SKRINING FITOKIMIA
I. TUJUAN PRAKTIKUM
Sebelum melakukan praktikum ini, praktikan wajib memahami berbagai golongan senyawa yang terdapat dalam tumbuhan, terutama yang disebut metabolit sekunder. Setelah melakukan praktikum ini, dengan menggunakan metode tabung dan metode KLT, mahasiswa mampu mengidentifikasi: a. Senyawa golongan flavanoid
d. Senyawa golongan alkaloid
b. Senyawa golongan antrakinon
e. Senyawa golongan fenolik dan
c. Senyawa golongan saponin (steroid
polifenolik
dan triterpenoid)
II. DASAR TEORI
Salah satu cara dalam mencari tumbuhan atau senyawa yang memiliki kandungan aktifitas biologi adalah dengan melakukan skrining fitokomia. Pendekatan skrining fitokimia meliputi analisis kualitatif kandungan kimia dalam tumbuhan atau bagian tumbuhan (akar, batang, daun, bunga, buah, biji) terutama kandungan metabolit sekunder yang bioaktif, yaitu alkaloid, antrakinon, flavonoid, glikosida jantung, kumarin, saponin (steroid dan triterpenoid), tannin (polifenol), minyak atsiri (terpenoid), iridoid dan sebagainya. Adapun tujuan utama dari pendekatan skrining fitokimia adalah untuk meneliti tumbuhan guna mendapatkan gambaran kandungan bioaktif atau kandungan yang berguna untuk pengobatan pengobatan (Farnsworth, 1966). Metode yang digunakan atau dipilih untuk melakukan skrining fitokimia harus memenuhi beberapa persyaratan antara lain : 1. sederhana 2. cepat 3. dapat dilakukan dengan peralatan yang minimal 4. selektif terhadap golongan senyawa yang dipelajari 5. bersifat semikuantitatif, yaitu memiliki batas kepekaan untuk senyawa yang bersangkutan 6. dapat memberikan keterangan tambahan ada atau tidaknya senyawa tertentu dari golongan senyawa yang dipelajari Untuk analisis fitokimia, sebaiknya digunakan jaringan tumbuhan segar yang diberi perlakuan dengan mencelupkan dalam alkohol mendidih beberapa menit setelah dikumpulkan atau dapat juga digunakan tumbuhan yang dikeringkan sebelum analisis. Pengeringan harus dilakukan dalam keadaan dikontrol untuk mencegah terjadinya perubahan kimia yang terlalu banyak.
1.Flavonoid
Flavonoid merupakan senyawa yang memiliki 15 asam karbon dalam inti dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C 6C3C6, yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan 3 karbon yang dapat atau tidak membentuk cincin. Ketiga cincin tersebut diberi tanda A, B, C, atom karbon dinamai menurut sistem penamaan yang menggunakan angka biasa untuk cincin A dan C, serta angka beraksen untuk cincin B. Kerangka dasar tersebut adalah
sebagai berikut: Senyawa yang hanya larut sedikit dalam air juga masih dapat diekstraksi dengan menggunakan metanol, etanol, atau aseton (Robinson, 1991). Senyawa flavonoid tersebar luas dalam dunia tanaman dan dapat ditemukan dalam bagian-bagian tertentu dari tanaman, lazimnya ditemukan sebagai campuran dari beberapa turunannya dan jarang ditemukan sebagai sen yawa tunggal (Markham, 1988). Penggolongan flavonoid didasarkan pada substituen cincin heterosiklik yang mengandung oksigen dan perbedaan distribusi gugus hidroksil, perbedaan di bagian rantai C 3 akan menentukan senyawa flavonoid yaitu flavon, flavonol, flavanon, flavanolol, isoflavon, auron, dan kalkon. Identifikasi adanya flavon dan flavonol dapat digunakan uap amoniak. Flavon dan flavonol akan menunjukkan warna kuning, sedangkan kalkon dan auron berubah warna dari kuning menjadi merah (Robinson, 1991). Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan kuat pada dasar spektrum UV, dan spektrum tampak. Flavonoid pada tanaman umumnya terikat gula sebagai glikosida dengan aglikon flavonoid yang bervariasi. Fenol menyerap sinar UV gelombang pendek sehingga bila dideteksi pada plat silika gel GF 254 terlihat sebagai bercak gelap dengan latar belakang fluoresensi (Harborne, 1987).
2.Saponin
Saponin mempunyai rasa pahit menusuk, biasanya menyebabkan bersin atau iritasi terhadap selaput lendir, bersifat toksik terhadap binatang berdarah dingin seperti ikan, bersifat hemolitik dan dapat membentuk larutan koloidal. Dalam air membentuk busa yang mantap pada penggojokan, sering digunakan sebagai deterjen, selain itu meningkatkan adsorpsi dieretikum, serta merangsang kerja ginjal. (Claus dkk, 1970; Harborne, 1987). Saponin adalah glikosida triterpen dan sterol sebagai glikosida, saponin bisa dihidrolisis oleh asam menghasilkan aglikon atau sapogenin dan macam-macam gula serta
asam uronat yang berkaitan. Berdasarkan struktur aglikon atau sapogenin, saponin dibedakan menjadi saponin tipe steroid dan terpenoid. Keduanya mempunyai hubungan glikosidal pada
C3. (Treane dan Evans, 1976). Kerangka dasar tersebut adalah sebagai berikut: 3.Tanin
Di dalam tumbuhan letak tannin terpisah dari protein dan enzim sitoplasma, tetapi bila jaringan rusak, maka reaksi penyamakan dapat terjadi (misal bila hewan memakan tanaman tersebut). Reaksi ini menyebabkan protein lebih sukar dicapai oleh cairan pencernaan hewan. Tumbuhan dengan jumlah tanin yang cukup banyak cenderung dihindari oleh hewan herbivora karena rasanya sepat. Tannin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae, terdapat khusus dalam jaringan kayu. Tannin dapat bereaksi dengan protein membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air. Dalam industri, tannin adalah senyawa yang mampu mengubah kulit hewan yang mentah menjadi kulit siap pakai karena kemampuannya menyambung silang protein. Secara kimia terdapat dua jenis tannin yang tersebar tidak merata dalam dunia tumbuhan. Tannin terkondensasi hamoir terdapat semesta di dalam paku-pakuan dan gimnospermae, serta tersebar luas dalam angiospermae, terutama pada jenis tumbuhabn berkayu. Nama lain untuk tannin terkondensaasi adalah proantosianidin karena bila direaksikan daengan asam panas, beberapa ikatan karbon-karbon penghubung satuan terputus dan dibebaskanlah monomer antosinidin. Kebanyakan proantosianidin adalah prosianidin, ini berarti bila direaksikan dengan asam akan mengjasilkan sianidin. Tannin terhidrolis terutama terdiri atas dua kelas yang paling sedergana yaitu galoilglukosa. Pada senyawa ini, inti yang berua glukosa dikelilingi oleh lima gugus ester galoil atau lebih. Pada jenis kedua, inti molekul berupa sen yawa dimer asam galat, yaitu asam heksa hidroksisidifenat, disinipun berikatan dengan glukosa. Bila dihidrolisis elagitanin inti menghasilkan asam elagat. Senyawa dalam kedua golongan ini dapt dipilih lebih lanjut berdasarkan asal usul biogenesisnya.Tannin yang terhidrolisis penyebarannya terbatas pada tumbuhan berkeping dua. Struktur polimer tanin adalah sebagai berikut:
4.Alkaloid
Alkaloid adalah senyawa nitrogen yang biasanya tedapat dalam tumbuh-tumbuhan. Alkaloid merupakan metabolit sekunder yang banyak terdapat dalam tanaman angiospermae. Pada umumnya alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen. Atom nitrogen dalam alkaloid terdapat sebagai amina primer, amina sekunder, amina tersier dan amina kuarterner.Pada umumnya alkaloid terdapat dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik dan bersifat fisiologis aktif pada manusia dan hewan (Harborne, 1987; Treane dan Evans, 1976). Berdasarkan struktur kimianya alkaloid dapat digolongkan sebagai: o
Golongan piridina, misalnya arekolina, dan nikotina
o
Golongan tropan, misalny hiosiamin, dan skopolamin
o
Golongan kinolin, mialnya kinin, dan kinidin
o
Golongan iso-kinolin, misalnya hidrastin, morfin, dan kodein
o
Golongan indol, misalnya ergotamin dan reserpin
o
Golongan amina, misalnya efedrin daan kolkisin
o
Golongan steroid, misalnya akonitin
o
Golongan purin, misalnya kofein dn teobromin
Identifikasi alkaloid dapat dilakukan dengan reaksi pengendapan dan reaksi warna. Sebelum dilakukan reaksi tersebut, diadakan isolasi, antara lain dengan cara: a. Penyekatan dengan pelarut organik
b. Penyekatan air-asam c. Mikrosublimasi d. Mikrodestilasi dengan alat tanur TAS, dilanjutkan dengan kromatografi Alkaloid seringkali bersifat racun pada manusia tapi sebagian besar memiliki aktifitas fisiologis. Kebanyakan alkaloid diendapkan dari larutan netral atau sedikit asam oleh pereaksi Mayer (kalium iodida dan merkuri klorida), Wagner (larutan iod dalam KI), larutan asam tanat, Hager (larutan jenuh asam pikrat) atau oleh pereaksi Dragendorf (larutan iodium bismut iodida). Endapan dapat berbentuk amorf, maupun kristalin dengan warna yang bervariasi yaitu krem (Mayer), coklat kemerahan (Wagner dan Dragendorf), kecuali alkaloid golongan yang tidak diendapkan, reaksi [engendapan dapat diganggu oleh adanya protein (Claus dkk, 1970). Dalam tanaman alkloid mempunyai beberapa fungsi antara lain sebagai pertahanan terhadapn insektisida dan herbivora, merupakan hasil akhir dari proses detoksifikasi, mengatur pertumbuhan dan merupakan elemen penting dalam tanaman untuk mengatur suplai nitrogen (Claus dkk, 1970).
5.Kumarin
Kumarin adalah lakton asam o-hidroksisinamat. Inti dasar dengan penomoran cincinnya. Hampir semua kumarin alam mempunyai oksigen (hidroksil atau alkoksil) pada C7. Posisi lain dapat pula teroksigenasi, dan sering pula terdapat rantai samping alkil. Rantai samping isoprenoid merupakan hal biasa. Kumarin sering dijumpai sebagai glikosida. Kumarin mungkin juga berupa senyawa jadian yang terbentuk karena hidrolisis asam glikosil-o- hidroksisinamat secara enzimatik dan kemudian segara terjadi siklisasi menjadi lakton. Cincin lakton kumarin dapat terbuka karena hidrolisis dengan basa hangat, tetapi segera terbentuk kembali jika diasamkan. Peleburan dengan basa memutuskan gugus alkil sehingga terbentuk fenol sederhana. Kumarin dialam tersebar luas didunia tumbuhan tetapi terutama terdapat dalam rumput-rumputan (Graminae), anggrek (Orchidaceae), buah jeruk (rutaceae), dan polong-polongan (leguminosae). Kumarin yang terdapat dalam tumbuhan tingkat tinggi adalah skopoletin.
6.Bufadienol Merupakan satu jenis glikosida jantung yang ditemukan pada skresi beracun kodok
genus bufo, sehingga senyawa seperti ini dinamakan Bufodienolida.
7.Kardenolin
Sering juga disebut kardenolida atau strukturnya merupai struktur saponin steroid dan mempunyai kelarutan dan pembentukan busa yang sama. Kardenolida dapat dibedakan dari
glikosida steroid lain oleh cincin lakton tak jenuh yang terikat pada C-17. Senyawa glikosida jantung sering terdapat pada, Apocynaceae, Liliaceae, Moraceae, dan Ranunculaceae. Keluarga ini tidak berkaitan satu sama lain.
8.Antrakuinon
Golongan kuinon di alam terbesar terdiri atas antrakuiNon. Beberapa antrakuinon merupakan zat warna penting dan lainnya sebagai pencahar. Keluarga tumbuhan yang kaya akan senyawa jenis ini adalah Rubiaceae, Rhamnaceae, Polygonaceae. Kebanyakan antrakuinon dari tumbuhan tingkat tinggi dihidroksilasi pada C-1, meskipun antrakuinon sendiri diketahui terdapat dalam berbagai ekstrak tannin tumbuhan, dan 2-metilantrakuinon diketahui merupakan kandungan pada kayu jati. Antrakuion berupa senyawa Kristal bertitik leleh tinggi, larut dalam pelarut organic biasa, senyawa ini biasanya berwarna merah, tetapi yang lainnya berwarna kuning sampai coklat. Mereka larut dalam larutan basa dengan membentuk warna violet merah.
Analisis kualitatif untuk mengetahui golongan senyawa yang bioaktif dapat dilakukan dengan uji tabung atau uji kualitatif secara KLT. Kedua metode ini dapat digabungkan dan dapat dilakukan untuk melakukan survei tumbuhan di lapangan. Kromatografi adalah suatu metode pemisahan secara analitik dan preparatif yang mana senyawa-senyawa yang dipisahkan berdasarkan perbedaan migrasi senyawa-senyawa tersebut dalam sistem 2 fase yaitu fase gerak dan fase diam. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu metode kromatografi cair yang dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sangat berbeda seperti senyawa organik sintesis, kompleks anorganik maupun ion anorganik. KLT dapat digunakan sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif maupun preparatif. KLT melibatkan 2 sifat yaitu sifat lapisan atau fase diam dan sifat fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair pada kromatografi cair-cair (Gritter et al, 1991). Kromatografi Lapis Tipis adalah suatu metode pemisahan fisikokimia. Lapisan yang memisahkan terdiri dari bahan berbutir-butir (fase diam) yang ditempatkan pada penyangga berupa pelat logam, gelas atau lapisan lain yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah pelat diletakkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya, senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (Stahl, 1985). Kondisi baku dalam pemeriksaan KLT adalah sebagai berikut: a. Fase Diam
Penjerap untuk KLT adalah silika gel, alumina, kiselgur, dan selulosa. Silika gel merupakan penjerap yang paling banyak digunakan. Pada umumnya ditambahkan dengan bahan pengikat untuk memberikan kekuatan perlekatan pada pendukungnya. Bahan pengikat yang sering digunakan adalah kalsium sulfat hidrat yang ditambahkan ke dalam penjerap sampai 10-15%. Silika gel yang diberi tambahan senyawa ini dikenal dengan silika gel G. Kadang untuk memudahkan identifikasi ditambah lagi dengan zat berfluorosensi yang dikenal sebagai silika gel GF. Indikator fluorosensi adalah senyawa yang memancarkan sinar tampak apabila disinari dengan si nar dengan panjang gelombang lain, biasanya sinar uv. Jadi lapisan yang mengandung indikator fluorosensi akan bersinar jika disinari dengan panjang gelombang yang tepat. Jika senyawa pada bercak yang akan ditampakkan mengandung ikatan rangkap terkonjugasi atau cincin aromatik. Sinar uv yang mengeksitasi tidak dapat mencapai indikator fluorosensi dan tidak ada cahaya yang dipancarkan. Hasilnya adalah bercak gelap dengan latar belakang bersinar. Cara ini sangat peka dan tidak merusak senyawa yang diteliti (Gritter et al, 1991). b. Fase Gerak Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri dari satu atau beberapa pelarut. Fase gerak ini bergerak di dalam fase diam yaitu suatu lapisan berpori karena adanya gaya kapiler. Yang digunakan hanyalah pelarut bertingkat analitik dan bila diperlukan, sistem pelarut multikomponen ini harus berupa campuran sesederhana mungkin yang maksimum terdiri atas tiga komponen (Stahl, 1985). c. Bejana Pemisah, Penjenuhan, Aras Pengisian Bejana harus dapat menampung pelat yang akan dimasukkan dan harus dapat tertutup rapat. Aras pengisian fase gerak sesuai dengan kedalaman lapisan terendam. Tingkat kejenuhan bejana dengan uap pelarut pengembang menpunyai pengaruh yang nyata pada pemisahan dan letak bercak pada kromatogram. Jika pelarut pengembang naik di dalam lapisan, sebagian menguap di daerah garis depan pelarut pengembang itu. Jadi untuk jarak pengembang sama, laju aliran pelarut pengembang lebih cepat di dalam bejana tanpa dijenuhkan dulu, demikian pula letak bercak lebih tinggi dibanding bercak yang terbentuk pada bejana yang dijenuhkan sempurna dengan uap pelarut pengembang (Stahl, 1985). d. Awal dan Jumlah Pencuplikan Bercak ditotolkan pada jarak tertentu dari tepi bawah lapisan. Jarak suatu bercak awal ke bercak awal lainnya dan jarak antara bercak paling pinggir dengan tepi samping sekurang-kurangnya 1 cm dan lapisan tidak boleh rusak selama penotolan cuplikan. Biasanya ditotolkan 1-10 µL larutan cuplikan 0,1-1%. Larutan yang ketasiriannya rendah atau jumlahnya besar, ditotolkan sebagian-sebagian, dalam hal
ini pelarut dibiarkan menguap dahulu sebelum penotolan berikutnya dilakukan (Stahl, 1985). e. Pengembangan Pengembangan ialah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Ada beberapa macam pengembangan yaitu pengembangan sederhana, pengembangan ganda, dan pengembangan landaian. Pengembangan sederhana yaitu perambatan satu kali sepanjang 10 cm ke atas. Pengembangan ganda yaitu 2 kali merambat 10 cm ke atas berturut-turut sedangkan pengembangan landaian merupakan 2 pengembangan dengan jarak yang berbeda (Stahl, 1985). f. Larutan Pembanding Di samping larutan cuplikan, selalu ada campuran pembanding yang di kromatografi pada waktu bersamaan. Campuran ini terdiri atas 1-5 senyawa yang diketahui, dengan konsentrasi yang telah diketahui pula. Bila mungkin, senyawa pembanding ini sama dengan senyawa yang terdapat di dalam larutan cuplikan. Tetapi boleh juga senyawa lain yang berbeda, yang mempunyai sifat rambat serupa dengan senyawa cuplikan (Stahl, 1985). g. Larutan Cuplikan Membuat larutan cuplikan secepat-cepatnya dan sesederhana mungkin adalah penting. Waktu yang dipakai jangan sampai melebihi waktu kromatografi. Angka banding kuantitatif komponen obat yang diteliti di dalam sediaan obat dan di dalam larutan cuplikan harus sama (Stahl, 1985). h. Deteksi Senyawa yang Dipisah Terdapat berbagai kemungkinan untuk deteksi senyawa berwarna pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan penyerapan di daerah uv gelombang pendek (radiasi utama pada 254 nm) atau jika senyawa itu dapat dieksitasi ke fluorosensi radiasi uv gelombang pendek atau gelombang panjang (366 nm). Jika dengan kedua cara tersebut senyawa tidak dapat dideteksi, harus dicoba dengan reaksi kimia (Stahl, 1985). Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dengan angka Rf atau hRf. Rf =
Jarak titik pusat bercak dari titik awal penotolan
Jarak garis akhir pengembangan dari titik awal penotolan Angka Rf berjangka antara 0,00 sampai 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 sampai 100. Jika dipilih 10 cm sebagai jarak pengembangan maka jarak rambat suatu senyawa (titik awal penotolan pusat bercak dalam cm) x 10 menghasilkan angka hRf. Akan tetapi, karena Rf merupakan fungsi sejumlah faktor, angka ini harus dianggap sebagai petunjuk. Inilah yang
menjadi alasan mengapa angka hRf-lah yang dicantumkan untuk menunjukkan letak suatu senyawa pada kromatogram (Stahl, 1985).
III. ALAT DAN BAHAN Alat
1. Gelas ukur
8. Gelas arloji
14. Corong pisah
2. Penangas air
9. Indicator pH universal
15. Silika GF 254
3. Kapas
10. Cawan Petri
16. Pipet tetes
4. Tabung reaksi
11. Corong
17. Plastik+karet
5. Labu Erlenmeyer
12. Sinar UV 254, 366
18. Pipa kapiler
6. Flakon 7. Kertas saring
nm
19. Bejana elusi
13. Gelas pengaduk
20. Aluminium foil
Bahan
1. Serbuk simplisia Buah Mahkota Dewa (SK14)
13. Pereaksi Carr-price (larutan jenuh SbCl3 dalam kloroform p)
2. NH3 encer, NH3 25%
14. Pereaksi Molisch
3. Petroleum-eter
15. Lugol LP
4. Kloroforn
16. HCl 2%, HCl 10%
5. Eter P
17. Metanol
6. NaOH 10%
18. Dragendroff LP
7. KOH 0,5 N
19. FeCl 3
8. Etanoat 70%
20. Mayer Lp
9. Aquadest
21. K 4(CN)6
10. NaCl padat
22. Anhidrida asam asetat
11. Pereaksi Liberman-Burchard
23. H2SO4 pekat
12. Na2SO4 anhidrat
24. Natrium sulfat anhidrat
Fase gerak untuk KLT :
Toluena-etilasetat-dietilamina (7:2:1)
Etilasetat-metanol-air (100:13,5:10)
Etil asetat-asam format-asam asetat glacial-air (100:11:11:27)
Kloroform-metanol-air (64:50:10)
Pembanding untuk KLT :
Deteksi :
Kinina
Dragendroff-Natrium Nitrit
saponin
FeCl3
Asam galat
Anisaldehid-asam sulfat
Rutin
IV.
CARA KERJA Uji Tabung
A. Sari Dalam Petroleum Eter 20 gram serbuk simplisia disari dengan petroleum eter (sampai serbuk terendam)
dikocok berkali-kali hingga larutan penyari jernih
sari petroleum eter dipekatkan hingga kira-kira sampai 10 mL
disisihkan sebanyak 1 mL untuk uji KLT
1. Steroid dan Triterpenoid
8 mL sari petroleum eter diuapkan sampai kering
ditambahkan 5 mL KOH 0,5 N dalam ethanol
direfluks dalam penangas air, dipanaskan
2. Karotenoid
5 mL sari eter pada uji steroid dan terpenoid diuapkan sampai kering
ditambah 2 – 3 tetes larutan jenuh SbCl 3 dalam kloroform P
warna mula-mula biru kemudian
dalam suhu 80 C diatas penangas air
menjadi merah
didinginkan
ada karotenoid
disari dengan eter di corong pisah berkali-kali setiap kali dengan 10 mL eter
5 mL sari eter diuapkan sampai kering
sisa dilarutkan dalam 0.5 mL anhidrida asam aseta t P
ditambah 0.5 mL kloroform P, larutan dituang ke tabung reaksi
ditambah asam sulfat pekat terbentuk cincin coklat kemerahan ata u ungu
ada steroid atau triterpenoid
B. Sari Dalam Eter serbuk sisa penyarian dengan PE disari kembali dengan eter P, dikocok berkali-kali
diuapkan sampai tidak meninggalkan sisa
sari dalam eter dipekatkan sampai 30 mL
disisihkan sebanyak 5 mL untuk KLT
a. Senyawa alkaloid
10 mL sari dalam eter diuapkan
sisa dilarutkan dalam 1.5 HCL 2%
dibagi menjadi 3 tabung reaksi
tabung 1 sebagai pembanding
tabung 2 direaksikan dengan 3-4 tetes pereaksi dragendorff
tabung 3 direaksikan dengan pereaksi mayer
adanya endapan pada tabung 2 dan 3 menunjukkan adanya kandungan alkaloid
b. Senyawa Fenolik
1 mL sari dalam eter diuapkan
ditetesi larutan FeCl3
warna hijau, ungu, biru, sampai hitam menunjukkan adanya senyawa fenolik terutama fenolik bebas
c. Senyawa Fenol-fenol
1 mL sari dalam eter diuapkan
ditetesi dengan campuran kalium heksasianoferat (III) dan larutan FeCl3
warna biru sampai hitam menunjukkan adanya fenol-fenol
d. Senyawa Fenil Propanoid
3 mL sari dalam eter diuapkan
sisa dilarutkan dalam air panas
didinginkan
larutan dibagi dalam dua tabung reaksi
tabung 1 untuk pembanding
tabung 2 diberi amonia encer hingga alkalis
bila terjadi fluorosensi biru atau hijau dibawah sinar UV menunjukkan adanya kumarin atau derivatnya
e. Senyawa Antarkuinon
3 mL sari dalam eter dituang dalam tabung reaksi
ditambah 1 mL amonia 25% atau NaOH 10%
larutan berubah menjadi berwarna merah menunjukkan adanya antrakuinon
C. Sari Dalam Etanol-Air serbuk sisa penyarian dengan eter disari dengan etanol 70% hingga pelarut hampir jernih
sari dipekatkan hingga 40 mL
disisihkan 5 mL, dipekatkan, digunakan sebagai larutan percobaan KLT
a. Garam Alkaloid
10 mL sari dalam etanol-air diuapkan
sisa ditambah HCL 10% sambil dipanaskan dan diaduk
larutan dibagi menjadi dua
larutan tabung 1 ditambah amonia encer
larutan pada tabung 2 ditambah sedikit
NaCl hingga pH 8-9
padat, diaduk
disari dengan kloroform
disaring
diuapkan sampai kering
kertas saring dicuci dengan HCL 10 %
sisa dilarutkan dalam HCL 2%
disisihkan 0.5 mL untuk KLT
disisihkan 0.5 mL untuk KLT alkaloid
sisa larutan diuji dengan
mayer/dragendorff
sisa larutan dibagi 3 bagian
tabung A sebagai pembanding
adanya kekeruhan
menunjukkan adanya basa kuartener atau amina teroksidasi
tabung B direaksikan dengan mayer
tabung C direaksikan dengan dragendorff
adanya alkaloid ditunjukkan dengan timbulnya endapan pada tabung B dan C
b. Antosian
Jika sari dalam etanol air bereaksi asam maka warna larutan merah
jika pH netral berwarna ungu
suasana alkalis membuat warna larutan menjadi biru
perubahan itu menunjukkan adanya antosian
c. Glikosida
20 mL sari dalam etanol air ditambah 15 mL HCL 10% LP
direfluks selama 30 menit
didinginkan, larutan disari 3 x masing masing dengan 8 mL eter P dalam corong pisah
lapisan eter dipisahkan ditambah dengan NaSO4 anhidrat
disisihkan sebagian untuk KLT
sisa sari eter digunakan untuk uji aglikon steroid , triterpenoid , kumarin (seperti pada sari eter)
fase air asam dinetralkan
digunakan untuk uji gula dengan reaksi molisch
d. Saponin
2 mL sari etanol air diuapkan hingga separuhnya
sisa diencerkan dengan air sama banyak, dikocok selama 15 menit
terbentuk buih stabil menunjukkan adanya saponin
dapat pula ditunjukkan dengan reaksi Lieberman-burchard yang didasarkan atas reaksi terhadap aglikon triterpenoid atau steroid penyusunnya
pada batas dua larutan terbentuk cincin coklat kemerahan atau ungu sedangkan larutan bagian atas menjadi berwarna hijau atau ungu
e. Tanin
1 mL sari etanol air diencerkan dengan 2 mL air
ditambah FeCl3 P
warna biru, hijau, kehitaman menunjukkan adanya tanin
f.
Karbohidrat
2 mL sari etanol air diuapkan hingga hampir kering
diberi pereaksi molisch
ditambahkan 2-3 tetes asam sulfat pekat melalui dinding
warna merah ungu menunjukkan adanya karbohidrat
1 mL sari dienap tuangkan
ditambah lugol LP
warna biru menunjukkan pati
Uji Kualitatif Secara KLT
A. Penyediaan larutan percobaan 1. Alkaloid a. diuapkan 2 mL sari eter
dibasahi dengan sedikit HCL dan
metanol b. diambil sedikit larutan untuk identifikasi garam alkaloid dan garam alkaloid basa kuaterner pada sari etanol air 2. Antrakuinon, glikosida, flavonoid dan kumarin
Gunakan sari eter yang telah dipekatkan 3. Saponin dan Tanin Gunakan sari etanol air yang telah dipekatkan 4. Minyak Atsiri Gunakan sari petroleum eter yang telah dipekatkan 5. Glikosida Jantung Gunakan sari eter hasil hidrolisis sari etanol air yang digunakan untuk uji glikosida pekatkan larutan B. Lempeng KLT Lempeng yang digunakan adalah Silika Gel F254 C. Fase gerak Gunakan fase gerak yang sesuai D. Pereaksi penampak atau cara deteksi Gunakan pereaksi penampak bercak yang sesuai Tanin dan senyawa fenolik lain Fase Diam Silika Gel F254 Fase Gerak Etil asetat : Metanol : Air ( 100 : 13,5 : 10 ) Sampel
Deteksi FeCl3 Pembanding Dibawah sinar tampak senyawa fenolik akan Keterangan berwarna hijau hingga biru kehitaman Alkaloid Fase Diam
Fase Gerak Sampel Deteksi Pembanding Keterangan
Silika Gel F254 Toluene : Etilasetat : dietilamina ( 7 : 2 : 1) Dragendorff dilanjutkan natrium nitrit Bercak berwarna jingga sampai merah tua Dibawah sinar tampak
Glikosida Jantung
Fase Diam Fase Gerak Sampel Deteksi Pembanding Keterangan Kumarin Fase Diam Fase Gerak
Silika Gel F254 Etilasetat : metanol : air ( 100 : 13,5 : 10) SbCl3 Dibawah sinar tampak
Silika Gel F254 Dietileter : Toluen (1 : 1) dijenuhkan dengan asam asetat
10% Sampel Deteksi Pembanding Keterangan
KOH 5% etanolik biru muda atau sawo matang
Saponin Fase Diam Fase Gerak Sampel
Silika Gel F254 Kloroform : Metanol : Air ( 64 : 50 : 10) Anisaldehida asam sulfat, dipanaskan 100oC
Deteksi Pembanding
bercak berwarna biru dibawah sinar tampak
Keterangan
Antrakinon Fase Diam Fase Gerak Sampel Deteksi
Silika Gel F254 Etilasetat : metanol : air KOH 5% etanolik
Pembanding Bercak dibawah sinar tampak berwarna merah menunjukkan adanya antrakinon
Keterangan
Flavonoid Fase Diam
Silika Gel F254 Etilasetat : asam format : as.asetatglasial : air
Fase Gerak Sampel Deteksi Pembanding
AlCl3 Di bawah UV 365 berpendar kuning intensif hijau atau jingga
Keterangan
V. HASIL PERCOBAAN 1. Uji Tabung No.
Uji
1.
Sari Dalam Petroleum Eter a.
Keterangan
Uji Steroid dan
Reaksi Lieberman-Burchard:
Triterpenoid
Positif bila terbentuk cincin
Hasil pengamatan
Negatif
merah coklat, larutan bagian atas berwarna hijau atau ungu
b. Uji Karotenoid
Reaksi Carr Price: Positif bila warna mula-mula biru kemudian
Negatif
menjadi merah 2.
Sari Dalam Eter a.
Uji Alkaloid
Positif bila ada endapan setelah ditambahkan Mayer LP atau Dragendorff LP
Mayer LP = Negatif Dragendorff LP = Positif
b. Senyawa Fenolik -
Fenol bebas
Positif bila muncul warna hijau,
Positif (warna hitam)
ungu,biru sampai hitam -
Fenol-fenol
Positif bila muncul warna biru sampai hitam
-
Fenil Propanoid
Positif bila ada fluorosensi biru
Positif (warna biru kehitaman) Negatif
atau hijau di bawah UV -
Antrakuinon
Positif bila larutan berubah
Negatif
warna menjadi merah
3.
Sari Dalam Etanol-Air a.
Garam Alkaloid
-
Garam Alkaloid
Positif bila timbul endapan pada
Mayer LP = Negatif
larutan percobaan setelah
Dragendorff LP =
ditambah Mayer LP atau
Positif
Dragendorff LP
-
Basa kuartener atau
Positif bila timbul kekeruhan
Mayer LP = Negatif
amina teroksidasi
pada larutan percobaan setelah
Dragendorff LP =
ditambah Mayer LP atau
Negatif
Dragendorff LP
b. Antosian
Sari etanol air dalam suasana asam = merah Sari etanol air dalam suasana netral = ungu Sari etanol air dalam suasana basa = biru atau hijau
c.
Glikosida
-
Steroid dan
Positif bila terbentuk cincin
Triterpenoid
merah-coklat, tidak ada warna
Asam = Negatif (warna tetap) Netral = Negatif (warna tetap) Basa = Negatif (warna tetap)
Negatif
biru/hijau
-
Kumarin
Positif bila warna mula-mula biru kemudian menjadi merah
Negatif
-
Gula
Positif bila sari asam + Molisch
Negatif
terbentuk cincin warna merah ungu pada perbatasan kedua cairan d. Saponin
Positif bila terbentuk buih yang
Negatif (tidak
stabil
terbentuk buih)
Rekasi Lieberman Burchard =
Liebermann
positif bila pada batas dua
Burchard= Negatif
larutan terbentuk cincin coklat
(terbentuk cincin
kemerahan atau ungu dan
coklat kemerahan,
larutan bagian atas menjadi
larutan bagian atas
hijau atau ungu
tidak berwarna hijau atau ungu)
e.
Tanin
Positif bila muncul warna biru,
Positif (warna biru
hijau kehitaman
f.
Karbohidrat
kehitaman)
Uji Molisch = positif bila
Negatif
terbentuk warna merah ungu Uji Lugol = positif bila
Negatif
terbentuk warna biru
2. Uji Kromatografi Lapis Tipis Alkaloid dan Garam Alkaloid Fase diam : silica gel GF254 Fase gerak : toluena : etil asetat : dietilamin (7 : 2 : 1) Sampel : SK14 Jumlah sampel :1 Jarak pengembangan : 8cm Deteksi : Dragendorf dan NaNO2
No.
Senyawa
Rf
1.
Sari dalam eter
0,38
2.
Sari etanol-air
0
3.
Quinin (pembandi ng)
0,38
Sebelum Disemprot UV 254 Tampak UV 366 Pemada man ungu muda
Setelah Disemprot UV 366 Tampak UV 254 Pemada man ungu
-
-
-
-
-
-
Pemada man ungu
-
-
-
Coklat
Pemada man ungu
Sebelum disemprot: UV 254
1
2
UV 366
3
1
2
Tampak
3
Setelah disemprot: UV 254
Rf 1
3cm
8cm
UV 366
Rf 3
0,38
Flavonoid Fase diam Fase gerak Sampel Jumlah sampel Jarak pengembangan Deteksi
No.
Senyawa
Tampak
3cm
8cm
0,38
: silika gel GF254 : etil asetat:asam format:asam asetat glasial:air (100:11:11:27) : SK14 :1 : 8 cm : Di bawah UV 366 berpendar kuning intensif, hijau atau jingga Rf
1.
Sari eter
0,65
2.
Rutin (pembandi ng)
0,45
Sebelum Disemprot UV 254 Tampak UV 366 Pemada Kuning man ungu muda Pemada man ungu
Kuning
-
Setelah Disemprot UV 366 Tampak UV 254 Kuning Pemada man ungu
Coklat
Kuning
Pemada man ungu
Sebelum disemprot: UV 254
UV 366
Tampak
Setelah disemprot: UV 254
1
Rf 1
UV 366
2
1
5,2cm
8cm
0,65
Tampak
2
Rf 2
1
3,6cm
8cm
2
0,45
Tanin dan Senyawa Fenolik Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak : etil asetat : methanol : air (100 : 13,5 : 10) Sampel : SK14 Jumlah sampel :1 Jarak pengembangan : 8cm Deteksi : FeCl3
No.
Senyawa
Rf
1.
Sari dalam eter
0,64
Sebelum Disemprot UV 254 Tampak UV 366 Pemada man ungu
0,64
Pemada man ungu
2.
Asam Gallat (pembandi ng)
-
-
Setelah Disemprot UV 366 Tampak UV 254 Biru Pemada Hitam man ungu
Biru hitam
Pemada man ungu
Sebelum disemprot: UV 254
UV 366
Tampak
Setelah disemprot: UV 254
1
Rf 1
UV 366
2 5,1cm
8cm
1
2
Rf 2
0,64
Tanin Fase diam Fase gerak Sampel Jumlah sampel Jarak pengembangan Deteksi
Senyawa
Rf
1.
Sari etanol-air
0,58
2.
1
5,1cm
8cm
2
0,64
: silica gel GF254 : etil asetat : methanol : asam galat (100 : 13,5 : 10) : SK14 :1 : 8cm : FeCl3
No.
Asam Gallat (pembandi ng)
Tampak
0,65
Sebelum Disemprot UV 254 Tampak UV 366 Pemada man ungu
Pemada man ungu
-
-
Setelah Disemprot UV 366 Tampak UV 254 Biru Pemada Hitam man ungu
Biru hitam
Pemada man ungu
Sebelum disemprot: UV 254
UV 366
Tampak
Setelah disemprot: UV 254
1
Rf 1
UV 366
2
1
4,6cm
8cm
2
Rf 2
0,58
Saponin Fase diam Fase gerak Sampel Jumlah sampel Jarak pengembangan Deteksi
Senyawa
Rf
1.
Sari etanol-air
0,81
2.
1
5,2cm
8cm
2
0,65
: silica gel GF254 : kloroform : methanol : air (64 : 50 : 10) : SK14 :1 : 8 cm : Anisaldehid-asam sulfat dipanaskan 100
No.
Saponin (pembandi ng)
Tampak
0,81
Sebelum Disemprot UV 254 Tampak UV 366 Pemada Kuning man coklat ungu
Pemada man ungu
Kuning coklat
-
Setelah Disemprot UV 366 Tampak UV 254 Kuning Pemada coklat man ungu
-
Kuning coklat
Pemada man ungu
Sebelum disemprot: UV 254
1
UV 366
2
Tampak
1
2
1
2
Setelah disemprot: UV 254
1
Rf 1
UV 366
2
1
6,5cm
8cm
Tampak
0,81
2
Rf 2
1
6,5cm
8cm
0,81
2