Manual de Practicas de Genetica Humana

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS BIOMÉDIC AS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS QUÍMICO-BIOLÓGIC AS PROGRAMA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS GENÉTICA HUMANA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE GENETICA HUMANA COMPILADORES: Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Juárez, Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez 2009 p. 68

MANUAL DE PRÁCTICAS DE GENETICA HUMANA COMPILADORES: Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodríguez Revisado por: Academia de Biologia 2011 Ciudad Juárez, Chihuahua Universidad Autónoma de Ciudad Juárez 2009 p. 68

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biología

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biología

Dr. Alejandro Martínez Martínez Jefe del Departamento de Ciencias Químico-Biológicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomédicas

Aprobados por la Academia de Biología, 2011

CONTENIDO Practica 1: Extraccion de DNA …………………………………………………………..3 Practica 2: Corrimiento de Acidos Nucleicos …………………………………………..9 Practica 3: El cariotioi humano …………………………………………………………11 Practica 4: Simulacion de errores durante el proceso de replicacion... ……………14 Practica 5: Digestion del DNA con endonucleasas de restriccion ………………….19 Practica 6: Southern blotting ……………………………………………………………23 Practica 7: Transformacion de celulas bacterianas …………………….……………28 Practica 8: Fundamentos de la clonacion ……………………………………………..32 Practica 9: Regulacion genica en procariotes ………………………………………...37 Practica 10: Factores involicrados en la regulacion de la transcripcion genica en eucariotas y sus funciones ……………………………………………………………...43 Practica 11: Biologia genomica ………………………………………………………...48 Practica 12: Estudio genealogico en el genoma humano …………………………...50 Practica 13: Estudio de la herencia poligenica ………………………………………56 Practica 14: Estudio de los polimorfismos del grupo sangineo ……………………..63 Pracitca 15: Tecnica del aplastamiento para el estudio de los cromosomas ……..66

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Pracitca 1 EXTRACCION DE DNA Objetivo: Que el alumno aprenderá sobre la extracción de DNA y la electroforesis.

Introducción Extracción de DNA El concepto básico de la extracción de DNA se puede dividir en 5 pasos: 1) Ruptura de las células.- es casi virtualmente posible obtener DNA de todas las células que se conocen, únicamente tendrá que adaptarse a las necesidades y facilidades para escoger los métodos de lisis celular. Entre los mas utilizados están: a) Los detergentes.- El uso de detergentes es útil para extraer DNA especialmente de parásitos, células en cultivo y tejido. b) Enzimas.- cuando se trata de extracción de DNA en bacterias, se utiliza la lisosima que es una enzima que se encuentra en varias secreciones del cuerpo humano como lagrimas y moco, y en la clara de huevo. Actúa desestabilizando la pared celular bacteriana cuando rompe las uniones glucosidicas entre los polisacáridos. 2) Eliminación de proteínas.- para eliminar las proteínas se utilizan enzimas proteolíticas, como la pronasa, la cual es activa contra un amplio espectro de proteínas naturales. 3) Eliminación de ARN.- Una vez concluida la digestión con las proteasas, se realiza la digestión con una RNasa para eliminar en su totalidad la presencia de ARN. La RNasa se utiliza a una concentración de 100mg/ml. 4) Extracción de proteínas.-la eliminación de las proteínas de la muestra se termina utilizando solventes organicos como el fenol que es utilizado en la extracción de las proteínas debe ser biodestilado o ultrapuro. 5) Precipitación del DNA.- para poder concentrar el DNA después de la eliminación de las proteínas, se utilizan una serie de sales entre las que se encuentran el acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro de litio. Una vez que el DNA ha estado en contacto con los cationes seleccionados se precipitan con volúmenes de etanol absoluto.

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Extracción del DNA A partir de células sanguíneas o de espermatozoides (Nature, Vol 318, 12 dic, 1985) 1.- Tomar 300 µl de glóbulos blancos principalmente. 2.- La solución grinding contiene las siguientes soluciones stock:

Para

1 muestra Agua 290 µl 0.5 M EDTA 100 µl 0.1 M tris (pH 50 µl 8.0) 10% SDS 50 µl Proteinasa 10 µl Total 500 µl

10 muestras 2.9 ml 1.0 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.1 ml 5.0 ml

3.- Homogenizar con un pistón de teflón 4.- Incubar el homogenizado a 55°C toda la noche (o por 3 horas) 5.- Agregar 20 µl de NaCl 5 M por cada tubo de muestra. 6.- Agregar un volumen igual de fenol equilibrado a la muestra. 7.- Dar vortex por 1 minuto. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a máxima velocidad. 8.- Tomar el sobrenadante (el cual contiene el DNA), y ponerlo en un tubo nuevo. Descartar el tubo con el pellet. 9.- Repite los pasos 6 y 8 de 2 a 3 veces, o hasta que el sobrenadante este claro y no turbio. 10.- Agregar un volumen igual de cloroformo a la muestra. 11.- Dar vortex por 1 min. Microcentrifuga de 3 a 5 minutos a máxima velocidad. 12.- Toma el sobrenadante (el cual contiene el DNA) y colócalo en un nuevo tubo. Repite los pasos 10 al 12. 13.- Agregar 2 volúmenes de etanol 100% frio al sobrenadante y mantenerlo por 5 min a -20°C (puede ser durante toda la noche). 4

14.- Microcentrifuga por 5 minutos hasta hacer un pellet de DNA cuidadosamente descarta el sobrenadante lentamente por la decantación.

y

15.- Adicional 2 volúmenes de etanol al 70% y dejar a temperatura de cuarto por 5 minutos. 16.- Centrifugar 5 minutos descartar sobrenadante dejando solamente el pellet, repetir los pasos 11 y 12. 17.- Secar el pellet a temperatura ambiente. 18.- Resuspender el pellet de DNA seco en 50 µl de H2O uv para cuantificar en el espectrofotómetro. 19.- Colocar las muestras en refrigeración a -20°C para almacenar el DNA.

Procedente de células epiteliales 1.- Raspar cuidadosamente dentro de la mejilla 4 veces con la punta de una pipeta P200 µl; raspar con la punta con un ángulo hacia la mejilla de manera que las células sean colectadas alrededor y dentro de la punta. 2.- Pon la punta de la pipeta dentro del tubo para microcentrifuga que contenga 500 µl de NaCl. Con un pipetor para la pipeta P200 suba y baje 3 a 5 veces para resuspender las células. 3.- Centrifugar el tubo a alta velocidad por 2 minutos. 4.- Remueve el sobrenadante con P1000 y pon el tubo conteniendo el pellet en hielo. 5.- Poner 200 µl de chelex al 5% sobre pellet y resuspender. 6.- Poner el tubo en baño de arena a 100°C por 8 minutos. 7.- Dar vortex por 10 a 15 segundos, después pasarlo al hielo por 1 minuto. 8.- centrifuga a alta velocidad por 2 min. 9.- Remover el sobrenadante a otro tuvo y dejarlo en el hielo hasta que vaya a ser  utilizado. 10.- Adicionar 2.5 µl de solución de células bucales a cada 50 ul de tubos de reacción.

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CUANTIFICACION DE DNA Cuantificación en espectrofotómetro. El espectrofotómetro mide la cantidad de luz ultravioleta a 260nm absorbida por  las bases. Usar una cubeta de cuarzo de 1 ml con el agua como blanco. Se ajusta a cero el espectrofotómetro con H 2O. Después de ajustar agregar 1 µl de DNA y 99 µl de H2O. Absorbancia de 1 a 260 nm es igual a 50 µg/ml de DNA de doble hebra. Nota: La contaminación de soluciones de acidos nucleicos hace la cuantificación espestrofotometrica inexacta. Calcular la proporción de OD260/OD280 para indicación de pureza del acido nucleico. El DNA puro tiene una proporción de cerca de 1.8. una proporción baja puede ser causada por la contaminación de proteínas o fenol. Double-Stranded DNA (dsDNA): A260 = OD 260= 1 for a 50 µg/ml solution Single-stranded RNA (ssRNA): A260= OD260= 1 for a 40 µg/ml solution Single-stranded DNA (ssDNA): A260= OD260= 1 for a 33 µg/ml solution Absorbance= Molar Extinction coefficient X concentration X pathlength (usually cuvette width)

GEL DE AGAROSA 1. Hacer 1.8 % agarosa en 1 X TBE: 0.9 g agarosa en 50ml 1 X TBE. 2. Hervir hasta que se aclare, usar microondas (1-2 min; examinar para asegurar que todo se solubilice) 3. Dejar enfriar hasta aprox 60°C. 4. Agregar 12µl de una solución de 5 mg/ml bromuro de etidio; mezclar. 5. Sellar ambos lados del aparato con agarosa utilizando cinta masking tape. 6. Colocar los peines en la cámara 7. Poner agarosa en la cámara, dejar solidificar -30 min. 8. Llenar con 1 XTBE hasta que la solución apenas alcance el borde del gel (sin cubrirlo). 9. Sacar los peines lentamente. 6

10. Mezclar cada muestra de ADN (50 µl) con 10 X loading buffer (5 µl). cargar la poza lentamente con una pipeta de 200 µl, utilizando los “gel loading tips”. (con un peine de 17 pozas se puede cargar hasta 25 µl/poza). Cargar una poza con marcadores con 10 µl. 11. Correr a 100 V hasta que el colorante azul llegue al borde del gel. Agarosa: sirve como matriz para la separación de fragmentos de DNA por su tamaño. La agarosa de bajo punto de fusión sirve como matriz inerte, facilitando la recuperación del DNA de la agarosa, evitando la perdida de la muestra. Recommended Agarose Gel Percentages for Resolution of DNA

Gel percentage 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%

DNA size range 1,000-30,000 bp 800-12,000 bp 500-10,000bp 400-7,000bp 200-3,000bp 50-2,000bp

Bromuro de etidio: colorante que fluoresce de una color rojo anaranjado (560nm) cuando se excita con luz ultravioleta (260 a 360 nm). Esto permite detectar 10ng de DNA. Tiene carga negativa y corre en dirección opuesta al DNA. El colorante se intercala entre los pares de bases que se encuentran en las moléculas lineares y circulares del DNA, haciéndolas mas rigidas.

Inactivación: 1. Diluir la solución de EtBr a menos que 0.1mg/ml con agua. 2. Agregar un volumen igual al volumen de solución de EtBr o del volumen de los geles de 0.1 M de KMnO4 y mezclar con cuidado para evitar cualquier  salpicado. 3. Agregar un volumen de 0.5 M de HCl y mezcla cuidadosamente. 4. Dejar que reaccione de 2 a 4 horas (o toda la noche). Agregar un volumen de 0.5 M de NaOH y mezclar con cuidado. La solución puede ser tirada en el lavabo.

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Referencias: Zavala Castro Jorge Eduardo, Manual de Técnicas Básicas de Biología Molecular, Mexico D.F., Pag 31-33 Berk, A., Harvey, L. 2005. Biologia celular y molecular 

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Practica 2 CORRIMIENTO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS. Objetivo. Que el alumno reconozca las características de los ácidos nucléicos y el principio de la electroforesis.

Introducción. La electoforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por  aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga: masa. Por ejemplo, si dos moléculas tienen más masa y formas iguales, la de mayor  carga neta se desplazara más rápido hacia un electrodo. Los ácidos nucleicos son separados mediante esta tenica utilizando una matriz o gel. El gel puede estar compuesto de agarosa o de poliacrilamida. El gel es sumergido en un buffer de electroforesis el cual provee iones que lleva una corriente. Los geles de agarosa tienen un rango grande de separación, pero su resolución es baja. En un gel agarosa se pueden separar fragmentos de DNA de entre 100 y 50,000 pares de bases. Por otra parte los geles hechos de poliacrilamida pueden separarse de fragmentos de DNA de menos de 500 pares de bases, y dependiente de la concentración del gel pueden observar diferencias de tamaño hasta 5 pares de bases.

Materiales y Métodos El Bromuro de etidio debe ser manejado siempre con guantes y bajo la supervisión del maestro. (Los geles con Bromuro de etidio deben ser desechados apropiadamente). Tubos eppendorf para microcentrifuga de 1.5 Puntas para micropipetas estériles. Marcador de peso molecular  Guantes

Material Biológico (proporcionado por el maestro): DNA genómico de Drosophila melanogaster.

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Equipo Camara de electroforesis Horno de microondas o mechero Transiluminador 

Metodología 1. Preparación de un gel agarosa al 1%. Pesar agarosa suficiente para 50 ml. De TAE 1X. fundir la agarosa hirviendo en un mechero o en un horno de microondas, estar pendientes de que no se derrame. Dejar enfriar en la mesa por 5 min. agitándola suavemente con movimientos circulares. Añadir  Bromuro de etidio a una concentración final de 30 µg por cada 100 ml. Vaciar la agarosa a una charola para electroforesis horizontal con un peine de al menos 10 pozos. 2. Una vez que gelifique el gel, se retira el peine y se coloca la charola en la cámara de electroforesis horizontal, se agrega TAE 1X hasta un cubre gel. 3. Preparar las muestras, añadiendo el buffer de cargado hacer los cálculos necesarios para cargar las siguientes cantidades de DNA genómico por  pozo: colocar 10,50, 100, 300, 500, 800 ng, 1 y 2 µd de DNA genómico y en el ultimo pozo cargar un marcador de un peso molecular. 4. Correr el gel a 80 V constante del polo negativo al polo positivo, durante 2 horas. 5. Visualizar en un transiluminador. 6. Tomar una foto si es posible o bien dibujar y describir lo que se observo. Si el DNA genómico fue aislado correctamente debe aparecer como una banda de alto peso molecular y con un ligero barrido por debajo de ella. Si aparecen barridos más extensos o de bajo peso molecular quiere decir que el DNA se degrado en algún paso del aislamiento, este DNA degradado es un DNA de mala calidad el cual no podrá ser utilizado en experimentos subsecuentes en el laboratorio.

Referencias. Berk, A., Harvey, L. 2005. Biologia celular y molecular  Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor  Laboratory Press

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Practica 3 EL CARIOTIPO HUMANO Objetivo El objetivo de esta práctica es el estudio del cariotipo humano. Se pretende que el alumno aprenda a elaborar cariogramas y a distinguir el cariotipo normal de cariotipos que reflejan alteraciones cromosómicas, obtenidos de individuos que presenten diferentes síndromes.

Introducción El cariotipo es el complemento cromosómico particular de un individuo y viene definido por el número y morfología de los cromosomas en la metafase mitótica. En la especie humana la dotación cromosómica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales). Utilizando técnicas de tinción estándar los cromosomas aparecen uniformemente teñidos en metafase y se clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la posición del centrómero que define su morfología. Los autosomas se numeran del 1 al 22 ordenados por tamaños decrecientes y por la posición del centrómero. Los cromosomas sexuales X e Y constituyen un par aparte, independientemente del resto (por su tamaño, el cromosoma X se incluiría en el grupo C, y el Y, en el grupo G). De esta forma el cariotipo humano queda constituido así: Grupo A

Pares cromosómicos 1, 2 y 3

B

4y5

C D E

6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 13, 14 y 15 16, 17 y 18

F G

19 y 20 21 y 22

X, Y

Características Cr. muy grandes casi metacéntricos (1 y 3 metacéntricos, pero 2 submetacéntrico) Cr. grandes y submetacéntricos, con dos brazos muy diferentes en tamaño Cr. medianos submetacéntricos Cr. medianos acrocéntricos con satélites Cr. pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17, 18 Cr. pequeños y metacéntricos Cr. pequeños y acrocéntricos, con satélites. El cr. X es parecido al 6. El Y, al grupo G, pero sin satélites.

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(Todos los cromosomas autosómicos están ordenados en orden decreciente de tamaño, excepto el cromosoma 21 que ahora se sabe que es más pequeño que el 22)

Clasificación de los cromosomas

A

1

2

B

4

3

5

C

6

7

8

9

10

11

12

D 13

14

E 16

15

17

18 Crs. sexuales

19

20

21

22 X

F

Y

G

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Materiales: Computadora Acceso a internet Cariotipos de individuo sano y enfermo

Metodologia: Seleccionar un cariotipo por medio de una imagen de la computadora en el que se muestran los cromosomas metafásicos teñidos pertenecientes a diversos individuos. El alumno deberá ordenar el cariograma y determinar si existen anomalías cromosómicas en cada individuo.

Referencias: Berk, A., Harvey, L. 2005. Biologia celular y molecular  Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T.1989. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor  Laboratory Press

Cuestionario: 1.- ¿Qué características permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de otros? 2.- ¿Qué células del organismo llevan el cariotipo diploide completo? 3.- ¿Qué mecanismos cromosómicos producen anomalías del cariotipo humano? 4.- ¿Se manifiestan siempre las alteraciones cromosómicas en el fenotipo del individuo que las transmite? Explica tu respuesta.

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Practica 4 SIMULACIÓN DE ERRORES DURANTE LA REPLICACIÓN. Objetivo Que el alumno entienda la Identificación de los distintos errores que pueden ocurrir  durante la replicación del DNA.

Introducción La replicación del DNA es un proceso complicado y altamente regulado que ocurre en diferentes etapas: 1.La iniciación requiere el reconocimiento de un origen se producen varios sucesos. Antes de la comience la síntesis de ADN, las cadenas parentales han de ser separadas y estabilizadas en forma de cadena simple. Entonces puede inciarse la síntesis de las cadenas hijas en la horquilla de replicación; E.coli ello se consigue por medio de un complejo proteico llamada primosoma. 2.La elongación es obra de otro complejo de proteínas. El replisoma no es una entidad independiente tan obvia como otras, ya que sus componentes solo se ensamblan al comienzo de la replicación. A medida que replisoma se mueve a lo largo del ADN, las cadenas parentales se desenrollan y se sintetizan las cadenas hijas. 3. Terminación al término de la replicación, se requiere de reacciones de unión y de terminación. Después de la terminación, los cromosomas duplicados se separan. La enzima que sintetiza una nueva hebra de DNA se denomina DNA polimerasa, existen3 tipos de DNA polimerasa: la I está involucrada en la reparación del DNA dañado y en un tipo de replicación llamada semiconservativa; la II también está involucrada en reparación y la III, una proteína con múltiples sub-unidades, es la responsable de la síntesis de novo de hebras de DNA añadiendo nucleotidosa un extremo 3´-OH. Durante la replicación pueden existir errores, estimaciones matemáticas indican que hay aproximadamente 1 error por 1000 ciclos de replicación. Los errores que produce la DNA polimerasa durante la replicación pueden dividirse en dos clases: sustituciones, que ocurre cuando el nucleótido incorrecto es incorporado, debido a un deficiente eficiencia de la lectura de prueba y, cambios de marco de lectura que ocurre cuando un nucleótido extra es insertado o cuando uno es omitido. 14

Cuestionario (Ejercicios modificados de Averes, 1984) 1. ¿Cuál es la importancia de que se mantenga la fidelidad de la replicación del DNA?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  2. Se ha demostrado que la secuencia de los aminoácidos del segmento de una enzima es:-Met-Lys-Ser-Leu-Asp-Ala-Tyr-His- en una cepa silvestre. Después de la inducción de una mutacion, se encuentra que el mismo segmento se ha modificado de la siguiente forma: -Met-Lys-Ser-His-HisLeu-Met-Leu-Thr-lle a) Si la secuencia original del DNA que codifica esta polipeptido es 5´-TAC TTT TCA GCT AGT GAA CTA CGA ATG GTA G 3´- ¿Cuál fue la naturaleza de la mutacion que condujo al cambio en la secuencia de aminoácidos?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  b) ¿Qué cambio particular en el DNA mutante podría restaurar todos los codones originales excepto para el codón que especifica el aminoácido numero nuatro (His)?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  15

3. Un análisis de una proteína muestra que dos mutantes diferentes contienen una substitución de aminoácidos en el sitio normalmente ocupado por la leucina. El origen de estos mutantes es : Leu→Val→Met-1 a) Asignar los codones respectivos de RNA a cada mutante y a la cepa silvestre  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  4. Un análisis de una proteína muestra que dos mutantes diferentes contienen una subritutcion de aminoácidos en el sitio normalmente ocuparo por la glicina. El origen de estos mutantes es: Gly→Arg→Met-2 a) Asignar los codones respectivos de RNA a cada mutantes y a la cepa silvestre  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  5. Un RNAm que codifica una pequeña hormona peptidica de tan solo once aminoácidos tiene la siguiente construcción: 5´AUG UGU AAU UUG UGG CAU UGC UAU UUU UAG AAAAAAAA-3´ a) ¿ Que aminoácidos conforman esta proteína?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  16

b) ¿Cuáles de los siete codones que especifican aminoácidos podrían ser  cambiado a un codón de terminación por una sola sustitución de una base? De el codón de terminación en cada paso que cite.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  6. Los plásmidos que portan los genes pen-r y test-r fueron expuestos a enzimas de restricción que cortan la región que porta prn-r pero dejan intacta a tet-r. El plásmido digerido se mezclo con fragmentos genómicos de restricción de una biblioteca genómica clonada de ratón para producir  DNA recombinante, el cual fue utilizado para transformar bacterias sensibles a drogas. Las bacterias transformadas fueron paqueadas (puestas a crecer en un medio de cultivo solido) en medio selectivo para identificar aquellas colonias de bacterias portando DNA recombinante, con los siguientes resultados.

Medio nutritivo + tetraciclina a)

Medio nutritivo + penicilina

¿Qué colonias portan DNA recombinante? recombinante? Explique.

 ________________________________________________________________________________  ________________________________________________________________________________  ________________________________________________________________________________  ________________________________________________________________________________  ________________________________________________________________________________ b) ¿Qué colonias podrían crecer en medio que contuviera penicilina penicilina y tetraciclina? tetraciclina? Explique.  ________________________________________________________________________________  ________________________________________________________________________________  ________________________________________________________________________________ 17

Referencias bibliográficas Lewin, B., Aguilar, A., Genes Benjamin Lewin. Tercera edición Avers, Ch. J. 1984. Genetica. Segunda edición. Willard Gran Prees, Boston E.U. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. 1989 Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

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Practica 5 DIGESTION DEL ADN CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION OBJETIVO Conocer, aprender y realizar la técnica de digestión del ADN utilizando dos enzimas de restricción.

OBJETIVOS PARTICULARES 1. Digerir el ADN del bacteriófago lambda con dos enzimas de restricción diferentes. 2. Separar por electroforesis los fragmentos de restricción 3. Visualizar los fragmentos de restricción y analizar.

INTRODUCCION Las endonucleasas de restricción y mapas de restricción Las endonucleasas de restricción permiten la hidrólisis selectiva del DNA para obtener mapas de restricción. La naturaleza posee un conjunto variado de herramientas, las endonucleasas de restricción, capaces de diseccionar  selectivamente moléculas de DNA de muchos tamanos y orígenes en fragmentos mas pequenos. Estas enzimas protegen a las bacterias de los virus invasores, los bacteriófagos. Las secuencias de DNA bacteriano, normalmente reconocidas por  la endonucleasa de restricción, están protegudas contra el corte por la metilación de las bases situadas dentro del palíndromo, mientras que el DNA vírico metilado es reconocido como extraño y es hidrolizado. Se han identificado y purificado numerosas endonucleasas de restricción de tipo II con diferente especificidad de secuencia; en la actualidad, muchas están disponibles comercialmente. Las endonucleasas de restricción permiten la construcción de nuevo tipo de mapa genético, el mapra de restricción, en el que se identifica el sitio de corte enzimático dentro del DNA. Especies de DNA purificadas que contienen secuencias para una endonucleasa de restricción son cortadas por esta. Variando el tiempo de digestión de las moléculas de DNA purificadas por la endonucleasa de restricción, se puede generar una población de fragmentos de DNA de diferentes tamanos total o parcialemtne hidrolizados. La separación de estos fragmentos generados enzimanticamente mediante electroforesis en gel de agarosa permite la obtención de mapas de restricción. El análisis de un DNA completamente hidrolizado por una endonucleasa de restricción establece el numero de sitios reconocidos por la

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endonucleasa dentro de la molecula, asi como el tamaño de los fragmentos generados.

METODOLOGIA (Adaptado de la traducción de Villalobos-Arambula, Moreno-Salcedo).

REACTIVOS ADN del bacteriófago lambda Amortiguador de reacción (2x) Enzima EcoRI Enzima hindIII H2O

MATERIALES Baño maría a 37 °C Micropipetas 0.5-10 µl Equipo electroforético Microcentrifuga Regla y papel semi-logaritmico

Digestión del ADN 1. Ubicar los microtubos proporcionados por el profesor que contienen las enzimas (“Es”para “Stock de EcoRI y “Hs”para “Stock de HindIII), en el ADN del fago lambda ” λ”, el amortiguador de restricción 2x “Am”y el amortiguador de carga “C”. Mantener las soluciones en hielo. 2. Rotular tres microtubos nuevos de la siguiente manera: Tubo uno L= ADN de λ(control sin digestión) Tubo dos E= Digestión con EcoRI Tubo tres H= Digestion con Hind III Agregar ademas una marca que distinga su grupo de los de sus companeros. 3. Dar un pulso de centrifuga y pipetear con extrema precisión (micropipeta de 0.5-10 µl) los reactivos en los microtubos rotulados: Tubo

ADN λ

L E H

2µl 4 µl 4 µl

Amortiguador  2x 5 µl 5 µl 5 µl

EcoRI

Hind III

-1 µl --

--1 µl

H 2O MilliQ 3 µl ---

Volumen Final 10 µl 10 µl 10 µl

4. Tapar los tubos y mezclar los componentes suavemente al agitar los tubos con el dedo. Utilizar una microcentrifuga para recolectar los liquidos en el fondo (pulso de centrifugación rápida). Verificar que el volumen total de cada tubo sea de 10 µl. utilizar una punta diferente para cada muestra y colocar las tres gotas en puntos diferentes del microtubo. 20

5. Colocar los tubos en la gradilla flotante e incubarlos durante 1 hora a 37°C. 6. Mientras, preparar el gel de agarosa al 1.5% (ver practica uno). 7. Después de la incubación, retirar los tubos del baño maría, centrifugar rápidamente (pulso) con el propósito de recolectar el líquido en el fondo del tubo. 8. Anadir 2 µl del amortiguador de carga azul (tubo “C”) en cada tubo. Tapar los tubos y mezclar suavemente, aguitando los tubos con el dedo. Dar un pulso de centrifugación rápida. 9. Llenar la cámara de electroforesis hasta cubrir el gel de agarosa con el amortiguador TBE 1X. 10. Asegurarse de que los pozos de gel agarosa estén cerca del electrodo (-) de color negro y que la base del gel este cerca del electrodo (+) color rojo. 11. Cargar la muestra dentro de los pozos del gel, utilizando una punta diferente para cada muestra, siguiendo el orden indicado, de izquierda a derecha: •

•

•

•

LINEA 1: tubo L (control sin digestión) LINEA 2: tubo E, digestión con EcoRI. LINEA 3: tubo H, digestión con Hind III LINEA 4: marcador de ADN (lambda-Hindi III, proporcionado por el profesor)

12. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis. Los cables rojo y negro de la tapa concordaran con los cables rojos y negro de la base. Conectar los electrodos con la fuente de poder. 13. Encender la fuente de poder y someter las muestras a 80V por 120 minutos. 14. Apagar la fuente de poder una vez terminado el proceso de electroforesis y retirar cuidadosamente el gel y la bandeja de la caja. Remover el gel de la bandeja tener cuidado ya que ¡el gel es muy resbaloso!, colocar el gel en la bandeja de tinción. 15. *Añadir 60 ml de colorante ADN bio-seguro en la charola de tinción. Cubrir la bandeja con papel aluminio. Dejar el gel tiñendo toda la noche. 16. * Colocar el sobrenadante de la solución bio-segura, una botella, ya que se puede volver a utilizar. Agregar 60 ml de agua destilada al gel. Dejar que se destina de 10 a 15 minutos, y vacias posteriormente el agua utilizada en un contenerdor de desechos. 21

17. * Para obtener un registro permanente, ponerlo sobre el acetato.

(*) Alternativamente el profesor realizara la tinción con bromuro de etidio (ver  practica uno) y entregara al alumno la fotografía instantánea o digitalizada del resultado de la electroforesis.

BIBLIOGRAFIA Devlin T.; Bioquimica: libro de texto con aplicaciones clínicas, 2006, 4ta edición, editorital Reverte, S.A., Barcelona, España. Sambrook J.; Fristsch E.F.; Maniatis, 1989, molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edicion.

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Practica 6 SOUTHERN ¨BLOTTING¨ OBJETIVO Que el alumno conozca la de transferencia tipo Southern.

INTRODUCCION Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior  revelado. Esta técnica consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones. Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia dedeterminadas secuencias. El Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producir  fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los fragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge en una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) al filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava el filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcaje no-radioctivo). 23

El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo utilizando sonicación ó enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor  tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon. A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.

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METODOLOGIA Reactivos Gel agarosa ADN genomico ADN digerido Amortiguador TBE 1X Amortiguador de desnaturalizacion Amortiguador de neutralizacion Amortiguador SSC* (20 X) Amortiguador SSC* (6 X) Amortiguador SSC* (2X) Membrana de nitrocelulosa o nylon (recordata al tamaño del gel)

Electroforesis de las muestras ADN a transferir:

Materia, equipo y accesorios Microcentrifuga Equipo electrpfpretico Micropipetas y puntas Termociclador  Equipo electroforetico Papel filtro grueso y delgado (Whatman) Selección del papel filtro largo Charola de vidrio y puente plastico Peso (1 kg) Agitador rotatorio Papel plastico

1. Cargar (por duplicado: en geles idénticos) las muestras de ADN (ADN del bacteriófago lambda con o sin digestión que proporcionara el profesor  2. Llevar a cavo la electroforesis, 2 horas, 80 volts. 3. Teñir un solo gel (con bromuro de etidio o colorante Biosafe), tomar  fotografía y guardar gel a 4°C, en oscuridad.

Transferencia del ADN a membrana de nylon: se trabaja únicamente con el gel NO teñido: 1. Sumergir el gel en 500 ml de solución de desnaturalización ** por 45 minuto con agitación leve sobre agitador rotacional 2. Enjuagar el gel en agua bidestilada 5 minutos ¡Cuidado el gel es muy resbaloso! 3. Neutralizar en 500 ml de solución de neutralización** 15 minutos, dos veces. 4. Cortar una pequeña sección de la esquina derecha superior del gel para su futura orientación.

Formación de la pirámide de transferencia por capilaridad: 1. Usar guantes para cortar la membrana de transferencia (proporcionada entre dos hojas de papel protector), 2 hojas de papel filtro grueso y una altura de 10 cm de papel filtro delgado al mismo tamaño que el gel. Cortar  25

la esquina derecha superior de la membrana de la misma manera que lo hizo para el gel. 2. Para formar la pirámide colocar en orden a) La charola de vidrio b) Transversalmente, el puente (tabla de vidrio o plástico) c) El papel filtro largo que cubra la tabla y toque al interior de la charola. d) El gel (con los puntos de carga hacia abajo) e) La membrana humedecida en agua bidestilada colocada exactamente encima del gel (con las esquinas recortadas en misma ubicación). Una vez ubicada no moverla. f) El plástico hermético alrededor del gel y membrana para evitar el contacto directo entre el puente y las siguientes capas. g) 2 hojas de papel whatman grueso, humedecidas en SSC 2x. h) 10 cm de papel Whatman delgado y seco. i) Suficiente solución SSC 20x para que humedezca el papel filtro grande.   j) Película de plástico alimenticio que cubra toda la charola (evita evaporación y polvo). k) Por último un peso (1kg aprox) 3. Dejar el proceso de transferencia de 8 a 24 horas. 4. Al dia siguiente, eliminar la pirámide en orden inverso al del montaje. Anotar  el aspecto (color) de cada capa. Antes de quitar la membrana, marca con lápiz la ubicación de los pozos de carga del gel. Separar con cuidado (y guantes) la membrana del gel. 5. Enjuagar brevemente (5min) la membrana con SSC 6x, escurrir la membrana hasta secar por 30 minutos. 6. Fijar el ADN de cadena sencilla covalentemente a la membrana: a) Horneado (cuidado de no quemarse) de 30 a 120 minutos (>80 °C). b) O irradiando con la luz UV 5 minutos (sobre la superficie limpia del transiluminador, ubicando la membrana con marca de lápiz por  arriba) ¡CUIDADO CON LOS OJOS Y LA PIEL, TOME PRECAUCIONES ADECUADAS! 7. Las membrana se puede conservar por varias semanas a -20 °C hasta su hibridación posterior con sonda marcada (esta parte sin embargo no se efectuara)

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Verificación del éxito de la transferencia: 1.- Para cerciorarse del éxito de la transferencia del ADN a la membrana se suele teñir el gel después de la transferencia y comprarlo con el gel que se tiño pero no se transfirió. BIBLIOGRAFIA Lunque J.; Herraez A.; Biologia Molecular e ingeniería genética, 2001, primera edición, editorial harcourt, Madrid, España. Sambrook J.; Fristsch E.F., Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, segunda edicion.

SOLUCIONES PROPORCIONADAS PARA LA PRACTICA: Solucion SSC 20x: Disolver 175.3 g de NaCl y 88.2 g de citrato de sodio en 800 ml de agua bidestilada. Ajustar a pH 7 con NaOH, ajustar el volumen a 1 litro, esteriliza en autoclave. Solución SSC 6x: al momento de su uso, diluir 3.3 veces el amortiguador SSC 20x. Solución SSC 2x: al momento de su unos, diluir 10 veces el amortiguador SSC 20x. Solución amortiguadora de desnaturalización NaOH---------- 0.5 M NaCl------------ 1.5 M Solucion de neutralización Tris pH 7.4---------- 1M NaCl------------------ 1.5 M

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Practica 7 TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS BACTERIANAS. Objetivo Que el alumno aprenda una de las técnicas más utilizadas en la biología molecular  para le analisis genetico.

Introducción Esta técnica es básica en un laboratorio de biología molecular. La finalidad de esta técnica es introducir un plásmido a una bacteria, y utilizar esta para amplificar el plásmido y así obtener grandes cantidades del mismo. Los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena que se encuentran naturalmente en varias especies de bacterias. Estos elementos genéticos son extracromosomales, se replican de manera independiente del cromosoma bacteriano y codifican para una gran variedad de enzimas que confieren resistencias a antibióticos y metales pesados, degradan complejos orgánicos o producen toxinas, etc. Dadas estas características, los plásmidos han sido empleados como vectores o vehículos de clonación de moléculas de ADN foráneas que permiten el transporte y manipulación del mismo. Es así como, hoy en día, se dispone de una gran variedad de plásmidos sintéticos de naturaleza modular con características diversas para lograr ya sea la clonación de un fragmento de ADN genómico, de cADN o de PCR, o para la expresión de los mismos y obtención del respectivo producto proteico. Entre las prioridades de los plásmidos que favorecen su utilización como vector de clonación se incluyen: (1) su pequeño tamaño que hace que el ADN sea fácil de aislar y de manipular; (2) su naturaleza circular que hace que el ADN se mas estable durante la extracción; (3) su origen de replicación independientemente del control directo de la replicación del cromosoma bacteriano; (4) su múltiple numero de copias, de manera que se aumenta la eficiencia de la extracción del ADN plasmidico; y (5) la presencia de marcadores seleccionables, tales como genes de resistencia a antibióticos, haciendo así mas fácil la detección y la selección de las bacterias que contienen plásmidos. La estructura modular de todo plásmidos comprende básicamente: (1) un origen de replicación autónomo que permita un alto número de copias por bacterias (replicación autónomo que permita un alto número de copias por bacteria (replicación relajada), (2) genes de resistencia a antibióticos, (3) marcadores de selección, y (4) un sitio múltiple de clonación, caracterizado por la presencia de 28

sitios únicos para enzimas de restricción, no encatrados en ninguna región del plásmido.

Materiales y Métodos El maestro elaborara con anterioridad los siguientes reactivos: Medio de cultivo LB Cajas de agar-LB con ampicilina X-gal 20 mg/ml (no filtrar) IPTG 100mM (estéril a través de filtración por un filtro de 0.22 mM) Cloruro de Calcio 100 Mm estéril

Materiales Puntas para micropipetas estériles Espátulas para sembrar bacterias Mechero Marcador indeleble punta negra Tubos 10 ml estériles Tubos para microcentrífuga de 1.5 ml. Matraz de 100 ml. estéril

Material biológico Cepas DH5α

Equipo Incubadora a 37°C Baño María 42°C Microcentrífuga

Metodología 1. Poner, de una caja fresca de células de la cepa DH5 α, un cultivo de 5 ml estéril, dejarlo toda la noche a 37° C con agitación. 2. Agregar al día siguiente 100 ml de medio luria, 3ml del cultivo de células de la cepa DH5 α, incubar con agitación a 37°C hasta que alcance una densidad óptica entre 0.4 a 0.6 (O.D. 600). 3. Centrifugar las células a 3000 rpm por 10 min. Se desecha el medio sobrenadante y las células se resuspenden delicadamente en 20 ml. De una solución 100 mM de CaCl ₂ fría. (Es muy importante que la solución este muy fría por que la pared de las células es muy delicada en este momento y la temperatura ayuda a mantener la viabilidad de las células). 29

4. Centrifugar de nuevo a 3000 rpm por 10 min. Resuspender en 1 ml de la solución de CaCl ₂ fría. Dividir el volumen en 10 tubos para microcentrífuga de 1.5 ml estéril y conservar en hielo. 5. Marcar cinco tubos como contro a, 1 ng a, 10 ng a, 100 ng, 300 ng a. Los cincos restantes marcarlos igual pero con al letra b. 6. A los tubos con la letra ¨a¨ añadir la cantidad indicada del plásmido pBluescript y a los tubos marcados con la letra ¨b¨ añadir la cantidad indica del plásmido pBluescript-ATRAX, el cual lleva clonado del DNA de un gen. A los tubos control no se les añadirá nada. Esto se hace para comprobar  que las baterías componentes recién preparados no estén contaminados con otro plásmido. 7. Incubar el DNA con las bacterias durante 1 hora en el hielo. Durante este tiempo de incubación se preparan 10 tubos de 5 ml con 1 ml de medio luria líquido, y se marcan como los tubos del inciso 5. 8. Terminado el tiempo de incubación rápidamente se pasan los tubos a un baño de 42°C (choque térmico) durante 1 min. al término de este minuto se vuelven a pasar los tubos al hielo durante otro minuto, se les agrega 1 ml de medio a cada tubo y se transfiere el medio a los tubos de 5 ml que se prepararon. 9. Se incuban los tubos en agitación a 37°C durante una hora para permitir  que las bacterias se recuperen. Durante este tiempo de incubación a las cajas con medio solido agar-luria, se les agrega 25 µ de X-Gal y se extiende con una espátula en un ambiente estéril (mechero). 10. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se centrifugan los tubos a 3000 rpm durante 10 min., se decanta el medio y con el medio restante se toma la totalidad de las bacterias y se siembran en las cajas en ambiente estéril y se espátulan para extenderlas. Las cajas se dejan incubar en una estufa a 37°C. 11. Al día siguiente se cuenta el número de colonias, y se calcula la competencia de las células dividiendo el número de colonias obtenidas en cada caja por la cantidad de DNA (en microgramos) que se agrego. Unas células muy bien preparadas deben de dar una competencia entre 10⁵ y 10⁶. Unas células muy componentes pueden estar en el orden de hasta 10⁸.

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Referencias bibliográficas Consepcion, J., Puerta, B., Cludia, P., Ureña, P., Practicas de biología molecular. Pontifica Universidad Javeriana.

Bolivar, f et al., 1977. Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid pMB9. Gene 2,75.

Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. 1989 Molecular cloning. Cold Dpring Harbor Laboratory Press.

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Practica 8 FUNDAMENTOS DE LA CLONACIÓN. Objetivo El alumno aprenderá la utilidad de la clonación para investigación actual.

Introducción El desarrollo de métodos para la introducción de DNA en células de mamíferos, ha hecho posible expresar genes clonados en una gran variedad de tipos de células de diferentes estructurales, y para identificar elementos involucrados en el control de la expresión genética. En este tipo de estudios se inserta la secuencia de interés en un vector de expresión apropiado, se clona en una bacteria, se amplifica por replicación y posteriormente se utiliza para transfectar células de mamífero, de insecto o bien para hacer organismos transgénicos. Estas construcciones también pueden utilizarse para sobre-expresar  proteínas o fragmentos de proteínas las cuales son posteriormente purificadas para hacer anticuerpos específicos contras esas proteínas. La clonación tiene por lo tanto múltiples aplicaciones y últimamente con ayuda de la ingeniera genética se han podido introducir mutaciones en genes que codifican para proteínas de interés, para producir proteínas mutantes en grandes cantidades en bacterias o en células de insecto o mamíferos. El introducir este mutación en el gen, en sitios específicos, ha llevado muchas veces a encontrar  funciones para proteínas desconocidas, o a estudiar en células de mamífero cómo se comportan estas proteínas mutadas y analizar a nivel celular su contribución a una enfermedad determinada. Las principales herramientas que un biólogo molecular tiene para poder  manipular el DNA son enzimas de restricción y otras enzimas modificadoras del DNA. Las enzimas de restricción se unen específicamente y cortan el DNA de doble cadena en sitios específicos en secuencias llamadas sitios clasificadas en 3 grupos: el grupo I y III cortan el DNA en su secuencia blanco y después se disocia del sustrato. El grupo II consiste de un sistema binario, el cual lleva una endonucleasa que corta una secuencia específica de nucleótidos y una metiltransferasa por separado que modifica la misma secuencia blanco. Este tipo de enzimas son las que han sido ampliamente utilizadas en biología molecular. La mayoría de las enzimas reconocen 4,5 o 6 nucleótidos específicos los cuales generalmente son palindromes. Existen también enzimas que reconocen 6 nucleótidos específicos los cuales generalmente son palindromes. Existen también enzimas que reconocen 6 nucleotidos o mas, pero las secuencias no son exactos o están degeneradas. Hay enzimas que cortan justo en el eje de simetría creando fragmentos de DNA cohesivos. 32

El DNA restringido con una cierta enzima posteriormente puede ser ¨ligado¨ a un vector que haya sido cortado con la misma enzima ya que tendrán extremos complementarios. Muchas veces al diferir con dos enzimas diferentes. Ya ligar  estos fragmentos a veces se puede formar un nuevo sitio de reconocimiento para una tercera enzima de restricción. El conocer toras estas combinaciones, ha hecho que los biólogos moleculares cuenten con muchas herramientas para poder manipulas los genes o el gen que codifican para una proteína particular a su conveniencia.

Cuestionario 1. ¿Cuáles son las propiedades de las endonucleasas del grupo II que las hacen útiles para la clonación?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   _____________________________________________________  2. A continuación se muestra el mapa de restricción del plásmido YIP5 de 5,541

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Figura: Mapa de restricción del plásmido YIP5 de 5,541 pb. Los números indicados después de cada enzima de restricción indican las posiciones de los sitios de corte.

Indicar los tamaños de los fragmentos que se obtendrían tras la digestión de los plásmidos YIP5 con las siguientes enzimas de restricción: Enzimas

Tamaño del fragmento obtenido

EcoRI EcoRI y Eagl, Hindilll y Apal Hindilll y Smal Pvull y Eagl Apal y Pvull 3. Un fragmento de DNA de ratón con extremos cohesivos EcoRI contiene el gen CyP1A1. Este fragmento de DNA, de 2 kb de largo, se inserta en el sitio EcoRI del plásmido bacteriano Pbr322. El plásmido recombinante se corta con tres enzimas de restricción distintas. La distribución de bandas tras la electroforesis en gel de agarosa, visualizadas con bromuro de etidio, se muestra en la figura siguiente: (i) EcoRI

(ii) BamHI

(iii) BamHI + EcoRI

Se transfiere el ADN del gel (iii) mediante la técnica de Soutjern blot. ¿Qué fragmentos hibridaran con una sonda de DNA del vector pBR322, marcada con P32?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  34

 __________________________________________________________________   __________________________________________________________________ 

A continuación se muestra una cadena sencilla de DNA: 5´ATGGGGTAGAATTCGAATTCAAGCTTGGCCCTGCAGGGATCC3´ Indicar las secuencias potenciales de reconocimiento de las enzimas de restricción, si las hay, en la forma de doble hélice de DNA.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  4. ¿Qué método se usa para crear extremos cohesivos?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  5. A continuación se muestran los sitios internos de corte del gen humano Cyp1A en el plásmido PCMvSport6.

Enzima BamH I Sph I EcoRI HInC II

Corte 1 1,773 1,577 1,515 732

2 2,444 1,071 1,345

Suponga que ha digerido este inserto con las encimas indicadas en la tabla anterior cada una por separado, y con BamH I- EcoRI. Lleve a cabo el análisis de los productos de digestión después de haber realizado una electroforesis de un gel 35

teñido con bromuro de etidio. En el esquema del gel mostrado a continuación indicar en cada carril las bandas que se espera obtener para cada muestra.

Gel de electroforesis teñido kb Marcador BamH I 23,000

Sph I

EcoRI

HLnC II

BamH I EcoRI

9,000 6,000 4,000

2,322 2,027

565 125

Referencias bibliográficas Bolivar, F. et al., 1977 a. Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid Pmb9. Gene 2, 75.

Bolivar, F. et al., 1977b. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. Ampicillin-resistant derivatives of plasmid Pmb9. Gene 2, 95.

Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. Molecular cloning. Cold spring Harbor  Laboratory Press.

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Practica 9 REGULACIÓN GÉNICA EN PROCARIONTES. Objetivo El alumno entenderá el proceso de regulación génica en procariontes.

Introducción Jacob, Monod y colaboradores analizaron el sistema de la lactosa en E. coli , de manera que los resultados de sus estudios permitieron establecer el modelo genético del Operón que permite comprender como tiene lugar la regulación de la expresión génica en bacterias. Jacob y Monod recibieron en 1965 el Premio Nobel pos estas investigaciones. Un Operón es grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores. Los principales elementos que constituyen un operón son los siguientes: Los genes estructurales: llevan información para polipéptidos. Se trata de los genes cuya expresión está regulada. Los operones bacterianos suelen contener  varios genes estructurales, son poligénicos o policistrónicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo gene estructural. Los operones eucarióticos suelen contener un sólo gen estructural siendo monocistrónicos. El promotor (P): se trata de un elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripción. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra P. El operador (O): se trata de otro elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la proteína reguladora. El operador se sitúa entre la región promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra O. El gen regulador (i): secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora que reconoce la secuencia de la región del operador. El gen regulador está cerca de los genes estructurales del operón pero no está inmediatamente al lado. Abreviadamente se le denomina gen i. Proteína reguladora: proteína codificada por el gen regulador. Está proteína se une a la región del operador. Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes. 37

El operón lactosa: control negativo El Operón lactosa, que abreviadamente se denomina Operón lac , es un sistema inducible que está bajo control negativo, de manera que la proteína reguladora, producto del gen regulador i , es un represor que impide la expresión de los genes estructurales en ausencia del inductor. El inductor del sistema es la lactosa. Como veremos más adelante, el operón lac  también está bajo control positivo, ya que existe otra proteína que estimula la transcripción de los genes estructurales. Los genes estructurales del operón lactosa son los siguientes: El gen z+: codifica para la b-galactosidasa que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa más galactosa. El gen y+: codifica para la galactósido permeasa que transporta b-galactósidos al interior de la célula bacteriana. El gen a+: codifica para la tiogalactósido transacetilasa que cataliza la transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor  tiogalatósido. Este gen no está relacionado con el metabolismo de la lactosa. El verdadero inductor del sistema es la  Alolactosa y no la lactosa de manera que la  β-galactosidasa transforma la lactosa en  Alolactosa. En los estudios del operón lactosa se utiliza como inductor un análogo sintético de la lactosa que es el Isopropil tiogalactósido (IPTG) . El IPTG no necesita ser transportado por la galactósido permeasa para entrar en la bacteria. Las cepas normales de E. coli  son inducibles, de manera que en ausencia del inductor (la lactosa), la proteína represora producto del gen i se encuentra unida a la región operadora e impide la unión de la ARN-polimerasa a la región promotora y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales.

Operón lactosa: control positivo El operón lactosa también está sujeto a un control de tipo positivo, de manera que existe una proteína que estimula la transcripción de los genes estructurales. En los sistemas de control negativo existe una proteína que que impide la transcripción de los genes estructurales, en los sistemas de control positivo existe una prteína activadora que estimula la transcripción de los genes. En principio existen cuatro tipos de sistemas posibles de regulación de la expresión génica: Tipo 1: Inducible, control negativo (operón lactosa y operón galactosa) Tipo 2: Inducible, control positivo (operón arabinosa y operón maltosa) 38

Tipo 3: Represible, control negativo (operón triptófano y operón histidina) Tipo 4: Represible, control positivo (no se han descrito) Por supuesto, un operón pude estar sujeto a más de un tipo de control, como sucede en el caso del operón lactosa que esta bajo control negativo ejercido por la   proteína represora y bajo control positivo ejecutado por  una proteína activadora  por catabolitos (CAP) también llamada proteína activadora del AMP cíclico (CRP). El control positivo del operón lactosaa como veremos está estrechamente relacionado con la Represión catabólica.

Figura: Operón de la lactosa.

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Cuestionario 1. Explicar con un ejemplo las diferencias fundamentales entre control negativo y positivo.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  2. Los mutantes lac Y puede sintetizar  β-galactosidasa. Sin embargo, aunque el gen lac I está intacto, no se puede inducir  β-galactosidasa añadiendo lactosa al medio. ¿Explique por qué?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  3. Explicar porque las mutaciones I del operón lac son recesivas frente al alelo silvestre I + y por qué I + es recesivo frente a las mutaciones I 5.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  4. ¿Qué significa que las mutaciones O c del operón lac sean dominantes en cis?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________ 

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5. Completar el siguiente cuadro. Genotipo +

a) b) c) d) e) f) g)

+

+

β-galactosidasa sin lactosa con lactosa +

+

+

Permeasa sin lactosa

con lactosa

+

I P O Z Y / I P O+ Z+ Y+ I- P+ OC Z+ Y- / I+ P+ O+ Z- Y+ I+ P- OC Z- Y+ / I- P+ OC Z+ YIS P+ O+ Z+ Y- / I+ P+ O+ Z- Y+ IS P+ O+ Z+ Y+ / I- P+ O+ Z+ Y+ I- P+ OC Z+ Y- / I- P+ O+ Z- Y+ I- P- O+ Z+ Y- / I- P+ OC Z+ Y+ 6. Como podría determinar experimentalmente si un gen se expresa de forma constitutiva.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  7. Comparar las características de los genes que se expresan de forma constitutiva con los que se expresan de forma regulada.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________ 

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8. Describir y explicar, con ayuda de esquemas como funcionan el cAMP y CAP en el operón de la lactosa.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________ 

Referencias bibliográficas Jacob, F y J. Monod 1961. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of  prteins. Journal of Molecular Biology 3:318-356

Klug W.S y Cummings M.R. 2002. Essentials of Genetics. 4 Th ed. Prentice Hall. Upper Sadle River N.J. 508 pp.

Lewin B. 2001. Genes VII. Oxford Press. New York. 990 pp. Lewis M., Chang G., Horton N.C., Kercher M.A., Pace H.C., Schumacher M.A., Brennan R.G y Lu P. 1996. Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with DNA and inducer. Science 271: 1247-1254.

Matthews K.S. 1996. The whole lactose repressor. Science 271:1245-1246. Niu W, Kim Y., Tau G., Heyduk T y Ebright R.H. 1996. Transcription activation ar  class II CAP-dependent promoters: two interactios betwwn CAP and RNA polymerase. Cell 87: 1123-1134.

Rodriguez Arnaiz R, Catañeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos básicos de genética. Las prensas de Ciencias. 262 pp.

Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2 nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

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Practica 10 FACTORES INVOLUCRADOS EN LA REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN GÉNICA EN EUCARIONTES Y SUS FUNCIONES. Objetivo El alumno reconocerá las características de los elementos involucrados en la regulación de la transcripción génica en los eucariontes.

Introducción En los ecuariontes superiores la regulación de la expresión génica se encuentra íntimamente asociado con la estructura de la cromatina. Los promotores de los genes eucariotas se encuentran cromatinizados, y cuando un gen debe expresarse, el promotor debe adoptar una estructura abierta que permita la unión de la maquinaria basal de transcripción a sus secuencias blanco. Los promotores se definen como secuencias que van de -40 a 40 pares de bases a partir del sitio de inicio de la transcripción, muchos de los promotores tienen una caja TATA a donde se une la proteína TBP (proteína de unión a la caja TATA, TATA Binding  Protein); aunque recientemente se ha demostrado la existencia de promotores que carecen de cajas TATA y que utilizan otras secuencias a donde también se une la maquinaria basal de transcripción. Los promotores también tienen una región llamada promotor proximal que va desde -40 hasta -200 pares de bases a la cual se unen otros factores transcripcionales. La apertura de la cromatina y la activación de la expresión de un gen son eventos controlados que deben de ocurrir en un tiempo, espacio y tejidos determinados. Para que esto ocurra, además de un promotor, los genes cuentan con regiones de control a distancia, como son los acrecentadores de la transcripción, los silenciadores y los islotes. Los acrecentadores son elementos que tiene una organización modular, es decir, tienen sitios de unión para diversos factores transcripcionales, son tejidos específicos y todos aumentan la tasa de transcripción. Los silenciadores también tienen una organización modular pero al contrario en los enhanceres, estos tienen un efecto negativo sobre la transcripción. Una característica compartida tanto por los acrecentadores como por los silenciadores en que se pueden actuar sobre un promotor independientemente de su posición, es decir, pueden encontrarse rio arriba o rio abajo del promotor y potenciar o reprimir su trascripción. A los acrecentadores y silenciadores se unen factores transcripcionales que pueden atraer actividades remodeladoras de la cromatina 43

como acetiltransferasas de hisotonas para favorecer una estructura ¨abierta¨ o bien desacetilasas de hisotonas para favorecer una estructura ¨cerrada¨. Debido a que estos elementos actúan a grandes distancias sobre un promotor  determinado, se hace evidente que deben de existir regiones de la cromatina que ayuden a organizar a los genes y a sus promotores en dominios bien definidos para evitar la promiscuidad entre los elementos de regulación de un promotor  determinado y los promotores de otro genes. Los islotes son elementos que tienen una actividad neutra, es decir no tienen efecto sobre la transcripción, no son promotores, ni silenciadores. Son elementos contitutivos, es decir que se mantienen a lo largo de la diferenciación celular y que no son tejidos específicos. Estos islotes se han encontrado en algunos casos enmarcando a un gen o a un grupo de genes y se ha propuesto que correspondan a los limites físicos de los dominios transcripcionalmente activos. Se ha propuesto que estos elementos son capaces de ayudar a la formación de un dominio transcripcionalmente activo protegiéndolo del silenciamiento por  heterocromatizacion y de la acción de elementos de regulación adyacentes al dominio. Funcionalmente los islotes se definen porque con capaces de bloquear la acción de un acrecentador sobre su promotor únicamente cuando esta posicionados entre el acrecentador y el promotor, es decir, su actividad depende de su posición, al contrario de los silenciadores y de lo acrecentadores.

Cuestionario 1. Se esta trantando de determinar cual es la región promotora de un gen. Se ha clonado 3 fragmentos de DNA genómico que se encuentran rio arriba y rio abajo del posible inicio de la transcripción del gen (A, B, C). Los fragmentos clonados se sobrelepan de la siguiente manera:

Las flechas indican el posible sitio de inicio de la transcripción del gen. 44

Se diseña un ensayo utilizando un plásmido que lleva como gen reportero al de la luciferasa, es decide clonar los fragmentos rio arriba del gen reportero y hacer  transfecciones transitorias en células eucariontes, medir la actividad del gen reportero 24 horas después de la transfección haciendo un lisado de las células cuantificando la actividad de la luciferasa en un luminometro. Se obtienen los siguientes resultados: Plásmido control (solo lleva al gen de la luciferasa): 0.000 Plásmido con el fragmento A: 250 Plásmido con el fragmento B: 2000 Plásmido con el fragmento C: 1000 (a) ¿Qué región contiene el promotor?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  (b) ¿Por qué la actividad del gen reportero disminuye con el fragmento C?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  (c) Al analizar otras de las clonas del fragmento B que se obtuvieron, hay una en particular que tiene mutada la caja TATA (sitio de unión TBP). De acuerdo a los valores obtenidos para los distintos fragmentos (A, B y C), ¿cuál será la actividad hipotética del gen reportero si se ensaya este fragmento?  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________ 

45

2. Se está tratando de determinar la función de un fragmento de DNA genómico que tiene varios posibles sitios de unión a factores de transcripción. Se quiere determinar si se trata de un silenciador, o de un islote. El alumno todavía no lo sabe pero esa región es un islote. Se tiene el siguiente vactor y se decide seguir la estrategia de transfecciones transitorias en el problema No.1:

a) Dibujar en qué posición o posiciones clonar el fragmento para demostrar  que se trata de un silenciador.

b) Dibujar en qué posición o posiciones clonar el fragmento para demostrar  que se trata de un islote.

c) La actividad del gen reportero del plásmido control es de 20,000 unidades, de acuerdo a las construcciones de las respuestas para a y b. escribir para cada casi cual es la actividad teórica del gen reportero. Recordar que el fragmento clonado tiene una actividad de islote.  __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________   __________________________________________________________________  46

Referencias bibliográficas Lewin, B et. al. 2002. Genes VII Oxford University Press. Valdez-Graham V, y Recillas-Targa Félix 2001. Características y formación de un dominio transcripcionalmente activo. Revista de Educacion Bioquimica 21, 2140.

Rodriguez Arnaiz R, Catañeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos básicos de genética. Las prensas de Ciencias. 262 pp.

Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2 nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

47

Practica 11 BIOLOGÍA GENÓMICA Objetivo El alumno aprenderá una de las metodologías empleada en la construcción de un gen de diferentes especies de un género.

Introducción El término “Genómica” fue acuñado hace aproximadamente 17 años y hace referencia al estudio no sólo de los genes, sino sus funciones, relaciones entre sí y con el medio ambiente. Esta disciplina surge, como la farmacogenética y la medicina proteómica, con la consolidación, a fines de la década de los ’80 del Proyecto Genoma Humano y nos introduce en un periodo de transición de la medicina donde el conocimiento genético específico se torna crítico para brindar  un cuidado efectivo de la salud para cada individuo. A diferencia de la genética clásica que a partir de un fenotipo, generalmente mutante, busca el o los genes responsables de dicho fenotipo, la genómica tiene como objetivo predecir la función de los genes a partir de su secuencia o de sus interacciones con otros genes. Así, la genómica tienen un enfoque distinto para responder preguntas biológicas cuando se compara a otras ramas de la biología más tradicionales. En lugar de un enfoque reduccionista más comúnmente usado en otras ramas como lo son la biología molecular o la bioquímica la genómica trata estos problemas de manera global. En el caso del estudio puro de genomas, la secuenciación de un genoma genera información sobre todos los genes presentes en un genoma. Distintas características de los genes como posición en el genoma, conservación de los genes observada entre distintas especies y predicciones de la estructura de las proteínas o el ARN ahí codificados permiten inferir la función de algunos de los genes estudiados. En la genómica aplicada a estudios de transcriptómica se estudian los patrones de expresión de distintos genes a una escala global (véase Chip de ADN, PCR en tiempo real). De esta forma es posible sugerir posibles funciones e interacciones de genes observadas en un punto en el tiempo. Los estudios genómicos se caracterizan por su interdisciplinaridad debido a que el gran número de datos generados en un estudio de este tipo requiere combinar  tanto conocimientos biológicos como estadísticos e informáticos. Por otra parte, los estudios en genómica utilizan una estrategia Top-down para analizar preguntas en biología. Con este enfoque primero se observa el comportamiento global de muchos genes o biomoléculas en un organismo (ARN mensajero, proteínas, metabolitos, etc.) y eventualmente se llega a conclusiones más particulares que conciernen solo algunas biomoléculas. Así la aplicación de las ciencias genómicas permite abordar preguntas de gran significancia en biología que requieren de una comprensión global del problema. Por ejemplo, para 48

el estudio de distintas enfermedades genéticas complejas es necesario disponer  de una lista completa de los genes participantes y luego estudiar sus interacciones. Para entender la evolución de los genomas también es necesario disponer de secuencias completas para poder inferir distintos eventos que pudieron dar lugar al estado actual del genoma. Para abordar distintos problemas biológicos las ciencias genómicas se subidividen en distintas áreas de conocimiento, por ejemplo la Genómica funcional, la Genómica estructural y la Genómica comparativa.

Materiales y métodos Material Diskettes o discos compactos (CD) nuevos.

Equipo Computadora con conexión a internet Programa de alineamiento Programa para análisis filogenético

Métodos 1. Investigar la biología de las especies que conforman al genero Canis y de Lycaon pictus. 2. Entrar a la dirección electrónica del Gene Bank: http://ncbi.nlm.nih.gov/ 3. Seleccionar las secuencias nucleotidicas del citocromo b de las especies que se agrupan en el género Canis. 4. Guardar la información en un disco 5. Alinear las secuencias con el programa de alineamientos que hayas seleccionado. 6. Utilizar el programa para análisis genéticos y generan el o los arboles filogenéticos, utilizando a L. pictus como grupo externo 7. Analizar los resultados e inferir la historia filogenética del genero Canis.

Referencias bibliográficas Beckoff. M.1977. Canis Latarans. Mammalian Species, 79, 1-9. Gotelli, D., Sillero-Zubiri, G.D, M.S. Roy, D.J Giramn, J. Garcia-Moreno, E.A. Ostrander y R.K. Wayne 1994. Molecular genetics of the most endangered canid: the etiopian wolf Canis simensis. Mol . Ecol. 3, 301-312.

Martin, L.D. 1989. Fossil history of the terrestrial carnivore. En : Gittleman, J.l. (Ed) Carnivore behavior, ecology and evolution. Pp 536-568 Cornell University Press. New York. 49

Practica 12 ESTUDIO GENEALOGICO EN GENETICA HUMANA Objetivo: El objetivo de esta práctica es que el alumno aprenda a confeccionar y esquematizar árboles genealógicos; a determinar, en la medida de los posible, el genotipo de los individuos que lo componen, y a conocer la transmisión de algunos caracteres sencillos y de fácil observación.

Introduccion: El hombre presenta ciertas características especiales que lo califican como un material difícil para el estudio genético. De hecho, estas características son: 1. Hay una gran diversidad genética de individuos, y también la estructura genética de las poblaciones humanas varía continuamente debido a las migraciones, la mezcla de razas, etc. 2. Por motivos éticos y morales no se practican cruzamientos experimentales, de los que por otra parte no se obtendría gran información, ya que: a) de cada parto suele nacer un solo individuo b) las gestaciones son largas c) entre una generación y la siguiente transcurre mucho tiempo d) el tamaño de las familias es pequeño. En cambio, otros organismos que se utilizan frecuentemente en la investigación genética presentan características mucho más ventajosas. Por ejemplo en los ratones, ocurre una generación cada dos meses y los descendientes de cada pareja pueden contarse por decenas. En Drosophila, la generación dura 20 días y se cuentan los descendientes por centenares. Así, en estos organismos y otros de características similares, los cruzamientos experimentales constituyen uno de los mejores métodos para el conocimiento de los caracteres hereditarios. Por lo tanto, la genética humana tiene que recurrir para su desarrollo a métodos indirectos tales como el uso de pedigrís o árboles genealógicos, análisis de poblaciones, etc. A pesar de todas estas dificultades, desde principios de siglo y mediante el uso de técnicas genealógicas, se ha ido acumulando el conocimiento de nuevos caracteres determinados genéticamente y de los genes que los controlan, hasta llegar a varios millares. Posteriormente, las técnicas citogenéticas y moleculares han permitido identificar nuevos genes y determinar su localización cromosómica. 50

Material: El material biológico de esta práctica serán los propios alumnos y sus familiares para la observación de algunos caracteres genéticos. Con sus datos se elaborarán las genealogías.

Procedimiento: La práctica en sí consiste, en primer lugar, en el reconocimiento de las variaciones fenotípicas para cada uno de los caracteres monogénicos que se describen a continuación, de donde el alumno deducirá su genotipo en cada caso. Los datos se tomarán en una hoja como la que se indica al final de esta práctica. Se usará una hoja de datos para cada persona. Descripción de los caracteres 1) Disposición del lóbulo de la oreja. Lóbulo separado de la mejilla o pegado lateralmente a la mejilla. 2) Línea frontal del pelo. Puede ser continua o tener un saliente frontal en el centro denominado "pico de viuda". Obviamente las personas calvas no se pueden contabilizar. 3) Capacidad de enrollar la lengua. Ser o no capaces de enrollar la lengua en forma de U fuera de la boca. 4) Pigmentación del iris. Ojos azules frente a ojos más oscuros, sean éstos verdes o marrones. Lo que se compara es la ausencia total o no de pigmentación en la superficie del ojo. En ausencia de ésta, se observa la lámina interna azul del iris, y los ojos serán totalmente azules. La presencia de pigmento en las capas superiores del iris enmascara en mayor o menor grado el color azul del fondo. Otros genes determinan el color exacto y su intensidad para ojos verdes, marrones, etc., pero en esto no nos fijaremos. 5) Hiperextensibilidad del dedo pulgar. Capacidad o incapacidad de doblar hacia atrás la última falange del pulgar en un ángulo de casi 90º respecto a la anterior  ("dedo del autoestopista"). Esta capacidad puede manifestarse sólo en una de las manos, y la expresividad del rasgo es variable. 6) Dedo meñique doblado. El meñique puede estar recto, o bien con la última falange doblada hacia el dedo anular. Se colocan ambas manos relajadas sobre una mesa y se observa si los dedos están paralelos o si los meñiques se doblan hacia dentro. 7) Longitud relativa del dedo índice. Dedo índice más o menos largo que el anular. Se realiza la observación como en el caso anterior. Se trata de un carácter de expresión influenciada por el sexo. 51

8) Hoyuelos faciales a ambos lados de la boca. Presencia o ausencia de hoyuelos en las mejillas. 9) Presencia de pelo en las segundas falanges de los dedos. Aunque sólo haya algo de pelo en alguna de las diez falanges, se considera como fenotipo positivo. 10) Dedo gordo del pie corto. El dedo gordo del pie puede ser más corto o más largo que el índice adyacente. 11) Capacidad de detectar la feniltiocarbamida (PTC). Hay individuos que detectan un sabor amargo y otras que no notan nada. Introducir primero en la boca el papel control, ensalivar, y sacar de la boca. Introducir a continuación el papel impregnado en PTC y ensalivar. Una vez realizada la observación, proceder de la siguiente manera: 1. Tomar los datos del fenotipo propio 2. Anotar todos los fenotipos en el lugar correspondiente de la hoja de datos. 3. Tomar los datos de tantos parientes (padres, hermanos, abuelos, tíos) como sea posible. 4. Anotar los datos de cada persona en una hoja de datos diferente. 5. Confeccionar el árbol genealógico indicando el fenotipo de cada persona para, al menos, dos de los caracteres analizados. 6. Determinar si es posible el tipo de herencia de los caracteres analizados. 7. En base al tipo de herencia, nombrar los alelos adjudicados a cada carácter en la hoja de datos, usando una letra distinta para cada carácter, en mayúsculas/minúsculas para dominante/recesivo. 8. Por último, indicar cuando sea posible los genotipos de todos los miembros para cada carácter. Como ejemplo de árbol genealógico se seguirá un esquema como el que se indica a continuación:

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I

1

2

3

4

II

1

2

3

4

5

6

1

2

7

8

4

5

9

III

3

En la genealogía se indica el orden de las generaciones con número romano. La primera generación (I) corresponde a la primera persona de la que se posean datos, por ejemplo la de los abuelos del alumno; la segunda (II) correspondería a la de los padres y tíos, y la tercera (III), a la generación del alumno. Los varones se representan con cuadrados, las mujeres con círculos, y por  rombos los individuos de los que no se conocen los datos (II.9). Las parejas se unen por una línea horizontal. Los descendientes se disponen bajo una línea horizontal desde la que parte una línea vertical por individuo, excepto en el caso de mellizos (III.4 y 5) o gemelos fraternos (II.4 y 5), que se indican por líneas convergentes (ver figura). Los individuos que muestran el fenotipo en estudio se indican rellenando el símbolo.

53

Referencias: Rodriguez Arnaiz R, Catañeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos básicos de genética. Las prensas de Ciencias. 262 pp.

Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2 nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

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HOJA DE DATOS 1 Parentesco: Fenotipo

Fenotipo

Lóbulo de la oreja

..... separado ..... unido

Dedo autoestopista ..... presente..... ausente

Pico de viuda

.... presente .... ausente

Longitud del índice ..... corto ... .. largo

Lengua en U 

..... capaz

Dedo meñique ..... curvado ..... recto

Pigmentación del iris Pelo en 2ª falanges Detección PTC:

..... incapaz

.... presente ..... ausente Hoyuelos faciales .... presente . ... ausente

…. SI

.... presentes... ausentes

Dedo gordo del pie ..... corto ... .. largo

.… NO

HOJA DE DATOS 2 Parentesco: Fenotipo Lóbulo de la oreja

Fenotipo ..... separado..... unido

Pico de viuda .... presente

.... ausente

Lengua en U  ..... capaz

..... incapaz

Pigmentación del iris

... presente .. ... ausente

Pelo en 2ª falanges ... presente ..... ausente Detección PTC:

…. SI

Dedo autoestopista ..... presente..... ausente Longitud del índice

..... corto

Dedo meñique .... curvado

..... largo ..... recto

Hoyuelos faciales.... presentes... ausentes Dedo gordo del pie ..... corto ..... largo

.… NO

HOJA DE DATOS 3 Parentesco: Fenotipo Lóbulo de la oreja

Fenotipo ..... separado..... unido

Pico de viuda ..... presente

.... ausente

Lengua en U .... capaz ..... incapaz

Dedo autoestopista ..... presente..... ausente Longitud del índice ..... corto ... .. largo Dedo meñique.... curvado

..... recto

Pigmentación del iris.... presente..... ausente

Hoyuelos faciales

Pelo en 2ª falanges.... presente..... ausente

Dedo gordo del pie ..... corto ... .. largo

Detección PTC:

…. SI

.... presentes... ausentes

.… NO

55

Practica 13 ESTUDIO DE LA HERENCIA POLIGENICA RECUENTO DE LAS LÍNEAS DE LAS HUELLAS DACTILARES Objetivo: Que el alumno comprenda la importancia del estudio de la herencia poligenica. Y comprenda el estudio que será totalmente de las líneas de la huella (en inglés: total ridge count o TRC)

Introducción: La herencia poligénica no se puede analizar empleando pedigríes ni estudiando los cromosomas (de no ser que se estudie una aberración cromosómica en concreto). Un rasgo poligénico es el fenotipo resultante de la acción de dos o más genes. Estos tienen unas características comunes: 1.- los rasgos se cuantifican midiéndose, 2.-los rasgos son controlados por 2 o más genes resultando en un efecto aditivo, 3.- los rasgos son controlados por efecto de alelos múltiples, 4.- los fenotipos de los rasgos poligénicos y multifactoriales varían de expresión  por efecto de los factores ambientales. Existen numerosos ejemplos de este tipo de herencia por ejemplo la estatura, el peso, la inteligencia, el color de la piel, etc. Demostrar y estudiar la herencia de los rasgos poligénicos no es fácil. El ejemplo que a continuación te proponemos estudiar explorará cómo los rasgos de la herencia de las huellas dactilares son modelos de herencia poligénicas. Recogeréis las huellas dactilares vuestras y prepararéis un perfil de las mismas. En 1890, Francis Galton sugirió que las huellas dactilares serían una buena manera de identificación para humanos. Durante los últimos años de hecho, tanto los dibujos de las huellas dactilares (de las manos y pies) y de las huellas de las palmas de las manos y pies han sido de gran interés para numerosos estudios especializados. Un ejemplo de su utilidad es el estudio de la huella del recién nacido para el diagnóstico precoz de anormalidades cromosómicas. La herencia de las huellas dactilares, al igual que los demás caracteres de herencia poligénica, también se ve influída por factores ambientales aunque, debido a la precocidad y rapidez del desarrollo de éstas, el fenotipo no cambiará tras el nacimiento. Las huellas dactilares se pueden detectar a partir de la 6ª semana de desarrollo fetal, llegando a su mayor desarrollo hacia la semana 12-13. Posteriormente regresarán hasta adquirir la morfología final que ya no se verá alterada durante el restante desarrollo prenatal y postnatal.

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ARCOS

LAZOS

ESPIRALES

Clasificación de las huellas Los patrones de los dibujos de las huellas se pueden clasificas en tres grupos principalmente: arcos, lazos y espirales. El arco es el patrón más simple y menos frecuente. En las huellas donde aparecen lazos, las líneas aparecen en tres direcciones, encontrándose en un punto intermedio (el trirradio) con ángulos de unos 120 grados. En el centro del punto de encuentro se forma un triángulo. Los lazos pueden denominarse radiales o cubitales, dependiendo de hacia dónde estén inclinados; por ejemplo, un dedo meñique presentará un lazo radial si su trirradio se abre hacia el pulgar de su misma mano. Un lazo cubital será aquel que del pulgar se abra hacia el meñique de la misma mano. El patrón espiral presenta dos trirradios (formándose dos triángulos). Las frecuencias de estros tres patrones en la población son de 5,0% para el arco, 5,4% para el lazo radial, 63,5% para el lazo cubital, y 26,1% para el espiral. Características de algunos síndromes comunes:

- Trisomía 21: dedos con lazos cubitales generalmente, lazos radiales en dedos 4 y 5.

- Trisomía 18: líneas poco desarrolladas, gran frecuencia de arcos (media de 7-8 con al menos un arco). En los pulgares sin arcos, con lazos radiales, recuentos TRC bajos. - Síndrome de Turner (45,X): alto recuento TRC sin aumento de espirales. Relación entre la media de TRC y el número de cromosomas X e Y 45, X 46, XY 46, XX 47, XXY

165 145 126 114

47, XYY 48, XXYY 48, XYYY 49, XXXXX

103 88 83 17

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Materiales: Cinta tape transparente. Regla

Metodologia: 1.- Recogida de un juego completo de huellas dactilares propias. 2.- Clasificar las huellas de acuerdo a su morfología. 3.- Determinar el recuento total de líneas (TRC) de un juego completo de huellas. 4.- Construír un histograma de la distribución de frecuencias con los datos obtenidos del grupo de prácticas. 5.- Discutir las características de la herencia poligénica y el por qué de su difícil análisis.

Bibliografia: Beckoff. M.1977. Canis Latarans. Mammalian Species, 79, 1-9. Gotelli, D., Sillero-Zubiri, G.D, M.S. Roy, D.J Giramn, J. Garcia-Moreno, E.A. Ostrander y R.K. Wayne 1994. Molecular genetics of the most endangered canid: the etiopian wolf Canis simensis. Mol . Ecol. 3, 301-312.

Martin, L.D. 1989. Fossil history of the terrestrial carnivore. En : Gittleman, J.l. (Ed) Carnivore behavior, ecology and evolution. Pp 536-568 Cornell University Press. New York.

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Resultados: Recogida de datos individuales (pegar aquí la cinta adhesiva con las huellas en cada casilla) pulgar derecho (I)

índice derecho (II)

corazón dcho (III) anular derecho meñique (VI) dcho(V)

pulgar izquierdo (I)

índice izquierdo (II) corazón izdo (III)

anular izdo (IV)

meñique (V)

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izdo

mano derecha pulgar patrón obtenido:

  _________

índice

_________

corazón

_________

anular

_________

meñique

_________ 

recuento parcial:

_________

_________

_________

_________

_________ 

recuento total =

 _________ 

mano dcha

mano izquierda pulgar patrón obtenido:

  _________

índice

_________

corazón

_________

anular

_________

meñique

_________ 

recuento parcial:

_________

_________

_________

_________

_________ 

recuento total =

 _________ 

mano izda

Recuento total dos manos:

TRC= ___________

60

Recogida de datos del grupo de prácticas sexo estudiante

V/M

TRC

lazos*

espirales*

arcos*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 61

22 23 24

% del total:

 

media del TRC: media mujeres:

TRC

media varones:

TRC

______

______

______ 

 ________ 

 ________ 

 ________ 

(*) poner el número de dedos

Realizar un histograma de frecuencias.

Preguntas de la práctica:

1.- ¿Cuál es la media TRC para la clase? ¿Existen diferencias en las TRC medias para los varones y mujeres? 2.- ¿Cuál puede ser la causa de esta diferencia? Razona tu respuesta. 3.- Compara tu TRC con la media total y con la de tu sexo. 4.- Resume y razona los resultados obtenidos en el histograma. 5.- De haber recogido datos de una población mucho mayor ¿crees que el gráfico presentaría otro aspecto? Razona tu respuesta. 62

Practica 14 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS ANÁLISIS DEL GRUPO SANGUÍNEO Objetivo: El objetivo del analisis del gurpo sangineo es analizar un polimorfismo evidente fenotípicamente, como es el de los grupos sanguíneos. Se pretende dar a conocer  la base genética de los grupos sanguíneos más importantes. Se determinarán los grupos sanguíneos de cada alumno mediante la extracción de unas gotas de sangre por punción del cuarto dedo de una mano con una lanceta estéril.

Introducción: Los polimorfismos son el reflejo de la diversidad genética de la especie. Se dice que existe un polimorfismo en un determinado locus cuando hay más de un alelo presente en la población con una frecuencia superior al 1%. Aunque un individuo sólo puede presentar como máximo dos alelos distintos para un locus, un estudio poblacional puede revelar la presencia de múltiples alelos para ese locus, especialmente en ciertos loci que son altamente polimórficos. Una pequeña proporción de los polimorfismos en el ADN dará lugar a diferencias a nivel de los aminoácidos codificados, produciendo por tanto un polimorfismo de proteínas. Pero la mayoría de los polimorfismos en las secuencias de ADN ocurren en ADN no codificante, y no tienen por tanto efecto fenotípico (se denominan silenciosos). La causa de que la mayor parte de polimorfismos sean silenciosos es, por una parte, que la gran mayoría del genoma humano consiste en ADN no codificante; y por otra, que este ADN está sometido a menores presiones selectivas. En esta práctica abordaremos el estudio de polimorfismos humanos de dos maneras muy distintas. En primer lugar se estudiará el polimorfismo del locus AB0 que determina el grupo sanguíneo. Puesto que es éste un polimorfismo fenotípico, y además la penetrancia es del 100%, el análisis se hará directamente sobre el producto génico.

Materiales: Sangre de los indviduos.

Metodologia: Sistema AB0 La determinación de grupos del sistema AB0 se efectúa enfrentando los hematíes problema con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti A,B (grupo 0). La aglutinación o no aglutinación de los hematíes ensayados frente 63

a cada uno de los antisueros es indicativa de la presencia o ausencia de los correspondientes antígenos en los mismos. 1.- Dividir un porta en cuadrados. Rotular las divisiones: anti-A, anti-B y anti-AB. 2.- Con una lanceta estéril realizar una punción en el cuarto dedo de una mano. 3.- Depositar en cada cuadrado una gota muy pequeña de la sangre a ensayar. 4.- Añadir 1 gota de cada antisuero en su respectivo cuadrado. 5.- Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada ensayo. 6.- Mover la placa lentamente por rotación a temperatura ambiente. Examinar  macroscópicamente la aparición de aglutinación a los 2 minutos.

Sistema Rh (anti-D) La presencia del antígeno D se determina enfrentando los hematíes problema, en un medio proteico alto, con suero anti-D. La aglutinación o no aglutinación de los hematíes ensayados es indicativa de la presencia o ausencia del correspondiente antígeno en los mismos. 1.- Depositar una gota de suero anti-D sobre un porta rotulado. 2.- Sobre otro porta depositar una gota de Autocontrol Rh-hr CROMATEST. 3.- Añadir a cada porta 2 gotas de sangre de un tamaño aproximado a la gota de suero en él depositada. 4.- Con palillos distintos mezclar reactivo y sangre de forma que cubran una extensión de unos 2 cm cuadrados. 5.- Colocar los portas sobre la lámpara visualizadora precalentada (45º). 6.- Mover la lámpara lentamente con movimientos pendulares durante 2 minutos, observando macroscópicamente la aparición de cualquier signo de aglutinación . Lectura

Reacción negativa: ausencia de aglutinación al cabo de los 2 minutos. Reacción positiva: aglutinación visible a los dos minutos y ausencia de aglutinación con el autocontrol. La reacción positiva indicará cuál es el antígeno presente en los eritrocitos (por ej. si sale aglutinación en la casilla “A” el grupo sanguíneo será A). Si los hematíes presentasen aglutinación en el Autocontrol, dar el resultado como no válido.

Cuestionario: 1.- Anotar los resultados obtenidos y deducir el genotipo ó genotipos posibles. 2.- ¿Por qué se tiene en cuenta el grupo sanguíneo de las series AB0 y Rh en las transfusiones y no la serie MN? 3.- ¿Por qué el antígeno D define básicamente al grupo Rh? 4.- ¿Por qué el análisis de los grupos sanguíneos sólo sirve en algunos casos para excluír la paternidad y no para asignarla? 5.- ¿En qué casos la eritroblastosis fetal puede manifestarse en el primer  embarazo asumiendo incompatibilidad Rh? 64

Referencias:

Rodriguez Arnaiz R, Catañeda Sortibaran A y M. G. Ordaz Tellez 2004. Conceptos básicos de genética. Las prensas de Ciencias. 262 pp.

Rusell P. J.2000. Fundamentals of Genetics. 2 nd ed. Addison-Wesley Longman. San Francisco, CA. 527 pp.

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Practica 15 TECNICA DE APLASTAMIENTO PARA EL ESTUDIO DE CROMOSOMAS

OBJETIVO Que el alumno comprenda la importancia del estudio de los cromosomas como portadores de la informacion genetica.

INTRODUCCION Los cromosomas son las estructuras en que se organiza la cromatina nuclear y que tienen una expresión dinámica en las distintas fases del ciclo celular. En la mitosis estas estructuras comienzan un proceso de compactación que alcanza su máximo nivel en la metafase. Los cromosomas se tiñen fácilmente cuando están condensados y pueden ser individualizados con el microscopio óptico. Cada cromosoma contiene una molécula de ADN lineal asociado a distintas proteínas y el contenido de genes es variable aunque está en relación con su tamaño. Por  eso, cualquier alteración en el número o la estructura de los cromosomas puede ser causa de enfermedades. Para la detección de estas alteraciones se desarrollaron numerosas técnicas y todas ellas requieren de un observador  entrenado que las interprete. Los humanos tenemos un número total de 46 cromosomas y este número varía según las especies. Los 46 cromosomas están constituidos por 23 pares de homólogos y cada miembro del par proviene de un progenitor. El cariotipo es la constitución cromosómica de un individuo y es un estudio de rutina en genética médica. Los cariotipos se pueden informar  presentando todos los pares cromosómicos ordenados de acuerdo a su tamaño, que en un principio eran recortados de la fotografía de una metafase, y ahora se pueden hacer con analizadores automáticos. De los 23 pares, el par de cromosomas sexuales se señala por separado para indicar el sexo del individuo. Para citar el cariotipo de un individuo se indica primero el número total de cromosomas y seguidamente los componentes del par sexual precedido de una coma. Así, el cariotipo normal de un varón se escribe 46,XY y el de una mujer  46,XX. Las anomalías cromosómicas son una causa más importante de abortos espontáneos, retardo mental y malformaciones.

METODOLOGIA 1. Utilizando una navaja corte las puntas radiculares que han crecido en la base de la cebolla colocada en agua; descarte las raíces mayores a 2 cm. Coloque la mitad de las puntas radiculares en colchicina y la otra proporción en solución de Carnoy. Mantenga las muestras siempre frescas y no deje que se sequen en ningún momento. Sea precavido con la

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colchicina ya que es venenosa (lave inmediatamente cualquier area de contacto) Después de unas horas en la solución de Carnoy, remueca cuatro puntas radiculares y coloque las puntas en la solución de maceración (1:1 de alcohol: HCl). Cronometre bien el tiempo en estos pasos, a intervalos de dos minutos remueva las puntas radiculares a viales con 45% de acido acético marcado con 2, 4,6 y 8 minutos. Las puntas radiculares deberán permanecer por lo menos durante 15 minutos en acido acético al 45%. Agregue una gota de acetocarmin a un portaobjeto y tranfiera la punta radicular macerada por dos minutos en el carmín. Utilice agujas con puntas finas (entomológicas) para remover la punta de 1mm. Descarte la opción restante de la raíz, adicione acetocarmin a la punta si es necesario. Detenga la punta de la raíz con una aguja de diseccion (de preferencia con punta de dicromo) y rasge la punta; durante este procedimiento la acetocarmina se tornara ligeramente morado, esto es ventajoso ya que acelera la reacción de la tinción de la cromatina. Si se expone mucho a la punta de acero la tinción formara un precipitado oscuro que puede arruinar  la preparación. Ponga un cubreobjetos limpio y adicione acetocarmin para rellenar los espacios bajo el cubreobjetos. Invierta cuidadosamente la preparación y coloque en los bordes de papel secante; presione con cuidado, pero no fuerte para aplastar las células. No deje que se resbale a los lados la preparación. Caliente en un mechero de alcohol la preparación con la muestra arriba para diferenciar la tinción (los cromosomas se tiñen mas y el citoplasma se aclara), cuide que no hierva la preparación de acetocarmina. Con la punta del borrador de un lápiz presione ligeramente la preparación para aplanar mas las células. Puede en este paso sellar los lados del cubreobjetos con barniz de uñas. Examine la preparación del microscopio utilizando un filtro verde para mejor claridez. Si las células están conglomeradas y no aplanadas, descarte la preparación y utilice las puntas radiculares que se encuentran maceradas a 4 minutos y si aun no hay éxito utilice las de mayor tiempo. Aunque la maceración prolongada resulta en fallas en la captación de tinción del núcleo y cromosomas. No haga las preparaciones de forma mecánica, hágalas de una en una y no apresuradamente. Guarde mejor la preparación para posteriores estudios. Si las mantiene por más de 2 o 3 días es mejor colocarlas en una caja de petri con un poco de papel secante húmedo y mantenerlas en el

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