LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI DNA Untuk memenuhi tugas Praktikum Biologi Molekuler Tanggal Praktikum : 10 Oktober 2014
Disusun oleh : Ana Mawarni 4411411019 Alfiatus Z. 4411412022 Darmawati 4411412059 Saeful Anhari 44114120 Ulin Nikhmatul A. 4411412074
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2014
A. TUJUAN -
Mahasiswa dapat melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan dan hewan dengan metode Dixit dan PCI
B. DASAR TEORI Langkah awal setiap percobaan di bidang biologi molekuler adalah memperoleh DNA yang dapat berasal dari berbagai jaringan atau sel makhluk hidup. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik berfungsi untuk mengatur keseimbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler . DNA terdapat pada nukleus, mitokondira dan kloroplas (Ridwan, 2010). DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponenya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah sel lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom (Ridwan, 2010) Prinsip dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding dan membran sel, pemisahan DNA dari debris sel dan purifikasi DNA (Nita, 2013). Dalam menentukan metode ekstraksi DNA yang digunakan sangat bergantung pada sumber DNA-nya. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254). DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberpa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sukit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim (Diah, 2010). Tujuan isolasi DNA menggunakan metode PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) adalah untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya. PhenolChloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi
terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase PhenolChloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar.
C. ALAT DAN BAHAN 1. Alat : -
Botol kecil
-
Label
-
Bekerglass
-
Tube dan Tip
-
Inkubator
-
Sentrifus
-
Mikropipet
-
Mortar dan pestle
-
Neraca analitik
-
Vortex
-
Waterbath
-
Freezer
2. Bahan : -
Daging sapi
-
Buah Strowberry
-
Larutan buffer ekstraksi
-
Pottasium asetat 5 M
-
Chloroform Isoamyl alcohol (CIAA)
-
SDS 20 %
-
Ethanol 70 %
-
Isopropanol
-
Buffer TE
-
Proteinase K
-
NaCl 5 M
-
Phenol
-
Ethanol Absolute dingin
D. METODE a. Isolasi DNA dengan metode Dixit 1. Menggerus 0.5 g sampel dengan menambahan 3ml buffer ekstraksi 2. menambahkan 600µl 20% SDS, kocok kuat 3. Menginkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit, mengocok perlahan tiap 5 menit 4. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 5 menit 5. Memindah supernatant ke tube baru, menambahkan 1 ml Potassium asetat 6. Menginkubasi pada suhu -20 °C selama 10 menit 7. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit 8. Memindahkan supernatant ke tube baru, menambahkan isopropanol sebanyak 2/3 volume supernatant 9. Mengocok perlahan membentuk angka 8 10. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2menit 11. Membuang supernatant, cuci pellet menggunakan 1 ml ethanol 70% 12. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 1 menit 13. Mengeringkan pellet pada suhu37 °C selama 60 menit 14. Melarutkan pellet dalam 100µl buffer TE, simpan pada suhu -20 °C
b. Isolasi DNA dengan metode PCI 1. Mnggerus 30 mg sampel dengan mortar hingga halus, menambahkan 500 µl buffer ekstraksi 2. Menambahkan 20 µl proteinase K (10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex 3. Menginkubasi dalam waterbath 55 °C selama 60 menit, kocok perlahan tiap 10menit 4. Menambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Putar pelan selama 60 menit pada suhu ruang 5. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3,000 rpm selama 5menit 6. Memindahkan supernatant ke tube baru, Menambahkan 50 µl 5 M NaCl dan 1 ml ethanol absolute dingin, kocok perlahan 7. Menginkubasi di freezer selama 60 menit 8. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit 9. Membuang supernatant
10. Menambahkan 1 ml ethanol 70% ke pellet 11. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit 12. Membuang supernatant dan meniriskan sampai tidak ada sisa ethanol yang tertinggal 13. Mengeringkan sisa ethanol padasuhu 37 °C selama 60 menit 14. Menambahkan 50-100 µl buffer TE pada pellet dan simpan pada freezer
E. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi DNA menggunakan Metode dixit Gambar
Hasil Warna larutan kemerahan. Agak berlendir dan keruh
Larutan homogen setelah di sentrifuse
Hasil Isolasi DNA menggunakan Metode PCI Warna agak keruh tekstur agak berlendir larutan homogen
supernatan yang telah di pindahkan ke tub yang baru. Dan pallet di buang supernatan tidak berwarna
Pallet setelah yang telah di keringkan
menggunakan
microwave
Pada praktikum isolasi DNA ini menggunakan sumber jaringan dari tanaman strawberry dan hewan yaitu daging sapi. Tanaman yang digunakan menggunakan
jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan di atas, misalnya menggunakan daging buah. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman atau hewan tersebut dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB dan buffer lisis yang mengandung potasium asetat dan SDS. Proteinase K digunakan untuk membantu mendenaturasi protein pada jaringan.Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen yang dapat melisis dinding sel dan juga mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potasium asetat-protein-debris sel. Kloroform isoamyl alkohol (CIAA) digunakan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan ethanol 70%. DNA dalam ethanol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Dengan menggunakan kedua bahan tersebut yaitu daging sapi dan buah strawberry, kami melakukan isolasi DNA dengan dua metode. Metode yang pertama menggunakan metode PCI ( Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol ) metode yang kedua menggunakan metode dixit. Pada kedua Metode Penambahan buffer ekstarksi pada kedua bahan tersebut dimaksudkan untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer dan menjaga struktur DNA ketika proses penggerusan. Bahan yang telah di tambahkan buffer ekstraksi di gerus untuk mempermudah dan mempercepat proses melisiskan membran sel. Sama halnya dengan pada metode dixit penambahan buffer ekstraksi juga dimaksudkan untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid. Terjadinya proses lisis ditandai dengan adanya tekstur lendir. Kedua metode menggunakan SDS dimaksudkan untuk melisiskan dinding dan membran sel. Untuk PCI ditambahkan proteinase-K untuk mendegradasi protein globuler dan membantu melarutkan lipid dan membran sel. Inkubasi dimaksudkan membantu proses denaturasi pada suhu optimum lipid atau protein dapat terdenaturasi. Pengocokan dimaksudkan supaya denaturasi merata pada seluruh bagian. Pada metode PCI dilakukan di waterbath dan inkubasi pada metode dixit dilakukan di oven. Kemudian pengocokan setiap 10 dan 5 menit.
Sebelum di sentrifuse isolasi DNA yang menggunakan metode PCI ditambahkan NaCl, CIAA, dan phenol. NaCl berfungsi untu menghilangkan polisakarida. Tujuan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar. Fase air yang diambil kemudian diendapkan. untukmenciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Sentrifus pada kedua metode dimaksudkaan supaya larutan dapat homogen lebih cepat. Pada metode PCI setelah sentrifus pertama supernatan ditambahkan larutan NaCl dan absolute dingin kemudain di kocok perlahan selama 60 menit. Hal tersebut di maksdukan agar larutan dapat homogen namun tidak merusak struktur DNA.
F. KESIMPULAN Dari praktikum isolasi DNA dapat disimpulkan bahwa DNA dapat diisolasi, baik pada hewan maupun pada tumbuhan. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
DAFTAR PUSTAKA Mulyani, Yanuar dkk. 2010. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.). Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Jatinangor, UBR 40600. Kusumawaty, Diah. 2010. Isolasi DNA Skala Kecil. Program Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI Maulana, Ridwan dkk. 2010. Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis DNA. http://www.academia.edu/6610678/Laporan_isolasi_DNA. Diakses pada 10 Oktober 2014.
