LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA KI-3061 SEMESTER II 2010/2011
PERCOBAAN VI PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT PIRUVAT DARI SERUM DISUSUN OLEH: IRLYVARA NANDINI 10409032 MIKROBIOLOGI SITH-ITB KELOMPOK 6 HARI/TANGGAL PERCOBAAN: JUMAT/3 APRIL 2011 ASISTEN: NAVIERA YULIASARI NIM ASISTEN: 10408022
LABORATORIUM BIOKIMIA PRODI MIKROBIOLOGI SEKOLAH ILMU TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2011
Laporan Praktikum Ke-6 PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT PIRUVAT DARI SERUM
I. TUJUAN Menentukan piruvat yang terbentuk per menit dari tiap liter serum
II. TEORI DASAR Dalam biokimia, transaminase atau aminotransferase merupakan sebuah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi antara asam amino dengan asam α-keto. Pada reaksi ini, α – amino dipindahkan secara enzimatis ke atom karbon-α pada α-ketoglutarat, sehingga menghasilkan asam- α-keto.
(Lehninger, 2005) Gugus semua aminotransferase memiliki grup prothestic yang sama dan memiliki mekanisme reaksi yang sama. Prothestic group adalah pyridoxal phospate (PLP), koenzime dalam bentuk pyridoxine atau vitamin B 6. Pada percobaan ini, yang menjadi substrat adalah L-alanin dan α-ketoglutarat, yang reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut:
(Berg, 2006)
Dalam percobaan ini, piruvat yang terbentuk per menit setiap liter serum (dengan konsentrasi standar 10 mM) ditentukan dengan rumus :
III. CARA KERJA 1. Pembuatan Sampel o
Dipipet 0,5 ml substrat, lalu diinkubasi dalam waterbath 37 C selama 3 menit. o
Ditambahkan 0,1 ml serum, dan diinkubasi dalam waterbath 37 C selama tepat 60 menit. Ditambahkan 0,5 ml DNFH, dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 20 menit. Lalu ditambah NaOH, dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 10 menit. Diukur absorbansinya. 2. Pembuatan Kontrol Dipipet 0,5 ml substrat dan ditambahkan 0,5 ml DNFH. Diaduk, lalu ditambahkan 0,1 o
ml serum. Diinkubasi pada waterbath 37 C selama 60 menit, dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruangan. Ditambahkan NaOH dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Diukur absorbansinya. 3. Pembuatan blanko o
Dipipet 0,5 ml substrat dan ditambahkan 0,1 ml air, lalu diinkubasi selama 37 C selama 60 menit. Ditambahkan 0,5 ml DNFH dan ditambahkan NaOH, lalu diinkubasi selama 10 menit. Dihitung absorbansinya. 4. Pembuatan Standar Dicampurkan 0,1 ml larutan standar piruvat dengan 0,4 ml substrat, 0,1 air, 0,5 ml DNFH. Diinkubasi pada suhu kamar selama 20 menit. Ditambahkan NaOH 0,4 5 ml. Diinkubasi 10 menit. 5. Semua tabung diukur absorbansinya pada
510
nm.
IV. HASIL PENGAMATAN 1. Hasil pengamatan reagen Yang Dibuat
Penambahan
Hasil
Sampel
Substrat + serum
Warna tetap bening
DNFH
Warna menjadi kuning
Kontrol
NaOH
Warna tetap kuning
Substrat + DNPH
Warna kuning, dan ada endapan
warna
putih
(mirip tetesan cat yang berdifusi dalam air).
Blanko
NaOH
Warna agak kuning
Substrat + air
warna tetap bening
DNPH
Warna menjadi kuning
NaOH
Warna
kuning
agak
memudar Standar
piruvat + substrat + air
bening
DNPH
warna menjadi kuning
NaOH
warna tetap kuning
2. Hasil pengukuran absorbansi Yang Diukur
V.
Kelompok A
Kelompok B
Sampel (T)
0,227
0,032
Kontrol (K)
0,246
0,129
Standar (S)
0,056
0,032
Blanko (B)
0,045
0,034
PERHITUNGAN DAN ANALISIS DATA
Dari hasil pengamatan diatas, maka untuk piruvat yang terbentuk per menit tiap liter serum adalah (dengan rumus Piruvat yang terbentuk per menit setiap liter serum :
)
Kelompok A:
Kelompok B:
VI.
PEMBAHASAN
Prinsip percobaan kali ini adalah mengukur aktivitas enzim aminotransferase dengan mengukur piruvat yang terbentuk tiap menit dari satu liter serum. Aminotransferase adalah enzim yang mengkatalis transfer grup
-amino
disebut sebagai transaminase, menyalurkan
ke asam
-amino
-keto.
Enzim-enzim ini, juga
dari berbagaim macam asam amino to
+
-keto-glutarate untuk mengubahnya menjadi NH 4 . Substrat
-ketoglutarat
dan alanin akan
membentuk produk piruvate dan penambahan 2,4-dinitrophenyl hydrazine akan membentuk kompleks hydrazone saat bereaksi dengan asam
-keto.
Intensitas warna yang dihasilkan
berhubungan dengan aktivitas enzim akan diukur dengan spektrofotometer.
(Berg, 2006) Pengukuran piruvat yang terbentuk tiap menit menggunakan empat macam tabung, yaitu tabung sampel, kontrol, standar, dan blanko. Sampel adalah larutan yang ingin kita ukur aktivitas enzimnya. Dalam tabung sampel, akan terjadi reaksi pembentukan piruvat. Setelah o
diinkubasi selama 60 menit pada waterbath dengan suhu 37 C, penambahan DNPH akan menghancurkan enzim sehingga reaksi terhenti. Sedangkan waktu inkubasi harus tepat 60 o
menit karena pembentukan piruvat baru stabil setelah 60 menit (Reitman, 1957). Suhu 37 C o
digunakan karena aktivitas enzim akan optimum pada suhu 37 C, dan merupakan suhu normal badan.
(Diwan, 2007) Penambahan DNPH juga membentuk senyawa kompleks. Kompleks yang terbentuk adalah DNPH-pyruvate dan DNPH- -ketoglutarat karena belum semua ketoglutarat menjadi glutamate. DNPH-pyruvate akan membentuk senyawa kompleks hidrazon yang dapat diukur secara spektrofotometri. Penambahan NaOH akan memberi suasana basa dan mencegah hidrazon kembali menjadi piruvat, karena suasana basa mencegah reaksi berjalan reversibel (Hummaller, 1957). Dalam suasana basa, akan terbentuk warna kuning yang dapat menjadi indeks aktivitas enzim transaminase. Sehingga yang kita ukur absorbansinya dengan spektrofotometer merupakan absorbansi dari
keto
dan piruvat.
Sedangkan untuk kontrol, penambahan DNPH dilakukan sebelum menginkubasi, dan baru ditambah substrat setelah inkubasi dengan tujuan tidak terbentuknya piruvat. Penambahan
DNPH
membentuk
endapan
putih
yang
merupakan
L-alanine
yang
terdenaturasi. Pengadukan dilakukan agar reaksi berjalan lebih cepat dan endapan protein yang terjadi lebih merata. Pembuatan tabung kontrol ini dimaksudkan untuk membuat tabung yang hanya terdiri atas keto
keto
saja, sehingga absorbansi tabung sampel yang terdiri atas
dan piruvat dapat dikurangkan dengan tabung kontrol yang terdiri atas
keto,
sehingga dapat diukur konsentrasi piruvat murninya. Karena walaupun kecepatan pembentukan kompleks
keto
hanya 1/200 dari pembentukan piruvat, kompleks
tetap dapat memberikan interferensi pada pengukuran. Reaksi yang terjadi antara DNPH dengan piruvat adalah:
keto
Sedangkan untuk 2,4-dinitrophenyl-alanine, strukturnya adalah sebagai berikut:
Dinitrophenyl-l-alanine Pembuatan tabung standar berfungsi untuk membandingkan piruvat pada sampel dengan piruvat yang telah diketahui konsentrasinya, yaitu 10 mM. Pada tabung standar ditambahkan piruvat, substrat, air dan DNPH. Air berfungsi untuk membantu melarutkan piruvat dan substrat. Substrat perlu ditambahkan untuk menyamakan keadaan dengan tabung sampel karena pada tabung sampel masih terdapat sisa substrat (karena belum semua substrat bereaksi dengan serum membentuk piruvat). Fungsi DNPH dan NaOH sama seperti yang telah disebutkan di atas. Pembuatan tabung blanko bertujuan untuk sebagai faktor koreksi. Pada pembuatan blanko ini, reagen yang ditambahkan hanya air, substrat, dan DNPH. Dalam pengukuran, standar harus dikurangkan terlebih dahulu dengan blanko. Keempat tabung tersebut lalu diukur pada
510 nm.
510 nm merupakan panjang
gelombang maksimum sehingga dihasilkan absorbansi yang maksimal. Selain itu
510 nm
merupakan panjang gelombang untuk warna kuning-hijau (Anonim, 2007). Pada kelompok A, setelah mengukur absorbansi dari tabung kontrol, standar, blanko, dan
sampel,
piruvat
yang
terbentuk
per
menit
dari
satu
liter
serum
adalah
-0,2878 . Hal ini disebabkan karena absorbansi kontrol lebih besar daripada absorbansi
sampel. Faktor-faktor kesalahan yang mungkin terjadi adalah: inkubasi tidak tepat 60 menit dan pada pembuatan tabung kontrol tidak dilakukan pengadukan. Lalu dilakukan kesalahan pada perlakuan tabung kontrol, yaitu waktu penginkubasian substrat dan DNPH pada suhu ruangan lebih dari 20 menit dan baru ditambah NaOH. Hal ini menyebabkan absorbansi kurang akurat karena kompleks DNP-alanine yang terbentuk mungkin terlalu banyak. Selain itu, kemungkinan terdapat endapan dari L-alanine yang masuk ke kuvet, sehingga saat dilakukan pengukuran, absorbansi menjadi kurang valid. Kurangnya penambahan reagen j uga dapat terjadi, karena saat mengukur dengan pipet ukur pun terdapat faktor kesalahan. Sedangkan pada kelompok B, berdasarkan perhitungan, piruvat yang terbentuk per menit dari satu liter serum adalah 8,083
µmol.
Walaupun hasilnya lebih dari nol, hasil ini
kurang valid, karena absorbansi dari kontrol melebihi absorbansi dari sampel, dan absorbansi dari blanko melebih absorbansi standar. Hal ini dapat diakibatkan beberapa hal, yaitu kesalahan dalam prosedur, seperti waktu inkubasi tidak tepat 60 menit, dan 20 menit, kurangnya volume penambahan reagen, serum, ataupun substrat. Atau terjadi kontaminasi pada tabung reaksi, atau pengadukan yang kurang kuat sehingga reagen kurang tercampur merata. Oleh itu dapat disimpulkan untuk menghasilkan absorbansi yang valid, seluruh perlakuan sangat penting untuk dilakukan dengan benar. Kadar normal konsentrasi piruvat yang dihasilkan oleh hati pada manusia adalah mencapai 23 mM per menit. Apabila sudah lebih dari 23 mM, maka terjadi kerusakan pada hati. Apabila terjadi kerusakan pada hati, maka enzim transaminase akan dilepas ke darah. Dari konsentrasi piruvat yang diukur oleh kelompok B kurang dari 23 mM, sehingga manusia yang darahnya diukur memiliki hati yang sehat. Sedangkan untuk kelompok A, konsentrasi piruvat tidak valid sehingga tidak dapat ditentukan.
VII.
KESIMPULAN
Dari hasil pengukuran, konsentrasi piruvat yang dihasilkan per menit per liter serum yang diukur kelompok A adalah -0,2878 µM, sedangkan kelompok B adalah 8,083 µM.
VIII.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim 1. 2007. Blood Safety and Clinical TechnologyBlood Safety and Clinical Technology.
http://www.searo.who.int/en/Section10/Section17/S ection53/Section481_
1760.htm.
Berg, Jeremy Mark. 2009. Biochemistry. Hampshire: W. H. Freeman. Amino Acid Catabolism: Carbon skeleton. Diwan, Joyce J. 2007. http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/aacarbon.htm#3chttp://ww w.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/aacarbon.htm#3c. Diakses pada tanggal 12 April 2011. Pukul 03.43 WIB.
Humoller, Fred L. 1957. Improved Method for The Colorimetric Determination of GlutamicOxaloacetic Transaminase Activity. Omaha: Medical Research Laboratory Lehninger. 2005. Lehninger Principles of Biochemistry. New York City: Macmillan Reitman, S & Frankel, S. (1957) Am J Clin Pathol., 28, 56-63.
