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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MANUAL BIOINFORMÁTICA Juan Capel Capel Salinas Fernando Juan Yuste Lisbona
Departamento de
Biología y Geología, área de Genética
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Manual de prácticas de Bioinformática © del texto: sus autores © Colección Textos docentes nº 5 Editorial Universidad de Almería, 2016
[email protected] www.ual.es/editorial Telf/Fax: T elf/Fax: 950 015459
¤ ISBN: 978-84-16642-34-2 Depósito legal: AL 1567-2016
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Índice
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Práctica 1: Bases de datos bibliográ�cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Revisión bibliográ�ca en Pubmed. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Búsqueda bibliográ�ca en Web of Science . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Consulta bibliográ�ca en Google Scholar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Práctica 2: Bases de datos biológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Clasi�cación de BD biológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Búsqueda de secuencias de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Consulta de secuencias proteicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructuras tridimensionales de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Identi�cación de ORF (Open Reading Frame , marco abierto de lectura) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mapas de restricción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Práctica 3: BLAST, una herramienta de análisis de secuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Accediendo a las secuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Análisis BLAST de secuencias de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Búsqueda BLAST de secuencias proteicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . You're Reading a Preview
Práctica 4: Diseño de cebadores para PCR in silico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Temperatura de fusión . . . . . . . . . . . . . . . . Unlock . . . . . full . . .access . . . . with . . . .a .free . . .trial. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. Tamaño del oligonucleótido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Especi�cidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Download . . . . . . . . . .With . . . . Free . . . . Trial ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... Complementariedad en la secuencia de los oligonucleótidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diseño de oligonucleótidos in silico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Práctica 5: Alineamiento de secuencias e identi�cación de motivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alineamiento óptimo de dos secuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alineamientos múltiples de secuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Identi�cación de motivos conservados en un conjunto de secuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . Sign up to vote on this title
. d e v r e s e
Práctica 6: Construcción de árboles �logenéticos . . . . . . . . . . . Useful . . . . . . . . . Not . . .useful .............. Filogenias basadas en secuencias de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Identi�cación de familias multigénicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Identi�cación de ORF (Open Reading Frame , marco abierto de lectura) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mapas de restricción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diseño de oligonucleótidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructuras tridimensionales de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Construcción de árboles �logenéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Diseño de ARçra CRISPR/Cas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Visualización y análisis de datos de secuenciación masiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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INTRODUCCIÓN
L
a Bioinformática es un campo de estudio que comprende un gran abanico de disciplina que participan científicos de muy diversa índole. Por ello, la Bioinformática podría definirs una ciencia multidisciplinar donde convergen en armonía los planteamientos experimen la Biología Molecular y Genética, con los enfoques metodológicos y tecnológicos de la Cienc Computación y la Ingeniería Informática, todo ello dirigido hacia la administración, el anál comprensión del conocimiento Biológico y Científico. El desarrollo de herramientas bioinformáticas ha experimentado una importante revolució última década, provocada por la combinación del impacto de Internet y los espectaculares en el campo de la Genómica, los cuales generan ingentes cantidades de datos, cuya gestión y plantean numerosos problemas que deben ser resueltos desde una perspectiva bioinformática. C cómo abordar y solucionar estos problemas son competencias que deberían poseer los investig y trabajadores en cualquiera de los ámbitos de la Biotecnología. La asignatura de Bioinformática ofrece una amplia visión sobre las aplicaciones bioinform You're Reading a Preview más comunes, así como los fundamentos científicos en las que se basan. El objetivo general full access with aacceder free trial. de forma eficiente a diferent manual de prácticas es que los alumnosUnlock aprendan cómo de datos biológicas, así cómo utilizar herramientas computacionales para solucionar casos pr que requieren el análisis de datos moleculares. Download With Free Trial
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Práctica 1: Bases de datos bibliográ�cas
Las bases de datos (BD) bibliográficas han popularizado su uso en la era de Internet y, hoy p son un instrumento indispensable para la difusión y el conocimiento de la producción cientí general todas las bases de datos bibliográficas actuales se caracterizan por contener registros formación básica sobre:
1. El documento (generalmente artículos) como título, tipo de documento, idioma, palabra y descriptores. 2. La fuente de donde provienen los documentos (principalmente revistas) como título, publicación, volumen, número y páginas. 3. La autoría, como el nombre o los nombres de los autores, institución de inscripción y
Normalmente, para cada documento se asignan descriptores para clasificarlos y utilizarl teriormente como referencia para recuperarlos por medio de las búsquedas. Las BD más com también contienen resúmenes, referencias, citas, conexión al documento en texto completo You're Reading a Preview restringido a un pago), los documentos relacionados, análisis bibliométricos y herramientas elect para almacenar y manejar las referencias recuperadas. Unlock full access with a free trial. Entre las características más importantes a considerar en una BD bibliográfica están la c de registros y el tipo de campos que capturan, las With herramientas Download Free Trialde búsqueda, manejo y análisi registros, así como la cobertura tipológica y temática. Actualmente, la búsqueda de información publicada en diferentes BD bibliográficas es un tareas más frecuentes para obtener información precisa y útil dirigida a solucionar un problem tífico. Es por ello que los objetivos principales de la presente práctica son:
. d e v r e s e
Aprender el uso básico de las BD bibliográficas. Comprender la información que ofrecen este tipo deSign BD.up to vote on this title
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Revisión bibliográ�ca en Pubmed El sistema de búsqueda PubMed es un proyecto desarrollado por el NCBI (National Center
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10 Manual de prácticas de Bioinformática
Acceda al sitio web del PubMed ubicado en la siguiente dirección:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Veamos cómo buscar referencias bibliográficas a través de PubMed. Por ejemplo, vamos información sobre una familia de factores de transcripción denominados “ WUSCHEL-relate box ” (WOX), los cuales están relacionados con la organización de grupos de células merist que mediante sucesivas etapas de diferenciación y división celular dan lugar a los diferentes de una planta. You're Reading a Preview En la ventana de búsqueda (�echa 1) podemos incluir los términos de búsqueda (en inglés) Unlock access with freeartículos trial. unafullrelación dea 65 en los que aparecen cualq CHEL-related homeobox ”, lo que nos da los términos introducidos y que posteriormente podremos reordenar de acuerdo a nuestros WithenFree Trial relevancia, tipo de artículo, periodo deDownload publicación años, etc.
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
Búsqueda bibliográ�ca en Web of Science La búsqueda de información en otras BD bibliográficas es similar a lo mostrado anteriorment viene que practiques buscando estos mismos búsqueda en la BD Web of Science You're términos Reading ade Preview Unlock full access with a free trial.
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12 Manual de prácticas de Bioinformática
artículos de revistas científicas, libros y otros tipos de material impreso que abarcan todos los del conocimiento académico. En este caso, al incluir como términos de búsqueda “ WUSCHEL-related homeobox ” y re dicha búsqueda dentro de la categoría “ Tema”, nos da una relación de 69 artículos, los cual riormente podremos reordenar de acuerdo a nuestros criterios: área de investigación, tipo de periodo de publicación en años, etc.
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. d e v r e s e
Consulta bibliográ�ca en Google Scholar Otro buscador especializado en bibliografía es Google Scholar o Google Académico, el cuál e gido a la comunidad científico-académica. Sign up to vote on this title búsqueda regular Google Académico es tan sencillo de utilizar como la Useful web useful de Google, Not mente con la función de «búsqueda avanzada», que puede filtrar automáticamente los resul búsqueda para mostrar únicamente los pertenecientes a una publicación o un artículo espec
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
Acceda a Google Scholar o Google Académico ubicado en la siguiente dirección:
https://scholar.google.es/
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14 Manual de prácticas de Bioinformática
Como tarea a realizar, utilizando los conocimientos adquiridos, en esta parte de la pr alumno debe obtener las respuestas a las siguientes preguntas:
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Práctica 2: Bases de datos biológicas
Las bases de datos (BD) biológicas constituyen una herramienta esencial para almacenar, estr organizar, actualizar y manipular datos biológicos. La variedad de éstos datos, así como tam rápido crecimiento, hacen de las BD una herramienta clave. Por ello las BD se han convertido instrumento indispensable para los científicos experimentales del campo de la biología, así com aquellos científicos del área de la bioinformática que desarrollan experimentos in silico. Los repo de datos más relevantes en biología incluyen datos de secuencias de nucleótidos, proteínas, est de proteínas, genomas, expresión genética, taxonomía, metabolismo, factores de transcripci Nos podemos hacer una idea de la cantidad y variedad de BD disponibles accediendo a la Database of Biological Database (DBD), a la cual puede acceder a través del siguiente enlace www.biodbs.info/ La búsqueda de información publicada así como la descarga de secuencias de moléculas de desde las BD, son unas de las tareas más comunes en bioinformática. Esta práctica cubrirá co You're Reading a Preview extensión esta labor, y al final de ella seremos capaces de extraer la información precisa de las comunes, de una manera eficiente. De Unlock este modo, los objetivos principales de la presente práct full access with a free trial.
Clasi�cación de BD biológicas Las BD biológicas se han desarrollado para diversos propósitos y almacenan datos muy hetero Según el alcance y cobertura de los datos almacenados, las BD pueden clasificarse en: Exhaustivas: abarcan diferentes tipos de datos de muchas especies. Entre este tipo de Sign up to vote on this title encuentran las tres BD de ácido nucleicos, que se localizan en Europa (EMBL, Europea Useful DNA useful (DDJB, NotData cular Biology Laboratory , , Japón Bank of Japan www.ddbj.nig.ac.jp/) y Estados Unidos (NCBI, National Center for Biotechnology Infor http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Estas tres BD fueron establecidas como una Colab
. d e v r e s e
Aprender el manejo básico de las BD biológicas. Download With Free Trial Comprender la información que proporcionan este tipo de BD.
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16 Manual de prácticas de Bioinformática
estos interfaces sean una página web, lo que posibilita que se acceda a los datos utilizando u navegador web. En las diferentes BD, estos interfaces proporcionan herramientas de búsqueda y de texto en los que mostrar la información. Cada uno de los ficheros incluye la información o varios registros de la BD. Durante la práctica utilizaremos la BD de nucleótidos de Estados gestionada por el NCBI, por ser una de las más sencillas e intuitivas. En cualquier caso, el for el que se encuentran depositadas las secuencias de genes y proteínas en las tres BD princip EMBL, European Molecular Biology Laboratory ; DDJB, DNA Data Bank of Japan ; y NCBI, Center for Biotechnology Information ) es el mismo, puesto que se estandarizaron los document que se recogen la información necesaria para depositar una secuencia en cualquier BD. A c ción, analizaremos un ejemplo concreto de secuencia nucleotídica depositada en la BD del N procedimiento es muy similar al indicado en la Práctica 1 para buscar información en PubM que ahora trabajaremos con una BD del NCBI diferente; en este caso será la BD “ Nucleotide
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih gov/ Nucleotide
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Podemos introducir los términos de búsqueda, bien en la ventana de búsqueda (�echa 1) o
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
pecie Arabidopsis thaliana usando el procedimiento de búsqueda avanzada. Para ello introdu sucesivamente los términos “ Arabidopsis thaliana” y “adenosine kinase ” en los campos “ Orga “Title”, respectivamente.
Entre los resultados obtenidos vamos a seleccionar aquellas resultados que se incluyen de la BD Refseq, la cual corresponde a una colección de secuencias no redundantes y bien an Este filtro se puede aplicar haciendo clic en la etiqueta “ Refseq ” (recuadro rojo) o bien al inic búsqueda avanzada, indicando dentro de la categoría “ Filter ” el término “Refseq”. You're Reading a Preview Unlock full access with a free trial.
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En las BD todas las nuevas secuencias que se van introduciendo reciben un número o ref que las identifica, en este caso entre los resultados obtenidos seleccionaremos la secuencia con
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18 Manual de prácticas de Bioinformática
Una secuencia en formato FASTA, bien de nucleótidos o de aminoácidos, tiene una sintax terizada por un primer párrafo que obligatoriamente empieza por el símbolo “ mayor que” (> por un nombre, número o referencia que identifica la secuencia en cuestión; este párrafo es me informativa. En el segundo párrafo se encuentra la secuencia de la molécula propiamente d hay más párrafos en el formato FASA.
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Consulta de secuencias proteicas El procedimiento de búsqueda es totalmente equiparable al de las búsquedas de secuencias nu cas, sólo que la BD del NCBI sobre la que se ha de trabajar es la de “ Protein”. Podemos acce desde la página principal de NCBI; pinchamos en el enlace correspondiente a “ Protein ”ye Sign up to vote on this title en la página inicial. . d e v r e s e
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thaliana usando el procedimiento de búsqueda avanzada. Para ello, al igual que en el caso a introduciremos sucesivamente los términos “ Arabidopsis thaliana” y “adenosine kinase ” en los “Organism” y “Title”, respectivamente. ras realizar este proceso de búsqueda aparecen apar proteínas de la especie Arabidopsis thaliana que incluyen el término “ adenosine kinase “.
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Al igual que con la BD de nucleótidos, entre los resultados obtenidos vamos a seleccionar Unlock full access with a free trial. proteínas que se incluyen dentro de la BD Refseq, la cual tiene la ventaja de que se trata de un ción de secuencias de proteínas no redundantes y bien anotadas. Este filtro se puede aplicar ha Download With Free Trial clic en la etiqueta “ Refseq ” (�echa) o bien al inicio de la búsqueda avanzada, indicando dent categoría “Filter ” el término “Refseq”.
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20 Manual de prácticas de Bioinformática
en el enlace “FASTA” de la proteína de 344 aa y tendremos la secuencia en un formato adecu realizar diferentes análisis bioinformáticos.
En esta parte de la práctica, siguiendo los procedimientos descritos anteriormente, el alum realizar las siguientes tareas:
Solanum lycopersicum
ade nosine kinase 2
Estructuras tridimensionales de proteínas You're Reading a Preview El punto de partida para obtener la estructura tridimensional de macromoléculas lo encontram enlace “Domains & Structures” situado la página del NCBI, en la columna de la iz Unlock full accessprincipal with a free trial. Pinchando en él, llegaremos a la página que nos permite acceder a las BD de estructuras mol tridimensionales. Download With Free Trial
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No obstante, para poder visualizar estas estructuras en modo 3D, se necesitan programas esp NCBI utiliza el visualizador Cn3D como estándar. La descarga del programa Cn3D se realiza d misma página “Domains & Structures ” accesible desde la página principal del NCBI. Una vez activamos la pestaña “ools”, y desde aquí pinchamos en el enlace al programa Cn3D.
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Una vez descargado e instalado en nuestro ordenador, ya estaremos en disposición de ver turas moleculares, bien moléculas completas o bien dominios de proteínas conservados dur Download With Free Trial evolución. Accedemos a la BD de dominios conservados (CDD) y realizamos la búsqueda del t “ MADS”. El nombre de la familia multigénica MADS-box deriva de las iniciales de sus cuatro m fundadores: MCM1 (Saccharomyces), AGAMOUS ( Arabidopsis), DEFICIENS ( Antirrhinum) y RESPONSE FACTOR (Homo sapiens ). Estas proteínas actúan como factores de transcripción, de un buen número de eucariotas, destacándose su presencia en animales, plantas y en levad su vez, intervienen en múltiples funciones, entre ellas destaca que están involucrados en el de �oral de muchas plantas. Sign up to vote on this title . d e v r e s e
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22 Manual de prácticas de Bioinformática
Durante el desarrollo de la práctica, veremos como ejemplo la estructura molecular del MADS a través del programa Cn3D, así como algunos aspectos básicos de su manejo. Si hace en la etiqueta “ MADS: MADS domain” (primer resultado, �echa), accederemos a la siguient
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. d e v r e s e
En cuanto a su estructura, las proteínas MADS-box poseen sus dominios de interacció ADN en su zona N-terminal (de unos 56 aminoácidos). Las secuencias de aminoácidos que el dominio MADS pueden observarse al final de la páginaSign (recuadro up to voterojo), on this en titlela sección “ Alignment ”. Useful Not useful Haciendo clic en la figura del dominio MADS (�echa) se inicia la descarga de un fichero “cddsrv.cn3” que podemos abrir con el programa Cn3D. Al abrir dicho fichero podremos v
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Y por otro lado la ventana correspondiente a la estructura 3D del dominio MADS:
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En la imagen se muestra que el dominio MADS está formado por dos hélices alfa (cilindros y dos láminas beta (rectángulos amarillos). Durante el transcurso de esta práctica sólo hemos visto los aspectos básicos del manejo del pr Cn3D, puede ampliar sus conocimientos sobre esta herramienta siguiendo la guía de utilizac https://galter.northw programa (menús, opciones, etc.) que encontrará en el siguiente enlace: Sign up to vote on this title edu/guides-and-tutorials/structure-viewers.pdf . d e v r e s e
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24 Manual de prácticas de Bioinformática
Imaginemos que la secuencia de cDNA problema es la siguiente: >cDNA_problema_1
AAAATCTCTTTACTACCAGCAAGTTGTTTTCTTGCTAACTTCAAACTTCTCTTTCTCTTGTTCCTCTCTAAGTCT GATCT TATT TACCGTTAACTT TGTGAACAAAAGTCGAATCAAACACACATGGAGCCGCCACAGCATCAGCA CATCATCATCAAGCCGACCAAGAAAGCGGCAACAACAACAACAACAAGTCCGGCTCTGGTGGTTACACG GTCGCCAGACCAGCACGAGGTGGACACCGACGACGGAGCAAATCAAAATCCTCAAAGAACTTTACTACAACA ATGCAATCCGGTCACCAACAGCCGATCAGATCCAGAAGATCACTGCAAGGCTGAGACAGTTCGGAAAGATT GAGGGCAAGAACGTCTTTTACTGGTTCCAGAACCATAAGGCTCGTGAGCGTCAGAAGAAGAGATTCAACGGA ACAAACATGACCACACCATCTTCATCACCCAACTCGGTTATGATGGCGGCTAACGATCATTATCATCCTCTACTT CACCATCATCACGGTGTTCCCATGCAGAGACCTGCTAATTCCGTCAACGTTAAACTTAACCAAGACCATCATCTC TATCATCATAACAAGCCATATCCCAGCTTCAATAACGGGAATT TAAATCATGCAAGCTCAGGTACTGAATGTGG GTTGTTAATGCTTCTAATGGCTACATGAGTAGCCATGTCTATGGATCTATGGAACAAGACTGTTCTATGAATTA CAACAACGTAGGTGGAGGATGGGCAAACATGGATCATCATTACTCATCTGCACCTTACAACTTCTTCGATAGA GCAAAGCCTCTGTTTGGTCTAGAAGGTCATCAAGAAGAAGAAGAATGTGGTGGCGATGCTTATCTGGAACA GACGTACGCTTCCTCTCTTCCCTATGCACGGTGAAGATCACATCAACGGTGGTAGTGGTGCCATCTGGAAGTA GGCCAATCGGAAGTTCGCCCTTGCGCTTCTCTTGAGCTACGTCTGAACTAGCTCTTACGCCGGTGTCGCTCGG GATTAAAGCTCT TTCCTCTCTCTCTCTCT TTCGTACTCGTATGTTCACAACTATGCTTCGCTAGTGATTAATGA GCAGTTGTTATATTAGTAGTTAACTAGTTATCTCTCGTTATGTGTAATTTGTAATTACTAGCTAAGTATCGTCTA GGTTTTAATTGTAATTGACAACCGTTTTATCTCTATGATGAATAAGTTAAAATTTTA
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a free trial.algún marco abierto de lectur Lo primero que vamos a hacer esUnlock tratarfulldeaccess ver with si contiene Reading Frame – ORF), es decir, si contiene un conjunto de codones que son capaces de tr Download Trial a proteína. Para ello vamos a utilizar la utilidad With que se encuentra en el NCBI ORFFree Finder clic en el vínculo correspondiente a esa utilidad, que se encuentra en la etiqueta “ Tools” de l “Sequence analysis ” y entramos en la página correspondiente a la búsqueda de ORF’s.
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La nueva página permite introducir el identificador de una de las secuencias ya contenida BD, o analizar una secuencia problema. Esto último es lo que vamos a hacer nosotros. En el grande en blanco vamos a introducir la secuencia problema en formato FASA.
El programa da como resultado los posibles ORF’s, tanto para la hebra plus (+) como para l minus (-), mostrando 3 posibilidades para cada una de las hebras. De todos los ORF’s que apar You're Reading a Preview cada una de las 3 pautas de lectura de las hebras plus (+) y minus (-). Empezaremos por inves mayor de todos (en este caso 879 nucleótidos). En la figura siguiente está recuadrado en rojo Unlock full access with a free trial. cado con una �echa. Pinchamos sobre él, y aparecerá una nueva pantalla con el ORF seleccion aislado y con su traducción a proteína. Download With Free Trial
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26 Manual de prácticas de Bioinformática
>unnamed_protein_product_1
MEPPQHQHHHHQADQESGNNNNNKSGSGGYTCRQTSTRWTPTTEQIKILKELYYNNAIRSPTADQIQKITARL QFGKIEGKNVFYWFQNHKARERQKKRFNGTNMTTPSSSPNSVMMAANDHYHPLLHHHHGVPMQRPANSVNVKL NQDHHLYHHNKPYPSFNNGNLNHASSGTECGVVNASNGYMSSHVYGSMEQDCSMNYNNVGGGWANMDHHY SAPYNFFDRAKPLFGLEGHQEEEECGGDAYLEHRRTLPLFPMHGEDHINGGSGAIWKYGQSEVRPCASLELRLN
Esta secuencia será objeto de estudio en la próxima práctica para ilustrar el uso de la herr BLAS. No obstante, en este punto de la práctica, el alumno deberá analizar la secuencia de problema mostrado a continuación e indicar en formato FASA cuál sería su secuencia prot dicha más probable. >cDNA_problema_2
ACATACATACATACATTTGTAGAGTTGTTGTTGTTTTATGATGGAACATCAACACAACATAGAAGATGGTGGTAAAA ATAGTAACAACAGTTTCCTGTGCAGGCAAAGTAGTAGCCGTTGGACGCCAACGAGCGATCAGATAAGAATATTGA AGGATCTCTACTACAACAATGGAGTTAGGTCTCCAACTGCTGAACAGATTCAGAGGATATCTGCTAAGTTGAGA CAGTACGGTAAGATTGAAGGCAAAAATGTGTTTTATTGGTTTCAGAACCATAAAGCTCGTGAAAGACAAAAGAAGA GGCTCATTGCTGCTGCCTCTGCCACTGATAATAATAATATCTCTTCCATGCAAATGATTCCACATCTTTGGAGATCTCCT GATGATCACCACAAGTACAACACTACTACTACTAATCCAGGTGTTCAGTGTCCATCACCATCTTCACATGGGGTATTAC CAGTGGTACAGACTGGAAACTATGGTTATGGAACTTTGGCTATGGAGAAGAGCTT TAGGGAGTGTTCAATATCAC You're Reading a Preview CACCAGGTGGTAGTTATCATCAAAATTTGACATGGGTTGGTGTTGATCCTTACAACAATATGAGTACTACTTCTCCA Unlock full access with a free trial. CAACTTACCCTTTTCTTGAAAAAAGCAACAACAAACACTATGAAGAAACCCTAGATGAAGAGCAAGAAGAAGAAA ATTACCAAAGGGGTAACTCTGCTTTAGAAACTCTGTCACTTTTCCCCATGCATGAAGAGAACATCATCTCAAATTTC Download With Free Trial GCATCAAACATCATGAATCTTCTGGAGGATGGTACCATTCTGATAATAACAATTTGGCTGCTCTTGAACTTACTCTCA ACTCT TTCCCCTAAATTATGAACTAGTCTATCTTATGTTTGTAGTAAGTAAGTACTAATCTAATTTGGTATGTGCCAAG TATTTGGACCTTATGGTAATGTTAATTAATCTTAATCTAAGTTGTACTAATATTATTAATTAAAGTATGGATAAGTTTATT
. d e v r e s e
Mapas de restricción Sign up tonucleotídica vote on this titlede los sitios Un mapa de restricción es la ubicación dentro de una secuencia Useful Notcortes useful para varios para diferentes enzimas. Generalmente, queremos conocer estos lugares de relacionados con la tecnología del DNA recombinante. Para realizar este tipo de análisis de re se utilizan herramientas bioinformáticas, las cuales localizan en la secuencia nucleotídica la
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remap
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/remap
Durante el desarrollo de esta práctica, utilizaremos la herramienta Webcutter 2.0 para la de dianas de restricción.
Webcutter 2.0 http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
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28 Manual de prácticas de Bioinformática
En la sección “Please select the type of analysis you would like ” indicaremos que se trat secuencia linear; mientras que en la sección “ Please indicate how you would like the restric displayed ” indicaremos que nos muestre el mapa de restricción y la lista de los sitios de re ordenados secuencialmente por número de base, tal y como se muestra en la siguiente figur
En la sección “Please indicate which enzymes to include in the display”, indicaremos qu enzimas queremos que aparezcan en la página de resultados, en nuestro caso “ All enzymes mente, seleccionaremos que tipo de enzimas queremos incluir en el análisis dentro de la sección indicate which enzymes to include in the analysis ”. En este caso utilizaremos sólo aquellas enzim dianas de restricción sean igual o mayor de 6 bases. Finalmente haremos clic en “ Analyze se You're Reading a Preview Unlock full access with a free trial.
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30 Manual de prácticas de Bioinformática
En segundo lugar podemos encontrar la tabla donde se indican los sitios de restricción or secuencialmente por número de base, como se muestra en la siguiente figura.
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Por último, antes de terminar esta práctica, el alumno deberá buscar las dianas de restric la secuencia nucleotídica problema que se muestra a continuación. Para ello utilizará sólo a enzimas cuyas dianas de restricción sean igual o mayor de 8 bases.
>Secuencia_problema
GAAAAGAAAAGTGAACAATACACTGTTTTTTACTAATTATTTTTTAGAAAAAGAAAAAAGGAATATTGTGTGTT TGCTT TT TT TTCTGACTAGTAGTATTGCTAACTATGTATTCCATTAAGGATTTGCTGTGAAAAAGCCTGATA CAGTAAGCATAAAACTCGGGAGATCACTTACACACACACACCCTCGTAAAAAAGAGAAGAGAGATTTACTGTTAAACAGAGGTT TT TT TCCATT TCTTT TT TT TT TCTCAGTGTGTGTGAGAGAGAGAGATGGTTTTCAT GGCAAAAACAAATAGAAAGGAACAAAATTTAGAGTGAAGAAGAAAGTGTGTGAGAGAATAATGGAGGGTGGTTCTAGTGGAAATACTAGTACATCTTGTTTAATGATGATGGGATATGGAGATCATGAGAACAACAACAACAACAATGGAAATGGTAATGGAAATGGAAATGGAAATGTAACAATTTGTGCTCCTCCAATGATGATGATGATGCCTCCTCCTCCTCCTTCTTTAACTAACAATAACAATGCAGAAACAAGCAGCAACAACATCCTTTTTCTTCCT CATGGACAACAACAACAATAATCCTCAAGAAGACAACAACTCT TCTTCTTCT TCCATCAAGTCAAAGATTA GGCTCATCCTCACTACCATCGTCTCTTGACTGCTTATCTCAATTGTCAAAAGATAGGAGCTCCGCCAGAAGTGGTGGCAAGGCTAGAGGAAATATGTGCCACGTCAGCAACAATGGGCCGTAGCAGTAGTAGTAGTGGTGGTGGAATCATTGGAGAAGATCCTGCACTAGATCAGTTCATGGAGGCTTATTGTGAGATGCTGACAAAATATGAACAAGAACTCTCAAAACCCTTCAAGGAAGCCATGGTTTTTCT TTCAAGAATTGAGTGTCAGTTCAAAGCTTTAACTCTTGCACCTAATTCTTCTCATGAATCTGCTTTGGGCGAGGCAATGGATAGAAATGGATCATCTGATGAAGAGGTTGACGTGAATAACAGTTTCATCGACCCCCAGGCTGAGGATAGAGAGCTCAAAGGTCAATTGTTGCGTAAGTACAGCGGTTACTTGGGAAGCCTTAAGCAGGAGTTCATGAAGAAGAGGAAGAAAGGCAAGCTGCCTAAGGAAYou're Reading a Preview GCAAGGCAACAATTGGTGGATTGGTGGCTTAGACATATTAAATGGCCATATCCATCGGAATCTCAGAAGCTTGUnlock full access with a free trial. CACTAGCTGAATCAACGGGATTGGACCAGAAGCAAATAAACAACTGGTTTATCAATCAAAGAAAGAGGCATTGGAAACCATCAGAAGATATGCAGTTTGTTGTGATGGATGCTGCTCATCCACATTACTATATGGATAATGTTCTTDownload With Free Trial GCTAACCATTTCCCAATGGATATGACACCCTCTCTCCTCTGAATTAAGATTTGTCATTATTAGTATCAAGGATGTTTAATTAATTTGCATATTACTTGTGTGCATGTAGTAGTACAAGGTATTGTGACACAATCAACTTTTTATTAGACCAAATATATAAAGTGCTTGTAATAGATCTTTCTATTATCATCTTTAATTATAGAATTAAATAGTT TGTACTTGCTAAAAATTTTGAAAAATAA
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Práctica 3: BLAST, una herramienta de análisis de secuenc
BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ) es un programa informático de alineamiento de
cias, ya sea de ADN o de proteínas, que puede comparar una secuencia problema con otra se o con todas las secuencias que se encuentren en una base de datos (como por ejemplo la base d de Refseq que contiene una colección de secuencias de proteínas no redundantes y bien an encontrando las secuencias de la base de datos que tienen mayor parecido a la secuencia prob BLAST fue creado y es mantenido por el NIH ( National Institutes of Health ) a través de (National Center for Biotechnology Information , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) siendo de d público y de uso gratuito. La ventaja de utilizar BLAST a través del formulario que provee el N que el usuario no tiene que mantener al día las bases de datos y además la búsqueda se reali rápidamente. BLAST utiliza el algoritmo Smith-Waterman que se basa en el uso de programación dinám garantizar que el alineamiento local encontrado es óptimo con respecto a un determinado sis puntuación como las matrices tipo BLOSUM o PAM. aUna matriz de este tipo contiene la pun You're Reading Preview (score) que se le da al alinear un nucleótido o un aminoácido de la posición X de la secuencia full access with a free otro aminoácido de la posición Y de laUnlock secuencia B. El uso detrial. este tipo de matrices permite a dar una puntuación a los alineamientos que realiza. Además, BLAST utiliza un algoritmo he DownloadloWith Trial un parámetro con el que valo para calcular la significación de los resultados, que Free nos dará resultados que se han obtenido tras la búsqueda. Durante esta práctica se utilizará el programa BLAST para analizar tanto secuencias de AD de aminoácidos. Durante su transcurso, aprenderemos a extraer, de forma estructurada y e información necesaria de las diferentes bases de datos moleculares. De este modo, el objetivo p de esta práctica es:
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Adquirir habilidades y destrezas en el análisis de secuencias de ADN y proteínas.
Accediendo a las secuencias
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El identificador “HO850244.1 ” corresponde a una secuencia de un EST (Expressed Seque o cDNA anónimos) de Arabidopsis thaliana similar al gen que codifica la adenosine kinase 1 muestra la secuencia en formato “ EST ”, el cual indica la siguiente información: CAMPO dbEST Id:
71461818
EST name: GenBank Acc: GenBank gi:
AT74 HO850244 309381023
CLONE INFO Clone Id: DNA type:
AT74 cDNA
PRIMERS . d e v r e s e
Sequencing: M13 Forward, RV-M Reversed PolyA Tail: no
DESCRIPCIÓN
You're Reading a Preview Unlock full access with a freeIdenti�cador trial.
y nombre de la secuencia e de datos de EST y GenBank
Download With Free Trial Identi�cador del clon a partir del cual esta secuencia y tipo de ADN con el que nerado dicho clon
Cebadores utilizados para obtener la secu Sign up to vote on this title interés. Información sobre si la secuencia Useful Not useful o no cola de poliA
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
CAMPO
PUTATIVE ID Assigned by submitter adenosine kinase 1
DESCRIPCIÓN
Función putativa y origen de esta asigna función
LIBRARY
Lib Name: LIBEST_026723 Arabidopsis vitri�cation solution treatment Library Organism: Arabidopsis thaliana Ecotype: Col-0 Tissue type: Seedlings Develop. stage: 2d and 3d Lab host: E. coli DH5-alpha Vector: pMD18-T simple vector R. Site 1: EcoRI Descripción de la genoteca: nombre, org Description: 2 & 3-day Arabidopsis thaliana seedlings were immerecotipo y protocolo utilizado para obtener sed in loading solution (MS liquid medium+2 M glycerol+0.4 M suteca a partir de la cual se ha obtenido la se crose) for 20 minutes at room temperature. Loading solution was removed from the cryovial and rapidly replaced by �ltered sterilized cryoprotective solution PVS2 (30% w/v glycerol, 15% w/v ethylene glycol and 15% w/v DMSO in liquid MS medium supplemented with You're Reading a Preview 0.4 M sucrose) and left at 0degC for 50 minutes. cDNA library was derived from these seedlings. cDNA synthesis was full initiated Unlock accessusing with a free trial. a oligo(dT) primer. Double-stranded cDNA was blunted, digested with EcoRI and MseI restriction endonuclease, ligated to EcoRI and Download With Free Trial MseI adaptors, using cDNA-AFLP to screen the different expression gene, and cloned into the pMD18-T simple vector.
SUBMITTER
. d e v r e s e
Name: Ren Li Lab: Ornamental Plant Germplasm Laboratory Institution: School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University Address: NO.800, Dong Chuan Rd., Shanghai, P. R. China Tel: +86 21 34205731
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Datos de contacto del investigador que ha useful Useful Not sitado la secuencia en la base de datos de NCBI
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36 Manual de prácticas de Bioinformática
NCBI permite visualizar la información sobre una secuencia (recuadro rojo). En la práctica (Práctica 2: Bases de datos biológicas) examinamos el formato FASA, válido tanto para se de nucleótidos como de aminoácidos, el cual nos proporciona las secuencias en un formato u en distintos programas bioinformáticos. A continuación seleccionaremos la pestaña “ Genbank ” y nos detendremos en describir de información recoge cada uno de los epígrafes de este formato.
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CAMPO Download With Free Trial
DESCRIPCIÓN
Identi�cador, longitud, tipo d lécula, división a la que perten secuencia y fecha de la última cación
LOCUS HO850244, 165 bp, mRNA, linear, EST 20-OCT-2010
DEFINITION secuenc AT74 Arabidopsis vitri�cation solution treatment library Arabidopsis thaBreve descripción de la Sign up to vote on this title liana cDNA clone AT74 similar to adenosine kinase 1, mRNA sequence. . d e v r e s e
ACCESSION
HO850244
Useful
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Identi�cador único de entrada, n aunque se modi�que la secuenc
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
CAMPO SOURCE Arabidopsis thaliana (thale cress) ORGANISM Arabidopsis thaliana Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; malvids; Brassicales; Brassicaceae; Camelineae; Arabidopsis
Nombre cientí�co del organismo
REFERENCE 1 (bases 1 to 165) AUTHORS Ren,L., Zhang,D. and Shen,X.H. TITLE Comparative cDNA-AFLP analysis reveals transcriptional pro�ling of 2 & 3-day Arabidopsis thaliana seedlings in response to vitri�cation solution treatment of cryopreservation JOURNAL Unpublished (2010)
Datos sobre como citar esta secu Nombre del artículo, autores, fec publicación, revista, etc.
COMMENT Contact: Ren Li. Ornamental Plant Germplasm Laboratory School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University NO.800, D ong Chuan Rd., Shanghai, P. R. China Tel: +86 21 34205731 Fax: +86 21 34205736 Email:
[email protected] The sequence was obtained from samples subjected to vitri�cation solution treatment of cryopreservation Seq primer: M13 Forward, RV-M Reversed POLYA=No You're Reading a Preview FEATURES
. d e v r e s e
DESCRIPCIÓN
Comentarios y observaciones so secuencia
Location/Quali�ers Unlock full access with a free trial. Source 1..165 /organism=”Arabidopsis thaliana”/mol_type=”mRNA”/ ecotype=”Col-0”/db_xref=”taxon:3702”/clone=”AT74”/ tissue_ type=”Seedlings” /dev_stage=”2d and 3d”/lab_host=”E. coli DH5-alpha” / Download With Free Trial clone_lib=”LIBEST_026723 Arabidopsis vitri�cation solution treatment library”/note=”Vector: pMD18-T simple vector; Site_1: EcoRI; 2 & 3-day Arabidopsis thaliana seedlings were immersed in loading solution (MS liquid medium+2 M glycerol+0.4 M sucrose) for 20 minutes at room temperatuCaracterísticas: contiene la inform re. Loading solution was removed from the cryovial and rapidly replaced biológica de la secuencia by �ltered sterilized cryoprotective solution PVS2 (30% w/v glycerol, 15% w/v ethylene glycol and 15% w/v DMSO in liquid MS medium supplemented with 0.4 M sucrose) and left at 0degC for 5 0 minutes. cDNA library was derived from these seedlings. cDNA synthesis was initiated usingSign a up to vote on this title oligo(dT) primer. Double-stranded cDNA was blunted, digested with Eco- Useful Not useful RI and MseI restriction endonuclease, ligated to EcoRI and MseI adaptors, using cDNA-AFLP to screen the different expression gene, and cloned into the pMD18-T simple vector.”
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38 Manual de prácticas de Bioinformática
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Existen distintos tipos de programas BLAST para el análisis de secuencias tanto de nu (blastn, tblastx , tblastn) como de proteínas ( blastp, blastx ). Para saber cuál utilizar es fund Download With Free Trial tener en cuenta 3 factores: (1) la naturaleza de la secuencia problema, (2) el objetivo de la bú (3) la base de datos donde se va a llevar a cabo la búsqueda. La siguiente tabla muestra las d versiones del programa BLAST: En nuestro caso utilizaremos blastn ( nucleotide blast , �echa roja). Sign up to vote on this title . d e v r e s e
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
Entre los posibles algoritmos que pueden ser utilizados para analizar la secuencia probl algoritmo “megablast ” es el más restrictivo entre los tres posibles, debido a que está diseñad You're Reading a identificar la propia secuencia problema (el parecido esPreview del 100%) o para encontrar secuenci parecidas (mayor del 95% de residuos nucleotídicos idénticos). En cuanto al algoritmo “ discon Unlock full access with a free trial. megablast ”, es más sensible y eficaz que el algoritmo “ blastn” porque ignora algunas bases (la de cada codón) y porque al comparar la secuencia problema con la diana no es necesario que Download With Free Trial sean idénticas, sino que permite la presencia de discontinuidades. En este caso utilizaremos el algoritmo “ megablast ”. Finalmente para ejecutar la búsqueda s naremos “Show results in a new window ” y haremos clic en el botón “ BLAST ”.
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40 Manual de prácticas de Bioinformática
La sección “ Descriptions ” muestra la lista de resultados en el siguiente formato: You're Reading a Preview Description: el nombre del resultado. Max Score: la puntuación máxima de alineamiento. Unlock full access with a free trial. Total Score: otra puntuación de alineamiento, puede diferir de Max Score si la consulta con un único registro de la base de datos en múltiples regiones. Download With Free Trial Query Coverage: qué porcentaje de la consulta tiene similitud con el resultado den base de datos. E-value: es probablemente la mejor medida de calidad del resultado. Los números m significan más hits, siendo 0.0 el mejor valor posible. Accession: identificador del resultado dentro del NCBI.
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
Las barras verticales representan emparejamientos entre la secuencia que usamos para la bú (Query ) y las secuencias de la base de datos ( Sbjct ), los espacios que no tienen barra vertical s que en ambas secuencias hay diferentes nucleótidos, mientras que las líneas horizontales son o gaps (en el ejemplo que se muestra no existe ningún gap), que deja BLAST para realizar m alineamiento. Reading a Preview En el ejemplo que se representa, la You're secuencia con identificador “ BT033101.1 ” es el resulta probable del análisis blastn. Si accedemos a la página que contiene dicha secuencia podremos o Unlock full access with a free trial. la información que recoge el NCBI sobre esta secuencia en formato “ GenBank”. Entre esta infor podemos distinguir los campos anteriormente descritos. Entre ellos, dado que se trata de una se Download With Free Trial de tipo CDS (CoDing Sequence ), merece la pena reseñar la información que recoge el campo TURES”, donde además de información biológica relevante podemos encontrar la secuencia p que codifica dicho CDS (recuadro rojo), cuyo número de identificación es “ ACF16163.1” (in con una �echa roja).
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42 Manual de prácticas de Bioinformática
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Juan Capel Salinas y Fernando Juan Yuste Lis
Como tarea a realizar, utilizando los conocimientos adquiridos, en esta parte de la prá alumno debe realizar las siguientes tareas: BF113600.1
Búsqueda BLAST de secuencias proteicas En la práctica anterior (Práctica 2: Bases de datos biológicas), se utilizó la herramienta ORF del NCBI para predecir la secuencia proteica codificada por una secuencia nucleotídica prob continuación se muestra dicha secuencia predicha en formato FASA: >unnamed_protein_product_1
You're Reading a Preview MEPPQHQHHHHQADQESGNNNNNKSGSGGYTCRQTSTRWTPTTEQIKILKELYYNNAIRSPTADQIQKITARLRQFGKIEGKNVFYWFQNHKARERQKKRFNGTNMTTPSSSPNSVMMAANDHYHPLLHHHHGVPMQRPANSVN Unlock full access with a free trial. VKLNQDHHLYHHNKPYPSFNNGNLNHASSGTECGVVNASNGYMSSHVYGSMEQDCSMNYNNVGGGWANMDHHYSSAPYNFFDRAKPLFGLEGHQEEEECGGDAYLEHRRTLPLFPMHGEDHINGGSGAIWKYGQSEVRPCASLELRLN Download With Free Trial
En esta práctica vamos a buscar si esta proteína problema presenta alguna relación co secuencias depositadas en la base datos; es decir, tratar de deducir en la medida de lo posibl comparación, la familia de proteínas a la que pertenece y su posible función.
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44 Manual de prácticas de Bioinformática
Copiamos la secuencia de la proteína problema en la ventana en blanco, y seleccionam base de datos de proteínas contra la que comparar (i.e. buscar secuencias similares - homólog nuestra). Las posibles bases de datos frente a las que comparar la secuencia proteica están mar el recuadro rojo. En este caso escogeremos la base de datos Refseq de proteínas. Dicha base tiene la ventaja de que se trata de una colección exhaustiva de secuencias de proteínas no redu y bien anotadas. No obstante, podríamos haber utilizado otra distinta como Swiss-Prot, cuya rística principal es que las proteínas que se encuentran almacenadas en esta base de datos p un alto nivel de anotación. Esto significa que se conoce la estructura tridimensional, la fun modificaciones post-traduccionales, variantes, etc. Entre los posibles algoritmos que pueden ser utilizados para analizar la secuencia problema remos el algoritmo “ blastp” que es el que compara secuencias proteicas. En último lugar para la búsqueda seleccionaremos “ Show results in a new window ” y haremos clic en el botón “
You're Reading a Preview Con ello se iniciará el proceso de búsqueda de secuencias similares a la nuestra. Durante el de búsqueda de secuencias nos aparecen unas pantallas que nos indican de qué tipo de pro Unlock full access with a free trial. trata nuestra proteína problema. Una de esas pantallas tiene el siguiente aspecto: Download With Free Trial
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Como se puede ver, se ha detectado un dominio proteico denominado “ homeodomain”. S mos en el esquema que muestra el dominio de “ homeodomain” podremos obtener informaci
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