čak i oni koji su imali značajne količine Hb Portland, je mrtvorođena. Neki su rođeni živi, ali su imali general'zovane edeme, masivnu hepatosplenomegaliju i insufi� cijenciju srca. Samo je mali broj ovih novorođenčadi preživeo više od nekoliko sati, bez obzira na intenzivnu negu, uključujući i brojne transfuzije.
Nasledno prisustvo povećanog fetalnog hemoglobina sistance of fetal hemoglobin)
(HPFH�Heredity per�
Nasledno prisustvo fetalnog Hb (HPFH) je benigno stanje koje se karakteriše kontinuiranom sintezom HbF. Ovo je forma 5�p�talasemija zbog prisutne sinteze Y�lanaca što kompenzuje deficijentne 5� i p�lance. HPFH se javlja u homozigotnoj i heterozigotnoj formi i u asocijaciji je sa varijantom p� lanaca hemoglobina. Može se klasifikovati prema raspodeli u eritrocitima na pancelulame i heteroce� lularne forme. U prvoj grupi je uniformna raspodela u eritrocitima dok je u drugoj heterozigotni oblik. Prema geografskoj i drugim karakteristikama podeljena je na nekoliko tipova: grčki, afrički, britanski, švajcarski, itd. Afrički tip se sreće i kod Američkih Crnaca i karakteriše se odsutnošću sinteze 6� i p� lanaca. HbF ima pancelularnu distribuciju. U većini slučajeva Y G � i y A �lanci se sintetišu u abnormalnim odnosima. Blaga eritrocitoza kao odgovor na visok afinitet HbF za kiseonik je vezana za blagu mikrocitozu i retikulocitozu. Elektroforetska analiza ukazuje da je prisutan HbF 100 % i da se u pod jednakim odnosima nalaze Y° � i Y A �lanci. Odnos a/ne a�lanci odgovara neravnoteži u sintezi lanaca koji se javlja kod talasemija.
11�32
Medicinska biohemija
Dijagnostika hemoglobinopatija
Dijagnostika hemoglobinopatija zasniva se na hematološkim i biohemijskim analizama. Pored sniženog nivoa hemoglobina, koji može označavati niz oboljenja, postoje još tri hematološka parametra čije vrednosti imaju veliki značaj za diferencijalnu dijagnostiku talasemijskih sindroma. To su: MCV, MCH i MCHC. Za pravilnu dijagnostiku neophodna je i krvna slika sa morfologijom eritrocita. Elektroforeza hemoglobina je veoma korisna metoda za izučavanje talasemijskih sindroma. U zadnje vreme genetske analize daju jasnu i nedvosmislenu potvrdu da je pacijent nosilac mutacije u genima za globinske lance hemoglobina.
Poglavlje 12 Ispitivanje funkcije bubrega Bubrezi obavljaju vrlo kompleksne funkcije, u prvom redu zahvaljujući tome što kroz njih prođe četvrtina zapremine krvi koju srce ispumpa u sistemsku cirkulaciju. Osnovne funkcije bubrega su ek� skretoma, regulatorna i endokrina. EKSKRETORNA FUNKCIJA BUBREGA
Ekskretorna funkcija bubrega omogućava eliminaciju neželjenih krajnjih proizvoda metabolizma, kao i viška neorganskih supstanci koje se unose hranom. U krajnje proizvode metabolizma koji se izlučuju bubrezima spadaju neproteinska azotna jedinjenja kao što su ureja, kreatinin i mokraćna kiselina, a zatim i brojne organske kiseline uključujući i aminokiseline. Sadržaj hrane je vrlo raznovrstan a u hrani se često nalaze u višku natrijum, kalijum, hloridi, kalcijum, fosfati, magnezijum, sulfati i bikar� bonati. Sposobnost bubrega da izlučuju višak unetih supstanci vidi se na primeru natrijuma: koncentracija natrijuma u organizmu je konstantna, bez obzira da li se hranom unosi 1 ili 150 mmol. Mehanizmi ekskrecije viška elektrolita, azotnih jedinjenja i organskih kiselina su slični mada nisu identični, a brzina ekskrecije zavisi od njihove koncentracije u plazmi i brzine filtracije kroz glomerule. Količina ovih supstanci koje se izluče urinom zavisi od kapaciteta tubula za reapsorpciju i obično je manja od količine koja se profiltrira u glomerulima, izuzev za one supstance koje se dodatno sekreti� raju u tubulima. Kroz membranu u glomerulima vrlo lako prolaze supstance čiji je prečnik manji od 1,8 nm (voda, joni, glukoza itd.), a nešto teže supstance sa prečnikom od 1,8 do 4,2 nm. Supstance sa prečnikom većim od 4,2 nm ne mogu da prođu glomerularnu membranu. Kanali u glomerulima su negativno na� elektrisani što omogućava da lako prolaze pozitivno naelektrisani molekuli, tako da se pozitivno nae� lektrisani molekuli sa prečnikom 3 nm lakše filtriraju nego negativno naelektrisani molekuli iste veličine. Imunološke i inflamatome bolesti koje oštećuju glomerularnu membranu smanjuju negativno nae� lektrisanje, pa negativno naelektrisani molekuli lakše prolaze, tako da se kod mnogih glomerularnih oštećenja u urinu mogu da nađu proteini. Određivanje brzine g lomerula rne filtracije
Brzina glomerularne filtracije predstavlja zapreminu glomerulamog filtrata koja se stvori u jednom minutu. Kod zdravih osoba brzina glomerularne filtracije je konstantna i iznosi oko 180 L dnevno ili 125 mL/min, a u mnogim bolestima se smanjuje čime se smanjuje sposobnost bubrega da regulišu zapreminu i sastav telesnih tečnosti. Stepen oštećenja bubrega procenjuje se merenjem brzine glomerularne filtracije. U praksi se brzina glomerularne filtracije meri određivanjem klirensa različitih en�
12�2
Medicinska biohem\\a
dogenih i egzogenih supstanci, a najčešće se u tu svrhu koriste klirens kreatinina i klirens inulina. Po jam klirensa je uveden još 1921. godine, a označava zapreminu plazme koja se u jedinici vremena potpuno "očisti" (od engleske reci "clear") od neke supstance i obično se izražava u mL/s. Klirens kreatinina Kreatinin je jedinjenje čija je sinteza, kao i difuzija u telesne tečnosti konstantna, a konstantna je i koncentracija u plazmi. Izlučuje se tako što se u glomerulima potpuno filtrira, a vrlo malo u tubulima dodatno sekretira. Zbog tih osobina predstavlja dobar parametar za procenu glomerulame filtracije. Na određivanje, a time i na interpretaciju klirensa kreatinina utiče dobrim delom i to što se za određi vanje kreatinina uglavnom koriste nespecifične metode zasnovane na reakciji sa alkalnim pikratom. U ovim metodama interferiraju nekreatininski hromogeni, koji se nalaze samo u serumu, a ne i u urinu, pa time utiču samo na rezultat za serum. Uticaj hromogena je manji što je koncentracija kreatinina viša. Klirens kreatinina može da se odredi sakupljanjem urina u toku 4, 12 ili 24 sata. Za to vreme pacijent treba da uzima dovoljnu količinu vode (da bi se obezbedio protok urina od 2 mL/min), ali ne čaj, kafu ili lekove. Pošto je koncentracija kreatinina u plazmi konstantna, nema značaja vreme kada se uzima krv, ali se preporučuje da to bude u sredini vremenskog perioda u kome se sakuplja urin. Kreatinin se odredi i u serumu i u urinu, a klirens se izračunava prema izrazu: klirenskreatininamL / s = — — — x —— Krs A gdeje: Kru � koncentracija kreatinina u urinu Krs � koncentracija kreatinina u serumu u istim jedinicama kao u urinu Vu � zapremina urina u ml_ 1,73 � standardna površina tela u m2 A � površina tela pacijenta u m2 Klirens kreatinina zavisi od površine tela, tako da se standardna površina tela od 1,73 m2 mora da koriguje površinom tela pacijenta, koja se izračunava iz težine i visine prema sledećoj formuli: A = j °' 4 2 5 xv °� 7 2 5 x71,84 gde je: A � površina tela u cm 2 , T � težina u kg, V � visina u cm Ova formula može da se napiše u sledećem obliku koji je jednostavniji za izračunavanje: log P = 0,425 log T + 725 log V � 2,144 gde je: P površina tela u m 2 .
Klirens inulina Inulin je idealna supstanca za određivanje brzine glomerulame filtracije iz sledećih razloga: 1. Inulin je polimer fruktoze koji ima sfernu strukturu i molekulsku masu 5000. Inulin se u glomerulima slobodno filtrira jer nema naelektrisanje i ne vezuje se za proteine plazme. Kako je egzogena supstanca u organizmu se ne sintetiše, ali se i ne razgrađuje. 2. Inulin se u tubulima ne reapsorpbuje niti se sekretira 3. Inulin nije toksičan i ne menja bubrežnu funkciju 4. Klirens inulina je nezavisan od volumena finalnog urina, jer se njegova koncentracija u urinu smanjuje proporcionalno porastu volumena urina. Pod stabilnim uslovima brzina kojom inulin prolazi glomerulamu membranu jednaka je brzini ko jom inulin stiže u finalni urin, tako da se merenjem koncentracije inulina u urinu može da proceni brzina glomerulame filtracije. Nedostatak određivanja klirensa inulina je što konstantna koncentracija u serumu pacijenta održava putem infuzije
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�3
REGULATORNA FUNKCIJA BUBREGA Regulatorna funkcija bubrega ima glavnu ulogu u homeostazi vode, elektrolita i vodoničnog jona, a ostvaruje se različitim mehanizmima reapsorpcije i sekrecije koji se odvijaju u tubulima. Ovi mehanizmi su pod kontrolom kompleksnih sistema ekstrarenalnih i intrarenalnih humoralnih faktora. Reapsorpcija u tubulima Zdravi proksimalni tubuli reapsorbuju oko 70% filtrirane vode, Na +, Cl", K+, kao i većina filtrirane glukoze, peptida i aminokiselina. Reapsorpcija Cl" je pasivna i sledi aktivnu reapsorpciju Na + da bi se održala elektroneutralnost. Reapsorpcija vode je pasivna kao rezultat osmotskih sila koje se stvaraju reapsorpcijom NaCI, a ekstremno visoka propustljivost proksimalnih tubula za vodu je esencijalna za skoro izoosomotsku reapsorpciju u ovom delu tubula. Svi reapsorpcioni procesi su povezani sa funkcijom Na+�K+�pumpe, a aktivna reapsorpcija rastvorenih supstanci čini da je tubularna tečnost malo razblaženija, a intersticijalna tečnost malo koncentrovanija u odnosu na tubulocite. Veliki broj supstanci se reapsorbuju u prcksimalnim tubulima zajedno sa Na + uz pomoć specifičnih simportera. Glukoza je tipičan primer za ovu reapsorpciju jer luminalna membrana sadrži Na +, glukoza�kotransporter (SGLT2), a bazolateralnu membranu glukoza prolazi olakšanom difuzijom. Genetski defekt u ovom proteinu razlog je za pojavu renalne glukozurije, kao što je genetski defekt u sličnom intestinalnom proteinu (SGLT1) razlog za pojavu malapsorpcije glukoze i galaktoze. Reapsorpcija Na + je takođe povezana sa sekrecijom H + iz tubulocita uz pomoć Na +/H+�antiportera, a važnu ulogu u tom procesu ima Na +�K+�pumpa na bazolateralnoj membrani koja izbacuje Na + u intersticijal� nu tečnost i krv. Sekrecija H + u gornjem delu proksimalnih tubula povezana je sa reapsorpcijom bi� karbonata. U drugoj polovini proksimalnih tubula Na + se reapsorbuje zajedno sa Cl" i to prolaskom kroz membranu ili paracelulamim putem. U ovom delu tubula tubularna tečnost sadrži visoku koncentraci ju Cl" i malo organskih molekula, a prelazak Cl" iz tubulame tečnosti u krv dovodi do toga da je tubularna tečnost pozitivno naelektrisana u odnosu na krv. Natrijum prolazi luminalnu membranu uz pomoć Na +/H+� i Na +/Cr�antiportera, a H + koji prelazi u tubularnu tečnost vezuje se anjonima. U debelom uzlaznom delu Henleove petlje održava se niska koncentracija Na + u ćeliji uz pomoć Na+,K +�pumpe, što omogućava dalju elektroneutralnu reapsorpciju 1 Na +, 1 K+ i 2CI" uz pomoć Na+/K+/CI"�simportera. Kanali za Cl" nalaze se na bazolateralnoj membrani, tako da Cl" može da pređe u intertsicijalnu tečnost, a kanali za K + se nalaze na svim membranama i K + može da kruži. Ovaj deo Henleove petlje je nepropustljiv za vodu. U početnom delu distalnih tubula reapsorpbuje se NaCI, ali ne i voda, dok zadnji deo distalnih tubula funkcioniše slično sabirnim cevčicama. Na + i Cl" se reapsorpbuju uz pomoć Na +/CI~� simportera, a iz ćelije Na + izlazi uz pomoć Na +/K+�pumpe, a Cl" difuzijom kroz kanale za Cl". Diuretici tipa tiazida inhibiraju Na +/CI~�simporter. U ovaj deo tubula stiže samo mali deo filtrata iz glomerula jer je najveći deo već reapsorbovan. Zadnji deo distalnih tubula sagrađen je od dva tipa ćelija, slično kao i sabirne cevčice. Glavne ćelije reapsorbuju Na + i sekretiraju K+, a Na+/K+�pumpa na bazolateralnoj membrani izbacuje Na + i ubacuje K+ u glavne ćelije. Ove ćelije imaju specijalne jonske kanale na luminalnoj membrani koji su propustljivi za Na +, ali i za K+. Prolazak Na + kroz ove kanale depolarizuje luminalnu membranu (�70 mV) i čini da lumen postane elektronegativniji (�12 mV) u poređenju sa intersticijalnom tečnošću. Zbog toga K + vrlo brzo difunduje u tubularnu tečnost, a sekrecija K + je povezana sa reapsorpcijom Na +. Količina Na + koja se reapsorpbuje u distalnim tubulima je mnogo manja od količine koja je reap� sorbovana u proksimalnim tubulima, ali može da se poveća pod uticajem aldosterona. Aldosteron je mineralokortikoid koji omogućava reapsorpciju Na + (pa i Cl") i sekreciju K + (i H+) u glavnim ćelijama. Aldosteron ulazi iz krvi i vezuje se za receptore, a kompleks aldosteron�receptor stimuliše sintezu bazolateralne Na +/K+�pumpe i luminalnih kanala za Na +. Aldosteron je osnovni kontrolni mehanizam za koncentraciju K + u ekstracelulamoj tečnosti, a sekrecija K + počinje kada je koncentracija K + u ECT veća od normalne. Aldosteron takođe stimuliše reapsorpciju Na + (i GI�) i sekreciju K + (i H+) u znojnim i salivarnim ćelijama na isti način kao u distalnim tubulima.
12�4
Medicinska biohem\'\a
Interkalirane ćelije sekretiraju H+ kroz luminalnu membranu i reapsorbuju K+, a sekrecija H + uz pomoć H+�pumpe precizno je određena koncentracijom H + u ECT. U sabirnim cevčicama takođe postoje glavne i interkalirane ćelije. Luminalna membrana glavnih ćelija može biti propustljiva ili nepropustljiva za vodu, u zavisnosti od prisustva antidiuretičnog hormona (ADH). ADH povećava propustljivost luminalne membrane zavodu stvaranjem kanala za vodu (akvaporina), a bazolateralna membrana sadrži druge vrste akvaporina koji su propustljivi za vodu bez obzira da li je prisutan ADH ili ne. Mutacija u genima za akvaporine uzrok je nastanka nefroge� nog diabetes insipidusa. Sekrecija u tubulima U proksimalnim tubulima se sekretiraju različite endogene supstance i lekovi. Ova jedinjenja izlaze iz peritubulamih kapilara i prelaze u tubulocite uz pomoć simportera na bazolateralnoj membrani. Molekuli se transportuju nasuprot koncentracionom i hemijskom gradijentu, a energija za ovaj proces obezbeđuje se uz pomoć Na+/K+�pumpe na bazolateralnoj membrani. Unutar tubulocita molekuli se akumuliraju sve dok ne budu u mogućnosti da prođu kroz luminalnu membranu. U tubulamu tečnost se transportuju uz pomoć antiportera, a većina supstanci koje se sekretiraju na ovaj način kompetira� ju za antiportere na luminalnoj membrani i jedna drugoj ometaju sekreciju. U endogene supstance koje se sekretiraju u proksimalnim tubulima spadaju adrenalin, žučne soli, cAMP, kreatinin, dopamin, hipurat, noradrenalin, organske kiseline, oksalat, prostaglandini, steroidi i urat. Lekovi koji se sekretiraju u ovom delu tubula su acetazolamin, amilorid, atropin, bumetanid, hlortiazid, cimetidin, furosemid, hidrohlortiazid, morfin, nitrofurantoin, p�aminohipurna kiselina (PAH), penicilin, fenol crveno, probenecid, sulfonamidi i acetilsalicilna kiselina. Sve ove supstance imaju različit ali vrlo visok afinitet za organski kiselo�bazni sekretomi sistem u proksimalnim tubulima koji pokazuje kinetiku zasićenja. Organski katjoni se sekretiraju slično kao i organski anjoni. Testovi za ispitivanje funkcije proksimalnih i distalnih tubula Za ispitivanje funkcije proksimalnih tubula koriste se sledeći testovi: 1. Oko 3 g albumina prolazi dnevno kroz membranu glomerula, a najveći deo se reapsorpbuje pinocitozom kroz četkastu prevlaku proksimalnih tubula; normalno se izluči manje od 150 mg/dan. Unutar ćelije albumin se razlaže do aminokiselina, koje zatim prolaze kroz bazolateralnu membranu mehanizmom olakšane difuzije. Ukoliko je proces reapsorpcije poremećen u urinu će se pojaviti više albumina i ta količina može da se kreće od 1 do 3 g/dan. Pojava i drugih proteina male molekulske mase, kao stoje p2�mikroglobulin takođe je znak poremećene reapsorpcije u tubulima. 2. Generalizovana aminoacidurija, odnosno izlučivanje velikih količina različitih aminokiselina (ko je su kao i glukoza supstance sa pragom) znak je poremećene rapsorpcije u proksimalnim tubulima. 3. Glukozurija u odsustvu hiperglikemije ukazuje na poremećaj reapsorpcije u proksimalnim tubulima, pošto se sva glukoza normalno reapsorpbuje pre nego što glomerulami filtrat dođe do kraja proksimalnih tubula. 3. Hipokalemija praćena normalnim ili povećanim izlučivanjem K+, znak je poremećene reapsorpcije u proksimalnim tubulima. 4. Određivanje klirensa p�aminohipume kiseline (PAH) koristi se merenje sekretornog kapaciteta proksimalnih tubula. Pacijentu se i.v. infuzijom aplicira PAH da se postigne koncentracija od 50 mg/100 ml_, jer se tom koncentracijom postiže maksimalna sekrecija PAH, koja iznosi 80 mg/min/1,73 m 2. Količina PAH koja se odredi u urinu predstavlja rezultat filtracije u glomerulima i se� krecije u tubulima, pa je potrebno odrediti brzinu glomerularne filtracije (uz pomoć klirensa kreatini� na). Razlika između ulkupne količine ekskretovane PAH i količine koja je profiltrirana u glomerulima predstavlja količinu koja je sekretovana u proksimalnim tubulima. Za ispitivanje funkcije distalnih tubula koriste se sledeći testovi:
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�5
1. Sposobnost bubrega za koncentrovanje urina procenjuje se preko osmolalnosti jutarnjeg urina. Kada je osomolalnost plazme između 275 i 290 mOsm/kg, onda je osmolalnost jutarnjeg urina iznad 600 mOsm/kg, što govori da je očuvana sposobnost bubrega za koncentrisanje urina. Za razlikovanje hipotalamusnih i renalnih uzroka koji mogu da dovedu do poremećaja sposobnosti bubrega za koncentrisanje ili diluciju urina rade se funkcionalni testovi. Test koncentrisanja urina izvodi se tako što pacijent određeno vreme (16�24 sata) ne unosi tečnost, a zatim se meri osmolalnost urina. Kod zdrave osobe osmolalnost će biti vrlo visoka (oko 900 mOsm/kg) što znači da je bubreg sposoban da čuva vodu, odnosno količina ADH koja se luči je dovoljna. Kod pacijenata koji imaju potpuni nedostatak ADH osmolalnost urina ne prelazi 300 mOsm/kg, a kod pacijenata sa parcijalnim nedostatkom ADH osomolalnost je između 300 i 800 mOsm/kg. Ako se dobiju patološke vrednosti testa, prelazi se na drugi stepen, odnosno davanje ADH, čime se razlikuje pituitami od nefrogenog uzroka patološkog rezultata testa. Ako je razlog nedovoljno lučenje ADH, posle davanja ADH paci jenti će izlučivati urin visoke osmolalnosti, što znači da je nesposobnost bubrega da koncentrišu urin pituitarnog porekla. Ukoliko je problem na nivou renalnih receptora za ADH i posle davanja hormona pacijenti će izlučivati urin male osmolalnosti. Pored testa koncentrisanja, u nekim slučajevima se izvodi i test dilucije kod koga se pacijent u vrlo kratkom vremenu optereti sa 1 � 1,5 L vode i kod zdrave osobe se u toku tri sata izluči najmanje polovina ove količine, a u uzorcima urina koji se tom prilikom dobiju (najmanje u jednom) osmolalnost treba da bude manja od 80 mOsm/kg. Ovaj test nije od velikog značaja za procenu funkcionalnih oštećenja bubrega jer mnogi razlozi mogu da dovedu do smanjenog izlučivanja vode. 2. Nesposobnost bubrega da izlučuju urin čiji je pH < 5,3 ukazuje na distalnu renalnu tubularnu acidozu (poremećena reapsorpcija bikarbonata). Dijagnoza ove bolesti se potvrđuje izvođenjem testa acidifikacije urina, kod koga se pacijentu daje amonijum hlorid u dozi od 100 mg/kg telesne težine i meri se pH urina u toku 8 sati. Kod zdrave osobe pH urina mora pasti ispod 5,5, najmanje u posled� njem uzorku. Kod osoba sa distalnom RTA posle davanja amonijum�hlorida pH urina neće biti ispod 6,5, a pH krvi će biti manji od 7,35 i bazni eksces će biti negativan, a koncentracija bikarbonata ispod 21 mmol/L
ENDOKRINA FUNKCIJA BUBREGA Bubrezi mogu da se posmatraju kao endokrini organ jer se u njima sintetišu, aktiviraju i degradiraju hormoni. U svojoj primarnoj endokrinoj funkciji bubrezi sintetišu eritropoetin, renin i prostaglandi� ni. Bubrezi su primarno odgovorni za sintezu 1,25(OH) 2D3 iz 25(OH)2D 3. U bubrezima se neki hormoni degradiraju, npr. insulin i aldosteron.
PREGLED URINA Sastav finalnog urina zavisi od sposobnosti bubrega da zadrže i reapsorbuju supstance koje su esencijalne za bazni metabolizam i homeostazu, kao i da izluče višak supstanci unetih hranom zajedno sa krajnjim proizvodima metaboličkih i endokrinih procesa. Kod prosečnog unošenja proteina zdrav čovek dnevno izluči oko 10 g azota, od čega najveći deo otpada na ureju. Ostatak azota potiče iz mokraćne kiseline, kreatinina, aminokiselina, amonijaka, glikoproteina, proteina u tragu, enzima i purina. Izlučivanje natrijuma i hlorida je u direktnoj vezi sa količinom ove soli u hrani, tako da se u toku dana urinom može da izluči od 5 do 20 g natrijum hlorida. Kalijuma se izluči oko 70 mmol za dan. Od ostalih jona u urinu ima sulfata i fosfata, koji su najvećim delom odgovorni za kiselost urina. Sulfati se izlučuju u neorganskom obliku (iz metabolizma čistina i metionina), organskom obliku (konju� gati steroida i fenola) i u obliku supstanci koje sadrže sumpor (sulfidi, cistein i merkaptan). Izlučivanje fosfata je promenljivo i zavisi od količine nukleinskih kiselina u hrani, kao i od drugih organskih i ne� organskih fosfata.
12�6
Medicinska biohem\\a
Pored azotnih jedinjenja i soli urin sadrži malu količinu šećera (uglavnom pentoza), intermedijar� nih metabolita (oksalat, citrat, piruvat), slobodnih masnih kiselina, hormona, vitamina, metala u tragu, porfirina u tragu itd. Ispitivanje urina može da se posmatra sa dve glavne tačke gledišta: 1. Dijagnoza i praćenje bolesti bubrega i urinarnog trakta i 2. Detekcija metaboličkih i sistemskih bolesti koje nisu u direktnoj vezi sa bubrezima. U urinu može da se izvodi kvalitativna i kvantitativna analiza, uz pomoć fizičkih, hemijskih i mikroskopskih postupaka. Prvi uslov da bi analiza urina (bilo kvalitativna ili kvantitativna) bila uspešna je pravilno sakupljanje urina. Izgled urina Normalan urin je bistar, svetio do tamno žute boje koja uglavnom potiče od pigmenta urohroma i malih količina urobilina i uroeritrina. Izlučivanje urohroma je proporcionalno brzini metaboličkih reakcija i povećava se u toku groznice, tireotoksikoze i gladovanja. Sasvim svetao urin kod zdravih osoba znak je da se unosi mnogo tečnosti, dok se kod smanjenog unošenja tečnosti izlučuje urin tamne bo je. Međutim, sama boja urina ne mora da bude u direktnoj korelaciji sa njegovom koncentracijom. Primera radi, dijabetičari izlučuju urin sasvim svetle boje zbog velike količine vode, ali i velike relativne gustine zbog prisutne glukoze. Kada se urin ohladi sa telesne na sobnu temperaturu u njemu može da se formira precipitat, tako da je zamućen urin najčešće normalan. U alkalnom urinu se obrazuje precipitat od fosfata (ponekad i od karbonata), koji se rastvara zakišeljavanjem urina. U kiselom urinu taloži se urat (talog može biti beo ili svetio ružičast), a rastvara se zagrevanjem na 60°C. Kod zdravih osoba zamućenje urina može da potiče i od mucina iz urinarnog ili genitalnog trakta. U patološkim slučajevima leukociti mogu da prouzrokuju zamućenje slično onome koje obrazuju fosfati, ali se ono ne gubi dodavanjem kiseline. U ovom slučaju leukociti se jasno vide mikroskopskim ispitivanjem. Bakterije takođe mogu da prouzrokuju ravnomernu opalescenciju koja se ne gubi ni zakišeljavanjem, ni filtriranjem, a osim toga takav urin ima neprijatan miris zbog pretvaranja ureje u amonijak. I eritrociti mogu da budu uzrok turbiditeta boje dima, koji ne može da se eliminiše dodatkom kiseline ili zagrevanjem, a prisustvo eritrocita se u tom slučaju potvrđuje mikroskopski. Boja urina Kada urin ima neuobičajenu boju, potrebno je prvo proveriti hranu koju je pacijent uneo, jer se mnoge veštačke boje za bojenje namirnica izlučuju urinom, kao i lekove koje je uzeo. U patološkim slučajevima najčešće se pojavljuje crvena boja urina. Kod hematurije urin ima zamućen izgled boje dima ili je crvene, odnosno smeđe boje. Kod hemoglobinurije urin je bistar, a boja je svetio ili tamno crvena, odnosno smeđa, zavisno od količine hemoglobina. Methemoglobin daje urinu tamno smeđu boju i pojavljuje se u kiselom urinu posle dužeg stajanja. Od mioglobina u urinu potiče crveno� smeđa boja. Žuto�smeđa ili zeleno�smeđa boja je najčešće poreklom od žučnih pigmenata, uglavnom bilirubi� na, koji se stajanjem oksiduje u zeleni biliverdin. Mućkanjem urina koji sadrži bilirubin obrazuje se tamno žuta pena, za razliku od normalnog urina tamne boje, kod koga je pena uvek bela. Urin koji sadrži urobilin ima tamnu boju, sličnu normalnom koncentrovanom urinu i mućkanjem ne daje obojenu penu. Miris urina Normalan urin ima aromatičan miris nedefinisanog porekla. Kada u urinu ima bakterija stajanjem dolazi do razlaganja ureje i drugih sastojaka urina, pa miris postaje neprijatan. Miris urina mogu da promene i neki sastojci hrane, kao i neki lekovi.
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�7
Zapremina urina Prosečna zapremina urina koja se tokom dana izluči kod zdravih odraslih osoba je 1200 do 1500 ml_, ali se normalnim smatra raspon od 600 do 2000 ml_. Noću se izluči oko 400 ml_ i odnos zapre� mine noćnog prema zapremini dnevnog urina je 2:1 do 3:1. Mala deca izlučuju tri do četiri puta više urina po kg telesne težine nego odrasle osobe. Izlučivanje manje od 500 ml_ urina dnevno naziva se oligurija, a potpuni prestanak izlučivanja urina je anurija. Izlučivanje urina u zapreminama većim od 2000 mL je poliurija. Nokturija je izluči vanje urina u toku noći sa zapreminom većom od 500 mL i relativnom gustinom manjom od 1,018. Svako povećano unošenje vode u organizam izaziva poliuriju, a sreće se u nekim neurotičnim stanjima, kod uzimanja nekih farmakološki aktivnih supstanci (kofein, alkohol, diuretici), kao i kod di� betes mellitus�a i diabetes insipidus�a. U ova dva poslednja slučaja mehanizam nastajanja poliurije je potpuno različit. Kod diabetes insipidus�a se izlučuju velike zapremine urina male relativne gustine (jer nema delovanja antidiuretičnog hormona), a kod diabetes mellitus�a urin ima veliku relativnu gustinu jer se izlučuje glukoza. Poliurija se sreće i u nekim hroničnim progresivnim bolestima bubrega u kojima tubuli imaju smanjenu moć da koncentrišu urin. Oligurija kod koje je urin relativne gustine oko 1,030, sreće se kod dehidracije, koja može da bude posledica produženog povraćanja, dijareje, intenzivnog znojenja ili smanjenog unošenja vode. U stanju šoka je smanjen krvni pritisak, zbog čega je smanjena perfuzija bubrega, time i filtracija u glo� merulima, a to sve dovodi do oligurije. I akutni glomerulonefritis može da bude razlog za pojavu oli� g u rije. pH urina Proizvodi metaboličkih reakcija su neisparljive kiseline (sumporna, fosforna, hlorovodonična, mlečna, limunska, male količine ketonskih tela) koje se izlučuju u obliku natrijumovih soli. U tubulima se natrijumov jon izmenjuje sa vodoničnim jonom i urin postaje kiseo. Prosečan pH urina zdravih osoba je 6,0, a može da se kreće od 4,6 do 8,0, zavisno od hrane koja se unosi. Kada se hranom unosi dosta proteina urin je kiseliji (zbog veće količine fosfata i sulfata), a kod pretežno vegetarijanske ishrane urin ima pH preko 6,0. U poremećajima acido�bazne ravnoteže menja se pH urina kao posledica kompenzatornog mehanizma bubrega. Određivanje pH i kiselosti urina mora uvek da se izvodi u potpuno svežem urinu, jer se stajanjem gubi ugljen�dioksid i razlaže ureja do amonijaka, zbog čega se smanjuje kiselost. Obično je dovoljno da se pH odredi uz pomoć indikatorskog papira, i u tu svrhu se koristi papir za područje 5 � 9, sa mogućnošću određivanja pH vrednosti sa razlikama od 0,5 pH. Kod pacijenata sa poremećajima acido� bazne ravnoteže često je potrebno odrediti pH precizno uz pomoć pH�metra. pH�metar se baždari sa fosfatnim puferima poznatih pH (5,6 , 7,0 i 8,0) a zatim se izmeri pH urina. Relativna gustina urina Zapremina urina i koncentracija sastojaka u njemu zavise od sposobnosti bubrega da održavaju homeostazu telesnih tečnosti i elektrolita. Koncentracija sastojaka urina zavisi od količine vode i soli koja se unosi u organizam, od stanja tubulamih ćelija i od uticaja antidiuretičnog hormona na reap� sorpciju vode u distalnim tubulima. Zdrave osobe na prosečnoj ishrani i sa prosečnim unošenjem vode izlučuju urin čija je relativna gustina od 1,016 do 1,022 u toku 24 sata. Uzorak urina uzet posle noći u toku koje se ne unosi teč� nost ima relativnu gustinu oko 1,022, a posle 24�časovnog perioda bez vode oko 1,026. Ako slučajni uzorak urina ima relativnu gustinu 1,023 ili više smatra se da je koncentraciona sposobnost bubrega normalna. Najmanja relativna gustina slučajnog uzorka urina je 1,003. Relativna gustina urina meri se urinometrom, koji predstavlja hidrometar adaptiran za merenje na sobnoj temperaturi. Kako temperatura utiče na relativnu gustinu, uzorak urina mora da bude do�
12�8
Medicinska biohem\\a
veden na sobnu temperaturu. Ukoliko to nije slučaj potrebno je uraditi korekciju i to tako što se vred� nost relativne gustine umanjuje za 0,001 za svaka 3°C ispod 20°C, odnosno povećava za 0,001 za svaka 3°C iznad 20°C.
Korekcija relativne gustine mora da se uradi i u odnosu na sadržaj proteina i glukoze i to tako što se relativna gustina umanjuje za 0,003 za svaki g/100 ml_ bilo proteina bilo glukoze. Ovu korekciju je neophodno uraditi kod ispitivanja koncentracione i dilucione sposobnosti tubula. Relativna gustina može da se meri i refraktometrom, za koji je potrebno samo nekoliko kapi urina. Refraktivni indeks predstavlja odnos brzine svetlosti u vazduhu i brzine u rastvoru i on se povećava sa povećanjem koncentracije rastvorenih supstanci. Merenje relativne gustine urina refraktome� trijski zasniva se na tome da se upoređuje refraktivni indeks rastvarača (u ovom slučaju vode) i rastvora, lako se refraktometrom meri refraktivni indeks rastvora, skala za očitavanje na instrumentu ka� librisana je u jedinicama relativne gustine. Vrednosti relativne gustine urina izmerene refraktometrom niže su za oko 0,002 od onih koje se izmere urinometrom. Osmolalnost Zdrave osobe na prosečnoj ishrani i sa prosečnim unošenjem vode izlučuju urin čija je osmolalnost 500 do 850 mOsm/kg vode. Time što izlučuju urin koji je dva do tri puta koncentrovaniji nego plazma (prosečna osmolalnost plazme je 285 mOsm/kg) bubrezi održavaju homeostazu telesnih teč� nosti i elektrolita. Normalni bubrezi su sposobni da stvaraju urin osmolalnosti 800 do 1400 mOsm/kg vode u stanju dehidratacije, odnosno 40 do 80 mOsm/kg vode kod velikog izlučivanja vode. Osmolalnost rastvora zavisi od broja (a ne od prirode i mase) rastvorenih čestica i može biti određena uz pomoć osmometra merenjem sniženja tačke mržnjenja. Metoda se zasniva na činjenici da rastvor koji ima 1 mol neelektrolita u 1 kg vode snižava tačku mržnjenja za 1,858°C i njegova osmolalnost se definiše kao 1 osm/kg vode. Proteini u urinu Normalan urin sadrži neznatne količine proteina i to uglavnom onih sa malom molekulskom masom koji prolaze kroz membranu u glomerulima. Najveći deo tih proteina se reapsorbuje u tubulima, tako da finalni urin sadrži manje od 100 mg/L, što ne može da se dokaže uobičajenim testovima za dokazivanje proteina. Pozitivna reakcija na proteine znak je da se u urinu nalazi veća količina proteina nego što je normalno, što je najčešće posledica povećane propustljivosti glomerula. Od stepena oštećenja zavisi koji će proteini prelaziti u urin. Pojava proteina u urinu naziva se proteinurija Šećeri u urinu Glukoza nije normalno prisutna u urinu, jer se u tubulima potpuno reapsorbuje. Granica do koje je reapsorpcija potpuna naziva se bubrežni prag i za glukozu iznosi 9 � 1 0 mmol/L. Pojava glukoze u urinu naziva se glukozurija i ona je znak povećane koncentracije glukoze u krvi. U urinu mogu da se nađu i drugi šećeri. Kod žena u vreme dojenja u urinu može biti prisutna laktoza, a posle uzimanja većih količina voća urin može sadržati fruktozu i neke pentoze. Fruktoza i galaktoza mogu da se izlučuju urinom kao posledica enzimskog defekta u jetri. Ketonska tela u urinu Ketonska tela (acetosirćetna kiselina, beta�hidroksibuterna kiselina i aceton) nastaju beta� oksidacijom masnih kiselina i prisutni su u normalnom urinu samo u tragovima. Povećane koncentracije se sreću kod šećerne bolesti, kod gladovanja ili kada se izbace ugljeni hidrati iz ishrane. Pojava ketonskih tela u urinu naziva se ketonurija.
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�9
Urobilinogen u urinu Urobilinogen se normalno izlučuje urinom u malim količinama. Povećane količine urobilinogena u urinu sreću se kod bolesti jetre, kada ona nije u stanju da eliminiše urobilinogen koji enterohepatič� nom cirkulacijom dolazi iz creva, kao i kod hemoliticne žutice. Dokazivanje urobilinogena u urinu ima značaja za diferencijalnu dijagnozu žutica. Bilirubin u urinu Bilirubin se izlučuje urinom samo u patološkim stanjima i to kao glukuronid. To se dešava kod opstrukcije žučnih puteva, kada je otežano ili onemogućeno izlučivanje putem žuči, ili kod hemoliticne žutice, kada se stvaraju velike količine bilirubina. Pojava bilirubina u urinu naziva se bilirubinurija. Krv u urinu Kod zdravih osoba u urinu nije prisutna krv. U nekim patološkim stanjima urinom može da se izlučuje puna krv i ta se pojava naziva hematurija, a ona može biti vidljiva golim okom (makrohematuri� ja) ili samo mikroskopom (mikrohematurija). Međutim, postoje i stanja kada se urinom izlučuje samo hemoglobin i ta se pojava naziva hemoglobinurija. Hematuriju prati uvek hemoglobinurija. Nitriti u urinu U svežem urinu normalno nema nitrita. Kada urin stoji na sobnoj temperaturi u njemu se razmnožavaju bakterije, koje mogu da redukuju nitrate do nitrita. Pojava nitrita u sasvim svežem urinu uvek je znak infekcije urogenitalnog trakta (koli�bacilima, stafilokokama itd.).
ANALIZA SEDIMENTA URINA Sediment urina sadrži sve nerastvorljive materije (uobličene elemente) koji se sakupljaju u urinu u procesu glomerularne filtracije i tokom prolaska tečnosti kroz tubule i uriname puteve. Ćelije koje se nalaze u urinu potiču: 1. od deskvamacije i eksfolijacije epitelnih ćelija gornjih i donjih delova urinamog trakta, 2. od ćelija iz cirkulacije (eritrociti i leukociti). Druga vrsta uobličenih elemenata koji se sreću u urinu su cilindri, koji nastaju u bubrežnim tubu� lima i sabirnim cevčicama. Organizmi (bakterije, gljivice, paraziti) i neoplastične ćelije su strani elementi za urinami sistem i njihova ispravna identifikacija može biti važna za dijagnozu nekih bolesti urinarnog sistema. Za analizu sedimenta urina obično se koristi prvi jutarnji, ili neki drugi slučajni uzorak urina. Urin se analizira svež, jer stajanjem dolazi do liže prisutnih ćelije, a ako nije moguća analiza u toku prvog sata, urin se obavezno čuva u frižideru. Eritrociti Hematurija je prisustvo abnormalnog broja eritrocita u urinu, čiji uzrok može da bude: oštećenje glomerula, tumori koji su oštetili urinami trakt u bilo kom njegovom delu, kamenci u urinarnom traktu, renalni infarkt, akutna tubularna nekroza, infekcija gornjih ili donjih delova urinarnog trakta, trauma bubrega, nefrotoksini i fizički stres. Eritrociti mogu da dospeju u urin i iz menstrualne krvi ili kao pos� ledica traume mokraćne bešike posle kateterizacije. Teorijski u urinu ne bi trebalo da bude eritrocita, ali i kod sasvim zdravih osoba može da se nađe po neki. Međutim, ako se u svakom mikroskopskom polju nađe jedan ili više eritrocita, a isključena je kontaminacija, verovatno se radi o patološkom uzorku. Rezultati se u izveštaju daju kao najmanji i najveći broj (5�10 eritrocita), a kada je broj veći od 60 u izveštaju se piše "masa eritrocita".
12�10
Medicinska biohem\\a
Eritrociti mogu biti normalnog izgleda, smežurani (ako je urin koncentrovan) ili nabubreli (ako je urin razblažen i tada u njima ostane samo opna i slobodan hemoglobin). Nekada je ovako promenje� ne eritrocite teško razlikovati od leukocita. Leukociti
Piurija je prisustvo abnormalnog broja leukocita u urinu, čiji uzrok može da bute infekcija ili gornjih ili donjih delova urinamog trakta, kao i akutni glomerulonefritis. leukociti koji su obično prisutni u urinu su granulociti. U urin mogu da dospeju leukociti ako postoji vaginalna ili cervikalna infekcija kod žena, ili infekcija spoljašnjih uretralnih delova kod muškaraca. Ako se u svakom mikroskopskom polju vidi jedan ili više leukocita, uzorak je verovatno patološki. Leukociti imaju jedro i granuliranu citopla� zmu. Epitelne ćelije
Renalne tubularne ćelije su obično veće od granulocita, imaju veliko okruglo ili ovalno jedro i normalno se u urinu nalaze u malom broju. Međutim, njihov broj se povećava kod nefrotskog sindroma, kao i kod procesa koji dovode do degeneracije tubula. U slučajevima kada postoji lipidurija ove ćelije sadrže endogene masti, kad su tako ispunjene brojnim masnim kapljicama označavaju se kao "masne kapi" ili "masna tela" u urinu. Tranzitne epitelne ćelije koje su poreklom iz renalnog pelvisa, uretre ili mokraćne bešike maju manje jedro u odnosu na veličinu ćelije nego ćelije renalnog tubularnog epitela. Skvamozne epitelne ćelije koje su poreklom sa kože mogu da dospeju u urin iz spoljašnje uretre. Njihovo prisustvo je dokaz daje uzorak kontaminiran sa kožnom florom. Cilindri
Cilindri se stvaraju samo u distalnim tubulima (DCT) ili sabirnim cevčicama, dok to nije slučaj sa proksimalnim tubulima (PCT) i Henleovom petljom. Hijalini cilindri su sastavljeni prvenstveno od mu� koproteina (Tamm�Horsfall protein) koga sekretiraju tubularne ćelije. Oštećenje glomerula može da dovede do povećanja propustljivosti glomerula za proteine, što dovodi do proteinurije, a matriks ili "lepak" koji povezuje uriname cilindre je Tamm�Horsfall protein, mada mogu da budu inkorporirani i albumin i neki globulini. Eritrociti mogu da se slepe međusobno i da obrazuju eritrocitne cilindre. Ovi cilindri ukazuju na glomerulonefritis sa propuštanjem eritrocita kroz glomerule, ili na teško oštećenje tubula. Leukocitni cilindri su tipični za akutni pijelonefritis, ali mogu da budu prisutni i kod glomerulonefritisa. Njihovo prisustvo ukazuje na inflamaciju bubrega, jer oni stvaraju isključivo u bubrezima. Faktori koji favorizuju stvaranje proteinskih cilindara su mala brzina protoka tečnosti kroz tubule, visoka koncentracija soli i nizak pH, odnosno sve ono što izaziva denaturaciju i precipitaciju proteina, posebno Tamm�Horsfall proteina. Proteinski, odnosno hijalini cilindri su dugački i tanki jer se formira ju na prelasku Henleove petlje u distalni tubul i nazivaju se još i cilindroidi. Ovi cilindri mogu da se nađu i kod zdravih osoba. Kada ćelijski cilindri ostanu neko vreme u nefronu pre nego što pređu u mokraćnu bečiku, ćelije mogu da se degenerišu i da postanu grubo granulirani cilindri, kasnije fino granulirani cilindri i na kra ju voštani cilindri. Granulirani i voštani cilindri su poreklom iz cilindara nastalih od renalnih tubularnih ćelija, što se dešava kod oštećenih i proširenih tubula, odnosno u krajnjim stadijumima hroničnih renalnih bolesti. Takozvani teleskopski urinarni sediment je onaj u kome su eritrociti, leukociti, ovalne masne kapi i sve vrste cilindara zastupljeni u manje više jednakom odnosu. Uzroci koji mogu da dovedu do teles� kopskog sedimenta su: 1. lupus nephritis, 2. maligna hipertenzija, 3. dijabetična skleroza glomerula i 4. brzi progresivni glomerulonefritis. U krajnjem stadijumu renalnih bolesti bilo kog porekla, urinarni sediment je vrlo siromašan pošto mali broj preostalih nefrona stvara vrlo razblaženi urin.
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�11
Bakterije su uobičajeno prisutne u urinu ? poreklom su iz normalne mikrobiološke flore vagine ili spoljašnjih delova uretre, a i zbog njihove ekstremne sposobnosti da se brzo umnožavaju stajanjem urina na sobnoj temperaturi. Dakle, mikrobiološki organizmi nađeni u većini pažljivo sakupljenih uzoraka urina treba da se posmatraju u svetlu kliničkih simptoma. Dokazana bakteriurija kod sumnje na infekciju urinamog trakta zahteva urinarnu kulturu. Gljivice mogu biti posledica kontaminacije ili prave gljivične infekcije. Njih je nekad teško razliko vati od eritrocita i amorfnih kristala, ali se razlikuju uglavnom po tome što imaju tendenciju da pupe. Najčešće prisutna gljivica je Candida, koja može da bude lokalizovana u bešici, uretri ili vagini. Kristali koji se najčešće sreću kod zdravih osoba su kalcijum�oksalat, trifosfat i amorfni fosfati. Neuobičajeni kristali su: kristali čistina u urinu novorođenčadi sa kongenitalnom cistinurijom ili teškim bolestima jetre, kristali tirozina kod kongenitalne tirozinoze ili značajno poremećene funkcije jetre ili kristali leucina kod pacijenata sa teškim bolestima jetre ili sindromom "marple syrup urine disease".
MOKRAĆNI KAMENCI Kamenci su depoziti hemijskih supstanci u čvrstom obliku koji se pojavljuju u svim delovima urinamog trakta. Na njihovo stvaranje utiče više različitih činioca: 1. metabolički poremećaji (cistinurija i giht) 2. endokrinopatije (hiperparatiroidizam) 3. opstrukcija urinamih puteva 4. infekcije 5. mukozna metaplazija (pojavljuje se u nedostatku vit. A) 6. neuobičajene situacije, kao što je stanje dehidratacije, uzimanje mnogo hrane ili lekova, hemo� terapija itd. 7. izohidrurija (istovremeni gubitak i kiselih i baznih jedinjenja) Mnogi kamenci imaju jasno definisano jezgro oko koga se talože hemijska jedinjenja. Kao jezgro mogu da posluže bakterije, epitelne ćelije, fibrin, koagulumi krvi itd., a uvećavanje kamenaca zavisi od pH urina i rastvorljivosti svake supstance. Približno 30 � 40% kamenaca ima "čist" sastav, dok ostali sadrže najmanje dva glavna konstitu� enta važna za postavljanje dijagnoze i određivanje terapije. Kalcijum je glavni katjon nađen u kamencima a sa njim su vezani oksalat, fosfat i karbonat. Zajedno sa kalcijum oksalatom može da se nađe apatit i mokraćna kiselina, ako je urin kiseo, a magnezijum amonijum fosfat u alkalnom urinu. Cistin, ksantin i fibrin su redi sastojci urinarnih kamenaca. U toku formiranja kamenaca u njih mogu da se inkorporiraju i druge supstance: teški metali, fluo� ridi, aminokiseline, albumin, mukopolisaharidi i mukoproteini. Kamenci su različite veličine, izgleda i boje, ali samo fizičke karakteristike kamenaca nisu dovoljne za identifikaciju njihovog sastava. Kamenci od kalcijum�oksalata su jako tvrdi, najčešće tamne bo je i ima ih od malih i glatkih do velikih sa hrapavom površinom. Kamenci od kalcijum�karbonata su takođe tvrdi, obično mali i okrugli sa bojom koja ide od bele do sive. Uratni kamenci su mali, okrugli, glatki i žute do smeđe boje. Fosfatni kamenci su glatki ili hrapavi, blede boje, a cistinski i ksantinski kamenci su voštanog izgleda i blede boje.
12�12
Medicinska biohem\\a
Ureja Krajnji proizvod metabolizma aminokiselina i proteina kod sisara je ureja. Kod zdravih osoba se dnevno sintetiše oko 0,5 � 0,7 mol ureje (30 � 40 g), a sinteza u prvom redu zavisi od količine proteina koja se unosi hranom, kao i od endogenog katabolizma proteina (1 g azota iz ureje odgovara 6,25 g proteina). Kod unošenja većih količina proteina nivo ureje u krvi može da se tri puta poveća. To je moguće stoga što se enzimi koji učestvuju u ciklusu ureje nalaze u višku i njihova aktivnost može da se adaptira na vrlo veliku količina proteina u hrani (dnevno može da se sintetiše do 1,5 mol ureje). Sintezu ureje stimuliše i opterećenje svake vrste (težak mišićni rad, stresne situacije itd.), kao i hormoni koji pojačavaju katabolizam proteina (glukokortikoidi i tiroksin). Androgeni i hormon rasta imaju anabolički efekat, pa prema tome smanjuju sintezu ureje. Biosinteza ureje po svom kvantitetu premašuje biosintezu svih ostalih supstanci u organizmu. Sinteza ureje se odvija u jetri, najvećim delom u mitohondrijama, u seriji reakcija koje se označa vaju kao ciklus ur eje. Ci kl us ureje je en de rg on sk i proces (AG = +5 9 kJ/mol) i za visi od me taboličkih procesa u kojima se obezbeđuje energija. GIT
JETRA
KRV
proteini
proteini iz hrane
It
aminokiseline
«• aminokiseline
sinteza aminokiselina NH,
CO,
\y
skelet uglj. hidra ta
NH 3
razgradnja (C 0 2> H 2 0)
bakterijska ureaza
ureja
�• NH 3
razgradnja aminokiselina
ureja
�*•
BUBREZI izlučivanje ureje
Slika 12�1. Sinteza i promet ureje Ureja je glavni proizvod detoksikacije amonijaka, koji za sisare predstavlja ćelijski otrov. U eks� tracelulamoj tečnosti, čiji je pH 7,4, odnos amonijaka i amonijum jona je 1:70, tako da se od ukupne količine amonijaka samo oko 1,5% nalazi kao rastvoreni gas. Amonijum jon nastaje najvećim delom u intermedijarnom metabolizmu posle razgradnje aminokiselina i drugih azotnih metabolita. Značajne
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�13
količine amonijum jona nastaju i u lumenu creva razgradnjom azotnih jedinjenja pod uticajem bakteri ja i ovaj amonijum jon portalnim krvotokom dolazi u jetru. U mnogim tkivima se amonijak eliminiše vezivanjem na ketokiseline, pri čemu nastaju aminokise� line, uglavnom glutamat, aspartat i alanin, kao i amidiranjem glutamata u glutamin. Najvažniji put eliminacije amonijaka je sinteza ureje u ciklusu ureje koji se odigrava u jetri. Iz jetre ureja prelazi u krv, a iz nje u sve ekstra� i intracelularne tečnosti jer je ureja slobodno difuzibilan molekul koji prolazi kroz sve membrane propustljive za vodu. Ureja se izlučuje u prvom redu putem urina, nešto malo znojem, a putem fecesa samo u neznatnim količinama. Ureja se u organizmu raspodeljuje na isti način kao i voda jer prolazi kroz sve membrane koje su propustljive za vodu, a njena koncentracija u vodenoj fazi ekstra� i intracelularne tečnosti je gotovo ista. Treba napomenuti da ureja difunduje iz krvi u lumen creva, gde se razgrađuje na amonijak i ugljendioksid pod uticajem ureaze iz bakterija, a amonijak ponovo dolazi u jetru u ciklus ureje. Na ovaj način se razgradi i do 40% od ukupne količine ureje. Zbog ove razgradnje u digestiv� nom traktu količina izlučene ureje je manje od količine koja se svakodnevno stvara. U glomerulima se ureja filtrira a u tubulima, uglavnom proksimalnim, reapsorbuje i to pasivnom difuzijom zajedno sa vodom. Reapsorbuje se 40 � 80% profiltrirane ureje, zavisno od brzine protoka tubularne tečnosti. U bubrezima sisara nema aktivne reapsorpcije niti sekrecije ureje. Ureja čini polovinu suve mase urina, a na nju otpada 80 do 90% ukupnog azota u urinu. Koncentracija ureje u krvi zdravih osoba se menja u širokom rasponu jer, kao što je napred rečeno zavisi od: � količine proteina koja se unosi hranom, � metaboličkog statusa, odnosno obima katabolizma proteina i � izlučivanja putem urina.
Poremećaji u koncentraciji ureje Povećanje koncentracije ureje u krvi označava se kao azotemija. Azotemija se prema poreklu najčešće deli na na prerenalnu, renalnu i postrenalnu. Prerenalna azotemija može da se podeli u dve glavne kategorije. Prva je posledica neodgovarajuće perfuzije bubrega, pa prema tome smanjene glomerularne filtracije uz istovremenu normalnu bubrežnu funkciju. Sreće se kod dehidratacije (diare� ja, povraćanje, opekotine, dijabetes), šoka, hipovolemije i kongestivnih bolesti srca (srce nije u stanju da pumpa dovoljne količine krvi u bubrege). Druga kategorija prerenalnih azotemija je vezana za pojačan katabolizam proteina, a javlja se kod intestinalnih krvavljenja, intravazalne hemolize, stresa, nekroze tkiva, terapije glukokortikoidima itd. U ovu grupu spadaj egzogena azotemija, kada se zbog pojačanog unošenja proteina, uglavnom putem infuzija i transfuzija, stvaraju velike količine ureje. Renalna azotemija nastaje zbog smanjene glomerularne filtracije, kada dolazi do zadržavanja ureje u krvi, a prisutna je u većini akutnih i hroničnih bolesti bubrega. Koncentracija ureje u krvi se povećava kada se glomerularna filtracija smanji na polovinu. Postrenalna azotemija je posledica opstrukcije urinarnog trakta, zbog čega dolazi do reapsorpcije ureje nazad u cirkulaciju. Do opstrukcije dolazi zbog prisustva tumora, kamena ili nagomilanih cilindara. Značajno snižene koncentracije ureje u krvi sreću se u malom broju slučajeva. Uglavnom su posledica smanjenog unošenja proteina, pojačane sinteze proteina (u kasnoj trudnoći ili ranom detinj� stvu), kao i kod unošenja velikih količina tečnosti (pićem ili intravenski), kada se u tubulima reapsor� buju male količine ureje zbog povećane brzine protoka urina. Teške bolesti jetre takođe uslovljavaju smanjenu sintezu ureje. U svakom slučaju snižene koncentracije ureje u krvi nemaju veliki dijagnostički značaj, jer za prepoznavanje tih stanja stoje na raspolaganju mnogo bolji parametri. Uopšte uzev određivanje ureje u krvi je nespecifičan i neosetljiv parametar za ocenu glomerularne funkcije, jer koncentracija ureje ne odražava bubrežnu funkciju. Razlog za to je, kao što je napred
12�14
Medicinska biohem\\a
rečeno) promenljiva sinteza ureje zavisna od endogene metaboličke situacije, kao i od egzogenog priliva proteina. Koncentracija ureje može da se koristi za izračunavanje koeficijenta ureja/kreatinin, koji kod zdravih osoba iznosi oko 60 (računato kao mol/mol). Ova se vrednost značajno povećava kod prerenalne oligurije, kod pojačanog katabolizma proteina, kod pojačanog unošenja proteina, kao i kod izrazite dehidratacije, zbog toga što se u tim stanjima koncentracija ureje mnogo brže povećava nego koncentracija kreatinina. Nasuprot ovome, vrednost ovog koeficijenta se snižava kod poliurije, smanjenog unošenja proteina, kao i stanja u kojima su metabolički procesi okrenuti u pravcu anabo� lizma. Takođe je snižen i kod hroničnih bolesti bubrega, jer se tada koncentracija kreatinina brže po većava nego koncentracija ureje.
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�15
Kreatin i kreatinin Kreatin ima važnu ulogu u metabolizmu mišića jer obezbeđuje visoko�energetsku fosfatnu grupu kroz sintezu kreatin�fosfata. Sinteza kreatina počinje reakcijom između glicina i arginina koju katalizu� je jedna amidotransferaza i u kojoj nastaje gvanidinoacetat. Reakcija je regulisana mehanizmom po vratne sprege, odnosno inhibiraju je povećane koncentracije kreatinina i obrnuto. Gvanidinoacetat se stvara u bubrezima, mukozi tankog creva, pankreasu i delimično u jetri. Gvanidinoacetat odlazi u jetru gde se metilira (metil grupu daje S�adenozil�metionin) i nastaje kreatin, koji se putem krvi distribuira po ćelom organizmu, a najviše u mišićne ćelije. Sadržaj kreatina u organizmu je proporcionalan mišićnoj masi, ali ne i telesnoj težini. Iz kreatin�fosfata oslobađa se kreatin kod svake mišićne kontrakcije, a veći deo ovog kreatina se ponovo fosforiliše. Ostatak se spontano ciklizacijom, pri čemu se izdvaja molekul vode, pretvara u kreatinin. Kreatinin je metabolički proizvod koji mora da se izluči, a njegova količina zavisi od mišićne mase, ali ne i od ishrane. Formiranje kreatinina je spontano i dnevno se oko 2% kreatina pretvori u kreatinin. Koncentracija kreatina u krvi je viša kod žena (45 do 76 umol/l) nego kod muškaraca (15 do umol/l) i podložna je promenama, za razliku od koncentracije kreatinina u krvi koja predstavlja stabilniji parametar. Kako je koncentracija kreatinina funkcija mišićne mase, kod muškaraca su vrednosti veće nego kod žena, a one osim toga zavise i od metode kojom su određene. Referentne vrednosti određene enzimskom metodom ili reakcijom sa alkalnim pikratom posle adsorpcije na Lloyd�ov rea� gens iznose: kod žena 50 � 80 umol/l a kod muškaraca 55 � 95 umol/l. Nespechičnijim metodama ko jima se određuju tzv. nekreatininski hromogeni, dobijaju se za 20 do 30 umol/l veće vrednosti. CH,
C=NH
+ ATP
kreatin� kinaza
NH, kreatin spontana, neenzimska ciklizacija
H2C� 0 =
CH, I "N.
\
C = NH
r
0 = P = 0
o kreatin�fosfat
CH,
H,0 +
H2C
N
I
0 = C
I
spontano
\
*C=NH y N '
H kreatinin
Slika 12�2. Sinteza kreatinina Kreatin se u glomerulima filtrira, a u proksimalnim tubulima gotovo potpuno reapsorbuje. Dnevno se izluči kod muškaraca manje od 0,3 mmol, a kod žena manje od 0,76 mmol. Kreatinin se u glome�
12�16
Medicinska biohem\\a
rulima takođe filtrira, ali se u tubulima ne reapsorbuje. Male ali značajne količine kreatinina se izluču ju takođe aktivnom tubularnom sekrecijom, koja se povećava kada se poveća koncentracija kreatinina u serumu, lako se smatra da je izlučivanje kreatinina konstantna veličina, ipak postoji intraindivi� dualna varijacija u njegovom izlučivanju, koja može da ide do 10%. Značajno povećanje izlučivanja kreatinina može da izazove jak fizički napor ili velika količina mesa u hrani. Normalno se kod žena izlučuje 5 do 16 mmol/dan, a kod muškaraca 7�18 mmol/dan kreatinina. Poremećaji u koncentraciji kreatina i kreatinina Koncentracija kreatina u serumu, kao i njegovo izlučivanje putem urina značajno se povećavaju kod nekroze mišićnog tkiva ili atrofije mišića, što se sreće kod različitih trauma, progresivne mišićne distrofije, poliomielitisa, nasledne amiotonije, dermatomiozitisa i gladovanja. Sinteza kreatina se po većava i kod uzimanja metiltestosterona, zatim kod dijabetične ketoacidoze i hipertiroidizma. Koncentracije kreatinina u plazmi se povećavaju iz dva razloga: zbog smanjene filtracije u glome� rulima i zbog povećanog oslobađanja iz mišića. Glomerulamu filtraciju smanjuju različite akutne i hro� nične bolesti bubrega, kao i kasniji stadijumi dijabetesa. Kreatinin se povećava u krvi i kada se zbog hipovolemije ili insuficijencije srca smanjuje perfuzija bubrega. Povećano oslobađanje kreatinina iz mišića javlja se posle traume ili u toku degenerativnih procesa, kao stoje npr. mišićna distrofija. Mnogi lekovi deluju nefrotoksično, što se odražava na koncentraciju kreatinina koja se povećava posle uzimanja ovih lekova. U te lekove spadaju soli litijuma, žive i talijuma, mnogi analgeti� ci/antiflogistici (aminopirin, indometacin, fenacetin, fenilbutazon), aminoglikozidi (amikacin, gentami� cin, kanamicin, tobramicin, streptomicin), drugi antibiotici (eritromicin, rifampin, tetraciklin i vankomi� cin), diuretici (naročito oni tipa tiazida i furosemid) i neki citostatici. Snižene vrednosti kreatinina nemaju dijagnostički značaj i obično se registruju kao prolazna po java. U prvom i drugom trimestru trudnoće često se zapažaju snižene vrednosti kreatinina. Zbog toga što je stvaranje i izlučivanje kreatinina relativno konstantno, određivanje njegove koncentracije u serumu služi kao osetljiv parametar za dijagnostikovanje smanjene glomerularne filtraci je. Međutim, treba takođe naglasiti da samo određivanje koncentracije kreatinina u serumu ima nedovoljnu dijagnostičku osetljivost i specifičnost. To je stoga što nije moguće sasvim tačno odrediti koncentraciju kreatinina koja predstavlja granicu između normalne i smanjene glomerularne filtracije. Na primer, ako se kao ta granica uzme vrednost 125 umol/l, onda je sigurno da je kod svih viših vrednosti od ove smanjena glomerularna filtracija, ali se isto tako povećava i broj lažno negativnih rezultata, jer i kod nekih vrednosti manjih od 125 umol/l može biti smanjena glomerularna filtracija. Isto tako, ako se kao granična vrednost uzme koncentracija manja od 125 umol/l, smanjuje se broj lažno negativnih rezultata, ali se povećava broj lažno pozitivnih, jer kod nekih koncentracija većih od granične vrednosti ne mora da bude smanjena glomerularna filtracija. Ovo sve smanjuje dijagnostičku osetljivost i specifičnost.
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�17
Mokraćna kiselina Kod čoveka je mokraćna kiselina glavni proizvod katabolizma purinskih nukleozida, adenozina i gvanozina, a stvara se iz ksantina pod uticajem ksantin�oksidaze. Kod nižih sisara se mokraćna kiselina dalje oksiduje u prisustvu urikaze u alantoin, koji prema tome predstavlja krajnji ekskretomi proizvod katabolizma purina. Prosečan sadržaj mokraćne kiseline u organizmu odraslih muškaraca je između 5,1 i 9,5 mmol (860 � 1600 mg), a kod žena između 3,3 i 4,2 mmol (550 � 700 mg). Sadržaj mokraćne kiseline zavisi od unošenja purina hranom, obima endogene sinteze purina, regulacije si� teze purina i razgradnje nukleinskih kiselina u tkivima. Dnevno se hranom unese oko 400 mg, a sintetiše se oko 600 mg. Sinteza mokraćne kiseline je najintenzivnija u jetri, jer ona ima najvišu aktivnost ksantin�oksidaze, a zatim u intestinalnoj mukozi, dok ostala tkiva imaju neznatnu aktivnost ovog enzima. Dnevno se oko 60% mokraćne kiseline prisutne u organizmu izmeni kroz proces sinteze i izlučivanja. AMP
IMP
P�5 i adenozin
XMP
P�5'�N
>~7
ksantozin
* i nozi n i
P
NH,
P�5'�N ^ P j
P�5'�N
AD
PNP
riboza�1�P
'�N
riboza�1�P
J
GMP
gvanozin P,�
PNP
PNP
riboza�1�P
! hipoksan tin
gvanin XO ksantin
XO
mokraćna kiselina
Slika 12�3. Sinteza mokraćne kiseline
Sinteza purina počinje od riboza�5�fosfata i ATP, a završava se stvaranjem inozin�monofosfata, iz koga dalje nastaju adenozin�monofosfat i gvanozin�monofosfat. Reakcija u kojoj nastaje 5� fosforibozilamin je reverzibilna i inhibira je povećanje koncentracije AMP, IMP, GMP. Katabolizam purinskih nukleotida počinje odvajanjem fosfata vezanog za ribozu (u prisustvu purin 5'�nukleotidaze), a zatim uklanjanjem ostatka riboze (reakciju katalizuje purin�nukleozid�fosforilaza), pri čemu nastaju hipoksantin i gvanin. Oba ova jedinjenja prelaze u ksantin, a ovaj u mokraćnu kiselinu.
12�18
Medicinska biohem\\a
Glavne purinske baze, adenin, hipoksantin i gvanin mogu ponovo da se iskoriste prevođenjem u odgovarajuće nukleotid�monofosfate ("salvage" put). Adenin se prevodi u AMP uz pomoć adenin� fosforibozil�transferaze, a hipoksantin i gvanin u IMP i GMP uz pomoć hipoksantin�gvanin� fosforibozil�transferaze. Kod nedostatka ovih enzima dolazi do povećanja koncentracije mokraćne kiseline u krvi, jer se sva količina purinskih baza prevodi u mokraćnu kiselinu.
hipoksantin PRPP�v
PRPP�^
PRPP�^
HGPRT P p
adenin
gvanin HGPRT
APRT
PP,
pps
i
IMP
GMP
AMP
Slika 12�4. "Salvage" put iskorišćavanja purinskih baza
Promet mokraćne kiseline u organizmu može šematski da se prikaže na sledeći način: ponovno korišćenje
de novo sinteza razgradnja endogenih purina
razgradnja egzogenih purina
mokraćna kiselina u plazmi
unošenje purina
"*"
deponovanje u tkivima
ekskrecija bubrezi (2/3)
GIT (1/3)
Mokraćna kiselina se zbog jonizacije na azotovom atomu u položaju 9 ponaša kao slaba kiselina: OH H
taklim
H*
urat
U plazmi, koja ima pH 7,4 jonizovano je oko 98% mokraćne kiseline, a mononatrijumova so je bolje rastvorljiva od slobodne kiseline. Kod koncentracije natrijuma od 140 mmol/l i pri temperaturi od
12�19
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
37°C maksimum rastvorljivosti mononatrijum�urata je 520 umol/L, a činjenica je da se soli mokraćne kiseline ne talože u serumu i kada su koncentracije mnoge veće. Razlog za to je verovatno vezivanje urata za proteine plazme. Mokraćna kiselina se izlučuje najvećim delom putem urina (više od dve trećine), a ostatak putem digestivnog trakta, u kome se pod uticajem bakterija razgrađuje do alantoina i dalje do nižih proizvoda. Izlučivanje putem urina je kompleksan proces i uključuje četiri stepena: � potpunu filtraciju u glomerulima, � reapsorpciju (98 �100%) u proksimalnim tubulima, � aktivnu sekreciju (oko 50%) u lumen proksimalnih tubula i � ponovnu reapsorpciju u distalnim tubulima. Krajnji neto efekat izlučivanja mokraćne kiseline je 6 � 12%. Ovaj proces šematski može da se prikaže na sledeći način. KRV
50%
n
GLOMERUL
ultrafiltrat 100% mokr.kiseline reapsorpcija 98�100%
i
PROKSIMALNI TUBUL
sekrecija 50% reapsorpcija 40�44 % izlučivanje u finalnom urinu 6�12%
Poremećaji u koncentraciji mokraćne kiseline Povećane vrednosti mokraćne kiseline (hiperurikemija) Hiperurikemija je stanje kod koga je koncentracija mokraćne kiseline kod muškaraca veća od 0,42 mmol/L, odnosno kod žena veća od 0,36 mmol/L. Zbog slabe rastvorljivosti mokraćne kiseline, svako povećanje njene koncentracije u krvi i telesnim tečnostima dovodi do taloženja slobodne mokraćne kiseline ili njenih soli u zglobovima (urički artritis, giht) i bubrezima (urički bubreg), ili do obrazovanja konkremenata u bubrezima ili mokraćnim putevima. Kada je koncentracija mokraćne kiseline u krvi izmedju 0,42 i 0,48 mmol/L do njenog taloženja dolazi kod približno 20% pacijenata, a kada je koncentracija veća od 0,54 mmol/L, taloženje se javlja kod 80�100% pacijenata. Kod uričkog artritisa urati se talože u tečnosti u zglobovima, ali i u mekim tkivima koja okružuju zglobove. Talog urata može da se javi i u drugim mekim tkivima, prouzrokujući intenzivan inflamato� ran odgovor. Renalna bolest kao posledica hiperurikemije može da ima nekoliko oblika: � urička nefropatija sa taloženjem urata u renalnom parenhimu;
12�20
Medicinska biohem)\a
� akutno intratubularno taloženje kristala urata;
� urička nefrolitijaza (urolitijaza). Uzroci za pojavu hiperurikemije su povećana biosinteza mokraćne kiseline ili smanjeno izlučivanje mokraćne kiseline putem bubrega. Oba ova uzroka mogu biti primarnog (genetički uslovljenog) ili sekundarnog porekla kao posledica niza drugih bolesti. 1. Primarna hiperurikemija "Pool" mokraćne kiseline kod zdravog čoveka iznosi manje od 1 g, a kod primarnih hiperurikemija povećava se na 15 � 25 g. Do primarnog povećanja sinteze, odnosno smanjenog izlučivanja mokraćne kiseline dovode različiti patogenetski mehanizmi. a. Esencijalna hiperurikemija je posledica povećane sinteze (kod 10 �20% pacijenata) ili smanjeno izlučivanje (kod 80 � 90% pacijenata) mokraćne kiseline. Povećana sinteza mokraćne kiseline može da bude posledica i prekomerne aktivnosti jetrene ksantin�oksidaze, do koje dolazi iz neobjašnjivih razloga. Kod pacijenata sa povećanom produkcijom mokraćne kiseline izlučivanje putem urina je uglavnom normalno, a kod pacijenata kod kojih je hiperurikemija posledica smanjenog izlučivanja, klirens mokraćne kiseline je < 6 mL/min (normalno je 6 � 11 mL/min) uz dnevno izlučivanje < 3,6 mmol/24 sata. Patogeneza smanjenog izlučivanja mokraćne kiseline preko bubrega još nije razjašnjena, jer je sam proces izlučivanja vrlo kompleksan (sastoji se iz filtracije, reapsorpcije i tubularne sekreci� je). b. Povećana aktivnost 5�fosforibozil�pirofosfat�sintetaze dovodi do povećanog utroška riboza�5� fosfata, koji je prekursor za sintezu nukleotida, što na kraju ima kao posledicu stvaranje prekomernih količina mokraćne kiseline. Povećana aktivnost može da bude posledica toga što je enzim neosetljiv na inhibiciju mehanizmom povratne sprege (viškom ADP i GDP), zbog toga što ima povećanu maksimalnu brzinu reakcije ili ima povećan afinitet za riboza�5�fosfat. c. Povećana aktivnost fosforibozil�pirofosfat�amidotransferaze koja je posledica smanjene osetlji� vosti enzima na višak IMP, AMP i GMP, odnosno na mehanizam povratne sprege. d. Potpuni ili delimični nedostatak enzima hipoksantin�gvanin�fosforibozil�transferaze (HGPRT),
koja je glavni enzim u "salvage" putu za ponovnu sintezu nukleotida. Ovaj se nedostatak označava kao Lesch�Nyhan sindrom i karakteriše se mentalnom retardacijom, abnormalnom mišićnom pokret� Ijivošću, kao i problemima u ponašanju (agresivno ponašanje). Neurološki simptomi ovog oboljenja objašnjavaju se time što mozak ima smanjenu sposobnost za sintezu purina de novo, pa mu je "sal vage" put važan izvor nukleotida; nedostatak enzima HGPRT direktno smanjuje količinu purinskih nukleotida koje mozak zahteva. Zbog nedostatka ovog enzima smanjuje se intracelularna koncentracija GMP i XMP, a kako ova jedinjenja kontrolišu sintezu purina mehanizmom negativne povratne sprege dolazi do povećanja obima sinteze purina. S druge strane, kod "salvage" puta se troši PRPP, što u ovom slučaju izostaje i koncentracija PRPP se povećava; kako je PRPP stimulator sinteze purina i iz ovog razloga dolazi do povećanja sinteze purina. I na kraju, zbog poremećaja u "salvage" putu nagomilava se hipoksantin, koji se prevodi u ksantin, a ovaj u mokraćnu kiselinu, što takođe doprinosi povećanju njene koncentracije. e. Nedostatak enzima adenin�fosforibozil�transferaze (APRT) koja katalizuje prevođenje adenina u AMP u "salvage" putu. Mehanizam koji dovodi do hiperurikemije je isti kao i kod nedostatka HGPRT. f. Nedostatak adenozin�dezaminaze koja u razgradnji purina katalizuje prevođenje adenozina u inozin; u odsustvu ovog enzima dezoksiadenozin se fosforiliše u dATP, čije se količine višestruko povećavaju. Visoke koncentracije dATP inhibiraju ribonukleotid�reduktazu, zbog čega se smanjuje produkcija dezoksinukleozid�trifosfata (dNTP) koji su potrebni za sintezu lanaca DNK u toku replika� cije, pa je krajnji efekat inhibicija sinteze DNK. Koncentracije dATP su naročito visoke u limfocitima, tako da nemogućnost limfocita da sintetišu DNK ozbiljno remeti imuni odgovor organizma. Kod paci jenata sa ovim poremećajima razvija se teška imunodeficijencija i bolest se letalno završava već u detinjstvu, ako se ne preduzmo specijalne zaštitne mere.
S. Spasić: Ispitivanje funkcije bubrega
12�21
g. Povećana aktivnost purin�5�nukleotidaze (P�5�N) zbog čega se povećava koncentracija inozina
i gvanozina, pa time i mokraćne kiseline. Bolest se takođe ispoljava kao imnodeficijencija, ali u manje teškom obliku nego u prethodnom slučaju. h. Nedostatak glukoza�6�fosfataze (glikogenoza tip I) dovodi do nagomilavanja glukoza�6�fosfata u jetri, stimuliše se pentozofosfatni ciklus, zbog čega se stvara velika količina riboza�5�fosfata, a to, kao i u prethodnom primeru ima kao posledicu prekomemo stvaranje nukleotida. S druge strane, kod nedostatka glukoza�6�fosfataze stimuliše se oksidacija masnih kiselina (zbog pratećeg nedostatka glukoze u cirkulaciji) što kao posledicu ima povećanu sintezu laktata, piruvata i ketonskih tela. Ove kiseline ometaju sekreciju mokraćne kiseline u tubulima, što dodatno povećava koncentraciju mokraćne kiseline u krvi. 2. Sekundarna hiperurikemija Uzroci za nastajanje sekundarnih hiperurikemija mogu biti sledeći: Povećana sinteza mokraćne kiseline
1. Hemoblastoze: hronična mijeloidna leukemija, policitemija, osteomijeloskleroza i hronična he� molitična anemija. Kod ovih bolesti dolazi do povećane razgradnje nukleinskih kiselina kao posledica primene citostatika, koji izazivaju akutno masivno razaranje ćelija. Kod limfatične i mijeloidne leukemije koncentracija mokraćne kiseline može da bude iznad 1,2 mmol/L. 2. Psorijaza 3. Povećano unošenje purina � životne namirnice koje sadrže veliku količinu purina (iznutrice, meso divljači, sardine u ulju) značajno povećavaju koncentraciju mokraćne kiselinu u krvi. Unošenjem hrane sa malim sadržajem purina koncentracija mokraćne kiseline smanjuje se na 180 � 210 umol/L Smanjeno renalno izlučivanje mokraćne kiseline
1. Hronične bolesti bubrega � najčešći razlog za hiperurikemiju u bolestima bubrega je poremećene tubulama sekrecija mokraćne kiseline. 2. Acidoza (laktatna, ketoacidoza) � mlečna kiselina i ketokiseline kompeti raju sa mokraćnom kiselinom za transportni sistem za izlučivanje mokraćne kiseline u tubulima, zbog čega se prvo izlučuju navedene kiseline, a tek potom mokraćna kiselina. 3. Povećana koncentracija alkohola u krvi � kod alkoholičara se povećava koncentracija laktata što ometa izlučivanje mokraćne kiseline 4. Uticaj lekova: diuretici (tiazid, furosemid), salicilna kiselina, tuberkulostatici (pirazinamid, izoni� jazid) � ovi lekovi inhibiraju renalno izlučivanje mokraćne kiseline. 5. Trovanja (olovo, berilijum) Snižene vrednosti mokraćne kiseline (hipourikemija)
Hipourikemija je stanje u kome je koncentracija mokraćne kiseline ispod 120 umol/L i mnogo je manje učestala pojava od hiperurikemije. Hipourikemija se najčešće sreće kod pacijenata koji uzima ju urikozurične (probenecid) ili urikostatične lekove (alopurinol). Do hipourikemije mogu da dovedu i drugi lekovi kao što su dikumarol, kortikosteroidi, estrogeni, fenilbutazon, salicilat itd. Hipourikemija može da nastane i kao posledica vrlo retkog nedostatka ksantin�oksidaze i kod takvih pacijenata se urinom izlučuju hipoksantin i ksantin. Kod teških bolesti jetre, kod kojih se smanju je aktivnost ksantin oksidaze, a i sinteza purina, takođe dolazi di hipourikemije. Kod svih poremećaja u tubularnoj reapsorpciji, bilo da su nasledni (Fanconi sindrom ili Wilson�ova bolest) ili posledica bolesti, znatno se smanjuje reapsorpcija mokraćne kiseline, a zbog togase smanjuje i njena koncentracija u krvi.
Poglavlje 13. Isp itivanje funkcije jetre
Jetra sadrži složene parenhimske ćelije�hepatocite, koji mogu da obavljaju brojne, vrlo različite funkcije neophodne za održavanje života. U hepatocitima se obavljaju procesi: sinteze, metabolizma, deponovanja i eliminacije endogenih i egzogenih supstanci. Hepatociti imaju sposobnost da velikim kapacitetom odgovore na povećane metaboličke zahteve organizma. Oni mogu da primaju, prerađuju i čuvaju brojne supstance koje se apsorbuju iz digestivnog trakta (aminokiseline, ugljeni hidrati, masne kiseline, holesterol, vitamini, itd), kao i da eliminišu njihove metabolite kada se za to ukaže potreba. Hepatociti imaju specifičnu, složenu strukturu koja je u skladu sa brojnim funkcijama koje jetra obavlja. Subcelulama struktura hepatocita sadrži: • veliki broj mitohondrija koji su generatori energije zahvaljujući procesima oksidativne fosforila� cije i (3�oksidacije masnih kiselina koji se obavljaju u njima; • lizozome koji sadrže proteolitičke enzime; • endoplazmatični retikulum i to: glatki ER gde se odvijaju procesi konjugacije bilirubina, metabolizma lekova i sinteza holesterola i zrnasti ER gde se odvija sinteza proteina; • Goldži kompleks gde se odvija sinteza lipoproteinske čestice VLDL�a, glikozilacija proteina i sekrecija albumina. Jetra je glavni organ u većini metaboličkih procesa. U njoj se ukrštaju brojni katabolički i anabolički procesi ugljenih hidrata, lipida i azotnih jedinjenja. Metabolički procesi vezani za ugljene hidrate su usmereni ka održavanju koncentracije glukoze u krvi. U jetri se odvija proces glukoneogeneze, gliko� geneze, glikogenolize i deponovanja glikogena. Glavne lipidne komponente u organizmu holesterol, masne kiseline i trigliceridi se sintetišu u jetri. U jetri se sintetišu i fosfolipidi, odvija se ketogeneza, sin� tetiše se i razgrađuje većina lipoproteinskih čestica. Jetra je svakako najvažniji organ u metabolizmu holesterola jer se tu ne samo sintetiše endogeni holesterol nego se i on dalje metaboliše u žučne kiseline i izlučuje putem žuči. Sinteza žučnih kiselina omogućava izlučivanje viška holesterola, emulzifika� ciju i varenje masti u gastrointestinalnom traktu. Jetra je mesto sinteze mnogih proteina plazme (albu� min, a� i p�globulini, faktori koagulacije, transportni proteini, enzimi), koji pored toga što obezbeđuju proteinski "pool" plazme, utiču i na homeostazu drugih supstanci (kalcijuma, magnezijuma, lekovi), održavaju onkotski pritisak, itd. U jetri se odvija metabolizam aminokiselina i vrši detoksikacija amoni jaka procesom sinteze uree. Jetra je glavno mesto za katabolizam mnogih hormona (pre svega steroi� dnih i polipeptidnih) i ona direktno utiče na održavanje nivoa hormona u plazmi. Jetra je glavni organ za metaboličku konverziju, odnosno detoksikaciju mnogih endogenih i egzogenih supstanci poput lekova i ksenobiotika. Jetra je depo ne samo glikogena, već i vitamina (A,D,E, B 12) i gvožđa. Za praćenje ovako složene funkcije jetre postoje mnogi testovi koji se koriste već dugi niz godina u cilju otkrivanja, utvrđivanja tipa i mesta oštećenja, praćenja toka bolesti i postavljanja prognoze. Normal�
13�2
Medicinska biohemija
no je da samo jedan test ne može da zadovolji sve ove kriterijume, tako da se obično koristi više različitih ispitivanja. Retko kada rezultati biohemijskih testova obezbeđuju preciznu dijagnozu, već obično ukazuju na opšti patofiziološki proces, zajednički za mnoge poremećaje funkcije jetre. No ipak, biohemijski testovi se često upotrebljavaju pri uspostavljanju dijagnoze jer su: neinvazivni, široko primenljivi, jeftini i određuju drugu vrstu testa koju treba primeniti da bi se uspostavila dijagnoza. Jetra je organ koji ima značajnu funkcionalnu rezervu tako da svako oštećenje jetre ne mora uvek uticati na njenu funkciju. U ovom slučaju obični testovi za ispitivanje funkcije jetre (određivanje bilirubi� na ili albumina u plazmi) ne pokazuju oštećenje jetre. Mnogo bolji indikatori oštećenja jetre su testovi određivanja aktivnosti enzima jetre u plazmi. Sam termin testovi funkcije jetre koji je široko rasprostranjen u praksi, nije potpuno adekvatan jer oni ne obezbeđuju kvantitativnu procenu funkcije jetre. Pravi testovi za ispitivanje funkcije jetre, koji treba da obezbede kvantitativnu procenu funkcionalne aktivnosti ćelija jetre postoje, ali se još uvek retko koriste u rutinskoj kliničkoj praksi. Za ispitivanje funkcije jetre postoje četiri grupe testova: 1. Testovi koji se zasnivaju na određivanju supstanci koje se sintetišu u jetri: � albumin, faktori koagulacije i drugi proteini plazme, aktivnost holinesteraze, lipidi i urea; 2. Testovi koji se zasnivaju na određivanju supstanci koje se metabolišu u jetri � lekovi, ksenobiotici, amonijak, bilirubin, holesterol i trigliceridi. 3. Testovi koji se zasnivaju na određivanju supstanci koje se oslobađaju iz oštećenog tkiva jetre: a) endogene supstance koje se oslobađaju iz oštećenih hepatocita, npr. enzimi (ALT i AST); b) endogene supstance čija se sinteza povećava ili se oslobađaju iz kanikulamih membrana, epi� tela žučne kese i endotela centralne ili peritonealne vene (aktivnost alkalne fosfataze, Y�9 , u t a m il � transferaze, 5'�nukleotidaze). 4. Testovi kojima se određuju supstance koje se izlučuju putem jetre kao što su: a) endogeni metaboliti � žučne kiseline, bilirubin i amonijak; b) egzogene supstance � bromsulfoftalein, indocijanin zeleno, kofein, aminopirin, lidokain. Od svih funkcionalnih testova danas se najviše koriste testovi za ispitivanje ekskretorne funkcije jetre. U tom cilju najčešće se određuju koncentracije endogenih supstanci: bilirubina i žučnih kiselina u serumu. U cilju ispitivanja sintetske funkcije jetre određuje se koncentracija sledećih proteina u serumu: albumina, ai�antitripsina, fibrinogena, ceruloplazmina, haptoglobina, transferina i proteina koagulacije, čija koncentracija može biti smanjena kao posledica poremećaja u funkciji jetre. U slučaju oštećenja i infla� macije povećava se sinteza proteina akutne faze: haptoglobina, a rantitripsina, orozomukoida, ceruloplazmina, C�reaktivnog proteina i komponenti komplementa. Metabolička funkcija jetre ispituje se na osnovu određivanja amonijaka i galaktoze koji se metaboli� zuju u jetri. Razne toksične i organizmu strane supstance konjuguju se u jetri sa glukuronskom, sumpornom kiselinom ili glicinom i time se prevode u netoksične i bolje rastvorljive supstance koje se zatim izlučuju iz tela. Na taj način jetra vrši detoksikaciju, iako taj izraz nije sasvim dobar jer se mnoga jedinjenja koja se stvaraju u organizmu, a nisu toksična (kao na primer bilirubin i neki hormoni) takođe konjuguju i izlučuju kao glukuronidi ili sulfati. Da bi se ispitala funkcija jetre u konjugaciji i detoksikaciji, predloženo je više metoda, a sve se temelje na tome da se pacijent optereti nekom supstancom koja se u jetri konjugu� je, a potom se ispituje koliko se glukuronida ili sulfata posle toga nalazi u krvi ili izlučuje putem urina. Od svih tih testova najviše se koristi test sinteze hipurne kiseline nastale konjugacijom benzoata sa glicinom. Ovaj test se ranije više koristio, kao i ostali testovi opterećenja, a danas se manje koristi, jer se dijagnostika oboljenja jetre sve više zasniva na primeni testova za određivanje aktivnosti enzima. U dijagnostici oboljenja jetre poseban značaj ima određivanje aktivnosti enzima specifičnih za jetru. U tom cilju određuje se enzimski profil koji je specifičan za pojedina oboljenja jetre (vidi poglavlje 4).
V. Spasojević�Kalimanovska: Ispitivanje funkcije jetre
13�3
ISPITIVANJE EKSKRETORNE FUNKCIJE JETRE Organski anjoni endogenog i egzogenog porekla uklanjaju se iz sinusoidalne krvi tako što se izlučuju u žuč. Praćenje ove ekskretorne funkcije jetre može biti od kliničkog značaja, a ostvaruje se određivanjem koncentracije nekih endogenih supstanci u plazmi, poput bilirubina i žučnih kiselina, ili praćenjem klirensa egzogenih supstanci, najčešće nekih boja kao što su indocijanin zeleno ili bromosulfo� ftalein.
Bilirubin Bilirubin nastaje iz hemoglobina procesom razgradnje ostarelih eritrocita. Normalni vek eritrocita je 120 dana, a po isteku ovog vremena ostareli eritrociti se eliminišu iz krvotoka pomoću retikuioendotelnog sistema fagocitnih ćelija slezine, jetre i kostne srži. U fagocitnim ćelijama hemoglobin i ostali hemoprote� ini katabolišu se do bilirubina pomoću čitavog niza enzimskih reakcija. Oko 85% stvorenog bilirubina je iz hema oslobođenog iz ostarelih eritrocita. Ostalih 15% bilirubina nastaje iz hema oslobođenog iz razorenih prekursora eritrocita u kostnoj srži ili iz drugih hemoproteina (mioglobin, citohromi, peroksida� ze) koji treba da se eliminišu iz organizma. U ćelijama retikuioendotelnog sistema (RES) počinje sinteza bilirubina. Dnevno se stvori 250 do 300 mg bilirubina. U prvom stupnju razgradnje hemoproteina, koja se odvija u ćelijama RES�a, dolazi do odvajanja hema od proteinskog dela. Proteinski deo molekula prelazi u plazmu gde ulazi u sastav proteina plazme i aminokiselinske rezerve. Nakon odvajanja globinskog dela hemoglobina u sledećoj fazi se otvara protoporfirinski prsten i nastaje zeleni pigment biliverdin. Sinteza biliverdina se odvija u glatkom endo� M V
Mikrozomalna hemoksigenaza
H H
H
H
Bilirubin
Slika 13�1. Metabolizam bilirubina: razgradnja hema, otvaranje protop orfirins kog jezgra dejstvom mikro� zomalne hemoksigenaze i sinteza biliverdina. Redukcija biliverdina dejstvom biliverdin�reduktaze u bilirubin.
13�4
Medicinska biohemija
plazmatičnom retikulumu gde se uz pomoć enzima mikrozomalne hemoksidaze vrši otvaranje proto� porfirinskog prstena na mestu ct�metenskog mosta. Kao produkt ove reakcije osim biliverdina, nastaje i jedan molekul gvožđa koji prelazi iz plazme u rezervno gvožđe, i jedan molekul ugljen monoksida koji se izbacuje preko pluća. Nakon toga, biliverdin prelazi u citozol gde se uz pomoć NADPH�zavisnog enzima biliverdin�reduktaze vrši parcijalna redukcija y�metenskog mosta biliverdina do bilirubina (Slika 13�1). Ovako oslobođeni bilirubin prelazi u krv, vezuje se za albumin i u tom obliku se transportuje do jetre. Ovaj transportni oblik bilirubina naziva se nekonjugovani ili slobodan bilirubin. U normalnom serumu 40 g/L albumina vezuje oko 600 umol bilirubina. Veza se ostvaruje između hidroksilnih grupa bilirubina i primarnih amino grupa albumina, koje uglavnom potiču iz lizina. Anjonski lekovi (npr. salicilati) se kompe� tetivno vezuju za proteine i time umanjuju kapacitet plazme za transport bilirubina. Cirkulacija
Albumirvbilirubin (Jtt
®
Albumin
O
H A
rrv Žuč
i
Glukuronil� transferaza I
=*=*
1
Bilirubin� monoglukuronid + UDP�Glukuronat Bilirubin� diglukuronid
Zuč
Slika 13�2. Metabolizam bilirubina u jetri. Karakteristike ovog bilirubina su nerastvorljivost u vodi i toksičnost. Bilirubin se ne izlučuje putem bubrega pošto ne prolazi kroz glomerulamu membranu. Ukoliko je njegovo stvaranje povećano (kao stoje slučaj kod hemolitičkih oboljenja), akumulira se u tkivima koja su bogata mastima (npr. potkožno tkivo i mozak). Nekonjugovani bilirubin se brzo eliminiše iz krvi i prelazi u jetru. Pre ulaska u jetru, biulirubin se oslobađa kompleksa sa albuminom i na membrani hepatocita preuzima ga membranski proteinski nosač, ko ji ga aktivnim transportom kroz sinusoidalnu membranu dovodi do citozola. U citozolu bilirubin se reverzibilno vezuje za dva proteina koji se nazivaju ligandin ili Y protein i Z protein. Ligandin ima osobinu da lako vezuje i druge anjonske boje (bromsulfaftalein, indocijan zeleno, itd.). Ligandin, koji čini oko 5% proteina citozola humanih hepatocita, vezuje bilirubin češće nego Z protein. Ovi proteini transportuju bilirubin do glatkog endoplazmatičnog retikuluma gde se odvija proces konjugacije bilirubina (Slika 13�2). U hepatocitima, bilirubin se brzo konjuguje sa glukuronskom kiselinom i gradi bilirubin�mono� i diglukuro�
13�5
V. Spasojević�Kalima novska: Ispitivanje funkcije jetre
nide koji se zatim izlučuju u žuč. Donor glukuronske kiseline je uridin�difosfoglukuronska kiselina, a ovaj proces katalizuje mikrozomalni enzim UDP�glukuronil�transferaza. Konjugovani bilimbin je rastvorljiv u vodi i netoksičan; oko 90% bilirubina se nalazi u vidu diglukuronida, a samo 10% u vidu monoglukuroni� da. Ekskrecija konjugovanog bilirubina u žučne kanikule je aktivan proces i odvija se nasuprot koncentracionog gradijenta. Izlučena žuč prelazi u žučni mehur gde se lageruje i koncentriše sve dok prisustvo hrane u duodenumu ne stimuliše kontrakciju žučnog mehura. Konjugovanog bilirubina normalno ima malo u plazmi, dok se ne pojavi oštećenje ćelija jetre koje utiče na normalan transport bilirubina iz hepatoci� ta u žuč, usled čega dolazi do pojave konjugovanog bilirubina u plazmi. Pojava konjugovanog bilirubina u plazmi je indikator oštećenja ćelija jetre. Dnevno se sintetiše oko 250 do 300 mg bilirubina, a kapacitet jetre za njegovu konjugaciju je preko 1500 mg na dan. Tako visoka funkcionalna rezerva je jedan od razloga zašto koncentracija bilirubina u plazmi nije tako osetljiv indikator oboljenja jetre. Kada se poveća koncentracija bilirubina u plazmi povećava se i njegovo izlučivanje putem urina. U tankom crevu enzimi ariaerobnih crevnih bakterija dekonjuguju glukuronide bilirubina i redukuju bi� lirubin do urobilinogena (Slika 13�3). Grupu urobilinogena sačinjavaju tri bezbojna jedinjenja koja imaju tetrapirolsko jezgro, a međusobno se razlikuju po stepenu hidrogenacije vinil� ostataka i dva pirolova prstena. Urobilinogeni koji sadrže 6, 8 ili 12 atoma vodonika više od bilirubina nazivaju se sterkobilinogen, mezobilinogen i urobilinogen. Oni se izlučuju urinom i fecesom i reaguju sa Ehrlichovim reagensom i grade obojene derivate. 20% urobilinogena reapsorbuje se iz creva u krvotok i portalnom cirkulacijom prelazi u jetru i reekskretuje ponovo u žuč (enterohepatična cirkulacija urobilinogena). Mala količina
1 Bilirubin
Jetra
diglukuronid Tanko crevo
$�glukoro� nidaza
Nekonjugovani bilirubin Redukcija intestinalnim anaerobnim f bakterijama
Urobilinogeni Debelo crevo
I
Spontana oksidacija
Sterkobilin i urobilinogeni
1
Ekskrecija fecesom
Ekskrecija urinom
I
Slika 13�3. Metabolizam bilirubina u crevima.
urobilinogena (2�5%) ulazi u cirkulaciju, a pošto su rastvomi u vodi izlučuju se urinom. U donjem delu creva tri urobilinogena se spontano oksiduju na srednjem metilenskom mostu i grade žuto�crvene žučne
13�6
Medicinska biohemija
pigmente: sterkobilin, mezobilin i urobilin. Ovi pigmenti su odgovorni za boju fecesa. Kod oštećenja jetre bez holestaze ili kod hiperprodukcije žučnih pigmenata kao kod hemolize, urobilinogen je povećan i u urinu i u plazmi. Ako se crevna flora uništi antibioticima smanjuje se prevođenje bilirubina u urobilinogen usled čega se nalaze niske koncentracije urobilinogena u fecesu i urinu. Struktura bilirubina Osnovna osobina bilirubina koja je odavno poznata je da je on nerastvoran u vodi, a rastvoran u nepolarnim rastvaračima. Na osnovu tetrapirolske strukture i prisustva dva propionil ostatka koji doprinose polarnosti molekule, realno je očekivati da je bilirubin rastvoran u vodi. Novijim ispitivanjima X� kristalografijom utvrđena je tačna struktura b :!irubina koja objašnjava fizičko�hemijske osobine ove supstance. Ispitivanja su pokazala da struktura bilirubina nije linearna već uvijena (vidi Sliku 13�4). Tačnije postoje dva važna svojstva ove strukture: • "Z�Z" trans konformacija dvogube veze između ugljenikovih atoma 4�5 i 15�16; •
Uvijeno st strukt ure � postoje vodon ične veze izmeđ u karboksilne grupe propions ke kiseline i atoma azota pirolovih prstenova.
Rigidna forma kristalnog bilirubina je takva da su prstenovi A i B u jednoj ravni, a C i D u drugoj pod uglom od 98°. E�E (cis) stru ktur a CH2 Me
CH
H
C02H C02H CH 2 CH 2
Me
CH2
H
CH2
CH2 Me
H
Me
CH
H
Rigidna Z�Z (trans) struktura
Slika 13�4. Strukture bilirubina: rigidna konformacija Z�Z i otvorena E�E. Kada se bilirubin izloži svetlosti Z�Z (trans) konfiguracija prelazi u E�E (cis) konformaciju, kao i u neke druge (4E�15Z i 4Z�15E). E�E konformacija sprečava stvaranje vodoničnih veza i on postaje više rastvorljiv u vodi jer su karboksilne grupe propionil ostataka oslobođeni. Dodatak nekih hemikalija poput: kofeina, metanola, etanola ili 6 mol/L uree dovodi do raskidanja internih vodoničnih veza u molekuli bilirubina što omogućava i njegovu reakciju sa diazotovanom sulfanilnom kiselinom u Van der Berghovo j reakciji. Za razliku od slobodno g bilirubina, bilirubin digluku ronid je rastvorljiv u vodi i direk�
13�7
V. Spasojević�Kalim anovska: Ispitivanje funkcije jetre
tno reaguje sa diazo reagensom. Zbog prisustva glomaznih ostataka glukuronske kiseline nije moguće stvaranje internih vodoničnih veza u molekuli konjugovanog bilirubina.
Poremećaji u metabolizmu bilirubina � hiperbilirubinemija Hiperbilirubinemija, žutica ili ikterus je posledica povećanih koncentracija konjugovanog, nekonjugovanog ili oba oblika bilirubina u plazmi. U serumu se određuje koncentracija ukupnog bilirubina i konjugovanog ili direktnog bilirubina. Koncentracija nekonjugovanog bilirubina određuje se iz razlike ukupnog i konjugovanog bilirubina. Referentne vrednosti za ukupan bilirubin u serumu su do 17,1 umol/L, a za direktan ili konjugovani bilirubin do 4,3 umol/L Pored određivanja u serumu, metaboliti se dokazuju u urinu i fecesu. Uzroci žutice su mnogobrojni, te postoje i razne klasifikacije žutica: 1. Klasifikacija prema etiologiji bolesti na: hemolitičku, toksičnu, infektivnu i opstrukcionu; 2. Klasifikacija prema anatomskom mestu nastanka žutice na: prehepatične (povećan nekonju� govani bilirubin), hepatične i posthepatične žutice (povećan konjugovani bilirubin); 3. Klasifikacija prema patofiziološkom mehanizmu na: retencione (retencija nekonjugovanog bilirubina) i regurgitacione (koje dovode do povećanja konjugovanog bilirubina); 4. Današnja klasifikacija žutica, koja se zasniva na prirodi žučnog pigmenta na nekonjugovane i konjugovane žutice. Nekonjugovane žutice Nekonjugovane žutice se karakterišu povećanim vrednostima nekonjugovanog bilirubina u serumu, a prema anatomskom mestu nastanka žutica dele se na prehepatične i hepatične. Prehepatična nekonjugovana žutica je posledica pojačane razgradnje eritrocita, odnosno hemoglobina što dovodi do pojačanog stvaranja bilirubina, a samim tim i do pojačane konjugacije. Prehepatična ili hemolitička žutica posledica je intenzivne hemolize koja se javlja kod: • kongenitalnih abnormalnosti eritrocita kao što su: sferocitoza, abnormalni hemoglobini (HbS) i kod enzimskih defekata (deficijencija glukozo�6�fosfat�dehidrogenaze); • reakcije antigen�antitelo (stečena hemolitička anemija, kod inkompatibilne transfuzije krvi, itd.);
^^mimmmj^ Hepatocit
Cirkulacija
Cirkulacija
Slika 13�5. a) Normalan metabolizam bilirubina sa prelaskom nekonjugovanog bilirubina u hepatocit (tamna strelica) i mikrozomalnom konjugacijom i ekskrecijom konjugovanog bilirubina (isprekidana strelica); b) Hemolitička žutica kod koje je povećano stvaranje bilirubina praćeno eksrecijom konjugovanog bilirubina i povećanjem nekonjugovanog bilirubina u plazmi (zbog premašenog kapaciteta jetre za konju� gaciju).
13�8
Medicinska biohemija
•
dejstva nekih lekova (metil�dope), hemikalija (arsina) i mikroorganizama (Plazmodiuma) na normalne eritrocite krvi; • neefektivne eritropoeze u slučaju perniciozne anemije i talasemije minor. Prehepatična nekonjugovana žutica karakteriše se pre svega porastom nekonjugovanog bilirubina u plazmi (Slika 13�5). Usled povećane koncentracije nekonjugovanog bilirubina, jetra konjuguje i tu povećanu količinu bilirubina pošto poseduje visok kapacitet za konjugaciju, ali zato dolazi do povećane produkcije urobilinogena i porasta njegove koncentracije u urinu i fecesu. Kako koncentracija hemoglobina počinje da opada kao posledica hemolitičkih procesa, kostna srž pokušava da to nadoknadi povećanim oslobađanjem eritrocita u krv. Maksimalan porast koji kostna srž može da obezbedi je oko osam puta viši od normalnog oslobađanja i odgovara nivou bilirubina od 75 umol/L Ukoliko se hemoli� za nastavi, hiperaktivnost kostne srži ne može da kompenzuje hemolizu tako da dolazi do pada koncentracije hemoglobina i rasta koncentracije bilirubina i preko 75 jumol/L.
Koncentracija bilirubina može da poraste preko 75 (imol/L i u slučaju hemolize u kombinaciji sa obolelom jetrom, kada jetra ne može da izbacuje tu povećanu količinu bilirubina. Tada je bitno odrediti udeo nekonjugovanog i konjugovanog bilirubina u povišenoj koncentraciji ukupnog bilirubina, radi ut vrđivanja hemolize kod pacijenata kod kojih se zna da imaju bolesnu jetru. Kod prehepatične konjugovane hiperbilirubinemije biohemijski nalaz je sledeći: • koncentracija nekonjugovanog bilirubina je povišena; • koncentracija konjugovanog bilirubina je normalna ili povišena; • bilirubina nema u urinu; • koncentracija urobilinogena u fecesu i urinu je povišena. Hepatična nekonjugovana hiperbilirubinemija se javlja kod; a) neonatalne ili fiziološke žutice; b) poremećenog transporta bilirubina u hepatocitima (Gilbert�ova bolest); c) nedostatka hepatične UDP�glukuronil�tranferaze (Crigler�Najjar�ov sindrom). Sve bebe imaju u serumu nekonjugovani bilirubin u koncentraciji većoj nego kod odraslih i otprilike 50% beba imaju žuticu u toku prvih pet dana života. Ukupna koncentracija bilirubina raste i do 70 umol/L Uzrok povišene koncentracije nekonjugovanog bilirubina u ovom slučaju je povećana produkcija bilirubina usled hemolize eritrocita zbog razgradnje fetalnog hemoglobina i usled nerazvijenosti određenih stupnjeva u metabolizmu i ekskreciji bilirubina. Ovo povećanje koncentracije bilirubina kod novorođenčadi je bez nekog trajnog oštećenja jetre, a posledica je pre svega nedostatka enzima glu� kuronil�transferaze. U serumu se nalazi uglavnom nekonjugovani bilirubin postoje količina nastalog bilirubina veća od kapaciteta konjugacije i ekskrecije bilirubina (vidi Sliku 13�6). Gilbert�ov sindrom je posledica poremećenog transporta bilirubina kroz ćelijsku membranu hepa� tocita i praćen je povećanjem nekonjugovanog bilirubina u plazmi. Crigler�Najjar�ov sindrom je retko, nasledno oboljenje., koje nastaje usled nedostatka (tip 1) ili smanjenja (tip 2) aktivnosti hepatične bili� rubin�UDP�glukuronil�transferaze. Ova tri nasledna poremećaja u metabolizmu i ekskreciji bilirubina možemo međusobno da razliku jemo po koncentracijama ukupnog bilirubina. Crigler�Najjar�ov sindrom � tip 1, uslovljava koncentraciju ukupnog bilirubina u intervalu (342�855 (imol/L), Crigler�Najjar�ov sindrom � tip 2, uslovljava koncentraciju ukupnog bilirubina ispod 342 ^mol/L, a Gilbertov sindrom prouzrokuje koncentraciju ukupnog bilirubina ispod 51 |umol/L U sva tri slučaja najveći deo ukupnog bilirubina u plazmi, čini nekonjugovani bilirubin dok je koncentracija konjugovanog bilirubina jako smanjena. Kod hepatične nekonjugovane hiperbilirubinemije biohemijski nalaz je sledeći: • koncentracija nekonjugovanog bilirubina je povišena; • koncentracija konjugovanog bilirubina je normalna ili snižena; • bilirubina u urinu nema; • koncentracija urobilinogena u urinu i fecesu je normalna.
V. Spasojević�Kalimanovska: Ispitivanje funkcije jetre
13�11
Žučne kiseline Određivanje koncentracije žučnih kiselina polako potiskuje druge funkcionalne testove u dijagnostici oboljenja jetre jer je svaka promena u koncentraciji žučnih kiselina vrlo osetljiv indikator funkcije jetre. Procesima sinteze žučnih kiselina, konjugacije i sekrecije, jetra održava ravnotežu u koncentraciji holesterola, obezbeđuje površinski aktivne molekule koji olakšavaju ekskreciju holesterola i intestinalno varenje i apsorpciju lipida. Usavršavanjem metoda za određivanje žučnih kiselina (npr. radioimuno i enzimi� muno određivanje), koje su dovoljno osetljive i tačne za određivanje žučnih kiselina u raznim telesnim te� čnostima, dovelo je do boljeg razumevanja metabolizma i funkcije žučnih kiselina. Sinteza žučnih kiselina Sinteza žučnih kiselina se odvija u jetri gde one nastaju iz holesterola. U cilju sprečavanja akumulacije holesterola i razvoja ateroskleroze, on se transformiše u polarna jedinjenja, žučne kiseline koje se zatim izlučuju u žuč. Ova transformacija holesterola, kao i sposobnost žučnih kiselina da solubilizuju preostali holesterol u žuči, glavni su mehanizmi eliminacije holesterola. Mehanizam transformacije holesterola u žučne kiseline odvija se u više etapa, pri čemu dolazi do sledećih promena na steroidnom jezgru holesterola (vidi Sliku 13�8): 7a �hidroksiholesterol
Holesterol
7a�Hidroksi�5�holesten�3�on
21
CHg
22 18T20
CH 3 l m *3l
13 14
/1 7\ 1 H 151
26
3 Tin*T 5 | CH 3 27
J
5p�Holestan�3a, 7a, 12a�triol
7a, 12a�Dihidroksi� 4�holesten�3�on
7a�Hidroksi�4�holesten�3�on
HO
c« u i * �> f �to oc * * i &p�Hoiestan�J, 7,12, Zb�tetrol
3a,7a,12a�Trihidroksi 3x,7a,12a�Trihidroksi 5p� 5p�holestan�26�onska kiselina holanska kiselina (Holna kiselina]
COOH
Slika 13�8. Šematski prikaz metabolizma holesterola u primarne žučne kiseline : holnu i henodezok sihol� nu kiselinu.
13�12
Medicinska biohemija
A. Reakcija hidroksilacije u na C7 u a položaju koju katalizuje enzim holesterol�7�a�hidroksilaza. Ovo je regulatorni enzim u procesu biosinteze žučnih kiselina, a inhibitor ovog enzima je holna kiselina. A. Oksidacija 3�p hidroksilne grupe u 3�on grupu. B. Izomerizacija 5�enske strukture. C. Reakcija hidroksilacije na C12 u a položaju D. Zasićenje dvogube veze na poziciji 5�6 i redukcija 3�on grupe. E. Hidroksilacija bočnog lanca na poziciji C24. F. Oksidacija hidroksilne grupe na C24 u karboksilnu grupu (holestanonska kiselina) G. Transformacija bočnog lanca holesterola tako da se gube tri C atoma, pa nastaje molekul sa 24 atoma; Ovim procesom transformacije u jetri iz holesterola nastaju primarne žučne kiseline: holna i henode� zoksiholna kiselina. Ove dve žučne kiseline međusobno se razlikuju po tome što henodezoksiholna kiselina, za razliku od holne kiseline, ne sadrži OH grupu na položaju C12. Druga faza u metabolizmu žučnih kiselina je konjugacija karboksilne grupe aminokiselinama pre se� krecije u žučne kanaliće. Konjugacija se vrši pomoću aminokiselina: taurina ili glicina, što znatno povećava polaritet žučnih kiselina, a time i rastvorljivost u vodi. Ovim postupkom nastaju četiri primarne žučne kiseline: holiltaurin, hoiilglicin, henodezoksiholiltaurin i henodezoksiholilglicin (Slika 13�9). U lumenu cre� va žučne kiseline se nalaze u jonizovanom obliku jer je njihova pKa vrednost niža od pH vrednosti u lumenu creva.
Tauroholna kiselina
CONHCH2CH2S03"H+
Holna kiselina HO COOH
HO
[NH2CH2CH2SO3H] + Taurin + Glicin (NH2CH2COOH] Glikoholna kiselina
CONHCH2COO�H'
HO
Slika 13�9. Konjuga cija prim arnih žučnih kiselina.
L
Treća faza u metabolizmu žučnih kiselina odvija se u tankom i debelom crevu pri čemu primarne žučne kiseline se najpre dekonjuguju, a zatim dejstvom enzima 7�a�dehidroksilaze, koja potiče iz crevne bakterijske flore, prelaze u sekundarne žučne kiseline: dezoksiholnu i litoholnu (Slika 13�10). Posle reap� sorpcije, sekundarne žučne kiseline se konjuguju u jetri sa glicinom i taurinom i zajedno sa primarnim žučnim kiselinama izlučuju u žuč. Normalno u žuči se nalazi oko 38% konjugata holne kiseline, 34% he� nodezoksiholne kiseline, 28% dezoksiholne kiseline i 1�2% konjugata litoholne kiseline. U organizmu čoveka postoji "pool" žučnih kiselina koji se održava zahvaljujući enterohepatičnoj cirkulaciji žučnih kiselina (Slika 13�11). Žučne kiseline kao polarni organski anjoni u toku svog aktivnog transporta u žučne kanale obezbeđuju osmotski protok vode i to je glavni faktor koji reguliše stvaranje i izlučivanje žuči. Transport ovih organskih anjona takođe utiče na sekreciju preostalih komponenata žuči, a pre svega bilirubina, holesterola i fosfolipida. Za sekreciju holesterola i fosfolipida neophodno je prisus�
13�13
V. Spasojević�Kalimanovska: Ispitivanje funkcije jetre
tvo žučnih kiselina, jer one solubilizuju holesterol i fosfolipide u vodenom rastvoru. Sposobnost žučnih kiselina da solubilizuju lipide žuči potiče od njihove amfolitičke prirode, tj. one sadrže i polarne i nepolarne grupe u svojoj molekuli. Takve molekule okružuju lipidni sloj, smanjuju površinski napon i deluju kao emulgatori. U vodenim rastvorima žučne kiseline se agregiraju i grade male polimolekularne agregate zvane micele (~ 5nm u dijametru) koje su sposobne da inkorporiraju holesterol i fosfolipide. CO NH � giic'm
Bakterijska Transormacija OOOH (7a�dehidroksilacija)
Bakterijska dekonjugacija
(taurin) HO�
v
^ "OH Gliko�(Tauro)�ho!at
HO'
^ ^ OH Holna kiselina
CONHglicin (taurin) H0
�
^ ^ �on Gliko�(Tauro)�henodezoksiholat
HO"
COOH
HO'
COOH
Dezoksiholna kiselina
COOH
OH Henodezoksiholna kiselina
Litoholna kiselina
Slika 13�10. Sinteza sekundarnih žučnih kiselina.
U serumu, žučne kiseline su vezane za albumin, a manjim delom i za globuline, i njihova koncentracija je uglavnom jako niska, izuzev u portalnoj veni. Referentne vrednosti zavise od metode određivanja, a enzimskom metodom nađene su vrednosti od 2,5 do 6,8 umol/L U poslednje vreme žučnim kiselinama se pridaje sve veći dijagnostički značaj i to više određivanju koncentracije ukupnih žučnih kiselina nego pojedinačnim. Holesterol
Jetra
\
Sekundarne
r
**• žučne
kiseline
•>• Primarne žučne .kiseline
Crevo
Fekalna ekstrakcija: žučnih kiselina i soli Slika 13� 11. E nterohepatična cirkulacija žučnih kiselina.
Poremećaji metabolizma žučnih kiselina Određivanje koncentracije žučnih kiselina u serumu ima klinički značaj kod većeg broja oboljenja hepatobilijarnog trakta koja dovode do poremećaja u sintezi žučnih kiselina, abnormalnosti u transportu
13�14
Medicinska biohemija
žučnih kiselina u žučni mehur, poremećaja enterohepatične cirkulacije žučnih kiselina, loše apsorpcije žučnih kiselina i poremećaja u metabolizmu žučnih kiselina (kod parenhimalnih oboljenja jetre). Koncentracija ukupnih žučnih kiselina u serumu povećava se kod oštećenja jetre, naročito kod ciroze jetre. Naj više vrednosti žučnih kiselina dobijene su kod opstrukcione žutice, pa je ovo određivanje usvojeno za diferencijalnu dijagnostiku žutice. U urinu normalno nema žučnih kiselina, aii se javljaju pri opstrukcionoj žutici, a ponekad i kod hepatocelularne žutice. 1. Poremećaji sinteze žučnih kiselina
Poremećaji sinteze žučnih kiselina se dele na urođene i stečene poremećaje. Urođeni poremećaji. Specifični defekti u sintezi žučnih kiselina smatraju se inicijalnim faktorom za razvoj raznih holestatskih poremećaja, pogotovo neonatalnih. Urođene greške u metabolizmu žučnih kiselina obično su posledica deficijencije enzima ili poremećaja u transportu žučnih kiselina. Ovi poremećaji dovode do smanjene produkcije normalnih žučnih kiselina koje podstiču izlučivanje žuči i povećanog stvaranja primitivnih žučnih kiselina, koje imaju hepatotoksično dejstvo. Stečeni poremećaji. Teška hepatična oboljenja kao što su hepatitis i ciroza praćena su poremećajem u sintezi žučnih kiselina. Kod hepatitisa se u oštećenim ćelijama jetre odvija promenjena sinteza žučnih kiselina dok je kod pacijenata sa cirozom jetre ustanovljena smanjena sinteza holne i dezoksi� holne kiseline, usled promenjene funkcije jetre i gubitka ćelijske mase jetre. Ciroza jetre je u dobroj korelaciji sa niskim kapacitetom za sintezu holne kiseline, tako da se merenjem niskog nivoa holne kiseline može ustanoviti stepen oštećenja jetre. 2. Poremećaji u transportu žučnih kiselina u žučni mehur Usporeno pražnjenje žučne kese ili mehanička opstrukcija žučne kese ili širokih žučnih kanala, sprečava izlivanje žučnih kiselina u intestinum. Usled toga dolazi do retencije žučnih kiselina u hepa� tocitima, a zatim i njihove regurgitacije u plazmu. Zbog toga su, na primer, kod opstrukcione žutice koncentracije žučnih kiselina vrlo visoke u krvi i detektuje se prisustvo žučnih kiselina u urinu, koje se inače ne nalaze u urinu zdravih osoba. 3. Poremećaji enterohepatične cirkulacije
Oko 95% žučnih kiselina koje se sekretuju u jednom ciklusu se reapsorbuju u intestinumu i pono vo dospevaju u jetru. Zbog toga poremećaj u enterohepatičnoj cirkulaciji dovodi do naglog smanjenja jetrene sekrecije žuči. Kompenzatorni mehanizam koji se tada uključuje je povećana sinteza žučnih kiselina, koja može samo delimično da ublaži poremećaj. Aktivni transportni mehanizam ileuma za apsorpciju žučnih kiselina ima najveći značaj za enterohepatičnu cirkulaciju. Zato su resekcija, inflamaci� ja ili biopsija ileuma povezane sa poremećajima u metabolizmu žučnih kiselina. Kod ovih stanja smanjuje se količina žučnih kiselina koja dospeva u jetru, usled toga povećava se sinteza žučnih kiselina u hepatocitima iz holesterola, što snižava koncentraciju holesterola u plazmi. Merenjem koncentracije žučnih kiselina u post�prandijalnom periodu, može se ustanoviti prisustvo poremećaja u apsorpciji žučnih kiselina u ileumu ukoliko ne dođe do očekivanog porasta koncentracije žučnih kiselina. 4. Poremećaji u metabolizmu žučnih kiselina kod holestaze Holestaza predstavlja poremećaj u ekskretornoj funkciji jetre koji uslovljava smanjen protok žuči. Može nastati kao posledica ekstrahepatičnih ili hepatičnih poremećaja. Uzroci smanjene sekrecije žuči su: • hepatički funkcionalni poremećaji; * • mehanička opstrukcija protoka žuči. Kod holestaze bez obzira koji je uzrok, bilijarna ekskrecija je smanjena, žučne kiseline se akumuliraju u jetri, žučne kiseline prelaze u plazmu i periferna tkiva tako da se detektuje njihova povišena koncentracija u krvi.
V. Spasojević�Kalimanovska: Ispitivanje funkcije jetre
13�15
5. Poremećaji u metabolizmu žučnih kiselina kod hepatocelularnih oboljenja Ranije je bilo reci o smanjenoj sekreciji žučnih kiselina kod hepatocelularnih oboljenja kaašto su hepatitis i ciroza. Porast koncentracije žučnih kiselina u plazmi posledica je: • regurgitacije žučnih kiselina iz hepatocita u krv kod holestaze; • porto�sistemskog santa usled: fibroze, ishemije ili opstrukcije hepatičnog tkiva. Kod ovih poremećaja dolazi do naglog skoka koncentracije žučnih kiselina u post�prandijalnom periodu, što se koristi kao veoma osetljiv pokazatelj ovih oboljenja. Određivanja žučnih kiselina u serumu i njihova primena u dijagnostici može se izvršiti na dva načina: a) Određivanje koncentracije žučnih kiselina nakon perioda gladovanja Povišena koncentracija žučnih kiselina nakon perioda gladovanja ukazuje na oštećeno preuzimanje žučnih kiselina od strane jetre iz portalne krvi ili na oštećenu sekreciju žuči ili na portalno sistemski šant. Ovaj test se može koristiti kao veoma osetljiv endogeni klirens test. b) Određivanje koncentracije žučnih kiselina u serumu nakon obroka Merenje koncentracije žučnih kiselina dva časa nakon obroka je osetljiviji test funkcije jetre od me� renja koncentracije žučnih kiselina nakon gladovanja. Praćenje koncentracije žučnih kiselina, bilo nakon endogene stimulacije kontrakcije žuči (hranom), bilo egzogenom upotrebom žučnih kiselina u kapsulama, predstavlja klirens test koji ima veliki značaj za uspostavljanje dijagnoze. U slučaju da je poremećen mehanizam aktivnog transporta žučnih kiselina iz jejunumu, neće doći do naglog skoka koncentracije žučnih kiselina prilikom primene ovog testa i najveći deo žučnih kiselina iz duodenuma biće eliminisano fecesom. Kod hepatocelularnih oboljenja, kao što su hepatitis i ciroza, dolazi do izuzetno naglog skoka koncentracije žučnih kiselina primenom ovog testa, usled porto�sistemskog santa ili smanjene mogućnosti preuzimanja žučnih kiselina iz portalnog krvotoka od strane oštećenih hepatocita.
Kvantitativno ispitivanje funkcije jetre Za ispitivanje ekskretome funkcije jetre upotrebljavaju se, pored određivanja bilirubina i žučnih kiselina i neki specifični testovi koji se zasnivaju na osobini jetre da iz cirkulacije eliminiše strane supstance kada se one iniciraju u cirkulaciju. Za kvantitativno ispitivanje funkcije jetre najviše se koriste sintetske anjonske boje i u novije vreme farmakokinetičko ispitivanje pojedinih lekova. Hepatični klirens test je analogan sa često korišćenim određivanjem renalnog klirensa, koji je pokazatelj renalne funkcije. Klirens test jetre nije potpuno standardizovan, pošto njegovi rezultati zavise od protoka krvi kroz jetru i od stepena ekstrakcije ispitivane supstance od strane hepatocita. Pošto ova dva parametra podležu interindividualnoj i intraindividualnoj varijabilnosti i kod zdravih ljudi, to otežava određivanje referentnih intervala testa i poređenje rezultata. Međutim, ovim testom se ipak mogu dobiti korisni podaci o eliminacionoj i detoksikacionoj funkciji jetre, pogotovo ako se ovaj test kombinuje sa još nekim testom. Utvrđeno je da se mnogi liposolubilni ksenobiotici preuzimaju i metabolišu putem jetre, kao na primer sintetske boje. Nakon toga, one se izlučuju u žuč, ili kao intaktni molekuli ili kao ko� njugati ili u oba oblika. Ova funkcija jetre ispituje se na jednostavan način sa jedinjenjima koja se lako mogu identifikovati zbog promene boje. Jetra veoma brzo preuzima molekule boje iz cirkulacije aktivnim transportom, polako ih ekskretuje u žuč. Eliminacija ovih boja iz krvotoka, zavisi najviše od protoka krvi kroz jetru, prohodnosti bilijamog stabla i funkcionisanja parenhima jetre (masa jetre, aktivnog transporta u ćelije jetre, konjugacija, izlučivanja u žučne kanaliće). Takve obojene supstance su meti� lensko plavo, indigo karmin, kongo crveno, azobilirubin S, Rose�bengal, indocijanin i bromsulfonftalein. Bromsulfonftaleinski test Od svih navedenih jedinjenja bromsulfonftalein (bromsufftalein, tetrabromsulfonftalein, BSP) se naj više koristi jer je klinički dovoljno osetljiv, brzo se izlučuje kroz jetru i ima boju koja je dovoljno jakog intenziteta. RSP je acidobazni indikator koji jetra uklanja iz cirkulacije, konjuguje sa glutationom i izlučuje
13�16
Medicinska biohemija
istim mehanizmom kao i žučne boje. BSP je u kiseloj sredini bezbojan, a dodatkom baze u uzorak seruma prelazi u crveni hinoidni oblik. Nastala crvena boja je proporcionalna koncentraciji BSP�a i meri se na 580 nm. Posle intravenozne injekcije, BSP se u krvi vezuje za albumin i (3�lipoproteine, a prilikom ulaska u jetru oslobađa se iz tog kompleksa sa proteinima. Ukoliko je funkcija jetre normalna BSP se brzo eli� miniše iz cirkulacije i posle 45 minuta svega 5% boje zaostaje u krvi. BSP iz krvi ulazi u Kupferove ćelije jetre i onda u poligonalne ćelije jetre, dok se u ćelijama retikuloendotelnog sistema blokira minimalno boje. Poligonalne ćelije jetrenog parenhima primaju BSP i eliminišu ga putem žuči u žučne ka� naliće. Preko žuči BSP prelazi u creva, a zatim se tu reapsorbuje u portalni krvotok i tako enterohepa� tičnom cirkulacijom vraća u jetru i ponovo izlučuje. U slučaju hroničnih oboljenja jetre i ciroze, retencija BSP�a je zbog smanjene funkcionalne sposobnosti jetre povećana. Na eliminaciju BSP�a iz krvotoka utiče više faktora: protok krvi kroz jetru, masa jetre, akt'van transport u ćelije jetre, konjugacija sa glutationom, izlučivanje u žučne kanaliće i eliminacija sa žuči. Upravo zato što je to kompleksan proces koji obuhvata više funkcija jetre (ekskretomu, detoksikacionu i konjugacionu), BSP je vrlo osetljiv test tako da se i malo slabljenje neke od ovih funkcija izražava retencijom BSP�a u krvi. Zbog slučajeva fatalnog ishoda usled reakcije preosetljivosti na BSP, prestalo se sa upotrebom ovog testa. Umesto BSP�a može se koristiti indocijanin zeleno (ICG) koje ne pokazuje takav efekat. Najčešće se ICG klirens test koristi za određivanje protoka krvi kroz jetru i za predviđanje klirensa le� kova Koje kirakteriše efekat prvog prolaza kroz jetru. Metabolizam ksenobiotika u jetri i klirens testovi Usavršavanjem određivanja klirensa lekova omogućena je upotreba nekih lekova kao markera ek� skretorne funkcije jetre. U cilju ispitivanja ekskretorne funkcije jetre najviše se koriste sledeći lekovi: kofein, lidokain, aminopirin, antipirin, itd. 1. Kofein Kofein se smatra farmakološki relativno sigurnim u dozi između 3�5 mg/kg telesne mase. Nakon oralne upotrebe kofeina vrši se njegova brza i potpuna apsorpcija u gastrointestinalnom traktu. Apsor� bovani kofein se zatim N�demetiluje pomoću sistema hepatičnih oksidaza (mikrozomalne�oksidaze), a nakon toga se njegovi metaboliti ekskretuju urinom. Zbog toga, merenjem klirensa kofeina može se pratiti mikrozomalna aktivnost jetre. Krv (ili saliva) koji se uzimaju pre i nakon upotrebe kofeina se analiziraju reverzno�faznom HPLC metodom. Produženi period eliminacije kofeina se zapaža kod pacijenata sa obolelom jetrom. Kofein klirens test omogućava dinamičko praćenje funkcije jetre. 2. Lidokain Lidokain se deetiluje pomoću citohroma P450 hepatocita i nastaje metabolit monoetil�glicin�eksilidid (MEGX). Brzina porasta koncentracije MEGX�a u serumu reflektuje brzinu metabolizma i klirensa lido� kaina u jetri. Kod ciroze smanjuje se maksimalni klirens lidokaina. Merenjem MEGX�a nakon injekcije lidokaina dobijamo prognostičke informacije o metaboličkoj funkciji jetre. Određivanje lidokaina i MEGX�a omogućava kvantitativnu procenu funkcije jetre. Ovaj test se obično primenjuje u kombinaciji sa drugim testovima radi ispitivanja poremećaja funkcije jetre. 3. Aminopirinski test Ovaj test se zasniva na merenju količine radioaktivnog 14 C� obeleženog aminopirina, koja je u indirektnoj vezi sa funkcionalnom mikrozomalnom masom hepatocita. Aminopirin ima mali ekstrakcioni hepatički koeficijent (0,25), vezuje se za proteine u malom procentu i metabolizuje se najvećim delom u jetri. Zbog tih osobina aminopirina ovaj test bi mogao predstavljati idealan test, ali on nije pogodan za široku upotrebu jer poseduje specifične zahteve u pogledu upotrebe i merenja 14C�atoma. Test se izvodi tako što se pacijentu da 14C�metil obeleženi aminopirin oralno, a zatim se prati koncentracija leka u krvi nakon određenog vremena (obično nakon 30 minuta ili 2 časa) i izražava kao procenat ukupnog leka koji se ekskretovao. Kao standard koristi se 1 4 C 0 2 koji se primenjuje inhalaciono i sprovede se isti postupak. Test je efikasan pri određivanju kratkoročne prognoze alkoholnog hepatitisa i parace�
Sinteza proteina plazme se odvija u granuliranom endoplazmatičnom retikulumu hepatocita, odakle bivaju sekretovani u sinusoide jetre i nakon toga dalje transportovani krvlju u sistemsku cirkulaciju. Koncentracija proteina u plazmi je odraz ravnoteže između dostupnosti dovoljne količine prekursora proteina�aminokiselina i brzine sinteze, oslobađanja, distribucije i eliminacije proteina. Proteini se naj više koriste za ispitivanje sintetske funkcije jetre, ali u tom cilju se mogu određivati i lipidne komponente poput nekih lipoproteina, holesterola i triglicerida i azotnih jedinjenja poput uree, odnosno amonijaka. U akutnim bolestima jetre vrlo malo se promeni koncentracija ukupnih proteina plazme ili proteinski profil, dok su kod hroničnih bolesti te promene uočljivije: smanjuje se koncentracija albumina, a po većava koncentracija vglobulina. Kod teških poremećaja funkcije jetre dolazi do smanjenja sinteze mnogih proteina (albumina, ai�antitripsina, fibrinogena, ceruloplazmina, haptoglobina, transferina, faktora koagulacije, holinesteraze), što kao posledicu ima smanjenje koncentracije ovih proteina u plazmi. Na povredu ili inflamaciju jetra odgovara povećanjem sinteze nekih proteina, tzv. reaktanata akutne faze (arantitripsina, ch�kiselog glikoproteina, C�reaktivnog proteina, ceruloplazmina). Nivo ovih proteina se menja zavisno od vrste i težine bolesti, kao i od dužine njenog trajanja.
Albumin Albumin je globulami protein koji se sintetiše samo u jetri, brzinom od 12 g/dan. Od ukupne količine albumina u organizmu, 60 % je ekstravaskularno, a 40 % intravaskulamo raspoređeno. Albumin ima važne funkcije u organizmu i to: •
vezuje, solubilizuje i transportuje nepolame komponente plazme � bilirubin, masne kiseline, hormone (tiroksin, trijodtironin, kortizol, aldosteron), kalcijum, lekove (varfarin, fenilbutazon, salicilate); • reguliše onkotski pritisak zbog visokog procenta zastupljenosti u plazmi i zbog male molekulske mase. Poremećaj sintetske funkcije jetre dovodi do smanjene sinteze albumina što se onda posredno odražava i na funkcije albumina u organizmu. Hipoalbuminemija ima veliki dijagnostički značaj, ali nije visoko specifičan indikator smanjene sintetske funkcije jetre, jer nastaje usled ne samo smanjene sinteze u jetri, nego i zbog nedovoljnog unosa proteina ili smanjene apsorpcije aminokiselina (kod gastro� enteropatija), kao i zbog povećanog gubitka proteina bubregom (nefrotski sindrom), gastrointestinal� nim traktom i kožom (opekotine). Hipoalbuminemija ima za posledicu niz teških poremećaja u organizmu jer dovodi do poremećaja koncentracije hormona, endogenih supstanci i lekova u plazmi, nastanka edema i ascita usled pada onkotskog pritiska. U slučaju da se mogu isključiti svi ekstrahepatični uzroci hipoalbuminemije, smanjena koncentraci ja albumina u plazmi predstavlja znak smanjene sintetske funkcije jetre. Čak iako brzina sinteze opada, koncentracija albumina može ostati nepromenjena usled kompenzacije hipoalbuminemije smanjenjem brzine razgradnje albumina.
13�18
Medicinska biohemija
Zbog svog dugog poluživota (20 dana), koncentracija albumina u plazmi nije dobar indikator kod akutnih oboljenja jetre. Međutim, kod hroničnih poremećaja jetre, koncentracija albumina opada dovoljnom brzinom tako da je ona u ovom slučaju glavni indikator poremećaja i glavni prognostički faktor oboljenja. Koncentracija albumina u plazmi opada i u slučaju neadekvatne apsorpcije proteina koja često može da nastane kao posledica uznapredovanog oboljenja jetre ili ponekad kao posledica konzumacije alkohola. Hepatociti sintetišu specifične proteine a r antitripsin (odsutan u deficijenciji), ceruloplazmin (redu� kovan u VVilsonovom oboljenju), transferin i feritin (zasićeni gvožđem i povišeni u hemohromatozi). Određivanje ovih proteina ima mali značaj u ispitivanju poremećaja funkcije jetre, ali njihovo određivanje se koristi u dijagnozi specifičnih stanja poput deficijencije ch�antitripsina, VVilsonovog oboljenja, hemo� hromatoze, itd. Ovi plazmatski proteini, kao i neki drugi, nespecifično se povećavaju u toku inflamacije i spadaju u pozitivne reaktante akutne faze. Plazmatski imunoglobulini su povećani u većini hroničnih oboljenja jetre. Koncentracija imunoglo� bulina u akutnom hepatitisu pokazuje blagi porast dok su u hroničnom aktivnom hepatitisu značajno povišeni. U pojedinim oboljenjima jetre postoji specifičan porast imunoglobulina tako da je IgM povišen u primarnoj bilijarnoj cirozi, IgA u bolestima jetre kod alkoholičara i IgG u hroničnom aktivnom hepatitisu. U dijagnostici oboljenja jetre a pogotovu u dijagnostici virusnog hepatitisa poseban značaj imaju detekcija antigena i antitela. Faktori koagulacije Jetra je mesto sinteze svih faktora koagulacije tako da u slučaju poremećene sintetske funkcije jetre dolazi do poremećaja procesa koagulacije. U cilju ispitivanja poremećaja koagulacije određuje se protrombinsko vreme. Protrombinsko vreme (PT) je test koji se široko koristi u hematologiji i hepato� logiji. Protrombinsko vreme predstavlja vreme potrebno za prelazak protrombina u trombin u prisustvu tromboplastina, kalcijuma, fibrinogena i drugih faktora koagulacije (V,VII,X). U procesu koagulacije, trombin omogućava prelazak fibrinogena u fibrin. Protrombin i faktori VII, IX, X zahtevaju prisustvo vitamina K za svoju aktivaciju. Vitamin K je važan za post�translacionu modifikaciju ovih faktora koagulacije (karboksilacija proteina) čime se vrši njihova funkcionalna aktivacija. Zbog velike funkcionalne rezerve jetre, poremećaji u hemostazi ne prate sva oboljenja jetre. Važna upotreba testova koagulacije kod bolesti jetre je provera ispravnosti procesa koagulacije pre izvođenja biopsije jetre. Tu se pre svega misli na određivanje PT i broja trombocita. Dva su razloga zbog kojih oboljenja jetre dovode do produženog protrombinskog vremena: 1. Jetra može biti toliko oštećena da ne može da sintetiše faktore koagulacije; 2. U slučaju poremećene funkcije jetre može doći do deficijencije vitamina K koji je neophodan za sintezu ovih faktora koagulacije. Pošto je vitamin K liposolubilan, do njegove deficijencije dolazi usled smanjene apsorpcije lipida kod opstruktivne žutice gde je poremećena ekskrecija žučnih kiselina. U tom slučaju, nakon parenteralne primene vitamina K, protrombinsko vreme se vraća na normalu nakon 18 časova. Ukoliko nakon parenteralne primene vitamina K ne dođe do normalizovanja protrombinskog vremena, znači da se radi o velikom oštećenju parenhima jetre ili o dugom periodu postojanja bolesti. Pored toga, protrombinsko vreme predstavlja dobar prognostički indikator bolesti jetre. On nema visoku specifičnost za oboljenja jetre, ali ukoliko je pomoću drugih specifičnijih indikatora utvrđeno prisustvo bolesti jetre, praćenjem PT�a može se najpre videti početak oporavka jetre. Isto tako produžavanje PT�a ukazuje na pogoršanje stanja jetre. Produženo protrombinsko vreme se javlja kod: • opstrukcione žutice; • akutnog infektivnog ili toksičnog hepatitisa (PT normalno ili malo produženo); • fulminantnog hepatitisa (infektivne ili toksične etiologije) koji je praćen ozbiljnim hemoragijskim poremećajima i masovnim krvarenjem. U tumačenju rezultata protrombinskog vremena, mora se imati u vidu da primena antikoagulantne terapije produžava protrombinsko vreme.
V. Spasojević�Kalima novska: Ispitivanje funkcije jetre
13�19
Pseudoholinesteraza Određivanje nivoa aktivnosti pseudoholinestaraze u serumu, enzima koga sintetišu hepatociti, koristi se za merenje sintetske funkcije jetre. Pošto ovaj test ne daje konzistentne rezultate, ne koristi se često, osim u slučajevima diferencijalne dijagnoze žutice i pri praćenju pojedinih bolesti jetre. Nizak nivo aktivnosti pseudoholinesteraze nije specifičan indikator, jer se javlja kod mnogih oboljenja jetre kao što su: virusni hepatitis, ciroze., tumori, kao i sekundarnih oboljenja jetre koja su posle� dica smanjene funkcije srca. Kod oporavka od akutnog virusnog hepatitisa, nizak nivo holinesteraze se polako vraća na normalu tako da se u ovom slučaju to koristi kao prognostički indikator. Međutim, praćenje sniženog nivoa aktivnosti pseudoholinesteraze kod hroničnih bolesti jetre ili kod ciroze, ima mali prognostički značaj. Kod pacijenata sa ekstrahepatičnom opstrukcijom, nivo aktivnosti pseudoholinesteraze je normalan. Lipoproteini Jetra je glavno mesto sinteze i metabolizma lipoproteina plazme. U akutnom oštećenju ćelija jetre nivoi enzima koji se sintetišu u jetri kao što su lecitin�holesterol�acil�transferaza i hepatična triglicerid� lipaza, su sniženi. Pacijenti sa akutnim oboljenjima jetre imaju povišene vrednosti triglicerida u plazmi zbog sniženja hepatične triglicerid�lipaze, smanjen procenat holesterol�estara i abnormalne lipoprote� inske elektroforetske trake. U akutnom virusnom ili alkoholičarskom hepatitisu karakteristično je odsustvo a i pre�(3 trake, dok je p traka široka i intenzivna. Kod pacijenata sa intra� ili ekstrahepatičnom holestazom beleži se povećanje nivoa holesterola i fosfolipida. Pored toga, kod pacijenata sa opstruk� tivnom žuticom javlja se i abnormalni protein Lp�X. Holesterol
Endogeni holesterol se najviše sintetiše u jetri. Sintetisani holesterol se inkorpoprira u lipoprotein� ske čestice, metaboliše u žučne kiseline ili izlučuje putem žuči. Holesterol se u plazmi nalazi kao slobodan i mnogo više u esterifikovanom obliku. Intravaskulama esterifikacija holesterola vrši se pomoću enzima lecitin�holesterol�aciltransferaze (LCATj. Obzirom da se enzim LCAT sintetiše u jetri u slučaju nekih poremećaja funkcije jetre dolazi do smanjene sinteze enzima LCAT i smanjene esterifikacije holesterola u plazmi. Posledica ovoga je smanjen nivo esterifikovanog u odnosu na slobodan holesterol. Kod hroničnih bolesti jetre usled oštećenja hepatocita, dolazi do smanjene sinteze holesterola i smanjenja njegove koncentracije u plazmi. Kod bilijarne opstrukcije dolazi do porasta koncentracije holesterola usled njegovog smanjenog izlučivanja putem žuči. Trigliceridi Porast koncentracije triglicerida je relativno nespecifičan, jer taj porast mogu izazvati: hepatitis, ekstrahepatična bilijarna opstrukcija, ciroza, ali i mnoga ekstrahepatična oboljenja (akutni pankreatitis, infarkt miokarda, bubrežne bolesti, diabetes mellitus). Koncentracija slobodnih masnih kiselina je ta� kođo nespecifičan indikator. Niska koncentracija se javlja kod hroničnog hepatitisa, hronične insufici� jencije bubrega i cistične fibroze. Porast koncentracije slobodnih masnih kiselina javlja se kod Rey� ovog sindroma, hepatične encefalopatije, hroničnog hepatitisa, ali i kod ekstrahepatičnih oboljenja (akutna renalna insuficijencija, hipertirodizam). Urea
Sinteza uree se odvija u jetri u Krebs�Hanseleit�ov ciklusu uree. Ciklus uree se odvija najpre u mitohondrijama, pa u citoplazmi i opet u mitohondrijama heDatocita. Urea je glavni proizvod detoksikacije amonijaka, koji je za ćelije sisara toksičan. Amonijak je krajnji proizvod metabolizma aminokiselina i proteina, pa zbog toga brzina sinteze uree zavisi od unosa proteina i katabolizma proteina u organizmu. Iz jetre, urea prelazi u krv, zatim u sve ekstra� i intracelularne tečnosti pošto urea slobodno difun� duje kroz sve ćelijske membrane zbog svoje nepolamosti i male molekulske mase. Urea se izlučuje najviše preko bubrega, malo preko znoja i neznatno preko fecesa. Oko 40% sintetisane uree se izluči u lumen creva gde se pod uticajem ureaze razgrađuje do amonijaka i ugljendioksida. Amonijak se za�
13�20
Medicinska biohemija
tim ponovo resorbuje i uključuje u ciklus uree. Poremećaji koncentracije uree usled snižene sinteze ja vlja se kod nekih bolesti jetre. U tim bolestima dolazi do sniženja koncentracije uree u krvi i urinu bez obzira na primenu proteinske ishrane. Osim toga kod njih je nivo prekursora uree u plazmi (amonijaka i aminokiseline) povišen, a smanjena aktivnost enzima ciklusa uree. Kod pacijenata sa cirozom jetre postoji ograničenje u prevođenju amonijaka u ureu, tj. može se izmeriti maksimum brzine sinteze uree. Kod osoba sa zdravom jetrom ne postoji gornja granica za brzinu sinteze uree. Međutim, kod pacijenata sa cirozom jetre ta gornja granica se brzo ostvaruje.
Precipitacione i flokulacione probe (Labilitetne metode) Plazma je vrlo složena biološka tečnost, koja pored ostalih sastojaka zadrži proteine i lipide, ali je bistra uprkos njihovoj visokoj koncentraciji. Ovo se može objasniti formiranjem vrlo stabilnih kompleksa !i� pida i proteina. Kod mnogih oboljenja se menja odnos lipida i proteina i smanjuje se njihova stabilnost u rastvoru. U takvim uslovima relativno jednostavni hemijski agensi precipitrraju proteine. Labilitetne probe predstavljaju reakcije na serumske proteine i zasnivaju se na otkrivanju njihove smanjene koloidne stabilnosti pod patološkim uslovima. Ove reakcije su nespecifične u odnosu na etio� logiju bolesti i pojedini organ. One pokazuju promene u sastavu proteina i lipoproteina seruma ili plazme i danas se koriste pri dijagnozi oboljenja jetre, mada originalno nisu planirane za oboljenja jetre. Pošto se najveći broj proteina sintetiše u jetri, može se pretpostaviti da se patološki rezultati prvenstveno sreću kod oboljenja jetre. Druga grupa bolesti, kod kojih se pojavljuju patološki rezultati labilitetnih testova, su hronične infekcije praćene povećanjem y�globulina. Najvažnije labilitetne metode su: brzina sedimentacije eritrocita, Weltman�ov koagulacioni niz, McLagan�ova timol proba, sublimat test, Takata reakcija, kadmijum�sulfat reakcija i cefalin�holesterol reakcija. MacLagan�ova timol proba Kada se serum zdravih osoba izmeša sa zasićenim puferovanim rastvorom timola u odnosu 1:60, on će se neznatno zamutiti. Ukoliko se na isti način izmeša patološki serum, recimo od osoba koje boluju od hepatitisa, nastaće znatno zamućenje. Intenzitet ovako nastalog zamućenja upoređuje se od oka ili fotometrijski sa zamućenjem proizvoljno odabranog standarda. Mehanizam timol reakcije nije protumačen. Neki smatraju da je pozitivan ishod uslovljen povećanim sadržajem v�globulina, dok to drugi pripisuju porastu lipoproteina, odnosno porastu p�globulinske frakcije. Ovaj test omogućava da se otkrije poremećena funkcija jetre, a pogotovu ako je poremećaj posledica hepatitisa. Flokulacione probe imaju sve manji značaj u ispitivanju funkcije jetre jer se prednost daje savremenim metodama dijagnostike i novim biohemijskim markerima.
ISPITIVANJE METABOLIČKE FUNKCIJE JETRE Jetra ima centralnu ulogu u metaboličkim i regulatomim putevima. U ispitivanju metaboličke funkcije jetre od posebnog značaja su procesi u organelama hepatocita gde se odvija: • metabolizam lekova tj. aktivacija i detoksikacija lekova; • metabolizam egzogenih i endogenih supstanci i njihovih metabolita (npr. galaktoze i amonijaka). Kao posledica višestrukog metaboličkog poremećaja, koji je nastao usled nasledne deficijencije specifičnog enzima, može doći do primarnog ili sekundarnog oštećenja jetre. Praćenjem koncentracija supstanci koje se metabolizuju u jetri ili njihovih metabolita, moguće je proceniti metaboličku funkciju jetre. Najbolji indikator metaboličke funkcije jetre predstavlja određivanje koncentracije amonijaka u kr vi.
V. Spasojević�Kalimanovska: Ispitivanje funkcije jetre
13�21
Amonijak Amonijum jon se oslobađa u metaboličkim procesima iz aminokiselina i drugih jedinjenja koja sadrže azot. Amonijak je baza rastvorljiva u lipidima i zbog toga lako prolazi kroz ćelijske membrane, za razliku od amonijum jona za koji membrane nisu propustljive. pK vrednost sistema amonijak/amonijum jon iznosi 9,25, zbog čega se u krvi (čiji je pH oko 7,4) nalazi oko 99 % amonijum jona, odnosno 70 puta više amonijum jona nego molekula amonijaka. Mišići stvaraju velike količine amonijaka, naročito pri fizičkom opterećenju. Posebno velike količine amonijaka stvaraju se u lumenu creva zbog bakterijske razgradnje jedinjenja koja sadrže azot; ovaj amonijak se najvećim delom resorbuje i portalnim krvotokom dolazi u jetru. Urea koja se sintetiše u jetri lako difunduje u sve telesne prostore, pa tako dospeva i u lumen creva gde se i ona razlaže pod uti� cajem bakterija, a amonijak nastao u tom procesu ponovo dospeva u jetru. Iz proteina, aminokiselina, uree i drugih azotnih jedinjenja, amonijak se oslobađa dejstvom prote� aza, amino�oksidaza i ureaza bakterija. Koncentracija amonijaka u portalnoj plazmi je obično 5�10 puta veća nego u sistemskoj cirkulaciji. Pri normalnoj cirkulaciji, najveći deo amonijaka iz portalne cirkulacije biva preuzet od strane hepatocita gde se matabolizuje do uree, u Krebs�Hanseleit�ovom ciklusu uree (vidi Opštu biohemije).
Slika 13�13. Metabolizam amonijaka u organizmu. Stvaranje amonijaka u crevima i eliminacija amonijaka u vidu uee i glutamina (Glu � glutamat i Gln � glutamin). Amonijak se u većini tkiva eliminiše vezivanjem za keto kiseline, odnosno a�ketoglutarat, oksala� cetat i piruvat, pri čemu nastaju aminokiseline: glutamat, aspartat i alanin, a daljom amidacijom gluta� mata nastaje glutamin. Stvoreni glutamin prelazi u cirkulaciju i dospeva u jetru gde se odvija najvažniji proces u kome se eliminiše amonijak, a to je sinteza uree.
13�22
Medicinska biohemija
Urea i glutamin su najvažnija jedinjenja u obliku kojih se putem bubrega izlučuje amonijak iz organizma. Urea se slobodno izlučuje urinom. Glutamin se u tubulocitima dejstvom glutaminaze razlaže na amonijum jon i glutamat. Stvoreni glutamat oksidativnom dezaminacijom sa glutamat�dehidrogenazom prelazi u a�ketoglutarat i oslobađa se još jedan amonijum jon. a�Ketog luta rat se uključuje u proces glukoneogeneze. Amonijum jon u tubulocitima prelazi u amonijak koji lako difunduje u lumen tubula gde vezuje jon vodonika i na taj način, osim što se eliminiše, učestvuje i u puferovanju urina (Slika 13� 13).
Hiperamonemija Hiperamonemija je stanje kod koga je u arterijskoj krvi koncentracija amonijum jona veća od 50 umol/L Intoksikacija amonijakom se u prvom redu odražava na CNS; amonijačna encefalopatija se karakteriše motoričkim nemirom, grčevima, somnolencijom i na kraju nastupa smrt zbog inhibicije disanja. Do intoksikacije amonijakom dolazi kod teških poremećaja jetre ili kod genetskih enzimskih defekata u nekom od stupnjeva u ciklusu uree. Hiperamonemija kod poremećaja funkcije jetre Kod teških oštećenja parenhima jetre ili kod poremećaja u cirkulaciji u jetri (anastomoze kojima se zaobilazi jetra) dolazi do merljivog povećanja koncentracije amonijaka. Najčešći uzrok sekundarne hi� peramonemije su: hepatična koma koja je posledica virusnog hepatitisa ili teških trovanja organskim rastvaračima, ciroza jetre u terminalnoj fazi, ciroza jetre praćena hipokalemičnom alkalozom, poremećena portalna cirkulacija usled čega dolazi do razvoja kolaterala kojima se zaobilazi jetra i operacije posle kojih ostaju bočne kolaterale kojima se zaobilazi jetra. Ove bolesti jetre izazivaju usporavanje normalnog metabolizma amonijaka, porast koncentracije amonijaka u krvi, povećan prelazak amonijaka u mozak što uslovljava razvoj hepatične encefalopatije. Hepatična encefalopatija
Amonijak ulazi u mozak pasivnom difuzijom zahvaljujući svojoj nepolarnosti i maloj molekulskoj masi, daleko brže nego amonijum jon. Brzina njegovog prelaska u mozak zavisi od koncentracije amonijaka u krvi i od pH krvi, kao što je već rečeno. Dijagnoza hepatične encefalopatije se vrši na osnovu karakterističnih pikova na EEG�u i merenjem koncentracije amonijaka u krvi. Koncentracija amonijaka je u ovom slučaju uvek povećana, ali slabo koreliše sa stepenom razvoja encefalopatije. Zbog toga se merenje koncentracije amonijaka u krvi koristi u slučaju kada se ne zna uzrok kome. Mnogo veći dijagnostički značaj ima merenje glutamina u cerebrospinalnoj tečnosti, koje nam pomaže pri razlikovanju hepatične od septične encefalopatije. Naravno, ovaj metod nije u širokoj upotrebi. Hepatična encefalopatija se može javiti kod: • pacijenata sa cirozom, gde može biti ubrzana epizodama gastrointestinalnih krvarenja jer se onda povećava produkcija amonijaka dejstvom intestinalnih bakterija na proteine; • pacijenata sa cirozom u kombinaciji sa otežanom portalnom cirkulacijom od intestinuma do jetre, što uslovljava razvoj kolaterala koje krv odvode mimo jetre u sistemsku cirkulaciju; • velikih proteinskih obroka; • infekcije; • disbalansa elektrolita i acido�bazne ravnoteže; • smanjenog izlučivanja urina usled čega raste koncentracija uree u krvi, što uslovljava povećano izlučivanje uree u intestinum, gde se prevodi u amonijak i dovodi do povećanja koncentracije amonijaka u krvi.
V. Spasojević�Kalim anovska: Ispitivanje funkcije jetre
13�23
Hiperamonemija kod urođenih enzimskih defekata u ciklusu uree Ovi defekti mogu biti različiti zavisno od toga koji stupanj u ciklusu uree je pogođen (Tabela 13�1). Usled nedostatka nekog od pet enzima koji sudeluju u biosintezi uree dolazi do poremećaja u ovoj sintezi. Urođene genetske deficijencije su dosta retke jer je mali broj pacijenata kod kojih je opisan ovaj poremećaj. Najčešća je hiperamonemija tipa II koja je posledica deficijencije ornitin� transkarbamoilaze. Tabela 13�1. Nasledni poremećaji ciklusa uree. Tip Hiperamonemija I Hiperamonemija II Citrulinemija Arginino�sukcinaturija Hiperargininemija
Enzimski defekt Karbamoilfosfat�sintetaza Ornitin�transkarbamoilaza Arginino�sukcinat�sintetaza Arginino�sukcinat�lijaza Arginaza
Hiperamonemija se može javiti i kod nekih drugih oboljenja. Rey�ov sidrom je akutna i često smrtonosna encefalopatija koja se javlja kod dece, obično kod virusnih infekcija, a praćena je vrlo velikim povećanjem amonijaka u plazmi. Do povećanja amonijaka u plazmi dolazi i kod dugotrajne primene valproata. Test tolerancije amonijaka se sastoji u merenju koncentracije amonijaka u plazmi pre i posle uzimanja standardne doze amonijum�hlorida, radi procene stepena u kome portalna krv zaobilazi jetru. Ukoliko dođe do naglog porasta koncentracije amonijaka nakon uzimanja amonijum�hlorida, može se smatrati da portalna krv velikim delom zaobilazi jetru tako da ne može da se detoksikuje amonijum jon u ciklusu uree u hepatocitima.
Poglavlje 14. Ispitivanje funkcije gastrointestinalnog trakta
Gastrointestinalni trakt (GIT) ne treba posmatrati kao inertni mišićni tubus kroz koji se unosi hrana u organizam, već kao složeni neuroendokrini organ. GIT možemo smatrati glavnim endokrinim organom, ali i glavnim ciljnim organom za mnoge hormone koji se izlučuju lokalno ili tu dospevaju sa drugih mesta. Gastrointestinalne hormone izlučuju endokrine ćelije raspoređene duž mukoze GIT i one su tako brojne da je GIT najveći endokrini organ. GIT je pod neuroendokrinom regulacijom koja se ostvaruje delovanjem brojnih gastrointestinalnih hormona. Izlučivanje ovih hormona se odvija ner� vnom ili lokalnom stimulacijom tj prisustvom hrane. Hormoni deluju na pojedine regione gastrointestinalnog trakta i regulišu procese varenja i apsorpcije. Gastrointestinalni hormoni imaju različite funkci je: regulišu pokretljivost GIT, stimulišu lučenje određenih sastojaka sokova (HCI ili bikarbonata) i brojnih enzima koji utiču na varenje. U gastrointestinalne hormone spadaju: gastrin, sekretin, holecis� tokinin (CCK), GIP (gastrični inhibitorni polipeptid) VIP (vazoaktivni intestinalni polipeptid), somatos� tatin, bombesin, glukagon, itd. U GIT traktu se odvijaju složeni procesi varenja i apsorpcije hrane pod uticajem brojnih enzima koji vode poreklo iz: želuca (pepsinogen i pepsin), pankreasa (proteolitički enzimi: tripsin, himotripsin, karboksipeptidaze, nukleaze: DNK i RNK nukleaze; lipolitički enzimi: lipaza, fosfolipaza, holesteroles� teraza, kao i amilaza); jejunuma (aminopeptidaze, oligo� i disaharidaze). Poremećaji u funkciji ovih organa odražavaju se na varenje i apsorpciju svih hranljivih materija, pa i na njihov dalji metabolizam. Procena funkcije GIT zasniva se na ispitivanju poremećaja na nivou pojedinih njegovih delova: želuca, pankreasa i creva. Najčešći su poremećaji u egzokrinoj funkciji pankreasa pa je i najveći broj biohemijskih i funkcionalnih ispitivanja vezan za pankreas i njegov uticaj na varenje lipida i proteina, kao i njihovu kasniju apsorpciju u crevima. Ispitivanja poremećaja funkcije GIT mogu se sprovesti na osnovu promene određenih biohemijskih parametara u krvi, urinu ili fecesu. Drugi tip ispitivanja pod� razumeva analizu želudačnog ili duodenalnog sadržaja nakon intubacije bolesnika i davanja hormonske stimulacije. Posebnu grupu funkcionalnih testova predstavljaju testovi poput PABA itd. gde se pacijentu daje određeno jedinjenje koje se rpzlaže dejstvom odgovarajućih enzima iz gastrointestinalnog trakta, a zatim se apsorbovane supstance putem krvi transportuju u jetru, metabolišu i izluču ju urinom. U urinu se vrši određivanje razložene supstance.
ISPITIVANJE FUNKCIJE ŽELUCA U cilju ispitivanja funkcije želuca koristi se ispitivanje želudačnog soka tj. sadržaja želuca posle gladovanja od 12 sati. Biohemijska ispitivanja sadržaja želudačnog soka obuhvataju više fizičko� hemijskih ispitivanja. Uzorak želudačnog soka se dobija intubacijom pacijenta i aspiracijom sadržaja
14�2
Medicinska biohemija
želuca kroz odgovarajuću gastričnu sondu. Uzorak želudačne soka se dobija nakon stimulacije sekrecije u želucu koja se sprovodi na više načina: • Davanjem određene hrane (tosta sa vodom ili čajem), kofeina ili alkohola. Stepen stimulacije sekrecije želudačnog soka u ovom slučaju je dosta mali. • Primena histaloga (3 p�aminoetilpirazoldihidrohlorid) i derivata histamina. Ovaj tip stimulacije može imati dosta sporednih efekata zbog neželjenih dejstava histamina i zbog toga treba dobro pripremiti pacijenta i dati mu antihistaminik. • Davanjem gastrina ili pentagastrina. Gastrin je prirodni hormonski stimulans lučenja hlorovodo� nične kiseline i najefikasnije deluje na njeno lučenje. Može se gastrin zameniti pentagastrinom koji je sintetički stimulans, polipeptid koji ima terminalnu sekvencu četiri aminokiselina identičnu sa gastrinom i te aminokiseline su odgovorne za fiziološko dejstvo gastrina. Stimulacija pentagastrinom se najviše koristi jer je efekat stimulacije veliki, a nema sporednih dejstava. • Davanje insulina dovodi do hipoglikemije što stimuliše oslobađanje gastrina koji prouzrokuje se� kreciju hlorovodonične kiseline. Želudačni sok se sakuplja nakon pravilne pripreme pacijenta. U dobijenom uzorku želudačnog soka vrše se sledeća fizičko�hemijska ispitivanja: 1. Određivanje zapremine Normalna zapremina želudačnog soka iznosi od 20 do 100 ml (obično 50 ml). Zapremina preko 100 ml je abnormalna i ona može biti posledica otežanog pražnjenja sadržaja želuca zbog opstrukci je pilorusa, povećane sekrecije u slučaju Zoilinger�Ellisonovog sindroma ili zbog vraćanja sadržaja iz duodenuma i u tom slučaju se dokazuje žuč u želudačnom soku. 2. Miris Miris želudačnog soka je specifičan, a jači miris ukazuje na fermentaciju i putrefikaciju. 3. Konsistencija Želudačni sok je obično tečan, a može biti viskozan usled viška mukusa. 4. Boja Želudačni sok je bez boje, ali može biti žut ili žutozelen zbog prisustva žuči. Ovakva boja soka se javlja kod 25 % normalnih osoba, a i kod pacijenata posle gastroktomije. Prisustvo žuči dokazuje se reakcijom specifičnom za bilirubin tkz. iktotestom. Crvena ili braon boja se javlja usled prisustva krvi što se isto tako može dokazati odgovarajućim testom. 5. Slobodna hlorovodonična kiselina Koncentracija hlorovodonične kiseline (HC!) koju luče parijetalne ćelije je oko 155 mmol/L, a pH je 0,9. Finalna koncentracija vodonikovih jona u želudačnom soku zbog mešanja sa ostalim sastojcima želuca (mukozom, salivom, unetom hranom) je oko 40 mmol/L i pH 1,5�3,5. Kod nekih osoba kao što su mlađe ili starije može se javiti nedostatak lučenja HCI. Kod ovih osoba potrebna je stimulacija parijetalnih ćelija da bi se procenila sposobnost lučenja HCI. Ahlorhidrija označava stanje potpunog odsustva HCI i posle stimulacije pentagastrinom. 6. Ukupan aciditet Pojam ukupnog aciditeta želudačnog soka obuhvata sve jone vodonika koji vode poreklo od slobodne hlorovodonične kiseline, organskih kiselina (mlečna i buterna) i mukoproteina. Laktata i butira� ta normalno nema u želudačnom soku, a nastaju nakon dužeg zadržavanja hrane (više od 6 sati) u želucu dejstvom bakterija. Ukupan aciditet iznosi od 10 do 50 mmol/L. 7. Enzimi
U želudačnom soku se može odrediti aktivnost sledećih enzima: pepsina, gastrične lipaze i sali� varne amilaze. 8. Mukus Mukus produkuju epitelne i glavne ćelije želuca, a uglavnom se sastoji od mukopolisaharida i proteina. Normalno ga ima minimalno, a povećane količine se javljaju kod karcinoma, gastritisa ili mehaničke iritacije.
V. Spasojević�Kalimanovska: Ispitivanje funkcije GIT
14�3
9. Krv Pojava krvi u želudačnom soku pokazatelj je patološkog stanja kao što je karcinom želuca, pepti� čki ulkus ili gastritis. Boja prisutne krvi zavisi od pH vrednosti želuca. Pri niskoj vrednosti pH prisutan je kiseli hematin, braonkaste boje, zrnastog oblika u vidu zrna kafe. Prisustvo sveže crvene krvi pos� ledica je skore traume (sa sondom), ali se javlja i kod ulkusa i karcinoma želuca. 10. Hrana Normalno sonda ne sadrži hranu, tako da prisustvo hrane ukazuje na smanjenu pokretljivost želuca ili opstrukciju pilorusa. 11. Unutrašnji faktor Unutrašnji faktor je mukoprotein koga luče ćelije fundusa. Unutrašnji faktor je neophodan u apsorpciji vitamina B 12 . Njegov nedostatak onemogućava apsorpciju ovog vitamina i odražava se na razvoj eritrocita. Ovaj glikoprotein se može dokazati u želudačnom soku, ali njegov nedostatak se dokazuje specifičnim Šilingovim testom. 12. U želudačnom soku se mogu dokazati i ćelije želuca (parijetalne, glavne i mukozne ćelije) kao i regurgitac.one tečnosti poput žuči, pankreasnog ili duodenalnog soka. Bolesti u kojima je važno ispitivanje želudačnog soka su: gastrični ulkus, pilorusna opstrukcija, karcinom želuca i Zollinger�Ellisonov sindrom.
ISPITIVANJE EGZOKRINE FUNKCIJE PANKREASA Egzokrina funkcija pankreasa je od presudnog značaja u varenju svih sastojaka hrane. Svaki poremećaj u egzokrinoj funkciji pankreasa odražava se i na procese varenja i apsorpcije hrane u GIT.
Direktni testovi Osnovna egzokrina uloga pankreasa je produkcija i sekrecija pankreasnog soka bogatog enzimima i bikarbonatima. Normalni pankreasni sok je bezbojan i bez mirisa. pH pankreasnog soka je 8,0 do 8,3, gustina 1,007 do 1,042. Ukupna zapremina izlučenog pankreasnog soka u toku 24 sata se kreće od 800 do 3000 ml_. U cilju ispitivanja egzokrine funkcije pankreasa mogu se primeniti direktni i indirektni testovi. U direktne testove spada analiza sadržaja duodenalnog soka. Radi sakupljanja duodenalnog soka potrebna je intubacija pacijenta i sakupljanje sadržaja duodenuma u vidu tri porcije u određenim vremenskim intervalima od po 10 minuta. Duodenalni sok se sakuplja obično nakon stimulacije lučenja pankreasa hranom ili hormonima. Egzokrina funkcija pankreasa se proce� njuje određivanjem zapremine duodenalnog soka, sadržaja bikarbonata i aktivnosti enzima. Od enzima ispituje se pre svega tripsin, a potom i amilaza i lipaza. U zavisnosti od primenjene stimulacije lučenja pankreasnog soka postoji više testova: 1. Sekretinski test Sekretinski test se zasniva na merenju zapremine duodenalne sonde i koncentracije bikarbonata u njoj. Egzokrina funkcija pankreasa u ovom testu ispituje se intravenskim davanjem hormona sekre� tina koji pre svega stimuliše lučenje bikarbonata i vode. Tumačenje sekretinskog testa vrši se na osnovu merenja volumena svake porcije duodenalnog soka. Ukoliko je egzokrina funkcija pankreasa sačuvana, sekretin normalno povećava zapreminu za 1,5 mL/kg u toku 30 minuta, a najveća dostignuta vrednost bikarbonata je 90 mmol/L. Patološke vrednosti sekretinskog testa se dobijaju kod opstrukcije pankreasnog kanala, hroničnog pankreatitisa gde je sadržaj bikarbonata nizak i kod tumora pankreasa gde je snižen protok tečnosti. U ovom testu određivanje aktivnosti enzima nema dijagnostički značaj. 2. Holecistokinin�pankreozimin stimulirajući test Holecistokinin�pankreozimin stimulirajući test zasniva se samo na merenju aktivnosti enzima koje luči pankreas. Holecistokinin izlučuje intestinalna mukoza, a fiziološki stimulans za lučenje ovog hormona je prisustvo proteina, lipida i njihovih produkata. U slučaju stimulirajućeg testa intravenski
14�4
Medicinska biohemija
se aplikuje ovaj hormon i nakon toga prati njegov efekat na sekreciju enzima varenja iz acinarnih ćelija. Ovaj test se može izvoditi u kombinaciji sa sekretinskim testom i na taj način pratiti kompletna funkcija pankreasa i njegova sposobnost lučenja i bikarbonata i enzima. 3. Lundhovtest Pacijentu se daje standardan obrok i posle toga u duodenalnom soku određuje tripsin. Standardni obrok se sastoji iz tačno propisane količine proteina, lipida i glukoze. Pored ovih testova stimulacije za ispitivanje egzokrine funkcije pankreasa u direktne testove spada i određivanje enzima tripsina i himotripsina u fecesu. Pankreas sekretuje dva proteolitička enzima tripsin i himotripsin koji svoje dejstvo ispoljavaju u duodenumu. Ovi enzimi se delimično razlazu u intestinalnom traktu, ali dobrim delom se izlučuju putem fecesa. Određivanjem aktivnosti ovih enzima u fecesu može se pratiti egzokrina funkcija pankreasa i ovaj test je našao pre svega primenu u dijagnozi insuficijencije pankreasa (npr. kod cistične fibroze) i kod opstrukcije pankreasnog kanala. Određivanje aktivnosti himotripsina u fecesu se više primenjuje od tripsina jer je ovaj enzim stabilniji u fecesu, pokazuje veću osetljivost i bolji je pokazatelj pankreasne funkcije.
Indirektni testovi Ispitivanje egzokrine funkcije pankreasa primenom testova stimulacije i analizom duodenalnog soka su dobri pokazatelji ove funkcije, ali ipak su to invazivni testovi koji podrazumevaju intubaciju pacijenta što je neprijatno za pacijenta. Zbog ovoga se sve više koriste indirektni testovi gde se funkcija pankreasa procenjuje na osnovu dejstva pankreasnih enzima na varenje određenih supstanci. U tom cilju pacijentu se oralno daje supstrat koji se hidrolizuje dejstvom specifičnog pankreasnog enzima. U ovoj reakciji oslobađa se proizvod koji se apsorbuje u GIT, a zatim jednostavno određuje u krvi ili urinu. 1. PABAtest Pacijentu se oralno daje peptid N�benzoil�L�tirozil�p�aminobenzojeva kiselina (BTP) ili bentiromid na koga deluje himotripsin. Hidrolitičkim razlaganjem oslobađa se p�aminobenžojeva kiselina (PABA) koja se apsorbuje u intestinumu i dalje metaboliše u jetri do odgovarajućeg glukuronida i potom izlučuje urinom. U urinu se paraminobenzojeva kiselina određuje specifičnom bojenom reakcijom. Koncentracija PABA u urinu odraz je egzokrine funkcije pankreasa. Snižena koncentracija PABA u urinu dobija se u slučaju insuficijencije pankreasa i smanjenog lučenja himotripsina. 2. Fluorescein�diularatni test (FDL) Fluorescein�diularat se oralno daje pacijentu i on je supstrat za pankreasni enzim holesteroles� ter�hidrolazu. Hidrolizom ovog supstrata oslobađa se fluorescein, koji se apsorbuje i izlučuje urinom. Određivanje koncentracije izlučenog fluoresceina je vrlo jednostavan postupak. Patološke vrednosti ovog testa dobijaju se kod pacijenata sa teškim oblikom hroničnog pankreatitisa, cistične fibroze i kod pacijenata sa totalnom pankreaktomijom. 3. Izotopski testovi varenja masti Opšti princip ovih testova je oralno davanje triglicerida radioaktivno obeleženim izotopima i praćenje poremećaja u varenju ili apsorpciji triglicerida. Testovi omogućavaju praćenje poremećaja u egzokrinoj funkciji pankreasa, ali i poremećaja procesa apsorpcije u crevima. Poremećaj funkcije pankreasa odražava se na smanjenu sekreciju enzima lipaze koja sudeluje u procesima hidrolize triglicerida i to se može detektovati na osnovu povećane količine izotopa u fecesu i smanjene količine u serumu ili izdahnutom vazduhu. Merenje izotopa u izdisaju se koristi u slučaju isparljivih produkata metabolizma lipida
V. Spasojević�Kalimanovska: Ispitivanje funkcije GIT
14�5
Test izdisaja Za pacijenta je svakako najjednostavniji test izdisaja jer se prisustvo steatoreje dokazuje na osnovu abnormalnih niskih vrednosti 1 4 C 0 2 u izdahnutom vazduhu posle oralnog davanja 14 C� triglicerida. Test se izvodi u dve faze jer se najpre pacijentu daje esterifikovana 14 C masna kiselina, a zatim se u izdahnutom vazduhu određuje 1 4 C0 2 . Normalne vrednosti ukazuju da pacijent ima normalno varenje i apsorpciju neutralnih masti. Ukoliko se dobiju niske vrednosti test se ponavlja, ali se pacijentu daje ekvimolarna količina 14C�slobodna masna kiselina. Ukoliko se i u drugoj fazi dobiju niske vrednosti 1 4 C 0 2 radi se o poremećajima u crevima. Normalne vrednosti ukazuju da je apsorptiv� na funkcija u crevima očuvana, a nemogućnost metabolisanja triglicerida posledica je poremećene funkcije pankreasa i sekrecije pankreasnog enzima lipaze. Masti u stolici (vidi sledeći podnaslov) Pored testova za ispitivanje egzokrine funkcije pankreasa u cilju dijagnoze oboljenja pankreasa određuje se veći broj biohemijskih parametara u serumu, urinu i fecesu. U cilju dijagnoze akutnog i hroničnog pankreatitisa, insuficijencije pankreasa, cistične fibroze, karcinoma pankreasa itd., u serumu se određuju enzimi amilaza, izoenzimi amilaze, lipaza, fosfolipaza, tripsin i tripsinogen (vidi poglavlje Enzimi).
ISPITIVANJE FUNKCIJE VARENJA I APSORPCIJE U GASTROINTE� STINALNOM TRAKTU U duodenumu, jejunumu i ostalim delovima creva odvijaju se dva fiziološka procesa: varenje i apsorpcija svih hranljivih materija. Proces varenja je zavistan od egzokrine funkcije pankreasa i lučenja odgovarajućih enzima, tako da se i poremećaji procesa varenja ispituju zapravo testovima za ispitivanje poremećaja egzokrine funkcije pankreasa. Ponekad se istim testom može odrediti da li je poremećaj na nivou varenja ili na nivou apsorpcije. 1. Masti u stolici Pod pojmom ukupni lipidi u fecesu spadaju sve lipidne komponente koje nisu apsorbovane iz creva i u njih spadaju mono�, di� i trigliceridi, masne kiseline, soli masnih kiselina, fosfolipidi, glikolipi� di i estri holesterola. Lipidi u fecesu su neapsorbovane masti unete hranom, ali deo tih lipida potiče iz intestinalnih bakterija i epitelnih ćelija intestinalne mukoze. Određivanje lipida u fecesu ima višestruki značaj jer omogućava: (a) ispitivanje poremećaja balansa metabolizma lipida; (b) dijagnozu poremećaja apsorpcije kao posledice pankreasnih oboljenja ili intestinalnih oboljenja; (c) definitivnu dijagnozu steatoreje. Lipidi u fecesu se mogu dokazati bojenom reakcijom i na osnovu izgleda i mirisa fecesa, ili kvantitativnim određivanjem lipida u fecesu. Određivanje lipida u fecesu zahteva sakupljanje i čuvanje fecesa 72 sata što je neprijatno za pacijenta i zahteva specijalne uslove u laboratoriji. Za rutinsko dokazivanje steatoreje primenjuje se mikroskopski pregled fecesa na masne kapi sa Sudan III. Da bi se izbeglo sakupljanje fecesa 72 sati, primenjuje se i test sa 14 C obeleženim trigliceridima i mere� nj e 14 C0 2 u izdahnutom vazduhu. U fecesu se pored masti dokazuje i prisustvo nesvarenih mišićnih vlakana, kao i prisustvo krvi u slučaju krvarenja u gastrointestinalnom traktu. 2. Test apsorpcije D�ksiloze D�ksiloza je pentoza koje normalno nema u krvi. Ukoliko se primeni oralno, ona se pasivno ap� sorbuje u proksimalnom delu tankog creva (oko 60 %) i potom izlučuje urinom. Količina D�ksiloze u krvi i urinu je srazmerna apsorptivnoj sposobnosti crevne mukoze. Niska apsorptivnost D�ksiloze se javlja u slučaju malapsorpcije, celijačnog oboljenja, Kronove bolesti, tropskog spru�a, radijacionog enteritisa, dehidratacije, povraćanja, itd. Lažni rezultati se dobijaju u slučaju poremećaja bubrežne funkcije i zbog toga se uporedo određuje D�ksiloza u urinu i u krvi. U slučaju malapsorpcije ovaj test apsorpcije D�ksiloze omogućava diferenciranje insuficijencije pankreasa od poremećaja apsorpcije u jejunumu. U slučaju poremećaja apsorpcije, 80 % pacijenata pokazuje niske vrednosti ovog testa.
Poglavlje 15. Uticaj lekova na rezultate biokemijskih analiza S obzirom na sve širu primenu i sve veći značaj različitih kliničko�hemijskih analiza, mora se voditi računa o brojnim faktorima koji mogu da utiču na tačnost laboratorijskih određivanja. Interpretacija laboratorijskih rezultata dobijenih spektrofotometrijskim, fluorimetrijskum ili drugim metodama može biti otežana ili čak pogrešna zavisno od: • analitičkih faktora kao što su konzervisanje uzorka, nekvalitetna oprema, neispravnost reagenasa, čistoća hemikalija itd. Najveći broj ovih nedostataka može da se otkrije i ukloni pravilnom kontrolom kvaliteta. • fizioloških i spoljnih faktora. Na primer, dobro su poznate varijacije koje zavise od pola, starosti ili fizičkog vežbanja, mada se mora voditi računa i o uticaju spoljnih faktora kao što su klimatski uslovi, navike u ishrani i uzimanje lekova. Prisustvo lekova u telesnim tečnostima može da dovede do pogrešne interpretacije rezultata laboratorijskih testova na dva načina: analitičkim uticajem, tj. metodološkom, in vitro interferencijom sa kliničko�hemijskom metodom, ili farmakološkim uticajem, tj. biološkim, in vivo efektima.
ANALITIČKI (IN VITRO) UTICAJI LEKOVA Do analitičkog uticaja dolazi u slučaju kada lek svojim fizičko�hemijskim osobinama utiče na rezultat metode kojom se određuje koncentracija određenog konstituenta telesne tečnosti. Ovakvi uticaji čine samo oko petinu efekata prikazanih u obimnom pregledu Young�a i saradnika. In vitro uticaji mogu da budu posledica nekih fizičkih osobina, npr. boje ili fluorescencije lekova, a cesto se javljaju kada se reakcija izvodi u kiselim ili baznim rastvorima. Analitički efekti se javljaju i usled hemijskih osobina lekova kojima oni deluju na hemijske reakcije prilikom izvođenja raznih laboratorijskih analiza i menjaju njihove rezultate. Npr. metildopa, koji se koristi za lečenje hipertenzije povećava rezultate određivanja kateholamina u urinu, pošto učestvuje u hemijskoj reakciji i daje fluorescenciju sličnu onoj koja potiče od noradrenalir.a. Značajna je činjenica da lek koji utiče na rezultate neke metode, ne mora da utiče i na druge metode koje se koriste za određivanje koncentracije istog sastojka biološkog materijala. Zbog toga je poznavanje analitičkih uticaja veoma važno prilikom izbora referentnih metoda (treba birati najspecifičnije metode koje su najmanje podložne in vitro interferencijama), kao i u slučaju svih ostalih metoda koje se primenjuju u kliničko�hemijskim laboratorijama, a izvode se bilo ručno, bilo pomoću kliničko�hemijskih analizatora.
15�2
Medicinska biohemija
Tabela 15�1. Analitičke interferencije nekih nesteroidnih antiinflamatornih lekova sa određivanjem nekih sastojaka seruma. Lek
Interferencija
Acetilsalicilna kiselina
povećana glukoza (ABTS) povećana mokraćna kiselina (urikaza) sniženi ukupni proteini (biuretska metoda) snižen holesterol (Liebermann�Burchard�ova reakci ja)
Aminofenazon
snižena glukoza (ABTS) sniženi ukupni proteini (biuretska metoda)
Diklofenak
povećana gluKoza (ABTS) povećana mokraćna kiselina (urikaza) sniženo gvožđe (Ramsav)
Indometacin
povećana glukoza (ABTS; GDH) sniženi ukupni proteini (biuretska metoda)
Analitički efekti lekova mogu da se znatno smanje uvođenjem savremenijih, specifičnijih metoda. Tako je analiza joda vezanog za proteine (PBI) zamenjena određivanjima hormona tiroideje, na koja ne utiče uzimanje joda. Uvode se i nove metode za mnoga rutinska određivanja u kliničkoj hemiji. Glukoza, holesterol, ureja, mokraćna kiselina i dr. sada se određuju enzimskim tehnikama koje su specifičnije od starijih kolorimetrijskih metoda. Tabela 15�2. Analitičke interferencije acetilsalicilne kiseline, tetraciklina i sulfonamida kod ispitivanja urina Lek Acetilsalicilna kiselina
Interferencija pozitivna reakcija na glukozu (redukcione metode) pozitivna reakcija na bilirubin (Fouchet) pozitivna reakcija na fenilketone (FeCI 3) povećana acetosirćetna kiselina (Gerhardt) povećana hipurna kiselina povećani kateholamini (fluorescencija) povećana homogentizinska kiselina povećani proteini (Folin) povećana mokraćna kiselina (redukcione metode) snižena glukoza (GOD metoda) snižena 5�HIAA (fluorimetrijski) snižen estriol (ometa enzimsku reakciju)
Sulfonamidi
pozitivna reakcija na proteine (sulfosalicilna kiselina) povećan urobilinogen (Ehrlich) povećani proteini (Folin) pramena boje urina
Tetraciklini
negativna reakcija na glukozu (neke test�trake) pozitivna reakcija na glukozu (metode sa Cu 2+ �jonima) povećani kateholamini (fluorescencija) povećan urobilinogen (Ehrlich) snižena glukoza (GOD metoda)
Z. Jelić�lvanović: Uticaj lekova na rezultate biohemijskih analiza
15�3
Male razlike u postupcima mogu da budu veoma važne za stepen interferencije leka, npr. askorbinska kiselina i metildopa ne utiču podjednako na sve metode za određivanje kreatinina, iako se one zasnivaju na istom principu. Rezultati ispitivanja uticaja nesteroidnih antiinflamatomih lekova na rezultate kliničko�biohemijskih metoda, koje je dobila grupa naših autora, mogu da posluže kao primer in vitro interferencije lekova. Rezultati su pokazali da veće doze nekih od ovih lekovitih supstanci utiču na određivanje glukoze, proteina, holesterola, mokraćne, kiseline, bilirubina i gvožđa (Tabela 15�1). In vitro interferencije lekova u pravilu su više izražene kod ispitivanja urina nego kod metoda za analizu krvi (Tabela 15�2). Ponekad se interferencija ksenobiotika primećuje i makroskopski, kao stoje slučaj npr. kod supstanci koje menjaju boju urina (BSP, PSP, antibiotici, aminopirin, difenilhidantoin, antrahinoni, fenacetin, riboflavin i dr).
FARMAKOLOŠKI (IN VIVO) EFEKTI Svojim farmakološkim dejstvom na organizam, lekovi mogu da promene stvarnu koncentraciju nekih konstituenata telesnih tečnosti. Ova promena može da bude željena � npr. alopurinol, inhibitor ksantin� oksidaze koristi se da bi se smanjila koncentracija mokraćne kiseline u plazmi pacijenata obolelih od gihta. Međutim, mora se očekivati da će unošenje bilo kojeg agensa u organizam, koji predstavlja sistem u dinamičkoj ravnoteži, sem željenog efekta izazvati i druge promene. Lekovi takođe mogu da deluju toksično na pojedine organe, najčešće na jetru ili bubrege, što se odražava na rezultate testova koji se koriste za ispitivanje funkcije tih odraga. In vivo efekti lekova mogu da budu: uobičajeni, tj. da se javljaju kod svih osoba koje primaju određenu terapiju, ili retki, ako se javljaju samo kod nekih pacijenata kao posledica idiosinkrazije.
Uobičajeni efekti Ovakvi efekti se često sreću pri terapiji hormonima, koji utiču na metabolizam i dovode do znatne promene u koncentraciji pojedinih proteina plazme. Prilikom upotrebe oralnih kontraceptiva, smanjuje se koncentracija haptoglobina, a1�kiselog glikooroteina i albumina, a povećava sadržaj lipoproteina, transferina, plazminogena, a1�antitripsina i ceruloplazmina. Osim toga dolazi i do naročito velikog porasta specifičnog globulina koji vezuje tiroksin u serumu. Posledica toga je povećanje ukupnog tiroksina i nezasićenog globulina u serumu, dok koncentracija slobodnog tiroksina ostaje nepromenjena. Poznavanje ovog efekta neophodno je pri tumačenju rezultata testova za ispitivanje funkcije tireoideje. Oralna kontraceptivna sredstva utiču i na metabolizam lipida. Stariji preparati su izazivali povećanje koncentracije triglicerida, holesterola i lipoproteina u serumu. Ovi efekti su znatno umanjeni pojavom novijih preparata sa manjim sadržajem hormona. Isto tako, pri primeni novijih kontraceptivnih preparata ne smanjuje se brzina eliminacije glukoze, što se dešavalo prilikom upotrebe starijih preparata. Česti su i drugi primeri sporednih efekata lekova, kao stoje npr. hiperkalcemija koja se javlja u toku terapije tiazidima. Povećanje aktivnosti amilaze u serumu i urinu posle uzimanja morfina ili kodeina može takođe da dovede do pogrešne interpretacije laboratorijskih rezultata. Kod terapije fenitoinom, redovno se dobija povećana aktivnost Y�glutamil transferaze. Mnogi lekovi utiču na promenu mokraćne kiseline u serumu: značajno povećanje izazivaju diuretici, tiazidi, furosemid i acetazolamid. Neki lekovi utiču i na metabolizam glukoze: tako je npr. primećen dijabetogeni efekt hlorpromazina, hlortalidona i hidrohlorotiazida.
Retki efekti Sintetski 19�norsteroidi koji ulaze u sastav nekih oralnih kontraceptivnih preparata, ponekad mogu da izazovu ikterus. Učestalost ovog efekta je 1 od 10 000 pacijenata, a još je reda kod primene novijih preparata. Zapaženo je i povećanje alkalne fosfataze i transaminaza u serumu.
15�4
Medicinska biohemija
Poznato je da više od 200 različitih lekova moće da dovede do porasta aktivnosti serumskih transaminaza. Steroidni anabolici sa alkil�grupom na C�17 položaju mogu da izazovu holestazu sa povećanjem aktivnosti alkalne fosfataze u serumu. Većina psihofarmaka može kod nekih pacijenata da izazove holestazu uz povećanje alkalne fosfataze i bilirubina. Poznati su i drugi lekovi koji mogu da budu hepatotoksični: metildopa, nitrofurantoin, rifampicin, i sulfonamidi. Oštećenje jetre koja se javljaju usled dejstva lekova skoro uvek su reverzibilna i gube se nakon prekida terapije.
Literatura 1. Barth JH, Butler G i Hammond P. Biochemical Investigation in Laboratory Medicine. ACB Ven� ture Publications, London, 20 01. 2. Baynes J i Dominiczak MH. Medical Btochemistry. Mosby, London, 1999. 3. Burtis CA i Ashvvood ER. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, W. B. Saunders Company, Phila� delphia, 1999. 4. Champe PC i Harvey RA. Lippincott's llustrated Revievvs: Biochemistry. Lippincott�Raven, Phi� ladelphia, 1994. 5. Coffee C. Metabolism. Fence Creek Publishing, Madison, Connecticut, 1998. 6. Covelli I, Spandrio L, Zatti M, Lechi C i Nani E. Medicina di laboratorio. Edizioni Sorbona, Milano, 1993. 7. Devlin TM. Textbook of Biochemistry. Wiley�Liss, Nevv York, 1997.
8. Frayn KN. Metabolic Regulation: a Human Perspective, Portland Press, London, 1997. 9. Greiling H i Gressner AM. Lehrbuch der klinischen Chemie und Patobiochemie. Schattauer, Stuttgart, 1995. 10. Henry JB. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. W. B. Saunders, Phila� delphia, 1996. 11. Jacobs DS, Oxley DK i DeMott WR. Laboratory Test Handbook. Lexi�Comp, Ine, Hudson, OH, USA, 2001. 12. Kaplan LA i Pesce AJ. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation. Mosby, St Louis, 1996. 13. Keller H. Klinisch�chemische Labordiagnostik fur Praxis. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1991. 14. LoefflerG i Petrides PE. Biochemie und Pathobiochemie, Springer Verlag, Berlin, 1997. 15. Marshall WJ i Bangert SK. Clinical Biochemistry: Metabolic and Clinical Aspects. Churchill Liv� ingstone, NewYork, 1995. 16. McKee T i McKee JR. Biochemistry: an Introduction. W. C. Brovvn Publishers, Boston, 1996. 17. Porth C. Pathophysiology: Concepts of/Itered Health States. J. B. Lippincott Company, Phila� delphia, 1994. 18. Rifai N, Russell VVamick G i Dominiczak MH. Handbook of Lipoprotein Testing. AACC Publishers, VVashington, 2000. 19. Spasić S, Jelić�lvanović Z, Spasojević�Kalimanovska V. Opšta biohemija. Beograd, 2002. 20. Voet D i Voet JG. Biochemistry. J. Wiley and Sons, Nevv York, 1995.
21. VVallach J. Interpretation of Diagnostic Tests. Lippincott VVilliams and VVilkins, Philadelphia, 2000. 22. Walmsley RN i White GH. A Guide to Diagnostic Clinical Chemistry, Blackvvell Scientific Publications, Melboume, 1988.
CIP � KaTanoni3aqMja y ny6nMKau.Mjti HapoflHa 6n6jiMOTeKa Cp6nje, BeorpaA 577.1
CnACMT>, C/iaBHua Medicinska biohemija / Slavica Spasić, Zorana Jelić�lvanović, Vesna Spasojević�Kalimanovska. � Beograd autori, 2003 (Beograd : Foto Futura). � 1 knj. (razl. pag .): graf. prikazi; 24 cm. Tiraž 400. �Bibliografija. ISBN 86�903797�1�1 1. Jenufi�MBaHOBun, 3opaina 2. CnacojeBMn�KanuMaHOBCKa, BecHa a) MeAUMMHCKa 6noxeMMja COBISS.SR�ID 104674316