Karantina Hewan
Hari, tanggal : Sabtu, 9 Desember 2017 Dosen : Drh. Taryu M.Si. Drh. Apris Beniawan, M.Si. Drh. Tetty Barunawati
METODE PEMERIKSAAN HEMAGLUTINASI (HA) DAN UJI HEMAGLUTINASI INHIBITION (HI) Kelompok 10/P1: Ahmad Najihal Asri Sulastri Tata Martha Riza Dwileski F Rama Alwia Fitri Gelvinda Jamil
J3P115006 J3P1150 J3P1150 J3P115047 J3P2150 J3P21507
PROGRAM KEAHLIAN PARAMEDIK VETERINER PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2017
PENGERTIAN Uji HA merupakan uji yang digunakan untuk mendeteksi virus yang memiliki hemaglutinin. Hemaglutinin ini dapat mengaglutinasi eritrosit beberapa spesies hewan, salah satunya adalah eritrosit unggas. Uji HA juga dapat sebagai dasar untuk menentukan titer virus ND (Darminto 1996). Uji HA untuk menentukan titer virus ND didasarkan pada prinsip kemampuan hemaglutinasi dari virus ND terhadap sel darah merah (Grimes 2002). Sumber virus biasanya berasal dari ekskreta ayam terinfeksi baik melalui pakan, air minum, lendir, feses, maupunudara yang tercemar virus, peralatan, dan pekerja kandang. Patogenisitas VND dipengaruhi oleh galur virus, rute infeksi, umur ayam, lingkungan, dan status kebal ayam saat terinfeksi virus. Selama sakit, ayam mengeluarkan virus dalam jumlah besar melalui feses (Alexander 2001) Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan virus dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi ( end point ) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur (Stephen, 1980). Sedangkan, uji HA cepat biasanya dipakai untuk mengidentifikasi virus yang mampu menghemaglutinasi eritrosit ayam. Uji HA bertujuan untuk membedakan subtipe HA dan mengukur nilai HA sediaan virus Influenza. Uji Haemaglutination Inhibition (HI) merupakan yang digunakan pada virusvirus yang mempunyai sisi Ag yang dapat berikatan dengan BDM yaitu ND, EDS'76 dan 113 . Oleh sebab itu cara uji HI dimodifikasi terlebih dahulu misalnya sisi Ag atau Ab dimodifikasi terlebih dahulu sehingga dapat terjadi reaksi aglutinasi, misalnya pada virus Infectious Bronchitis (IB). Pada prinsipnya metode HI ini merupakan reaksi ikatan Ab yang terkandung dalam serum yang diperiksa dengan jumlah Ag ND atau EDS'76 yang digunakan sebanyak 4 HAU. Menurut Indriani (2004), menyatakan bahwa fungsi uji HI untuk mengetahui adanya respon antibodi terhadap antigen virus patogen pada hewan dan mengetahui korelasi antara titer antibodi dan ketahanan pada uji tantang dengan virus patogen. Menurut Nuradji (2008) menyatakan bahwa keberadaan virus yang mampu mengaglutinasi sel darah merah ayam aitu virrrus AI, ND, dan EDS ( Egg Drop Syndrome). Faktor yang mempengaruhi hasil uji HI yaitu kesesuaian subtype virus vasin yang digunakan dalam vaksin, faktr penyimpanan, dan prosdur kerja dengan SOP yang telah ditetapkan akan berpengaruh pada uji HA dan HI (Heryanto 2010)
Langkah Kerja Uji Hemaglutinasi (HA) dan Uji Hemaglutinasi inhibition (HI)
A. Uji Hemaglutinasi (HA) Alat dan Bahan: Alat dan bahan yang diperlukan dalam pengujian HA diantaranya: Multichanel micropipette volume 10 – 50 ml Singlechanel micropipette volume 10 – 50 ml Microtips volume 50 ml Micropalte 96 well type V Sampel virus/antigen Pelarut PBS (Phosphate Buffer saline) (-) 0,01 M steril, ph 7-7.4 RBC 1 % Prosedur : Masing-masing well dari microplate, diisi larutan PBS (-) sebanyak 0,025 ml. Dengan menggunakan Singlechanel micropipette, tambahkan 0,025 ml sampel virus/antigen pada well no.1 yang sudah terisi 0,025 ml PBS Dengan menggunakan multichannel, kocok well no 1 sampai homogen, ambil 0,025 ml dan masukan ke well no. 2 kemudian kocok. Lakukan langkah ini sampai dengan well no 11, pada well 11 setelah pengocokan larutan di buang 0,025 ml. Well no 12 sebagai kontrol RBC.
Tambahkan 0.025 ml PBS (-) ke dalam semua well. Tambahkan RBC 1% kedalam tiap well sampai dengan control RBC (well no 12), Campur dengan baik secara manual (ketuk-ketuk secara perlahan tepi microplate pada setiap sisinya atau dengan menggerakannya dalam bentuk angka 8). Biarkan di suhu ruang 45 menit. Baca hasilnya dengan mengamati pengenceran tertinggi yang memperlihatkan aglutinasi sempurna, titer ini direpresentasi sebagai 1 HA unit (HAU).
Uji HA dengan pelat mikro ini bertujuan untuk mengetahui jumlah titer virus. Titer virus adalah pengenceran tertinggi dari virus yang masih mampu mengaglutinasi eritrosit. Pada uji HA dapat diamati bentuk hemaglutinasi eritrosit pada dasar wall. Uji positif ditandai dengan terbentuknya endapan seperti bunga sedangkan hasil negatif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan eritrosit di dasar tabung. Pernbacaan dilakukan dengan cara sebagai berikut. Pada lubang yang rnenampakkan terjadinya endapan seperti pada lubang kontrol negatif dinyatakan negatif HA, sedangkan yang menunjukkan terjadinya aglutinasi (penggumpalan BDM) dinyatakan positif HA. Untuk memudahkan pembacaan, pelat rnikrotiter dimiringkan 45 derajat. Penghitungan HA unit dilakukan dengan cara menghitung lubang yang positip dimulai dan enceran yang paling pekat (lubang pertama). Apabila aglutinasi terjadi sampai pada lubang ke-6, maka titer HA dinyatakan dengan nilai 26 yaitu sama dengan 64 HA (Kurniadi 2002).
Gambar ilustrasi HA dan HI
B. Uji Hemaglutinasi inhibition (HI)
Alat dan Bahan: Multichanel micropipette volume 10 – 50 ml Singlechanel micropipette volume 10 – 50 ml Microtips volume 50 ml Microplate type V 96 well Pelarut PBS (Phosphate Buffer saline) 0,01 M steril, ph 7.2 RBC 1 % Serum uji yang telah diinaktifasi pada waterbath 56 ˚C selama 30 menit. Antigen, titer 4HAU. Cara Membuat antigen 4HAU: Sebelum penambahan antigen pada uji HI, antigen tersebut di lakukan uji HA utuk mengetahui titer awal dari antigen tersebut -Dilakukan Uji HA -Setelah diketahui titer awal dari antigen (misal titernya log 29 atau 512) kemudian untuk mendapatkan 4HAU, antigen diencerkan dengan larutan PBS Caranya: Jika titer antigen 512 Maka untuk dijadikan 4 HAU adalah: 512 : 4 = 128 (128 kali) Untuk menjadikan 4HAU adalah 1 bagian antigen diencerkan dengan 127 bagian larutan PBS (1 ml antigen + 127 ml PBS) -Untuk memastikan titer antigen 4 HAU, antigen yang telah diencerkan lakukan uji HA kembali Prosedur: Ke dalam microplate masukan 0.025 ml PBS, dari well no 1 hingga well no 12. Tambahkan 0.025 ml serum uji pada well no.1 yang sudah terisi 0.025 ml PBS Dihomogenkan, ambil 0.025 ml dari well no.1 dan masukan ke well no. 2 kemudian kocok. Lakukan step ini sampai dengan well no. 11, setelah pengocokan pada well 11 larutan sampel serum dibuang 0.025 ml, well ke 12 sebagai control RBC
Masukan 0.025 ml 4HAU antigen ke semua well kecuali well ke 12, kocok dan simpan di suhu ruang selama 30 menit Tambahkan 0.025 ml RBC 1 % kesemua well
Campur dengan baik secara manual (ketuk-ketuk secara perlahan tepi microplate pada setiap sisinya atau dengan menggerakannya dalam bentuk angka 8). Biarkan di suhu ruang 45 menit dan baca titer antibodinya dengan cara memiringkan plate dengan kemiringan 45o Table 2 HI test
Uji HI bertujuan untuk menentukan titer antibodi yang ada dalam serum darah dan mampu digunakan untuk mengetahui sejauh mana tingkat kekebalan hewan terhadap virus tersebut. Titer antibodi yaitu pengenceran tertinggi dari serum yang masih mampu menghambat reaksi aglutinasi eritrosit. Pernbacaan dilakukan setelah 45 menit. Pada lubang yang menunjukkan terjadinya endapan BDM seperti yang terdapat pada lubang kontrol negatif diberikan nilai positif, sedang pada lubang yang tidak menunjukkan adanya endapan tetapi terjadi aglutinasi (penggumpalan) BDM dinilai negatif. Untuk memudahkan pembacaan pelat mikrotiter tersebut dimiringkan sekitar 45 derajat. Penghitungan titer HI dilakukan dengan cara menghitung lubang yang positif, dimulai dan enceran yang paling pekat (lubang pertama). Apabila tidak terjadi aglutinasi sampai pada lubang ke-6, maka titer HI dinyatakan dengan nilai 26 yaitu sama dengan 64 (Kurniadi 2002).
Contoh hasil uji
Gambar HI test, pengenceran serum bertingkat dari terkecil (kiri) ke terbesar (kanan). Hasil positif tidak terjadi agglutinasi (sepuluh kolom kiri) dan hasil negatif terjadi aglutinasi (dua kolom kanan). sumber : info.medion.co.id
JENIS DAN CONTOH PENYAKIT HA-HI TEST
1. Uji HI TEST Hemagglutination Inhibiton Test (HI Test) merupakan uji penghambatan aglutinasi sel darah merah (SDM) karena terjadi penghambatan kemampuan untuk menggumpalkan dari virus oleh antibodi yang sejenis. Uji ini bertujuan untuk identifikasi atau pengenalan jenis antigen tertentu (dengan mereaksikannya dengan antibodi yang diketahui), dan mengetahui jenis antibodi dan titernya yang terdapat dalam contoh sera (dengan mereaksikannya dengan antigen yang diketahui). Uji ini memiliki dua macam cara, yaitu cara alpha (jumlah sera tetap sedangkan virus diencerkan) dan cara beta (sera diencerkan sedangkan virus diencerkan). berdasarkan besar-kecilnya reagen yang digunakan, uji ini bisa menggunakan cara makro (volume dalam ml) dan cara mikro (volume dalam mikroliter). HI titer = end point x HA unit End point (batas akhir) aktivitas penghambatan adalah pengenceran tertinggi dari serum tersebut yang masih dapat menghambat secara sempurna penggumpalan dari SDM. Titer HI dari serum dengan cara beta adalah nilai dari pengenceran serum dikalikan dengan unit aglutinasi yang digunakan. Nuradji (2008), menyatakan bahwa keberadaan virus yang mampu mengaglutinasi sel darah merah (SDM) ayam yaitu virus AI, ND atau EDS (Egg Drop Syndrome). 2. Uji HA TEST Berbagai sifat virus dapat digunakan untuk mengidentifikasi. Salah satu sifat virus yang dapat digunakan untuk mengidentifiksi tersebut adalah kemampuan
mengaglutinasi sel darah merah. Salah satu virus yang dapat mengaglutinasi sel darah merah adalah virus ND (tetelo). Haemaglutinasi (HA) biasanya disebabkan oleh virion itu sendiri ( partikel virus keseluruhan), namun ada juga yang disebabkan oleh haemaglutinin yang dihasilkan selama pembiakan virusnya. Virus dapat mengaglutinasi darah (eritrosit) karena virus mempunyai protein haemaglutinin pada permukaan virusnya. Haemaglutinin secara spontan akan melekat pada permukaan sel darah merah yang merupakan receptor dari membran eritrosit, sehingga membentuk sebuah jembatan antara dua sel darah merah.
Contoh penyakit dengan Uji HA-HI TEST : 1. 2. 3. 4.
Tetelo / Newcastle Disease Avian influenza (AI) CRD (Chronic Respiratory Disease) Infectionis Bronchitis
DAFTAR PUSTAKA Alexander, D.J. 2001. Newcastle disease: The Gordon Memorial Lecture. Br. Poult. Sci. 42:5-22 Darminto dan P. Ronohardjo. 1996. Vaksin Newcastle Disease Inaktif Berasal Dari Virus Isolat Lokal Galur Velogenik. Bogor (ID) : Balai Penelitian Veteriner Grimes, S.E. 2002. A Basic laboratory manual for the small scale production and testing of 1 – 2 Newcastle Disease Vaccine. FAO Regional Office for Asia and the Pacific Indriani, R., Dharmayanti, N.L.P.I., dkk. 2004. Deteksi Respon Antibodi dengan Uji Hemaglutinasi Inhibisi dan Titer Proteksi terhadap Virus Avian Influenza Subtipe H5N1. JITV 9 (3) : 205 Kurniadi P. 2002. Metode Uji Haibat Hemaglutinasi (Hi Test) Sebagai Teknik Pemeriksaan Diagnosis Serologik Terhadap Penyakit Aujeszky. Buletin Teknik Pertanian. Vol. 7. No. 2 Nuradji H. Parade L. 2008. Isolasi dan Identifikasi Virus Avian Influenza Asal Bebek . Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner : 686-687 Siregar A.G.A. 1988. Penuntun Praktikum Virologi dan Serologi. Bogor (ID) : Pusat Antar Universitas
