Química Bioinorgânica 2012/2013
MEDIÇÃO DO POTENCIAL REDOX DO CITOCROMO C POR ESPECTROFOTOMETRIA DE UV/VISÍVEL Henrique Fernandes e João Rodrigues Data da realização: 18 de março de 2013; Data do relatório 20 de março de 2013
RESUMO Com este trabalho pretende-se medir o potencial de oxidação-redução do citocromo c (cyt c), uma proteína globular de pequenas dimensões e que se encontra presente nas mitocôndrias, desempenhando um papel fundamental no transporte de electrões, força motriz da cadeia respiratória. Esta proteína, constituída por uma cadeia polipeptídica de 104 resíduos de aminoácidos, permite o transporte de electrões através de oxidações e reduções do ião de ferro do seu grupo prostético. O espectro UV/Vis da proteína na sua forma oxidada, cyt c Fe! , é diferente do da forma reduzida, cyt c Fe! , verificando-se nesta última forma uma banda de absorção adicional, a 550 nm. !
!
Através da utilização dos iões i ões hexacianoferrato hexacianofe rrato (II) e hexacianoferrato h exacianoferrato (III) - ( )! !! e !! , respectivamente – determina-se o potencial redox do cyt c, através da ( )! adição de alíquotas de solução ( )! !!/cyt c a uma solução ( )! !!/cyt c.
REAGENTES E INSTRUMENTAÇÃO REAGENTES Hexacianoferrato (II) de potássio (K4[Fe(CN)6]) ≥99% da Carlos ERBA e hexacianoferrato (III) de potássio (K3[Fe(CN)6]) ≥99,0% da Sigma-Aldrich para a preparação de 5,00 cm 3 de duas soluções com igual concentração, 100 mmol dm -3. Citocromo c extraído do coração de cavalo e conservado no congelador em tampão fosfato 50 mmol dm-3 e pH 7. Ditionito de sódio (Na 2O4S2) quimicamente puro da Panreac.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS Como resultados da preparação de três soluções com meios diferentes obtiveramse três espectros de absorvância, de 300,0 a 800,0 nm, correspondente a solução de citocromo em solução com c hexacianoferrato (III); solução aquosa de ditionito de sódio, um agente redutor; e hexacianoferrato (II). Os espectros estão apresentados na Figura 1. 4,000 3,500
Espetros de absorvância de soluções com citocromo c em diferentes meios
3,000 2,500 2,000
A
EQUIPAMENTOS
1,500 1,000
Balança analítica AG204 Mettler Toledo com um alcance de 210g e uma incerteza de 0,1mg. Espectrofotómetro UV/Visível Spectrophotometer 8500 UV-Vis com recolha de dados por computador. Henrique Fernandes e João Rodrigues
0,500 0,000 -0,500 300,0
400,0
500,0 λ/nm
600,0
700,0
800,0
Figura 1 –Espectros de absorvância para a solução de citocromo c e hexacianoferrato (III)
1
Química Bioinorgânica 2012/2013 (tubo 1), curva a vermelho; solução de citocromo c e ditionito de sódio (tubo 2), curva a verde; solução de citocromo c e hexacianoferrato (II) (tubo 3), curva a azul. Os valores obtidos com recurso ao espectrofotómetro encontram-se sumariados em tabela an exo a este documento .
1,000
De seguida (Figura 2) apresenta-se uma ampliação do gráfico apresentado na Figura 1, de modo a evidenciar o comportamento espectrofotométrico em torno do comprimento de onda alvo, 550,0nm.
Espetros de absorvância de soluções com citocromo c em diferentes meios
0,900 0,800 0,700
0,64946
0,600
A
0,573979
0,500 0,400 0,300
0,228378 0,200 0,100 0,000 450,0
470,0
490,0
510,0
530,0
550,0
570,0
590,0
λ/nm Figura 2 – Pormenor do espectro apresentado na Figura 1 para o intervalo de comprimentos de onda de 450,0nm a 600,0nm. De igual forma, a curva a vermelho corresponde à solução de cyt c e hexacianoferrato (III); a curva a verde, a solução de cyt c e ditionito de sódio; e a curva a azul, a solução de cyt c e hexacianoferrato (II). Os valores apresentados no gráfico correspondem às absorvâncias a 550,0nm para cada um dos tubos.
No que diz respeito à solução onde foi adicionado o ditionito de sódio ao cyt c , num ensaio subsequente procedeu-se à adição de pequenas porções de ditionito
de sódio e mediu-se a absorvância da solução, após devida homogeneização, a 550,0nm. Os resultados obtidos encontramse sumariados na Tabela 1.
Tabela 1 – Valores de absorvância da solução do tubo 2 (cyt c e ditionito de sódio) após sucessivas adições de pequenas porções de ditionito de sódio sólido (uma pequena porção corresponde a uma microspátula de ditionito de sódio).
Porções adicionados A 550,0 550,0
0
1
2
3
4
5
6
0,7042
0,9292
0,9584
1,0325
1,2274
0,9723
1,1007
Após a última ú ltima adição de ditionito de sódio, voltou a traçar-se o espectro de Henrique Fernandes e João Rodrigues
absorvância par a anova solução. O espectro em causa está apresentado na
2
Química Bioinorgânica 2012/2013 ditionito de sódio.
Figura 3 onde é comparado com o espectro respectivo com apenas uma adição de
Espetro de absrovância do citocromo c em soluções aquosas de ditionito de sódio 2,500
2,000
1,500
A 1,000
0,500
0,000 300,0
350,0
400,0
450,0
500,0
550,0
600,0
650,0
700,0
750,0
800,0
λ/nm Figura 3 – 3 – Espectros de absorvância das soluções de cyt c em solução aquosa de ditionito de sódio de baixa con centração (curva a verde ); e da me sma solu ção com concentração mais e levada de ditio nito de sódio (curva a laranja).
Por fim, procedeu-se à adição de volumes sucessivos da solução do tubo 1 ( cyt c e hexacianoferrato (III)) ao tubo 3 ( cyt c e hexacianoferrato (II)). As adições foram de 7,5 µL para os primeiros 6 ensaios, sendo
os últimos e 3 de adições de 15 µL. Após a adição da solução do tubo 1 ao tubo 3 era medida a absorvância a 550,0nm para a solução resultante. Os valores obtidos estão sumariados na Tabela 2.
Tabela 2 – 2 – Valores da absorvância da solução do tubo 3 por adição de um certo volume da solução do tubo 1, sendo que as adições eram sucessivas e as medições eram feitas após a adição de um certo volume. Apresenta também os valores para as fracções de cyt c (Fe 2+ ) e (Fe3+ ), concentrações de [Fe(CN) 6 ] 4- e [Fe(CN)6 ] 3- , assim como os logaritmos das razões das fracções de cyt c (Fe2+ ) e (Fe3+ ) e [Fe(CN) 6 ] 4- e [Fe(CN)6 ] 3-.
Vadicionado do tubo 1 (µL) A 550,0 550,0 2+
cytc(Fe ) 3+
cytc(Fe )
log
(Fe!! ) (Fe! ! )
7,5
7,5
7,5
7,5
7,5
7,5
15
15
15
0,4572 0,543 0,457
0,3932 0,391 0,609
0,3572 0,306 0,694
0,3380 0,260 0,740
0,3254 0,231 0,769
0,3214 0,221 0,779
0,3067 0,186 0,814
0,3028 0,177 0,823
0,3029 0,177 0,823
0,076
-0,192
-0,356
-0,453
-0,524
-0,547
-0,641
-0,668 -0,668
-0,667
0,00998
0,00995
0,00993
0,00990
0,00988
0,00985
0,00980
0,00976
0,00971
0,249
0,498
0,744
0,990
1,23
1,48
1,96
2,44
2,91
2,60
2,30
2,12
2,00
1,90
1,82
1,70
1,60
1,52
4-
|[Fe(CN) 6] | -3 (moldm ) 34 |[Fe(CN) 6] |X10 -3 (moldm )
log
[ [
! !
!!
|
!!
|
Henrique Fernandes e João Rodrigues
3
Química Bioinorgânica 2012/2013 A fração de cyt c (Fe2+) foi calculada com base nas absorvâncias medidas para as amostras (A 550,0 550,0) e as absorvâncias a 550,0nm para o tubo 1 e 2 recorrendo à seguinte expressão
!!
=
!!!" ! !!!!" !"#$ !
(1)
,
!!!" !"#$ ! !!!!" !"#$ !
onde a A 550,0 550,0 corresponde aos valores apresentados na Tabela 2 e os valores de A 550 550 tubo 1 e A 550 550 tubo 2 podem ser lidos no espectro de absorvância apresentado na Figura 2. No que diz respeito ao valor da fração de cyt c (Fe 3+) este é calculado por diferença em relação à fração de cyt c (Fe2+), ou seja
!!
=
1
−
(2)
!!
As concentrações de hexacianoferrato hexacianoferra to (II) e hexacianoferrato (III) são calculadas tendo em conta os fatores de diluição a partir da solução inicial de concentração 0,100 mol dm-3. Sendo que ocorre uma primeira diluição na preparação da solução do tubo 1, e sucessivas diluições aquando da adição dos respectivos volumes do tubo tub o 1 para o tubo 3. 3. São aplicados os logaritmos de base 10 para as razões entre as frações de ! e ! , bem como para as concentrações de [Fe(CN)6]4- e [Fe(CN)6]3-. Todos os cálculos foram efectuados recorrendo ao Microsoft Excel ® Mac 2011 e estão disponíveis disponíveis em folha de cálculo anexo. !
!
0,200 0,100 ] )
0,000
log[cyt c (Fe (Fe2+)/cyt c (Fe (Fe3+)] = 0,756 log{[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-} - 1,93 x0=2,55 R² = 0,9874
+ 3
e F ( c t y c / )
+ 2
e F ( c t y c [ g o l
-0,100 -0,200 -0,300 -0,400 -0,500 -0,600 -0,700 -0,800 1,50
1,70
1,90
2,10
2,30
2,50
2,70
log{[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-} Figura 4 – Representação – Representação gráfica de log [cyt c (Fe2+ )/cyt c (Fe3+ )] em função de log{[Fe(CN)6 ] 4 /[Fe(CN) 6 ] 3-}. Os pontos assinalados a verde correspondem a todos os pontos obtidos experimentalmente, contudo apenas os pontos assinalados a vermelho foram considerados para o traçado da regressão linear dado o afastamento do único ponto não considerado para o efeito. Para além da equação da reta e quadrado do coeficiente de correlação também está calculado o valor da intercepção da reta com o eixo das abcissas, valo r calculado ao igu alar log[cyt c (Fe 2+ )/cyt c (Fe3+ )] a zero.
A partir da regressão linear obtida e representada na Figura 4, é possível obter o valor de log{[Fe(CN) 6]4-/[Fe(CN) 6]3-} Henrique Fernandes e João Rodrigues
como é descrito na legenda da Figura 4. Este valor, 2,55, permite calcular o valor do
4
Química Bioinorgânica 2012/2013 potencial da semirreação dos hexacianoferratos através da expressão
=
!
− 2 303 ,
!" !"
log!"
!
|
!" !" !
!|
|
! !" !" ! ! |
(3)
onde E 0 é igual a 430 mV e o valor de !" as condições 59 16 mV para 2 303 !" =
,
,
padrão. Por substituição do valor obtido experimentalmente obtém-se que o potencial da semirreação dos ferratos é 279 mV, sendo este o potencial potencial de redução do cyt c .
CONCLUSÕES Relativamente aos gráficos das figuras 1 e 2 verifica-se que apenas as soluções correspondentes aos tubos 2 e 3 apresentam um pico de absorvância a 550 nm, característico da forma reduzida do cyt, que não é observado no espectro correspondente ao tubo 1, pelo que se conclui que, na presença de hexacianoferrato (III), o citocromo se encontra oxidado, enquanto que, na presença de hexacianoferrato (II), este se encontra reduzido. A presença deste pico de absorção pode ser explicada pela teoria de campo de ligado: dado que o ião de ferro se encontra coordenado por quatro átomos de azoto da porfirina substituída, de campo intermédio, e por um azoto de uma histidina e um enxofre de uma metionina, ambos de campo forte, este apresenta um carácter de spin alto. Enquanto que a forma oxidada apresenta o ião central do grupo prostético sob a forma ! , este possui 5 eletrões nas orbitais d, um em cada uma delas, pelo que não há bandas de absorção permitidas por multiplicidade de spin, daí não apresentar a banda a 550 nm. Para o caso da forma reduzida, o ião apresenta-se sob a forma ! , com 6 eletrões nas orbitais d, 2 nas ! , e 4 nas !! , três com o mesmo spin e um com spin contrário, levando à existência de diferentes microestados com a mesma multiplicidade de spin, o que origina !
!
Henrique Fernandes e João Rodrigues
bandas de absorção, sendo uma delas a banda a 550 nm. Através da equação (3), dos valores exibidos na tabela 2, e da regressão linear de log [cyt c (Fe2+)/cyt c (Fe3+)] em função de log{[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-}, obteve-se um valor do potencial redox do citocromo c de 279 mV,
o que é ligeiramente superior ao intervalo de valores apresentado na literatura (256266 mV). Esta variação pode ser justificada pelo facto de estarmos a assumir que estivemos a trabalhar em condições padrão, e pelo facto de não termos controlado a temperatura das soluções, sendo esta um fator importante na equação de Nernst. Para minimizar esses efeitos, as soluções deviam ter sido termostatizadas e as absorvâncias deviam ter sido medidas num espectrofotómetro que possuísse sistema de controlo de temperatura. No que diz respeito aos espectros representados na Figura 2, verifica-se uma maior absorvância a 550,0nm para a solução com hexacianoferrato (II) do que com hexacionoferrato (III), isto significa que o cyt c absorve mais radiação a 550,0nm quando se encontra na forma reduzida, pois o hexacianoferrato (II) tende e reduzir o cyt c e o hexacioneferrato (III) tende a oxidar o cyt c . Esta evidência é constatada pelo ensaio onde se recorre ao ditionito de sódio, um redutor. Este, quando adicionado ao cyt c reduz o cyt c o que leva a um aumento da absorvância da solução, sobretudo sobretudo a 550,0 nm.
BIBLIOGRAFIA Daveport, H. E. e Hill, R., Proc. R. Soc. London Ser. B 1952, 139, 327-347 Craig, D.B. e Nichols, E. R., J. Chem, Ed. 2006, 83, 1325-1326 Wallace, C. J. A.; Proudfoot, A. E. I. Biochem. J. 1987, 245, 773-779.
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