MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA Mikroorganisme harus dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrien yang berperan penting untuk pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Susunan b ahan nutrien, baik bahan alami maupun sintetik/buatan, yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri. Media berfungsi untuk menumbuhkan bakteri, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah bakteri, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Macam nutrien yang digunakan tergantung dari macam bakteri yang dibiakkan. Untuk menciptakan keadaan lingkungan yang tepat secara sintetis sebagai pengganti keadaan alam, maka diperlukan persyaratan tertentu agar bakteri dapat tumbuh dan berkembang dengan baik dalam media. Persyaratan tersebut yaitu: 1.
Media harus mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri.
2.
Media harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan bakteri.
3.
Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami bakteri yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain.
A. Bentuk media
Bentuk media ditentukan oleh ada tidaknya penambahan zat pemadatan, seperti agaragar, gelatin dan sebagainya. Ada tiga bentuk media, yaitu: 1. Media padat, Dimana pada media digunakan bahan pemadat, misalnya agar-agar. Jumlah tepung agar yang ditambahkan tergantung kepada jenis mikroba yang dibiakkan. Bila mikroba memerlukan kadar air tinggi maka jumlah tepung agar harus rendah/sedikit, tetapi bila kadar air harus rendah makan penambahan tepung agar harus lebih banyak. Media padat umumnya dipergunakan untuk bakteri, ragi, jamur dn akadang-kadang mikroalgae. Media ini terdiri dari tiga macam bentuk, yaitu: a.
Bentuk lempeng, media dibekukan di dalam cawan pertri.
b. Bentuk miring, media dibekukan dalam keadaan miring di dalam tabung reaksi. c.
Bentuk tegak, media dibekukan dalam keadaan tegak dalam tabung.
2. Media cair,
Yaitu bila ke dalam media tidak ditambahkan zat pemadat. Umumnya dipergunakan untuk pembiakan mikroalgae, kadang-kadang bakteri dan ragi. 3. Media semi padat atau semi cair,
Yaitu bila penambahan zat pemadat hanya 50% atau kurang. Umumnya diperlukan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik atau fakultatif, atau untuk pemeriksaan pergerakkan bakteri.
B. Susunan Media
Sesuai dengan fungsi fisiologi dan masing-masing komponen yang terdapat di dalam media, maka susunan media mempunyai kesamaan isi, yaitu: 1. Kandungan air 2. Kandungan nitrogen, baik berasal dari protein, asam amino, dan senyawa lain yang mengandung nitrogen. Sebagian besar digunakan untuk sintesis protein dan asam-asam nukleat. 3. Kandungan karbon berasal dari karbohidrat, lemak, dan senyawa-senyawa lain yang. Diperlukan sebagai
sumber
energi
bagi
reaksi-reaksi
sintesis
dalam
pertumbuhan,
pemeliharaan
keseimbangan cairan, bergerak dan sebagainya. 4.
Kandungan garam-garam anorganik, baik unsur makro maupun mikro, seperti fosfat, potasium, sodium, besi, mangan, magnesium, dan sulfat
5.
Kandungan vitamin dan asam-asam amino sebagai unsur tambahan bagi pertumbuhan dan sintesis metabolik esensial.
C. Jenis Media
Berdasarkan persyaratan mengenai susunan media bagi pertumbuhan bakteri, maka media dapat berupa:
1. Media alami,
Yaitu media yang disusun oleh bahan-bahan alami seperti kentang, touge, daging, umbiumbian dan sebagainya, pada saat ini media alami yang banyak digunakan adalah dalam bentuk kultur jaringan. Contoh media alami yang paling banyak digunakan adalah penggunaan telur untuk pertumbuhan dan perkembanganbiakan virus. 2. Media Sintetik Atau Buatan
Yaitu media yang disusun oleh senyawa-senyawa kimia baik organik maupun anorganik. Contoh media sintetik bagi pertumbuhan bakteri C lostridium: K 2HPO4
0,5 gram
KH2PO4
0,5 gram
MgSO4
0,1 gram
NaCl
0,1 gram
CaCO3
secukupnya
3. Media Semi Sintetik
Yaitu media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintetik. Misalnya:
Kaldu nutrisi untuk pertumbuhan bakteri: Pepton
10 gram
Ekstrak daging
10 gram
NaCl
5 gram
Aquades
1 liter
D. SIFAT MEDIA
Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakkan mikroba, tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain seperti isolasi, seleksi dan diferensiasi biakan yang didapat. Artinya penggunaan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perrkembangbiakkan mikroba, banyak juga dilakukan dan digunakan. Sehingga masing-masing media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan maksudnya. Berdasarkan sifat-sifatnya, media dibedakan menjadi: 1. Media dasar/ umum
Yaitu media pembiakan sederhana yang mengandung zat-zat yang umum diperlukan oleh sebagian besar mikroorganisme dan dipakai juga sebagai komponen dasar untuk membuat media pembiakan lain.
2. Media Diperkaya
Media ini dibuat dari media dasar dengan penambahan bahan-bahan lain umtuk mempersubur pertumbuhan mikroba tertentu, yang pada media dasar tidak dapat tumbuh dengan baik. Untuk itu dibutuhkan beberapa penambahan nutrisi pengaya kedalam media dasar yang dapat menyokong pertumbuhan mikroba, misalnya dengan menambahkan darah, serum atau ekstrak hati. \3. Media diferensial
Media ini digunakan untuk membedakan bentuk dan karakter koloni mikroba yang tumbuh. Beberapa mikroba dapat tumbuh di dalam media ini, tetapi hanya beberapa jenis saja yang mempunyai penampilan pertumbuhan yang khas. Media ini berfungsi untuk isolasi dan identifikasi bakteri. 4. Media Selektif
Media ini digunakan untuk menyeleksi pertumbuhan mikroba yang diperlukan dari campuran mikroba-mikroba lain yang terdapat dalam bahan yang akan diperiksa. dengan penambahan zat-zat tertentu mikroba yang dicari dapat dipisahkan dengan mudah. Media ini sangat berguna untuk identifikasi. Contohnya, SS-agar (agar Salmonella-Shigella) yang digunakan untuk mengisolasi bakteri jenis Salmonella dan Shigella. 5. Media Uji
Media ini digunakan untuk pengujian senyawa atau benda tertentu dengan bantuan mikroba. Misalnya, media penguji vitamin, antibiotika, residu pestisida, residu deterjen dan lain-lain. Media ini disamping tersusun oleh senyawa dasar untuk kepentingan pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, juga sejumlah senyawa tertentu yang akan diuji. 6. Media Enumerasi
Media ini digunakan untuk menghitung jumlah mikroba pada suatu biakan. Media ini dapat berbentuk media dasar, media selektif, media diferensial maupun media uji. E. Penyiapan Media
Media alami, misalnya susu skim, tidak menimbulkan masalah di dalam penyiapannya sebagai media; hanya semata-mata dituang kedalam wadah-wadah yang sesuai seperti tabung reaksi atau labu dan disterilkan sebelum digunakan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara menambahkan air pada suatu air pada
produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan. Pada praktisnya semua media tersebut secara komersial dalam bentuk bubuk, dan juga dalam bentuk siap pakai di dalam cawan-cawan petri, tabung atau botol. Penyiapan media bakteriologis selain media alamiah mengikuti langkah-langkah berikut: 1.
Setiap komponen atau medium terdehidrasi yang lengkap dilarutkan dalam air suling dengan volume yang sesuai.
2.
pH (derajat keasaman dan kebasaan) medium fluida ditentukan dan disesuaikan (dengan penambahan larutan basa atau asam) dengan nilai optimum bagi pertumbuhan bakteri yang akan dikultivasi. pH ditentukan dengan menggunakan indikator pH.
3. Medium tersebut dituang kedalam wadah yang sesuai seperti tabung, labu, atau botol dan ditutup dengan sumbat kapas atau tutup plastik atau logam sebelum disterilisasi. 4.
Medium itu disterilkan, biasanya dengan menggunakan autoklaf; proses ini menggunakan panas dibawah tekanan uap.
F. Kondisi fisik yang dibutuhkan untuk pertumbuhan
Untuk berhasilnya kultivasi berbagai tipe bakteri, dibutuhkan suatu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang sesuai, seperti;
sfer gas man atau kebasaan (pH)
G. Pilihan Media Dan Kondisi Inkubasi
Untuk dapat memilih dengan baik media dan kondisi fisik, haruslah dapat menjawab pertanyaan-pertanyaan sebagai berikut: 1. Apakah bakteri yang akan diisolasi itu aerobik atau anaerobik? 2. Apakah spesimen itu mengandung bakteri autotrofik atau heterotrofik, dan bila demikian apakah kedua tipe tersebut akan dikultivasi? 3. Apakah spesimen itu mengandung organisme termofilik, mesofilik atau psikrofilik?
Berikut ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi: 1. Lactose Broth
Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.
2. EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)
Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.
3. Nutrient Agar
Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk p angan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Untuk komposisi nutrien agar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.
4. Nutrient Broth
Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut: 1.Larutkan
5
g
pepton
dalam
850
ml
air
distilasi/akuades.
2.Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama. 3.Atur 4.Beri
pH air
sampai
distilasi
7,0.
sebanyak
1.000
ml.
5.Sterilisasi dengan autoklaf.
5. MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)
MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor p ertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung: 1.
Protein
2.
Ekstrak
3. 4. 5.
dari daging
Ekstrak D
ragi (+)
Magnesium
kasein
10 8,0
g/L
4,0 glukosa
sulfat
g/L
g/L 20
0,2
g/L g/L
6. 7. 8. 9.
Agar-agar Dipotassium Tween Diamonium
10.
Natrium
11.
Mangan
14
hidrogen
g/L
phosphate 80
hidrogen
2 1,0
sitrat
sulfat
g/L 2
asetat
g/L
5 0,04
g/L g/L g/L
MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth.
6. Trypticase Soy Broth (TSB)
TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.
7. Plate Count Agar (PCA)
PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.
8. Potato Dextrose Agar (PDA)
PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi
kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. campur dan panaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.
9. VRBA (Violet Red Bile Agar)
VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat.
