LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROTEKNIK TUMBUHAN
PERCOBAAN I
PEMBUATAN PREPARAT MELINTANG DENGAN METODE PARAFIN
NAMA : MUHAMMAD ABDUL
NIM : H411 14 510
KELOMPOK : VII (TUJUH)
ASISTEN : SARTIKA SARI
HARI/TANGGAL : JUMAT/26FEBRUARI 2016
LABORATORIUM BOTANI JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2016
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Meneliti suatu organisme, baik dari tingkatan sel, jaringan, organ dan sebagainya memerlukan cara tertentu untuk mempermudah penelitian tersebut. Hewan dan tumbuhan dapat diteliti dengan terlebih dahulu membuat preparat dengan berbagai metode yang telah ditemukan, metode tersebut yang paling umum adalah mikroteknik.
Mikroteknik semakin berkembang dewasa ini, banyak metode yang digunakan untuk pembuatan sediaan tergantung bahan yang akan digunakan. sel hewan yang kebanyakan digunakan untuk pembuatan sediaan dengan metode smear ataupun embedding dan seringkali pula dengan metodewhole mount. Sedangkan sel tumbuhan kebanyakandibuat dengan menggunakan metode yang lebih ringan daripada sel hewan karenastruktur sel hewan dan sel tumbuhan yang berbeda. Metode yang paling umumdigunakan untuk melihat jaringan dan sel tumbuhan adalah metode parafin denganbahan utamanya adalah blok parafin (Sedjo, 2004).
Salah satu metode yang digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah metode parafin. Metode parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen dengan menggunakan para fin sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 µm-8 µm. Alat yang digunakan untuk dapat mencapai hasil irisan 6 µm-8 µm adalah mikrotom Untuk mengamati dan melihat preparat secara melintang dari akar jagung Zea mays dengan menggunakan metode parafin, maka dilakukanlah percobaan ini.
I.2 Tujuan Praktikum
Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengamati dan melihat preparat secara melintang dari akar jagung Zea mays dengan menggunakan metode parafin.
I.3 Waktu dan Tempat Praktikum
Percobaan ini dilakukan pada hari Jumat, 26 Februari 2016 pukul 14:00-18:00 WITA di Laboratorium Botani, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewan ataupun tumbuhan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan penyelubungan karena jaringan merupakan bahan yang lunak. Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya. Dilakukan infiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnai lalu dimounting, dan diberi label nama (Nugroho, 2006).
Gambar 1.MikrotomPutar. Sumber: www.aliexpress.com
Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau standar. Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode ini. Kebaikan-kebaikan jaringan ini adalah irisan menjadi lebih tipis dibandingkan metode beku atau metode seloidin. Dengan menggunakan metode beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tetapi dengan metode parafin irisan dapat mencapai tebal 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah, bila menggunakan metode ini. Prosesnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin, kejelekannya adalah jaringan menjadi keras, mengkerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan bila menggunakan metode ini. Sebagian enzim-enzim akan larut di dalam metode ini (Sugiharto, 1989).
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode parafin melalui beberapa tahapan, yaitu (Widjajanto, 2001):
Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)
Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing). Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan. Pencucian ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis.
Fiksasi (Fixation)
Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran.Media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar Jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan.
Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses dehidrasi merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sample ke dalam larutan dehidrasi secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan mengurai konsentrasi air.
Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode paraffin adalah alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol, aniline oil dan bergamot oil. Alkohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatif lebih murah dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alkohol dipakai serial dengan konsentrasi yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam. Alkohol 70% sebagai stoping point, jaringan di malamkan.
Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alkohol dilakukan setingkat demi setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus dikembalikan ke dehidran.
Penjernihan (Clearing)
Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alkohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam parafin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya.
Infiltrasi (Infiltration)
Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embeddingmedia) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis parafin yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan parafin keras dengan titik leleh 56°C-58°C. Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam parafin murni, tetapi sebelum parafin murni jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan parafin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri prubahan lingkungan yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi sangat mengkerut.
Setelah dalam campuran parafin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke parafin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan dalam oven.Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan parafin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.
Penanaman (Embedding)
Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam balok-balik parafin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok parafin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat permanen.
Parafin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang sama dengan parafin yang digunakn waktu infiltrasi. Parafin ketiga yang dipakai pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat memang sudah bersih dari bahan penjernih.
Penyayatan (Sectioning)
Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop. Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel.
Penempelan dan Afiksasi (Afixing)
Afixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu, dapatberupaparafinpadat yang dicairkanlaludimasukkankedalam box ukurantertentudandibiarkanmemadat. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita parafin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek.
Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)
Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari parafin. Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-selnya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati.
Penutupan dan Labelling
Langkah terakhir adalah menyimpan sayatan dalam canada balsem serta menutupnya dengan kaca penutup. Penempatan kaca penutup hendaklah dilakukan dengan rapi dengan cara menempatkan suatu sisi kaca tersebut samping sayatan kemudian dengan hati-hati sisi dihadapannya diturunkan dengan jarum.
BAB III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat Percobaan
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu mistar, silet, pipet tetes, gelas ukur, erlenmeyer, object glass, dan tabung reaksi.
III.2 Bahan Percobaan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu akar jagung Zea mays, aquadest, xylol, alkohol 96%, 90%, 80%, 70 %, formalin, parafin wax, parafin cair, asam asetat glasial, box kecil dan tissue.
III.3 Cara Kerja
Cara kerja pada percobaan ini yaitu :
I. Pembuatan Larutan FAA
Asam asetat Glasial = 5 ml
Formalin = 5 ml
Alkohol = 96 %
II. Pengenceran Alkohol Bertingkat
Rumus : V1xM1 = V2x M2
Dilakukan pengenceran alkohol 90% yang diencerkan dari alkohol 96% dengan volume aquadest yang digunakan yaitu 6,25 ml dan volume alkohol yaitu 93,75 ml.
Dilakukan pengenceran alkohol 80% yang dimana diencerkan pula dari alkohol 96% dengan volume aquadest yang digunakan 16,67 ml dan volume alkohol yaitu 83,33 ml.
Dilakukan lagi pengencaran alkohol 70% yang dimana diencerkan pula dari alkohol 96% dengan volume aquadest yang digunakan 27,09 ml dan volume alkohol yaitu 72,91 ml.
III. Pembuatan Preparat Permanen
Fiksasi FAA selama 30 menit, fiksasi ini bertujuan untuk mengawetkan semua struktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan pada waktu masih hidup.
Direndam dengan aquadestt selama 30 detik.
Dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 96% masing-masing 10 menit. Dehidrasi ini bertujuan untuk menarik air keluar dari jaringan dan akan digantikan dengan alkohol.
Dealkoholisasi dengan menggunakan alkohol-xylol perbandingan 3:1, 1:1, 1:3 masing-masing 10 menit. Dealkoholisasi ini bertujuan untuk menarik alkohol keluar dari jaringan dan digantikan dengan xylol.
Dilakukan penjernihan dengan menggunakan xylol murni. Penjernihan ini dilakukan 2x yaitu xylol murni I 10 menit dan xylol murni II 10 menit. Penjernihan ini dilakukan untuk menarik sisa alkohol yang masih terdapat dalam jaringan.
Infiltrasi terbagi atas infiltrasi I dan II. Infiltrasi I dilakukan dengan menggunakan xylol-parafin dengan perbandingan 1:9 kemudian dilakukan infiltrasi II yaitu dengan menggunakan parafin murni selama 5 menit. Infiltrasi ini bertujuan untuk mengganti campuran xylol-parafin dengan parafin murni.
Setelah itu dilakukan penanaman(embedding) menggunakan parafin yang padat.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil
IV.1.1 Gambar Penampang Melintang Batang Jagung Zea mays
34
3
4
1
2
Keterangan :
Epidermis (lapisan luar)
Korteks (jaringan dasar)
Floem (pembuluh tapis)
Xilem (pembuluh kayu)
IV.2 Pembahasan
Pada percobaan ini menggunakan jaringan batang tanaman Jagung Zea mays yang dipotong melintang dengan panjang 2mm, kemudian dilakukan fiksasi dengan menggunakan larutan FAA (Formaldehyde Acetic-acid Alkohol96%), selama 30 menit, tujuan dari fiksasi adalah mempertahankan struktur sel dan menghentikn proses metabolisme sel. Setelah melakukan fiksasi selanjutnya dilakukan tahap pencucian untuk menghilangkan larutan FAA dari dalam jaringan. Setelah dilakukan pencucian selanjutnya dilakukan tahap alkoholisasi atau dehidrasi, tahap ini bertujuan untuk menghilangkan kandungan air dari jaringan Zea mays, dehidrasi dilakukan dengan menggunakan alkohol bertingkat dengan konsentrasi mulai dari 70%, 80%, 90%, dan 96% masing-masing selama 5 menit, alkohol bertingkat digunakan agar kandungan air di dalam jaringan dapat keluar sedikit demi sedikit, dan juga agar sel-sel pada jaringan tidak mengalami lisis.
Tahap selanjutnya setelah dehidrasi adalah dealkoholisasi, dealkoholisasi merupakan tahap pengeluaran air ari dalam jaringan. Pada tahap dealkoholisasi menggunkan alkohol dan xylol dengan perbandingan alkohol : xylolyaitu 1:3, 1:1, dan 3:1 dengan rentang waktu setiap 5 menit, hal ini dilakukan agar alkohol dapat dikeluarkan secara maksimal dari dalam jaringan, sehingga larutan xylol yang dapat masuk ke dalam jaringan, dan terikat dengan parafin.
Setelah dilakukan dealkoholisasi, tahap selanjutnya adalah penjernihan, penjernihan bertujuan untuk mengeluarkan sisa-sisa alkohol yang mungkin masih ada di didalam jaringan, penjernihan dilakukan dengan menggunakan xylol I dan xylol II secara bertahap selama 5 menit.
Langkah selanjutnya adalah infiltrasi, pada tahap ini infiltrasi dilakukan sebanyak 2 kali. Pada infiltrasi I digunakan xylol dan parafin dengan perbandingan 1 : 9, dan infiltrasi II dilakukan perendaman dengan menggunakan parafin murni selama 30 menit. Setelah proses infiltrasi dilakukan, selanjutnya dilakukan penanaman jaringan pada parafin yang telah memadat dengan cara meletakkan jaringan pada permukaan parafin padat dan kemudian meneteskan parafin cair pada permukaan jaringan, hingga seluruh jaringan tertutupi oleh parafin cair.Setelah proses penanaman selesai selanjutnya adalah tahap pengirisan dengan menggunakan mikrotom hingga tahap labelling, namun pada percobaan kali ini tidak dilakukan pemotongan karena mikrotom rusak. Sehingga pada praktikum pembuatan preparat melintang dengan metode parafin terhadap jaringan batang tanaman Jagung Zea mays tidak dapat dibuat preparat permanen karena keterbatasan alat.
BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Dari hasil percobaan ini dapat diketahui tahap-tahap pembuatan preparat jaringan batang Jagung Zea mays dengan metode parafin meskipun tidak dapat dihasilkan preparat permanen karena keterbatasan alat yang diunakan. Tahap-tahap pembuatan preparat jaringan batang Jagung Zea mays dengan metode parafin adalah melumpuhkan, fiksasi, dehidrasi, dealkoholisasi, penjernihan, infiltrasi, penanaman (embadding), ukuran mikrotom, penempelan pita, pewarnaan, penutupan dan labelling.
V.2 Saran
Saran yang saya berikan sebaiknya mikrotom yang ada di Laboratorium diadakan demi kelancaran praktikum.
DAFTAR PUSTAKA
Joe, 2012, Picture Mikrotom, www.aliexpress.com, diaksespadatanggal 28 februari 2016, pukul 20:47 WITA.
Nugroho, H. L., 2006,Struktur dan Perkembangan Tumbuhan, PenebarSwadaya, Depok.
Ramdan, 2010, Penampang melintang jagung, http://bioliciousedu.blogspot.com, diakses pada tanggal 04 maret 2016, pukul 06:07 WITA.
Setjo, S., 2004, Anatomi Tumbuhan, Universitas Negeri Malang, Malang.
Sugiharto, 1989,Mikroteknik, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Widjajanto dan Susetyoadi S., 2001, Mikroteknik Tumbuhan, Universitas Negeri Malang, Malang.
