Leishmania (v) Panamensis_ Un Ensayo in Vitro Utilizando La Expresión de GFP Para La Detección de Drogas Antileishmanial

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Leishman Leishmania ia (V) pana panamens mensis: is: Un ensayo ensayo in vitro utili utili zando zando la expresión expresión de GFP para para la dete detección cción de drogas drogas antileishma antileishmanial nial

Exp Parasitol. Autor manuscrito; disponible en PMC 2013 1 de mayo. Publicado en forma editada final como:

PMCID: PMC3640980 NIHMSID: NIHMS463079

Exp Parasitol. 2009 Jun; 122 (2): 134-139. Publicado en Internet el 2009 Mar 20. doi: 10.1016 / j.ex j.exppara.2009.02.012 ppara.2009.02.012

Leishmania (V) panamensis : panamensis : An in vitro ensayo vitro ensayo utilizando la expresión de GFP para la detección de drogas antileishmanial Rubén Eduardo Varela M , a, c Diana Lorena Muñoz , a, c Sara M. Robledo , a, d Bala K. Kolli , b Sujoy Dutta , b Kwang Poo Chang , b y Carlos Muskus a, *, d un

Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales de-PECET, Universidad de Antioquia, Calle 62 No 52-59, Lab. 632, Medellín, Colombia b Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de Chicago, la Universidad Rosalind Franklin, 3333 Green Bay Road, North Chicago, IL 60064, EE.UU. * Correspondencia: Carlos Muskus, Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (de PECET), Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Calle 62 No 52-59, 632. Lab, Teléfono: (574) 219 a 6507, Fax (574) 219 a 6511,E-mail: [email protected] c contribuyó igualmente d autor principal Conjunta

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Abstracto Ab stracto

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Leishmania panamensis (Viannia) (Viannia) fueron transfectadas con éxito con p6.5- EGFP para Promastigotes de Leishmania para expresar la proteína verde fluorescente. Los transfectantes se mantuvieron infeccioso a los macrófagos, proporcionando una in vitro modelo para el cribado cribado de fármacos antileishmania. antileishmania. Esto fue demostrado por citometría de flujo de GFPmacrófago asociada después de la exposición de los cultivos infectados con fármacos anti-Leishmania conocidas, es decir, anfotericina B y Glucantime. La fluorescencia de GFP disminuye progresivamente a partir de células infectadas con el aumento de las concentraciones de fármaco utilizado en ambos casos. La disponibilidad de este (V.) panamensis facilita el programa de ensayo fluorescente para la infección de los macrófagos por L. (V.) Leishmania descubrimiento de fármacos para los Viannia especies, que difieren significativamente de los de la Leishmania subgénero.

Índice de descriptor: L. (V.) (V.) panamensis , L. (L.) amazonensis , L. (L.) major , D onovani (L.) , Viannia , L. Donovani Leishmania subgénero, la leishmaniasis, la proteína fluorescente verde, la detección de drogas contra la subgénero, Leishmania leishmania Introducción

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Leishmania Leishmania spp. son responsables de la leishmaniasis - una enfermedad parasitaria importante de más de 12

millones de personas en 88 países. Hay dos millones de nuevos casos al año, es decir, 1,5 millones de casos cutáneos y 500.000 casos de leishmaniasis visceral, respectivamente ( OMS, 2004 ). 2004 ). Colombia es uno de los principales principales lugares lugares endémicos donde el 99% de los casos son la leishmani leishmaniasis asis cutánea cutánea y el 70% son causadas por Leishmania Leishmania panam ensis (V.) (V.) . La quimioterapia de esta enfermedad se ha basado principalmente en los compuestos de antimonio pentavalente, sino también de la anfotericina B y la pentamidina como los fármacos de segunda línea alternativos. (Desarrollo de resistencia a los antimoniales Leishmania . Rojas et al, 2006 ) 2006 ) requieren tratamientos http://www.ncbi .nl m .ni h.gov/pm c/ar ticles/PM C3640980/?r epor t= cl assi c

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Leishmania (V) panamensis: Un ensayo in vitro utili zando la expresión de GFP para la detección de drogas antileishmanial

prolongados de pacientes con dosis crecientes, resultando en efectos secundarios graves, incluyendo la muerte ( Cesur et al., 2002 ; . Oliveira et al, 2005 ). Evaluación reciente de la miltefosina produjo resultados prometedores ( Soto y Soto, 2006 ), pero el desarrollo de la resistencia a este fármaco en estudios de laboratorio predice su aparición en las clínicas. Por tanto, existe siempre una necesidad urgente de encontrar nuevos fármacos contra leishmania. Los compuestos candidatos son generalmente seleccionados contra el amastigote como la etapa clínicamente relevante por microscopía cuantitativa y / o por otros ensayos de viabilidad celular, por ejemplo de propidio permeabilidad yoduro ( Kamau et al., 2001 ) o el etiquetado de biosíntesis radiactivo ( Goto et al., 1995 ) . Automatización de tales ensayos se ha visto facilitada por transfección de Leishmania para expresar genes indicadores que codifican, por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP), la luciferasa y la β-galactosidasa que se puede utilizar para la detección rápida y de alto rendimiento de fármacos. GFP de la medusa, Aequorea victoria , es a menudo el marcador de elección, ya que no es tóxico y auto-fluorescente para formación de imágenes fácil por microscopía de fluorescencia y la cuantificación listo por citometría de flujo o fluorimetría. GFP también se compara favorablemente por la sencillez de su uso contra otros marcadores, es decir, luciferasa, β-lactamasa y βgalactosidasa. Recientemente, GFP transfectantes que expresan se han desarrollado a partir de muchas especies en el Leishmania subgénero, por ejemplo, L. (L.) infantum ( Kamau et al., 2001 ) , L. (L.) donovani ( Ha et al., 1996 ; Singh y Dube, 2004. ; Dube et al., 2005 ) y L. (L.) amazonensis ( Chan et al., 2003 ; . Okuno et al, 2003 ; . Dutta et al, 2005 ). Esto también es cierto para otros marcadores, por ejemplo luciferasa en L. (L.) donovani ( Roy et al., 2000 ; Gupta et al, 2005;. Ashutosh et al., 2005 ), L. (L.) infantum ( Sereno et al., 2001 ), L. (L.) importante ( Roy et al., 2000 ) y L. (L.) amazonensis ( . Lang et al, 2005 ), y β-lactamasa y β-galactosidasa en L. (. L) amazonensis ( Buckner y Wilson, 2005 ; Okuno et al., 2003 ). Por el contrario, los transfectantes similares no han sido puestos a disposición para aquellos en el Viannia subgénero, a excepción de dos luciferasa transfectadas L. (V.) panamensis para estudios de fármacos ( Romero et al., 2005 ; . Henao et al, 2004 ). Leishmania y Viannia se cree que han divergido hace 40 a 80 millones de años ( McMahon-Pratt et al., 1992 ; McMahon-Pratt y Alexander, 2004 ). Leishmania panamensis del Viannia subgénero difiere significativamente de su contraparte en el Leishmania subgénero, es decir, L. (L.) importante en la infectividad a animales de laboratorio ( Goto et al., 1995 ; . Guevara-Mendoza et al, 1997 ). Diferentes especies dentro del Viannia subgénero también

varían entre sí en la patogenicidad ( Colmenares et al., 2002 ; McMahon-Pratt y Alexander, 2004 ), produciendo un espectro de cutánea simple, cutánea difusa y leishmaniasis mucocutánea. Heterogeneidad intra-especie se observó además en el Viannia subgénero ( Cupolillo et al., 1997 ; Muskus et al., 1997 ; Pacheco et al., 2000 ; Saravia et al., 2002 ), incluyendo la sensibilidad a fármacos específicos de la cepa ( Croft y Brun, 2003 ). Por lo tanto, se necesitan modelos adicionales para la detección de drogas para desarrollar Viannia quimioterapia específico de. En este estudio se reporta el desarrollo de GFP-transfectantes de promastigotes de L. (V.) panamensis. Estos transfectantes mantienen su infectividad en líneas celulares de macrófagos y continúan expresando GFP intracelular in vitro . Hemos demostrado la utilidad de este modelo de infección para el potencial de cribado de alto rendimiento de fármacos antileishmania in vitro por citometría de flujo. materiales y métodos

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Los parásitos y transfección

Promastigotes de L. (V.) panamensis (MHOM / 87 / CO / UA140), un aislado de Colombia, se cultivó a 25 ° C en medio de Schneider (Gibco) con 10% HIFBS en 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos (Cellstar). Para la transfección, estas células crecer hasta la fase logarítmica tardía se lavaron por centrifugación a 3500 g a 4 ° C durante 10 min una vez con PBS y dos veces en tampón de electroporación enfriado (HEPES 25 mM, NaCl 137 mM, KCl 5 mM, NaH 0,7 mM 2 PO 4 y glucosa 6 mM). La suspensión parásito (0,4 ml a 50 × 10 6 células / ml) se mezcló con 30 ~ g de p6.5- EGFP ( Dutta et al., 2005 ) en una cubeta de 2 mm-gapped (BioRad) para la electroporación en un gen Pulsador (BioRad) a 0,45 kV y 500 mF ( Chen et al., 2000 ). Después de ~ 24 horas de incubación para la recuperación en medio libre de fármaco con 20% HIFBS, se seleccionaron los transfectantes por http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3640980/?report=classic

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su resistencia a la tunicamicina en 1,25, 2,5 y 5 mg / ml. Las células fueron monitoreados microscópicamente diaria para la viabilidad y el crecimiento (Nikon Labophot-2). Los transfectantes obtenidos fueron clonados por dilución limitante en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. clones fluorescentes surgieron se recogieron y se seleccionaron adicionalmente con concentraciones crecientes de tunicamicina de 5 a 25 mg / ml. Los transfectantes cultivadas a crecientes presiones selectivas fueron cosecha y se fijaron con 0,5% de paraformaldehído en PBS para citometría de flujo (Beckman-Coulter Epics XL) utilizando un láser de argón a 488 nm para la excitación y 525 nm para la emisión. promastigotes que expresan GFP se analizaron flujo citometría de 10.000 eventos cerrados y los datos numéricos se procesaron mediante el uso de software WinMDI. La infección de macrófagos con transfectantes GFP y determinación de su mediana de la dosis infecciosa (IC 50 )

Se utilizaron los macrófagos derivados de los monocitos de la línea celular humana U937 para determinar esto después de la infección con GFP-transfectantes ( Sundstrom y Nilsson, 1976 ). Los monocitos no infectados se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) más 10% HIFBS a 37 ° C en 5% de CO 2 y se pasaron cada 2 días. Estos monocitos se trataron a 3 × 10 5 células / ml por pocillo con 1 M de acetato de forbol miristato (PMA) (Sigma) durante 48 horas a 37 ° C en placas de 24 pocillos de cultivo (Fisher). Los macrófagos obtenidos de este modo se infectaron durante dos horas a 34 ° C con la GFP-transfectantes en diferentes relaciones parásito-a-host. Los cultivos se lavaron tres veces con medio fresco precalentado para eliminar los parásitos un-ingerido y se incubaron adicionalmente durante 24 horas a 34 ° C. Las células se retiraron entonces de los pozos individuales por aspiración vigorosa con medio frío para reacción a 4 ° C durante 30 min con PE conjugado anti-CD33 (Pharmingen) (5 l por muestra) específico para el monocítica linaje / mieloide ( Simmons y Seed, 1988 ). Control de isotipo conjugado con PE se incluyó para estimar la unión no específica del anticuerpo primario a CD33. Después del lavado, las muestras de células individuales se sometieron a análisis de citometría de flujo de dos colores, es decir, emisión a 488 nm y excitación a 530 nm para GFP y 575 nm para PE. Las alícuotas de estas muestras a diferentes relaciones parásito-a macrófagos se recogieron simultáneamente para la evaluación microscópica del porcentaje de infección después de la fijación en metanol y la tinción con Giemsa al 10% (Merck). La dosis infecciosa mediana o IC 50 se calculan a partir de los datos obtenidos por los dos métodos que utilizan el método de probit ( Finney, 1971 ). Los macrófagos de la línea J774 también se infectaron con la GFP-transfectantes en condiciones como se describe ( Dutta et al., 2005 ). Utilidad de las culturas GFP tansfectant infectadas para el cribado de fármacos contra leishmania por ensayo fluorescente

Dos medicamentos contra leishmania conocidos se incluyeron para la comparación, es decir, antimoniato de meglumina en 0,3125, 1,25, 5 y 20 mg / ml (Glucantime®, Aventis Pharma Ltd, Brasil) y anfotericina B en 0,1563, 0,625, 2,5 y 10 mg / ml (Bristol- Myers Squibb). Los controles fueron diluyentes solo en la concentración más alta utilizada para cada compuesto. Los macrófagos cultivados en placas de 24 pocillos como se ha descrito se infectaron durante 2 horas a 34 ° C con los transfectantes GFP fase estacionaria en el IC 50 determinado, es decir, una proporción de promastigote-a macrófagos de 35: 1. Los cultivos se lavaron para eliminar promastigotes uningerido como antes y después se trataron durante 96 horas a 34 ° C con los fármacos a diferentes concentraciones como se indica. Los efectos de los medicamentos se analizaron por citometría de flujo de células GFP asociado y por microscopía como se describe. La CE 50 se calcula a partir de las intensidades de fluorescencia de macrófagos infectados CD33 y positivas para GFP usando una regresión logarítmica con el método probit ( Finney, 1971 ). resultados

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La expresión de GFP en transfectadas L. (V.) panamensis

Transfectantes fluorescentes surgieron después de la electroporación de las células en virtud de las presiones selectivas iniciales de ≤5 ug tunicamicina / ml, alcanzando un nivel de 50-60% de la población total por día 25. La http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3640980/?report=classic

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proporción de células fluorescentes de GFP aumentó de manera significativa al 96% cuando los clones eran obtenido y seleccionado aún más la resistencia a concentraciones más altas de tunicamicina de 10 a 25 mg / ml. La fluorescencia de GFP de células individuales apareció en gran parte citosólica y variado en intensidad ( Fig. 1A-D ). Los transfectantes cultivadas continuamente con el aumento de las presiones selectivas de 0 a 25 g de tunicamicina / ml mostraron un aumento en las células fluorescentes 0-96% de la población ( Fig. 2 ). Figura 1 Promastigotes fluorescentes de L. (V.) panamensis (UA-140) transfectadas con las p6.5- EGFP construcciones. (A y C), contraste de fase; (B y D), microscopía fluorescente. Figura 2 Población de células fluorescentes de la GFP-expresión de L. (V.) panamensis promastigotes aumentaron con el aumento de la presión selectiva de 10-25 g / ml de tunicamicina. Parásitos utilizados fueron cultivadas durante un ciclo en medio libre de droga antes de la citometría de flujo. ... Ensayo para la actividad de fármacos antileishmania conocidos a base de Leishmania intensidades de fluorescencia de GFP en macrófagos infectados

Los transfectantes retuvieron su infectividad a las macrófagos y en ello diferenciarse en amastigotes, que permanecieron fluorescente para la duración de los experimentos, como se ve por tanto microscopía de fluorescencia ( Fig. 3 ) y citometría de flujo ( Fig. 4 ). La fluorescencia de GFP se asoció con estrictamente intracelular Leishmania en las vacuolas parasitóforas ( Fig. 3A-D ). La citometría de flujo de los macrófagos infectados durante 4 días mostraron que el porcentaje de parásitos GFP + aumento en las células CD33 + proporcionalmente con el aumento de las proporciones de promastigote-a macrófagos, indicativo de infección cada vez mayor, como se esperaba ( Fig. 4A ). La presencia de células CD33-negativas ( Fig. 4A , el cuadrante inferior izquierdo) sugiere que un bajo porcentaje de células U937 tratadas con PMA no reaccionó con el anticuerpo antiCD33-PE utilizado. Estimación de la tasa de infección por la fluorescencia de GFP de las células CD33 + es comparable a la obtenida por enumeración microscópica de intracelular Leishmania en las células U937 transfectantes infectados, mostrando un aumento con el aumento de promastigote-a-macrófagos proporciones del 19% al 74% en microscopía (datos no presentados) y de 17% a 58%, por citometría de flujo. La dosis infecciosa mediana de los transfectantes GFP se estima que caen dentro del alcance de su número utilizado en una proporción de parásito a los macrófagos entre 25: 1 y 35: 1. figura 3 GFP fluorescencia intracelular de L. (V.) panamensis después de la infección de los macrófagos. (A y C), la Fase microscopía de contraste; (B y D), microscopía fluorescente. Los macrófagos de la línea J774 fueron infectados con L. (V.) panamensis transfectantes como promastigotes ... Figura 4 ( A ) La mediana de dosis infecciosa (IC 50 ) de expresión de GFP- L. (V.) Panamensis en células U937. El IC 50 se calculó a partir de células de doble fluorescentes CD33 y GFP en las muestras a aumentar las proporciones de promastigote-a macrófagos de 0: 1 a 40: 1 como se indica. [1] isotipo ... Los macrófagos infectados con la dosis infecciosa mediana de la GFP-transfectantes fueron tratados posteriormente http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3640980/?report=classic

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con antimoniato de meglumina y anfotericina B para ~ 4 días en el aumento de las concentraciones de fármacos mencionados. Las CE 50 s 'de ambos fármacos contra leishmania se determinaron por citometría de flujo de los niveles de fluorescencia de GFP en el CD33 + células. Las intensidades de fluorescencia de GFP en unidad de fluorescencia arbitraria (FU) se redujeron en estos CD33 + poblaciones gradualmente de 95,5 FU del control infectado y no tratado a 48.17 y 41.03 FU, en las personas expuestas a las mayores concentraciones de antimoniato y anfotericina B, respectivamente (no datos mostrado). Cuando estos FU se convirtieron a porcentaje de parásitos intracelulares viables, la viabilidad disminuyó de 100% a 52% con antimoniato y de 100% a 0,8 % con anfotericina B, en las células infectadas expuestas a las más altas concentraciones de estos fármacos antileishmania ( Fig. 4B ). Es decir, las células fluorescentes CD33 + GFP + dobles o macrófagos infectados disminuyó de 36,77% de control no tratado proporcionalmente con el aumento de las concentraciones de fármaco a 13,31% ( Fig. 4C 1-3) y 7,61% ( Fig. 4C 1, 4-5) para antimoniato y anfotericina B, respectivamente. Las poblaciones GFP + CD33- estaban presentes en todos los casos, al parecer, en representación de los amastigotes, que fueron puestos en libertad sin darse cuenta de las células infectadas durante su retirada de los frascos de cultivo por aspiración vigorosa o como resultado de la infección en sí. La proporción de CD33 + células se redujo ligeramente al aumentar la concentración de ambos fármacos, que indica que son marginalmente tóxico para las células U937 en las condiciones experimentales. Sin embargo, las concentraciones de los fármacos utilizados fueron siempre por debajo de la LC 50 . Las CE 50 se determinaron s 'de los compuestos contra leishmania a ser de 20 mg / ml y 0,078 g / ml para el antimoniato de meglumina y anfotericina B, respectivamente. Estos valores son comparables, aunque no idénticos, a los determinados anteriormente para las células de tipo salvaje por los métodos convencionales, por ejemplo, una EC 50 valor de 0,132 ± 0,09 g / ml para la anfotericina B (sin publicar). Discusión

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La ingeniería genética de Leishmania para expresar marcadores fluorescentes, tales como GFP, facilita la automatización de detección de drogas. Hemos producido tales transfectantes de L. (V.) panamensis con los p6.5 EGFP construcciones, que se han utilizado anteriormente sólo para las especies de la Leishmania subgénero ( Chan et al., 2003 ; . Dutta et al, 2005 ). Variación clonal en la expresión de GFP fue evidente entre los transfectantes emergentes en la selección inicial. Clones estables fueron seleccionados posteriormente con el aumento de las concentraciones de fármaco, dando la fluorescencia de GFP intensa en casi el 100% de la población ( Figs 1 y 2 ). El P6.5 vector contiene secuencias de ADN de un miembro de la Leishmania subgénero, L. (L.) amazonensis , incluyendo NAGT como el marcador selectivo para tunicamicina resistencia ( Liu y Chang, 1992 ) y la eliminación precisa de un gen expresado constitutivamente ( p36 ) 2,3 kb aguas abajo de NAGT como el sitio de expresión ( Liu y Chang, 1994 ). Anteriormente, se ha demostrado P6.5 para expresar genes extraños con alto rendimiento en L. (L.) amazonensis ( Sah et al., 2002 ) y otros miembros de la Leishmania subgénero ( Dutta et al, 2008 ). El trabajo presentado aquí representa el primer informe de la utilidad de este Leishmania vector subgénero derivado para la transfección de un miembro en el Viannia subgénero. Funcionalidad Cross-subgénero del marcador selectivo y el sitio de expresión en P6.5 este modo se demostró. Si esto puede contribuir a la heterogeneidad inicial de la expresión de GFP visto, es desconocido. Variaciones clonales inherentes de L. (V.) anamensis en la expresión génica y bajas presiones selectivas inicialmente usadas son las alternativas posibles, en espera de una mayor investigación. Los EGFP- transfectantes de L. (V.) panamensis conservar no sólo su infectividad in vitro de macrófagos derivados de monocitos humanos de la línea celular U937 y macrófagos J774 de origen murino, sino también la capacidad de diferenciar de los promastigotes en amastigotes en estos macrófagos. Más importante aún, los parásitos intracelulares contienen suficiente fluorescencia de GFP fácilmente detectable por microscopía de fluorescencia ( Fig. 3 ) y por citometría de flujo ( . Figs 4 ). Hay una buena correlación entre las cargas de parásitos y de fluorescencia determinados cuantitativamente por microscopía y por citometría de flujo. El último método es menos laboriosa, más precisa y más alto en capacidad de evaluar un gran número de células que sea posible por microscopía. Esto puede simplificarse aún más por fluorimetría de suspensiones de células para la medición cuantitativa de la fluorescencia de GFP. Aquí, también demuestran la utilidad de L. (V.) panamensis transfectadas con GFP para evaluar su respuesta a los compuestos conocidos en la lucha contra la leishmaniasis in vitro modelo de infección descrito. La GFP-expresión http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3640980/?report=classic

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de los transfectantes nos permite evaluar la infección de los macrófagos mediante la medición de la fluorescencia, como se muestra anteriormente para otros patógenos intracelulares, por ejemplo Mycobacterium tuberculosis ( Collins et al., 1998 ), Toxoplasma gondii ( Gubbels et al., 2004 ) y Leishmania especies subgénero ( Kamau et al., 2001 ; Singh y Dube, 2004 ; . Dube et al, 2005 ). En nuestro caso, la estabilidad de la fluorescencia de GFP en los amastigotes de L. (V.) panamensis en las células infectadas hace posible mostrar un dependiente de la dosis contra leishmania actividades de ambas Glucantime® y anfotericina B. Sus actividades leishmania diferenciales a favor de este último fármaco están de acuerdo con informes anteriores ( Escobar et al., 2001 ; . Sereno et al, 2000 ). En resumen, los datos presentados muestran que L. (V.) panamensis se puede transfectar para producir GFP en el vector de expresión P6.5, que se ha demostrado para expresar proteínas extrañas de manera eficiente en los miembros de la Leishmania subgénero. Este es el primer informe para tal transfección de L. (V.) panamensis y su utilidad para evaluar compuestos leishmania. La disponibilidad de estos transfectantes facilitará la selección de fármacos específicos para el Viannia grupo y también el estudio de las interacciones huésped-parásito. Expresiones de gratitud

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Este trabajo fue financiado por la agencia financiera de Colombia, Colciencias (números de contrato 110 y 257, los códigos de identificación de proyectos 11150412982 y 11150416514, respectivamente) y EE.UU. NIH AI-20486 de KPC. Agradecemos a Miguel Toro para obtener ayuda con la preparación figura. abreviaturas

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GFP

proteína fluorescente verde

HIFBS

suero bovino fetal inactivado por calor

PMA

miristato acetato de forbol

EDUCACIÓN FÍSICA ficoeritrina NAGT

N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa gen

Notas al pie

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Exención de responsabilidad del editor: Este es un archivo PDF de un manuscrito inédito que ha sido aceptado para su publicación. Como un servicio a nuestros clientes estamos proporcionando esta primera versión del manuscrito. El manuscrito será sometido a la corrección de estilo, composición y revisión de la prueba resultante antes de que se publique en su forma final. Tenga en cuenta que durante los errores en el proceso de producción se pueden descubrir lo que podría afectar el contenido, y todos los avisos legales que se aplican a la revista pertenecen.

referencias

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1. Ashutosh Gupta S, Ramesh Sundar S, Goyal N. El uso de Leishmania donovani aislados de campo que expresa el gen reportero de la luciferasa en in vitro de detección de drogas. Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia. 2005; 49 :. 3.776-3.783 [ PMC libres artículo ] [ PubMed ] 2. Buckner FS, Wilson AJ. Ensayo colorimétrico para la selección de compuestos contra Leishmania amastigotes cultiva en macrófagos. American Journal de Medicina Tropical e Higiene. 2005; 72 :. 600-605 [ PubMed ] 3. Chan MM, Bulinski JC, Chang KP, Fong D. Un ensayo en microplaca de Leishmania am azonensis promastigotes que expresan la proteína verde fluorescente multimérica. Parasitología de Investigación. 2003; 89 :. 266-271 [ PubMed ] 4. Chen DQ, Kolli BK, Yadava N, Lu HG, Gilman-Sachs A, Peterson DA, Chang KP. Expresión episomal de los ARNm sentido y antisentido específicos de Leishmania amazonensis : modulación del nivel de gp63 en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3640980/?report=classic

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Leishmania (v) Panamensis_ Un Ensayo in Vitro Utilizando La Expresión de GFP Para La Detección de Drogas Antileishmanial

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