PEMERIKSAAN WIDAL
TUJUAN
- Untuk Untuk dapat dapat menget mengetahu ahuii adanya adanya antibo antibodi di spesifi spesifik k dalam dalam serum serum pasien pasien terhadap antigen Salmonella sp. - Untuk membantu membantu menegakkan diagnosa diagnosa demam typhosa. typhosa.
METODE
Metode yang dipakai pada pemeriksaan ini adalah slide aglutinasi dan tabung aglutinasi.
PRINSIP
Prinsi Prinsip p uji Widal Widal adalah adalah reaksi reaksi agluti aglutinas nasii antara antara antibo antibodi di agluti aglutinin nin dalam dalam serum serum pender penderita ita yang yang telah telah mengal mengalami ami pengen pengencera ceran n berbed berbeda-b a-beda eda terhada terhadap p antigen somatik (O) dan flagela (H) dari bakteri Salmonella sp. dalam reagen yang ditam ditamba bahk hkan an dala dalam m juml jumlah ah yang yang sama. sama. Peng Pengen encer ceran an terti terting nggi gi yang yang masih masih menimbulkan aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam serum.
DASAR TEORI
Dema Demam m typh typhoi oid d (Typ (Typho hoid id Feve Fever) r) meru merupa paka kan n suatu suatu peny penyak akit it infe infeks ksii sistemik yang disebabkan oleh Salmonella typhi maupun Salmonella paratyphi A,B dan C yang masih dijumpai secara luas di negara berkembang yang terutama terletak di daerah tropis dan subtropics (Musyaffa, 2010). Petanda Serologi Serologi Demam Typhoid Typhoid
Tubuh Tubuh yang yang kemasu kemasukan kan Salmon Salmonell ellaa akan akan terang terangsang sang untuk untuk memben membentuk tuk antib tibodi
yang
bersif sifat
spesif sifik
terhadap
antigen
yang
merang angsang
pembentukannya. Antibodi yang dibentuk merupakan petanda demam typhoid, yang dapat dikategorikan sebagai berikut (Musyaffa, 2010): 1. Aglu Agluti tini nin n O (Som (Somat atik ik)) Titer aglutinin O akan naik lebih dulu dan lebih cepat hilang daripada aglutinin H atau Vi, karena pembentukannya T independent sehingga dapat merang merangsan sang g limfosi limfositt B untuk untuk mengek mengekskr skresik esikan an antibo antibodi di tanpa tanpa melalu melaluii
limfosit T. Titer aglutinin O ini lebih bermanfaat dalam diagnosa dibandingkan titer aglutinin H. Bila bereaksi dengan antigen spesifik akan terbentuk endapan seperti pasir. Titer aglutinin O 1/160 dinyatakan positif demam typhoid dengan catatan 8 bulan terakhir tidak mendapat vaksinasi atau sembuh dari demam typhoid dan untuk yang tidak pernah terkena 1/80 merupakan positif. 2. Aglutinin H (flageller) Titer aglutinin ini lebih lambat naik karena dalam pembentukan memerlukan rangsangan limfosit T. Titer aglutinin 1/80 keatas mempunyai nilai diagnostik yang baik dalam menentukan demam typhoid. Kenaikan titer aglutinin empat kali dalam jangka 5-7 hari berguna untuk menentukan demam typhoid. Bila bereaksi dengan antigen spesifik akan terbentuk endapan seperti kapas atau awan. 3. Aglutinin Vi (Envelop) Antigen Vi tidak digunakan untuk menunjang diagnosis demam thypoid. Aglutinin Vi digunakan untuk mendeteksi adanya carrier. Antigen ini menghalangi reaksi aglutinasi anti-O antibodi dengan antigen somatik. Selain itu antigen Vi dapat untuk menentukan atau menemukan penderita yang terinfeksi oleh Salmonella typhi atau kuman-kuman yang identik antigennya. Salah satu pemeriksaan yang bertujuan untuk menegakan diagnosa demam typhoid adalah pemeriksaan widal. Widal atau uji widal adalah prosedur uji serologi untuk mendeteksi bakteri Salmonella enterica yang mengakibatkan penyakit th y poid. Pemeriksaan widal ditujukan untuk mendeteksi adanya antibodi (di dalam darah) terhadap antigen kuman Samonella typhi / paratyphi (reagen). Uji ini merupakan test kuno yang masih amat popular dan paling sering diminati terutama di negara dimana penyakit ini endemis seperti di Indonesia. Sebagai uji cepat (rapid test) hasilnya dapat segera diketahui. Hasil positif dinyatakan dengan adanya aglutinasi. Karena itu antibodi jenis ini dikenal sebagai Febrile agglutinin. Untuk menentukan seseorang menderita demam typhoid atau bukan, tetap harus didasarkan atas gejala-gejala yang sesuai dengan penyakit tifus. Uji widal hanya
dapat dikatakan sebagai penunjang diagnose jika seseorang tanpa gejala dengan uji widal positif, tidak dapat dikatakan menderita tifus (Wiki,Tt). Teknik pemeriksaan uji widal dapat dilakukan dengan dua metode yaitu uji hapusan/ peluncuran ( slide test ) dan uji tabung (tube test ). Perbedaannya, uji tabung membutuhkan waktu inkubasi semalam karena membutuhkan teknik yang lebih rumit dan uji widal slide hanya membutuhkan waktu inkubasi 1 menit saja yang biasanya digunakan dalam prosedur penapisan (srenning). Umumnya sekarang lebih banyak digunakan uji widal slide. Sensitivitas dan spesifitas tes ini amat dipengaruhi oleh jenis antigen yang digunakan (Risnawati,2012). Teknik slide test biasanya hanya digunakan untuk skrining (deteksi dini) dan dapat digunakan untuk menentukan kehadiran dari antibodi homolog, jika antibodi muncul di serum kemudian test tabung digunakan untuk menentukan titer antibodi tersebut (Kit alat). Antigen yang digunakan dalam reagen pada tes widal ini berasal dari suspense Salmonella yang sudah dimatikan dan diolah dalam laboratorium. Dengan jalan mengencerkan serum, maka kadar anti dapat ditentukan. Pengenceran tertinggi yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam serum. (Wiki,Tt) Pada pemeriksaan uji widal dikenal beberapa antigen yang dipakai sebagai parameter penilaian hasil uji widal. Berikut ini penjelasan macam antigen tersebut (Risnawati,2012): •
Antigen O Antigen O merupakan somatik yang terletak di lapisan luar tubuh kuman.
Struktur kimianya terdiri dari lipopolisakarida. Antigen ini tahan terhadap pemanasan 100°C selama 2–5 jam, alkohol dan asam yang encer. Antigen O atau antigen somatik akan membentuk aglutinasi dengan serum yang mengandung antibodi yang ditunjukan dengan adanya gumpalan berpasir, antigen yang terdapat antigen O terutama IgM. •
Antigen H Antigen H merupakan antigen yang terletak di flagela, fimbriae atau fili S.
typhi dan berstruktur kimia protein. Antigen ini tidak aktif pada pemanasan di atas suhu 60°C dan pada pemberian alkohol atau asam. Antigen ini mengandung
beberapa unsur imunologik, dalam satu spesies Salmonella antigen flagel dapat ditemukan dalam fase 1 dan 2, ini dinamakan variasi fase antibodi terdapat antigen H terutama Ig C. •
Antigen Vi Antigen Vi terletak di lapisan terluar S. typhi (kapsul) yang melindungi kuman
dari fagositosis dengan struktur kimia glikolipid, akan rusak bila dipanaskan selama 1 jam pada suhu 60°C, dengan pemberian asam dan fenol. Antigen ini digunakan untuk mengetahui adanya karier. •
Outer Membrane Protein (OMP) Antigen OMP S typhi merupakan bagian dinding sel yang terletak di luar
membran sitoplasma dan lapisan peptidoglikan yang membatasi sel terhadap lingkungan sekitarnya. OMP ini terdiri dari 2 bagian yaitu protein porin dan protein nonporin. Porin merupakan komponen utama OMP, terdiri atas protein OMP C, OMP D, OMP F dan merupakan saluran hidrofilik yang berfungsi untuk difusi solut dengan BM < 6000. Sifatnya resisten terhadap proteolisis dan denaturasi pada suhu 85–100°C. Protein nonporin terdiri atas protein OMP A, protein a dan lipoprotein, bersifat sensitif terhadap protease, tetapi fungsinya masih belum diketahui dengan jelas. Beberapa peneliti menemukan antigen OMP S typhi yang sangat spesifik yaitu antigen protein 50 kDa/52 kDa.
Beberapa keterbatasan uji Widal ini adalah (Rudy, 2009): 1) Negatif Palsu
Pemberian antibiotika yang dilakukan sebelumnya (ini kejadian paling sering di negara kita, demam –> kasih antibiotika –> nggak sembuh dalam 5 hari –> tes Widal) menghalangi respon antibodi. Padahal sebenarnya bisa positif jika dilakukan kultur darah. 2) Positif Palsu •
Beberapa jenis serotipe Salmonella lainnya (misalnya S. paratyphi A, B, C) memiliki antigen O dan H juga, sehingga menimbulkan reaksi silang dengan
jenis
bakteri
lainnya
( Enterobacteriaceae
sp),
dan
bisa
menimbulkan hasil positif palsu (false positive). Padahal sebenarnya yang positif kuman non S. typhi (bukan typhoid).
•
Beberapa penyakit lainnya : malaria, tetanus, sirosis, dll.
•
Pernah mendapatkan vaksinasi, reaksi anamnestik (pernah sakit), dan adanya faktor rheumatoid (RF).
ALAT DAN BAHAN a. ALAT
Test Slide Aglutinasi
1. Objek glass/ slide berwarna putih 2. Stik pengaduk 3. Mikropipet 4. Yellow tip 5. Pensil lilin 6. Rotator
Test Tabung Aglutinasi
1.
Tabung reaksi
2.
Pipet volume 1 mL
3.
Pipet ukur
4.
Rak tabung reaksi
5.
Mikropipet 100 mikron
6.
Waterbath
7.
Label
b. BAHAN
1. Sampel Serum 2. Reagen Febrile-Antigen −
Salmonella “O” Group A
−
Salmonella “O” Group B
−
Salmonella “O” Group C
−
Salmonella “O” Group D (Typhoid O)
−
Salmonella “H” a
−
Salmonella “H” b
−
Salmonella “H” c
−
Salmonella “H” d (Typhoid H)
3. Kontrol serum positif dan negatif 4.
Larutan NaCl 0,9%
CARA KERJA
A. Slide test/ testlide aglutinasi 1.
Objek glass yang bersih disiapkan dan dibagi menjadi 1,5 inch dengan pensil lilin. Atau dapat digunakan slide khusus berwarna putih.
2.
Serum ditambahkan dengan mikropipet secara berurutan dari kiri ke kanan sebanyak : 0,08 ml, 0,04ml, 0,02ml, 0,01ml, 0,005ml. Serum harus bersih dan tidak panas. Prosedur ini diulangi dengan control sera positif dan negatif.
3.
Reagen (suspensi antigen) dihomogenkan perlahan.
4.
Suspense antigen diteteskan sebanyak 1 tetes di atas masing - masing serum tersebut.
5.
Serum dan antigen dicampurkan dengan baik menggunakan stik pengaduk. Stik yang digunakan boleh terpisah untuk masing-masing serum atau dapat digunakan stik yang sama dan diproses dari kanan ke kiri. Area masing – masing campuran dibentuk kurang lebih ½ sampai 1 inch.
6.
Slide diputar dengan menggunakan tangan atau dengan menggunakan mesin dengan kecepatan 150 rpm selama 2-3 menit.
7.
Aglutinasi yang terjadi diamati di tempat yang terang dengan latar belakang gelap.
8.
Hasil positif akan diketahui titernya, sedangkan hasil negative digunakan sebagai kontrol.
INTERPRETASI HASIL Tingkatan aglutinasi 4+
100% terbentuk aglutinasi
3+
75 % terbentuk aglutinasi
2+
50% terbentuk aglutinasi
1+
25% terbentuk aglutinasi
+
> 25 % terbentuk aglutinasi
-
Tidak ada aglutinasi yang terbentuk
Walaupun test slide tidak direkomendasikan untuk menentukan titer, namun jumlah serum yang memberikan hasil 60% aglutinasi kira-kira dapat digunakan untuk menentukan titer dari serum. Penurunan jumlah serum pada slide test kirakira sebanding dengan pengenceran pada test tabung, seperti dibawah ini :
Volume serum
Pengenceran pada test tabung
0,08 mL
1:20
0,04 mL
1:40
0,02 mL
1:80
0,01 mL
1:160
0,005 mL
1:320
B. Tube test/ tes tabung aglutinasi 1. 10 tabung yang berukuran 12 x 75 mm ditempatkan pada rak yang sesuai. 2.
1,9 ml larutan NaCl 0,9 % ditambahkan ke dalam tabung pertama.
3.
1,0 ml larutan NaCl 0,9% ditambahkan ke dalam sisa tabung.
4.
0,1 ml serum yang akan ditest ditambahkan pada tabung pertama dan dihomogenkan. Lalu dipindahkan 1,0 ml serum yang telah diencerkan dari tabung pertama ke tabung kedua. Prosedur ini diulangi sampai sepuluh tabung mengandung pengenceran serum kelipatan dua dari 1:20 sampai 1:10.240. 1,0 mL serum yang diencerkan dari tabung no 10 dibuang. Tabung no 1 dianggap pengenceran 1:20. Prosedur ini diulangi dengan kontrol sera positif dan negatif.
5.
Satu tabung ditempatkan pada akhir dari deretan tabung pengenceran dan ditambahkan 1,0 ml larutan NaCl 0,9% untuk mengencerkan serum. Kemudian diberi label pada tabung untuk “ saline control”
6.
Suspensi antigen dihomogenkan dengan mengocok botolnya secara perlahan. Satu tetes antigen diteteskan pada masing – masing tabung.
7.
Rak dikocok untuk mencampur antigen dan serum dan ditempatkan pada waterbath. Waktu dan suhu inkubasi yang disarankan adalah sebagai berikut:
Antigen
Suhu
Salmonella “O” Group A
0
Waktu inkubasi 0
18 jam
Salmonella “O” Group B
45 - 50 C 450 - 500 C
18 jam
Salmonella “O” Group C
450 - 500 C
18 jam
Salmonella “O” Group D (Typhoid O)
45 0 - 500 C
18 jam
Salmonella “H” a
450 - 500 C
2 jam
Salmonella “H” b
450 - 500 C
2 jam
Salmonella “H” c
450 - 500 C
2 jam
Salmonella “H” d (Typhoid H)
45 0 - 500 C
2 jam
Brucella
370 C
48 jam
abortus
and
Brucella
Meltonois Proteus OX2, OX19, OXK 8.
45 0 - 500 C
18 jam
Setelah inkubasi , rak yang berisi tabung test dipindahkan dengan perlahan dan diamati aglutinasinya. Untuk hasil yang optimal, pengamatan dilakukan di tempat yang terang dengan latar belakang gelap.
9.
Hasil yang diperoleh dicatat, sebagai berikut : 4+
100% gumpalan sempurna dibagian bawah tabung, dan cairan
3+
supernatannya bersih 75% terdapat gumpalan pada dasar tabung, cairan supermatan sedikit
2+
keruh 50% terdapat gumpalan pada dasar tabung, cairan supermatannya
1+
agak keruh 25% terdapat gumpalan pada dasar tabung, cairan supermatannya
-
keruh Tidak terdapat gumpalan dan campuran keruh.
10. Hasil titer dari serum yang reaktif dicatat sebagai pengenceran terakhir yang memberikan reaksi +2.
DAFTAR PUSTAKA
Rahmat.2012. Test Widal Slide. http://kumpulanmateridiiianaliskesehatan.blogspot.com/2012/05/testwidal-slide.html (diakses: 11 Maret 2013) Musyaffa, Ripani. 2010. Widal dan Typhoid Fever . http://ripanimusyaffalab.blogspot.com/2010/02/widal-dan-typhoidfever.html. (diakses : 13 Maret 2013) Risnawati.2012. Pemeriksaan Imunoserologi. http://RisnawatiHapilu.Blogspot.Com/2012/05/Pemeriksaan-Imunoserologi.Html. (diakses : 13 Maret 2013) Rudy.2009. Widal Test . http://rudy-infokesehatan.blogspot.com/2009/07/widaltest.html . (diakses : 13 Maret 2013) Sutrimo.2013. Uji Widal . http://analiskesehatankendariangkatan5.blogspot.com/2013/01/ujiwidal.html(diakses: 11 Maret 2013) Wiki. Tt. Widal. http://id.wikipedia.org/wiki/Widal (diakses: 13Maret 2013)
