FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL
RESPIRACIÓN CELULAR: ALTERACIÓN POR METALES PESADOS Huaman Siuce,Mercedes; Ricra Chavez, Ohaira; Quispe Apaza, Nohemi; Valverde Gaspar, Jasmin
LIMA, PERÚ 2017
1
MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES
Hígado de pollo fresco
Balanza de precisión
6 tubos de ensayo PYREX
Sistema de filtrado
Embudo PYREX
Matraz E. 100mL
Beaker PYREX de 200mL
Probeta de 100mL
Pipeta PYREX de 1mL
Crayón marcador
Pipetas PYREX de 10mL
Pizeta con agua destilada
Mortero 500mL
Gotero descartable
Masking tape
2 pares de guantes quirúrgicos Gasa 20 cm2
REACTIVOS
Acetate de plomo 10Mm (100mL)
Malato (1mL)
Succionato sódico 0.4M (100mL)
Aceite vegetal (100mL)
Buffer fosfato pH7 (250mL)
Azul de metileno 0.1% (gotero)
2
MÉTODOS Se realizó el pesado de 10g de hígado, el cual fue triturado en el mortero con 40mL de Buffer fosfato 0.1M pH 7, después se hizo uso del sistema de filtrado para obtener el homogenizado de hígado; Por otro lado, se tomó 6 tubos de ensayos los cuales fueron rotulados respectivamente. Al tubo 1 se le añadió 0.5mL de succinato 0.4M, 1mL de Buffer fosfato pH 7.4, 10 gotas de azul de metileno y 8 mL agua destilada; al tubo 2 se agregó 1mL de Buffer fosfato pH7.4, 10 gotas de azul metileno, 8mL de agua destilada y 0.5mL de homogenizado de hígado; en el tubo 3 se le añadió 0.5mL de succionato 0.4M, 1mL de buffer fosfato pH 7.4, 10 gotas de azul de metileno, 7.5mL de agua destilada y 0.5mL del homogenizado de hígado; en el tubo 4 se agregó 0.5mL de succinato 0.4M, 1mL de buffer fosfato pH 7.4, 10 gotas de azul de metileno, 7mL de agua destilada, 0.5mL del homogenizado de hígado y 0.5mL acetato de plomo; en el tubo 5 se añadió 0.5mL de succionato 0.4M, 1mL de buffer fosfato pH 7.4, 10 gotas de azul de metileno, 7.5mL de agua destilada y 0.5mL del homogenizado de hígado y por último en el tubo 6 se le agregó se añadió 0.5mL de succionato 0.4M, 1mL de buffer fosfato pH 7.4, 10 gotas de azul de metileno, 7.5mL de agua destilada y 0.5mL del homogenizado de hígado y 0.6mL de malonato. Inmediatamente después de realizar todas las baterías de tubos se les agregó 0.5cm de aceite vegetal a todos excepto al tubo 5. Terminado la elaboración de éstas batería de tubos [anexo1] se esperó aproximadamente 6 horas para evaluar los resultados.
3
RESULTADOS La evaluación de las muestras estuvo basada en la decoloración del azul de metileno, ya que éste es un indicador que señala si el ciclo de Krebs está llevándose a cabo o no. Al haber transcurridas seis horas aproximadamente se observó que las muestras tuvieron distintos grados de decoloración [Figura N°1]
Figura N°1: Niveles de reducción de Azul de Metileno en función a la respiración Celular de tejido hepático en seis diferentes tratamientos.
En el primer tubo, el cual contenía todos los reactivos similares al tubo tres, excepto el Homogenizado de hígado (véase anexo1), se observó que el color azul se mantuvo constante, es decir, ésta muestra no sufrió cambio de color desde el momento de su preparación hasta el tiempo en que fue evaluada. En comparación a las otras muestras, el resultado de ésta fue similar al tubo seis quien también no mostro cambio alguno de color, sin embargo, las otras muestras si se decoloraron en distintos grados. En cuanto al tubo dos, al cual no se le agregó succinato (sustrato) se obtuvo una decoloración más o menos parcial. Pese a la ausencia del succinato se notó una decoloración ligera de casi un 50% en comparación al tubo tres (el cual se decoloró totalmente). Además, cabe señalar que el resultado en éste tubo fue muy similar al resultado obtenido del tubo cuatro. En el caso del tubo tres, quien contenía todos los reactivos sin ningún inhibidor presente, el resultado fue una decoloración total del azul de metileno. Es decir, en el momento en que fue evaluada ya había pasado de ser azul a incolora. Cabe 4
señalar que este tubo al demostrar una decoloración al 100% ha sido usada como referencia para comparar a los otros tubos. En el tubo cuatro, quien contenía todos los reactivos similares al tubo tres, pero con una incorporación del acetato de plomo, se apreció una decoloración casi completa de aproximadamente un 90% en comparación al tubo al tres. Presentó una velocidad de decoloración inferior al tubo tres, pero superior a los otros tubos; Además, se evidencia que esta decoloración empezó desde la parte inferior del tupo quedando la parte superior un poco coloreada, similar al tubo dos, tres y cinco los cuales siguieron este mismo comportamiento. En el tubo cinco, quien también contenía los mismos reactivos del tubo tres, pero a quien no se le agregó la capa de aceite, se apreció una decoloración parcial de aproximadamente un 50% en comparación al tubo tres, además cabe señalar que esta decoloración era muy similar a la obtenida en el tubo dos. Finalmente, en el tubo seis a quien se le preparó en condiciones y con reactivos similares al tubo tres, pero con la incorporación de Malonato, se obtuvo como resultado la conservación de color del azul de metileno, es decir no hubo cambio de color. Además, cabe mencionar que éste resultado obtenido es similar al resultado del tubo uno.
DISCUSIÓN El azul de metileno actuó como un indicador, ya que el cambio de color (azul a incoloro) señalaba presencia de la actividad enzimática, en un artículo realizado por Gunawardena (2008) se indicó que el colorante azul de metileno puede funcionar como aceptor de electrones artificial (agente oxidante), reemplazando al NAD+ en la reacción enzimática en sistemas vivientes. Cuando el azul de metileno sustituye al NAD+, se torna incoloro a medida que se reduce, mientras los compuestos orgánicos involucrados en este metabolismo se van oxidando. Con este cambio del indicador redox se comprueba que la enzima está transformando el sustrato. (UNACHI 2011)
5
En el tubo uno, no hubo ciclo de krebs ya que el color azul se mantuvo igual desde el momento de su preparación hasta el tiempo en que fue evaluada. Al no agregar el homogenizado de hígado, no se incorporó enzimas y en ausencia d e éstas, los succinatos (sustrato) que se encontraban en el tubo se mantuvieron como tales, sin ser convertida a fumarato, por tal razón no se desarrolló el ciclo de Krebs. El resultado del tubo dos señaló presencia de actividad enzimática ya que hubo cambio de color, sin embargo, este cambio solo fue parcialmente porque en la parte superior se seguía apreciando un color azulado. Esto señala que se llevó cabo el ciclo de Krebs a pesar de que a este tubo no se le agregó succinato (sustrato); En una investigación realizada por Durant et al (2010) se evaluó a la enzima lactato deshidrogenasa en donde menciona que no se adicionó lactato de sodio como sustrato, pero la enzima operó utilizando como sustrato el lactato presente en el tejido hepático, por lo que hubo decoloración. Considerando lo anterior se podría considerar que en ésta experiencia al haber incorporado el homogenizado de hígado, no solo se incorporó enzimas sino también otro tipo de proteínas y sobre todo sustratos propios de éste homogenizado. Cabe señalar también que en este tubo las enzimas actuaron sobre una escasa concentración de sustratos, por ello se apreció que el cambio de color no fue de igual velocidad que lo obtenido en el tubo tres el cuan si contenía succinato. Para el caso del tubo tres, el resultado de actividad enzimática fue la más óptima comparada con las otras muestras, se interpretó esto porque el cambio de color (azul a incoloro) se dio a una gran velocidad y en el momento en que las muestras fueron evaluadas este tubo ya había perdido completamente todo el color azul. Esto significó que el succinato fue convertido a fuma rato y por lo tanto sí se llevó a cabo el ciclo de ckrebs. El resultado del tubo cuatro indicó que sí se llevó a cabo el ciclo de Krebs ya que hubo cambio de color; sin embargo, la velocidad de ésta variación de color fue más lenta en comparación del tubo tres; además de estar en las mismas condiciones que el tubo anterior, a éste tubo cuatro se le agregó una solución de acetato de plomo. Guerrero (2009) afirma que los metales pesados como el plomo, cobre mercurio o zinc pueden inhibir la actividad enzimática debido a la 6
reacción con residuos de aminoácidos como la cisteína. Por tal razón se afirma que el plomo actuó como un inhibidor, un inhibidor de tipo no competitivo (no se une al sitio activo) porque no paralizó completamente la actividad enzimática pero sí redujo la velocidad. La unión de este tipo de inhibidor altera la conformación tridimensional de la enzima, cambiando la configuración del sitio activo con uno de dos resultados. O el complejo enzima-sustrato no se forma a su velocidad normal, o, una vez formado, no produce productos a la velocidad normal (Davis 2014) En el tubo cinco, los resultados indicaron que sí se desarrolló el ciclo de Krebs, sin embargo, en esta muestra el cambio de color no fue total ya que la coloración azul se mantuvo sobre todo en la parte superior. Las condiciones de este tubo eran similar a la del tubo tres, con la única diferencia de que a éste no se le agregó aceite vegetal el cual actuaría para cubrir el medio reaccionante y aislarlo del oxígeno del ambiente (Durant et al 2010). En base a esto se consideró que el tubo cuatro al estar expuesto al medio ambiente, el azul de metileno pasó de un posible estado reducido a uno oxidado, por ello que sobre todo en la parte superior se aprecia mejor la coloración azulina. En el resultado del tubo seis se aprecia que el color azul se mantuvo constante, por ende se interpretó que no se desarrolló el ciclo de krebs. A esta muestra que en un principio presentaba las mismas condiciones que el tubo t res, se le agregó una solución de malonato. Battaner (2013) señaló que un inhibidor competitivo forma con el enzima libre un complejo enzima-inhibidor de características cinéticas análogas a las del complejo enzima-sustrato, pero que, lógicamente, no puede descomponerse a continuación para dar lugar al enzima libre y a los productos. En base a ello se consideró que el malonato actuó como un inhibidor competitivo del succinato deshidrogenasa, de tal manera que la presencia de malonato detuvo el ciclo de Krebs.
7
CUESTIONARIO 1.
¿Qué rutas metabólicas forman Acetil CoA? Explique.
La ruta metabólica que forma la Acetil CoA es la glucolisis en esta vía la glucosa se transforma, a través del intermediario fructuosa 1-6-bifosfato a piruvato con la producción de dos moléculas de ATP/mol de glucosa. La glucolisis es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa que conduce la producción de acetil CoA. (Melo, V. y Cuamatzi, O. 2013) El priruvato, producto de la glucolisis, se convierte en acetil-CoA, material de partida del ciclo de ácido cítrico, por acción del complejo de la priruvato deshidrogenasa. El complejo de la PDH está compuesto por múltiples copias de tres enzimas piruvato deshidrogenasa, E1 (con su cofactor ligado el TPP); dihidrolipoil trasacetilasa, E2 (con su grupo lipoilo unido de modo covalente) y dihidropoil deshidrogenasa, E3 (con sus cofactores de FAD y NAD). E1 cataliza en primer lugar la descarboxilacion del piruvato, produciendo hidrietil-TPP y a continuación la oxidación del grupo ladroxietilo a grupo acetilo. Los electrones de esta oxidación reducen el desulfuro del lipoato a E2, y se transfiere el grupo acetilo en forma de enlace tio éster con un grupo-SH del lipoato reducido. La E2 cataliza la transferencia del grupo acetilo al coenzima A formando acetil CoA. (Lehninger, Nelson, y Cox, 2013) 2.
¿Cuál es la función del plomo en la experiencia?
Los metales pesados son xenobioticos que pueden inhibir las enzimas . En el caso del plomo se ha reportado su efecto antagónico con otros metales divalentes que participan en el metabolismo celular, al parecer el ion compite con el Ca+2 alterando la función del metabolito (Mahaffey et al. 1982), debido a la alta electronegatividad del plomo, cambia la estructura tridimensional de las proteínas, y cuando ocurre ello el sitio activo se oculta, por ende disminuye la actividad enzimática. En la experiencia realizada el plomo actúa como un inhibidor no competitivo por lo que reduce la actividad enzimática.
8
3.
¿Explique químicamente el cambio de color del indicador? (azul de metileno). Se sabe que el azul de metileno es un indicador de la oxidación o reducción de una sustancia. El azul de metileno se encuentra oxidado, es por ello que tiene un color azul. Mientras hay oxígeno disuelto en la disolución, el azul de metileno está en su forma oxidada de color azul. Pero este oxígeno reacciona con la glucosa, que se oxida hasta ácido glucónico. Cuando se consume el oxígeno, la glucosa reacciona con el azul de metileno reduciéndolo hasta su forma reducida, que es incolora (Aguilar, et al 2003).Se observa en la etapa 1 de la anaerobia. Ejemplo:
Azul de metileno oxidad + glucosa
azul
gluconico Azul
4.
de metileno reducido mas acido
Incoloro
¿Qué contiene el homogenizado del hígado?
Al homogenizar el hígado, se destruye la membrana plasmática, entonces las organelas migran al medio en el cual se encuentran, por lo que se podría decir que en el homogenizado de hígado se encuentran, diversas organelas de la célula y biomoléculas disueltas. (Blanco, A, 2000) Contiene enzimas, proteínas y sustratos propios del tejido hepático.
9
BIBLIOGRAFÍA
Aguilar Muños, M., Fernández Tapia, M. y Durán Torre, C. (2003). EXPERIENCIAS CURIOSAS PARA ENSEÑAR QUIMICA. Centro de Ciencia Principia (Málaga). Bradley, F. and Bennett Peter, T. (1982). Bioquimica. 1ra ed. España: Reverte. Battaner Arias, Enrique. Compendio de enzimología. Salamanca, ES: Ediciones Universidad de Salamanca, 2013. ProQuest ebrary. Campbell, N.A.; y Reece, J.B. (2007). BIOLOGÍA. 7a ed. Buenos Aires; Madrid: panamericana, pp.161-169 Congresosadbia.com. (2010). IX Jornadas Nacionales y IV Congreso Internacional de Enseñanza de la Biología. Guerrero, C. (2009). Inhibicion de la actividad enzimatica de la polifenol oxidasa extraída del banano (cavendish valery) mediante sistemas bifásicos acuosos con isoespintanol y ácido. magister. Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Trabuco, J. (2014). Inhibidores del Ciclo de Krebs. Bioquimica. pp.2-6. Lehninger, A., Nelson, D. and Cox, M. (2013). Principios de bioquímica. 5a ed. Barcelona: Omega. Melo, V. y Cuamatzi, O. (2013). Bioquímica de los procesos metabólicos. 2a ed. Barcelona: Reverte , pp.99. Mejía, C. (2011). Metales pesados en suelos y plantas contaminación y fitotoxicidad.Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión Autora: Cecilia Maura Mejía Domíngue. Mahaffey K. R, Rosen, R. W. Chesney, J. T. Peeler, C. M. Smith y H. F. Deluca (1982) Association between age, blood lead concentration, and serum 1, 25 -Dihydroxy cholecalciferollevels in children. Am. J. Clin. Nutr. 35: 1327-1331. Porto, A. (n.d.). ENZIMA. [online] Departamento de Biología -Geología - IES María Casares Oleiros - A Coruña.
Universidad de Oriente-Nucleo Bolivar Escuela de ciencias de la salud "Dr. Francisco Battistini Casalta departamento de ciencias fisiologicas laboratorio de bioquimica (2010). Estudio de la actividad de L-lactato+ oxido -reductasa en el Musculo, Hígado y Corazón de animales de Experimentación. Bolivar: Amintan Cardozo, pp.3-12. Van Geen A, Bravo C, Gil V, Sherpa S, Jack D. Lead exposure from soil in Peruvian mining towns: a national assessment supported b y two contrasting examples. Bull World Health Organ. Wed. 2012.
10
ANEXO
ANEXO 1: Batería de tubos para la prueba de respiración celular.
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5
Tubo 6
Succinate 0.4M
0.5ml
-
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
Buffer fosfatopH7.4
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Azul de metileno 0.1%
0.5 ml
0.5 ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
0.5ml
Agua destilada
8 ml
8 ml
7.5ml
7 ml
7.5 ml
7.5 ml
Homogenizado de hígado
-
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
Acetado de plomo 10 mM
-
-
-
0.5 ml
-
-
Malonato
-
-
-
-
-
0.6ml
11
