1
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI
Disusun Oleh :
Nova Gupita Dersonolo
( 08613034)
Ridho Fadhilah
( 09613174)
Novialy Putri
(09613177)
Dwi Purnamasari
( 09613178)
Kelompok C6
Tanggal Praktikum
: 20 Oktober 2011
Tanggal Dikumpulkan
: 27 Oktober 2011
Asisten
: Herninggar
Dosen Pembimbing: Hady Anshory T, S.Si., Apt
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA YOGYAKARTA 2011
2
PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI
I. TUJUAN
Untuk mengetahui teknik perhitungan bakteri dan mampu melakukan perhitungan bakteri secara viable count atau teknik standar plate count dengan sampel air mineral.
II. LATAR BELAKANG
Pertumbuhan pada bakteri mempunyai arti perbanyakan sel dan peningkatan ukuran populasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri/kondisi untuk pertumbuhan optimum adalah: 1. Suhu 2. Sumber Nutrisi 3. pH 4. Zat-zat sisa metabolism 5. Konsentrasi garam 6. Zat kimia Pertumbuhan mikroorganisme terdiri dari beberapa fase yaitu fase adaptasi, pertumbuhan awal, pertumbuhan logaritmik, pertumbuhan lambat, pertumbuhan tetap (stationer), menuju kematian, serta fase kematian.Faktorfaktor yang mempengaruhi pertumbuhan adalah nutrient, air, pH, suhu dan oksigen.Suatu sampel yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml, per g, atau per cm permukaan, memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri, sehingga setelah dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah antara 30 – 300. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloni dapat dihitung sebagai satu koloni dan satu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. Untuk mendapatkan atau mengetahui jumlah mikroorganisme tertentu, maka dilakukan teknik perhitungan jumlah bakteri. Teknik perhitungan bakteri
3
dilakukan secara viable count atau teknik standar plate count dengan sampelyang digunakan yaitu air mineral.
III.
DASAR TEORI
Perkembangan mikrobiologi yang pesat salah satunya pada bidang produk makanan dan minuman tak lepas dari peran ilmu mikrobiologi. Para produsen makanan dan minuman berusaha untuk sebisa mungkin produk dari makanan dan minuman yang mereka produksi bebas dari pengaruh kontaminan seperti mikroba dan jasa drenik yang dapat merugikan dan mengganggu kesehatan konsumen. Namun tidak semua mikroba dapat merugikan kesehatan manusia, dikarenakan ada beberapa mikroba yang justru dapat membantu dalam proses pembuatan produk pangan, diantaranya produk hasil fermentasi seperti pada pembuatan yoghurt yang dibantu oleh mikroba lactobacillus bulgaricus. Sekaranginibanyaksudahprodukmakanansertaminuman yang pada proses pembuatanya menggunakan proses fermentasi. Produk makanan dan minuman penting untuk mengetahui ada tidaknya kandungan mikroba dalam produk tersebut, agar kita dapat mengetahui produk tersebut layak dikonsumsi atau tidak, hal ini juga akan berpengaruh pada kelayakan produk pangan dapat dipasarkan atau tidak, dapat pula dijadikan parameter kadaluarsa dari suatu produk. Pembiakan mikroba dalam laboratorium memerlukan medium yang berisi
zat
hara
serta
lingkungan
pertumbuhan
yang
sesuai
dengan
mikroorganisme. Zat hara yang digunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan, sintesis
sel, keperluan energi dalam metabolisme,
dan
pergerakan. Lazimnya, medium biakan berisi air, sumber energi, zat hara sebagai sumber sebagai sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen, hidrogen serta unsur – unsur sekelumit (trace element). Dalam bahan dasar medium dapat pula ditambahkan faktor pertumbuhan berupa asam amino, vitamin atau nukleotida(3). Tujuan penghitungan angka kuman anatara lain:
1. Membantu menegakan diagnosa 2. Mengetahui adanya cairan mikroorganisme pada makanan, minuman, kosmetik atau sediaan obat.
4
3. Kontrol kualitas mikrobiologi (1). Metode yang digunakan untuk menentukan jumlah bakteri ada 2, yaitu :
1. Jumlah bakteri secara keseluruhan ( Total Cell Count ) a) Menghitung langsung secara mikroskopik Pada metode ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil, untuk itu digunakan kaca obyek khusus yang bergaris ( Petroff – Hauster ) berbentuk bujur sangkar. Hitungan mikroskopik dilakukan dengan pertolongan kotak – kotak skala, dimana dalam setiap ukuran skalaseluas 1 mm2 terdapat 25 kotak besar dengan luas 0,04 mm 2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak – kotak kecil. Tinggi sampel yang terletak diantara kaca bend dan kaca penutup adalah 0,02 mm. Jumlah sel dalam beberapa kotak besar dapat dihitung, kemudian dapat dihitung jumlah setiap rata – rata dalam kotak besar. Metode ini umumnya cepat dan murah namun memiliki kelemahan, sbb : 1. Sel
–
sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel
yang hidup, 2. Sel
–
sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop
sehingga bila tidak,
teliti tidak akan terhitung,
3. Untuk mempertinggi penelitian jumlah sel dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal untuk bakteri 10 6 sel/ml. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat jumlah sel yang dapat vdihitung, dan 4. Tidak dapat digunakan untuk bahan makanan yang mengandung ekstrak makanan karena akan mengganggu perhitungan sel (3). b) Menghitung dengan cara kekeruhan Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar teknik ini adalah bakteri merupakan suatu partikel sinar yang mengenai sel bakteri sebagian akan diabsorpsi, dan sebagian lain akan diteruskan. Jumlah sinar yang diabsorpsi jumlah sel bakteri/absorbansi (optical density) – jumlah bakteri(1). c). Menghitung dengan cara pengecetan
5
Sampel sebanyak 100
μl,
lalu diletakkan pada sebuah kaca dan
dilakukan pengecetan. d) Menghitung dengan cara sentrifuge Syarat metode ini adalah sampel harus murni harus berisi bakteri yang berasal dari satu jenis bakteri saja dan ukuran / volume untuk satu sel bakteri yang akan ditentukan jumlahnya harus diketahui. Prosedur : sampel dalam tabung reaksi disentrifuge dengan kecepatan tertentu. Bakteri akan membentuk endapan, diukur volume endapan tersebut lalu diperbandingkan dengan volume sati sel bakteri, sehingga diperoleh nilai jumlah bakteri dalam sampel. e) Menghitung dengan cara perbandingan dengan darah Sejumlah darah diteteskan pada mikroskop. Diperbandingkan jumlah/volume
darah dengan jumlah bakteri. Jumlah normal darah
merah adalh 5 juta/ml. Misal, terdapat x bakteri dalam 100 ml darah , maka x/100 x 5 juta = y. f) Menghitung dengan elektronik counter Ukuran bakteri yang berkisar 0,1
–
1
μm
dapat dihitung secara
otomatis dengan melewatkan sampel pada elektronik counter ( syarat minimal ukuran partikel adalah 30 nm ). 2. Jumlah bakteri yang hidu p ( Viable Count ) Perhitungan jumlah mikroorganisme dengan cara viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah diinkubasi dalam media biakkan dan lingkungan yang sesuai. Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut(1). Metode ini merupakan cara yang paling sensitive untuk menentukan jumlah mikroorganisme, dengan alasan :
Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung,
Beberapa mikroorganisme dapat dihitung sekaligus, dan
6
Dapat
digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena
koloni yang terbentuk
mungkin
berasal
dari
mikrobia
yang
mempunyau penampakkan spesifik (3). Selain keuntungan
–
keuntungan tersebut, metode ini juga memiliki
kelemahan – kelemahan sbb :
Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang serbenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membebtuk koloni.
Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula.
Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat timbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak, tidak menyebar.
Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama (3). Metode Viable count dibedakan atas 2 cara, yakni metode tuang
(pour plate) dan metode permukaan (surface/spread plate). Pada metode tuang, sejumlah sampel (1 ml atau 0,1 ml) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambah agar – agar cair steril yang telah didinginkan (47 – 50°C) sebanyak 15 -20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya menyebar. Setelah pada penanaman dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat agar, kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar – agar tersebut. Kemudian diratakan dengan batang gelas melengkung yang steril (3). Laporan dari hasil menghitung dengan metode ini menggunakan suatu standar yang disebut Standar Plate Counts (SPC), sebagai berikut :Cawan yang dipilih dan yang dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 – 300 koloni,
Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni, dan
Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni (2).
7
III.
ALAT DAN BAHAN
Alat : 1.
Autoklaf
2.
Blue tip
3.
Cawan Petri
4.
Electronic counter
5.
Erlenmeyer
6.
Gelas beaker
7.
Gelas ukur
8.
Inkubator
9.
Kapas
10. Kaertas alumunium 11. Kertas coklat 12. LAF 13. Lampu spiritus 14. Mikro pipet 15. Ose 16. Pipet volume 17. Pro pipet 18. Spatula 19. Spreader 20. Tabung reaksi 21. Timbangan analitik 22. Yellow tipe
Bahan : 1. Media Mc Conkey 2. APHA 3. Nutrient broth 4. Air mineral
8
A. Cara Kerja
Hari Pertama Dibuat pengenceran 10-2 – 10-6 dari sampel dengan cara mengambil 0,1 ml sampel, masukkan ke tabung A ad 10 ml aquades
Ambil 0,1 ml dari tabung A, masukkan ke dalam tabung B ad 10 ml aquades
Ambil 0,1 ml dari tabung B, masukkan ke dalam tabung C ad 10 ml aquades
Encerkan 4 media Plate Count Agar @ 20ml pada labu erlenmeyer
Lakukan sterilisasi dengan autoklaf
Tuangkan ke dalam petri dish dan biarkan sampai membeku
Pipet cairan sampel dari masing-masing pengenceran sebanyak 1 ml dan 0,1 ml dari tabung B, 1 ml dan 0,1 ml dari tabung C ke dalam petri dish yang telah berisi media padat
Ratakan sampel diatas media dengan menggunakan spreader/ penyebar
Inkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam dengan posisi terbalik
9
Hari kedua Dihiitung jumlah koloni pada lempengan agar. Gunakan lempengan agar yang mempunyai 30-300 koloni. Bila tidak ada lempengan yang mempunyai kis aran jumlah koloni tersebut gunakan lempengan agar yang mempunyai koloni sekitar 300 koloni
Ditentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan cara mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran IV.
HASIL Gambar 1. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 10.000
Gambar 2. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 100.000
10
Gambar 4. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 1.000.000
Gambar 5. Biakan pada media padat (APHA) 1 : 10.000.000
Gambar 6. Biakan pada media M c Conkey
11
Gambar Perhitungan Bakteri
media padat (APHA) 1 : 10.000
media padat (APHA) 1 : 100.000
media padat (APHA) 1 : 1.000.000
12
media padat (APHA) 1 : 10.000.000
Perhitungan Jumlah Koloni
V.
Pengenceran
Volume sampel
Jumlah koloni
CFU /ml
10.000 x
1 ml
531
8,31 x 10
100.000 x
0,1 ml
683
1,05 x 10
1.000.000 x
1 ml
618
9,46 x 10
10.000.000 x
0,1 ml
428
6,55 x 10
PEMBAHASAN
Tujuan dari praktikum ini adalah agar praktikan mampu melakukan teknik perhitungan jumlah bakteri secara viable count atau lebih khususnya menggunakan teknik standard plate count . Perhitungan dengan teknik
standard
count
merupakan
perhitungan
bakteri
dengan
menggunakan suatu alat yang namanya elekronic counter yang otomatis dapat menghitung jumlah bakteri yang hidup saja, jadi bakteri yang mati tidak di hitung. Pada praktikum kali ini, sampel yang kami gunakan adalah air mineral, umunya bakteri yang terdapat dalam air mineral adalah bakteri E. Coli, bakteri koliform. Metode yang digunakan pada praktikum ini adalah metode viable count dengan menggunakan media agar membrane larutan APHA yang merupakan media padat.
13
Fungsi memindahkan bakteri dari sampel menuju ke media pertumbuhan agar membran APHA di LAF adalah agar steril karena di LAF tempatnya steril dengan prinsip blower akan mengeluarkan udara dari atas LAF tersebut dan dengan sinar ultra violet akan membunuh bakteri di sekitar ruangan tersebut sehingga kerjanya terjamin sterilisasinya. Fungsi 4 petridish yang akan disterilisasi dengan autoklaf dibungkus dengan kertas steril yaitu agar pada saat dikeluarkan dari autoklaf bakteri yang ada diruangan hanya mengkonaminasi kertasnya jadi tidak sampai kecawan petridis. Alat-alat yang digunakan pada praktikum Mikrobiologi Dasar materi perhitungan koloni bakteri dan isolasi antara lain :
Jarum Loop : untuk memindahkan/menginokulasi mikroba dari media padat ke cair atau sebaliknya.
Cawan petri : sebagai wadah untuk penanaman bakteri dan jamur.
Bunsen : untuk pengkondisian aseptis.
Incase : untuk menginkubasi media pada suhu kamar.
Colony Counter : untuk menghitung jumlah koloni bakteri.
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum Mikrobiologi Dasar materi perhitungan kolonii bakteri dan isolasi antara lain :
NA : sebagai media untuk bakteri.
Alkohol : untuk pengkondisian steril alat/lingkungan.
Kapas : untuk menutup lubang pangkal pipet serologis saat akan diinkubasi. Pada hari pertama, bakteri dikembangbiakkan pada 4 media
nutrient agar APHA dengan pengenceran 1:10.000 dan 1:100.000 dari tabung B, 1:10.000.000 dan 1:1000.000 dari tabung C, yang digunakan untuk pengembang biakkan bakteri yang kemudian dapat dihitung jumlah bakteri pada media tersebut, dan 1 media McConkey sebagai pengembang biakkan bakteri Gram negatif yang kemudian dapat diambil beberapa koloni untuk ditumbuhkan kedalam nutrient broth dalam tabung reaksi yang dilakukan pada hari kedua. Hasil koloni bakteri yang tumbuh pada
14
nutrient broth tersebut yang kemudian digunakan pada praktikum selanjutnya. Bakteri yang terhitung pada pengenceran 1:10.000 adalah sebesar 618, dan pada pengenceran 1 : 1.000.000 adalah pengenceran
683. Sedangkan
1:10.000 didapatkan jumlah koloni 531 dan pada
pengenceran 1 : 1.000.000 didapatkan 428 koloni bakteri. Pada umunya, bakteri yang terdapat pada air mineral khusunya pada sampel kami, yaitu Aqua terdapat sedikit bakteri, teapi pada praktikum kali ini, pada saat perhitungan jumlah bakteri dengan alat electronic counter, banyak sekali bakteri yang terhitung. Ini disebabkan banyaknya kontaminan yang mengkontaminasi dikarenakan pada saat akan memasukkan sampel ke petridish, tidak memanaskan seluruh sisi permukaan petri dish pada setelah menyebarkanya dan sesudahnya. Dan kapas yang digunakan untuk menutup tabung reaksi yang berisi sampel terbakar pada saat akan memanaskan ujung mulut tabung reaksi. Akibatnya terdapat banyak kontaminan. Pada pengembang biakan bakteri dengan media McConkey, kultur bakteri digoreskan pada media dengan sistem quadrant. Pengambilan dilakukan
setelah
diinkubasi
pada
hari
kedua
dan
pada
media
menunjukkan bintik-bintik merah dan putih. Pengambilan diambil koloni merah yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri Gram negatif. Pada saat pengambilan pun juga harus diperhatikan teknik aseptis supaya pengembang biakan bakteri pada nutrient broth tidak terjadi kontaminasi dengan mikroorganisme yang tidak diharapkan.
IV.
PERTANYAAN
a. Teknik perhitungan bakteri ada dua cara perhitungan langsung dan perhitungan tidak langsung
Perhitungan bakteri langsung : perhitungan bakteri yang langsung dilakukan di bawah mikroskop atau dengan perhitungan dengan alat penghitung elektronik
15
Perhitungan
bakteri
secara
tidak
langsung
:
dengan
mengkonsentrasikan mikroorganisme dalam sampel dan kemudian di tanam pada media yang sesuai yang kemudian akan tumbuh koloni pada media tersebut missal pada plat agar Metode perhitungan bakteri secara tidak langsung meliputi 1. Pengukuran dengan bilik hitung 2. Pengukuran dengan elektronik counter 3. Pengukuran dengan plating takhnique 4. Pengukuran dengan teknik filtrasi membrane b. Teknik membuat pengenceran 1:10 Dibuat sampel dengan mengambil 1 ml sampel dan di larutkan dengan NaCl isotonis
Diambil 1 ml, dan di add NaCl 9 ml maka didapatkan pengenceran 1:10
VI.
DAFTAR PUSTAKA
1.
Mulyaningsih, Sri. 2004. Diktat Analisis Mikrobiologi. Jurusan Farmasi. FMIPA UII,Yogyakarta. Hal : 36.
2.
Lay, Bibiana W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta. Hal : 48-49.
3.
Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. UMM-Press, Malang. Hal : 84-85.
