PEMBUATAN dan PEWARNAAN HAPUSAN DARAH TEPI
OLEH : PUTU RINA WIDHIASIH (P07134014002)
KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR JURUSAN ANALIS KESEHATAN TAHUN AKADEMIK 2015/2016
Tanggal Praktikum
: 14 & 21 Maret 2016
Materi Praktikum
: Pembuatan dan Pewarnaan Hapusan Darah Tepi
I. TUJUAN Untuk dapat mengetahui cara pembuatan dan pewarnaan sediaan hapusan darah. II.METODE Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah hapusan darah (blood smear) III.
PRINSIP Darah + antikoagulan di teteskan pada objek glass dan di buat hapusan menyerupai lidah, kemudian sediaan di warnai dengan giemsha lalu dibaca dibaca pada mikroskop.
IV.
DASAR TEORI 1. Darah Darah berasal dari kata haima, yang berasal dari akar kata hemo atau hemato. Darah adalah sejenis jaringan ikat yang sel-selnya (elemen pembentuk) tertahan dan dibawa dalam matriks cairan (plasma). Darah terdiri dari 45% korpuskula dan 55% plasma darah. Darah lebih berat dibandingkan air dan lebih kental. Cairan ini memiliki rasa dan bau yang khas, serta PH 7,4 (7,35 - 7,45). (Mansyur Arif.2012) Warna darah bervariasi dari merah terang sampai merah tua kebiruan, bergantung pada kadar oksigen yang dibawa sel darah merah. Volume darah total sekitar 5 liter pada lakilaki dewasa berukuran rata- rata, dan kurang sedikit pada perempuan dewasa. Volume ini bervariasi sesuai dengan ukuran tubuh dan berbanding terbalik dengan jumlah jaringan adiposa dalam tubuh. Volume ini juga bervariasi sesuai dengan perubahan cairan darah dan konsentrasi elektrolitnya. Darah memiliki komposisi yang terdiri atas sekitar 55% cairan darah (plasma) dan 45% sel-sel darah. Elemen pembentuk darah meliputi tiga macam sel darah, yaitu sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit). Ketiga sel-sel darah tersebut tergolong dalam unsur padat yang disebut korpuskuler. (Mansyur Arif.2012)
2. Sediaan hapusan darah Hapusan darah tepi adalah tindakan diagnostik yang digunakan dalam evaluasi dan diagnosis berbagai kondisi medis, atau dalam bahasa Inggris dikenal sebagai Blood Smear.
Ini adalah tindakan standar jika dokter menduga ada penyakit atau infeksi, Hapusan darah tepi biasanya tes diagnostik pertama yang dilakukan.Dalam hapusan darah tepi yang diperiksa adalah tiga komponen utama darah:
Trombosit
Sel darah putih
Sel darah merah Trombosit adalah sel yang memungkinkan pembentukan gumpalan darah untuk
mencegah darah mengalir dengan bebas dalam luka. Hal ini memainkan peran penting dalam proses penyembuhan. Sementara itu, sel-sel darah putih merupakan bagian penting dari sistem kekebalan tubuh karena mereka melawan zat asing dan penyakit menular. Sel darah merah, di sisi lain, memberikan oksigen ke berbagai organ untuk memungkinkan mereka berfungsi secara normal. (Bashar, yazhid.2013) Sediaan hapusan digunakan untuk melihat komponen-komponen ini di bawah mikroskop untuk memeriksa setiap kelainan, seperti dalam bentuk sel-sel atau jumlahnya. Kelainan sel-sel ini menghasilkan komplikasi dalam pengiriman oksigen, dalam sistem kekebalan tubuh, atau pembekuan darah.Hapusan darah tepi merupakan bagian tak terpisahkan dari proses diagnostik. Pewarnaan hapusan merupakan komponen penting dalam pembuatan hapusan ini karena dengan adanya pewarnaan maka akan memberikan gradasi warna dan memperjelas setiap inti dan bagian dari sel-sel darah, sehingga memudahkan dalam pengamatannya. Pewarnaan yang biasa dilakukan adalah pewarnaan Romanowsky yaitu : o Pewarna Wright, yang dipakai sebagai pewarna tunggal o Pewarna Giemsha, yang dipakai sebagai pewarna tunggal atau bersama-sama dengan pewarna May-Grunwald
o Pewarna May-Grunwald, yang dipakai bersama-sama dengan pewarna Giemsha sebagai pewarna May-Grunwald Giemsa (MGG) o Pewarna Leishman, yang dipakai sebagai pewarna tunggal (Riswanto. 2013) Bahkan, hampir setiap pasien akan memerlukan hapusan darah tepi. Namun, beberapa alasan
paling umum mengapa dokter akan meminta tindakan ini adalah untuk
mengidentifikasi alasan mengapa pasien mengalami anemia, penyakit kuning, memar abnormal, nyeri tulang, ruam, infeksi, penurunan berat badan, atau gejala flu berulang. Sangat penting untuk memahami bahwa hasil hapusan darah tepi dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor. Sangat penting bagi Anda untuk menginformasikan dokter, apa saja obat, vitamin, atau suplemen yang Anda konsumsi jika diminta untuk menjalani tindakan tersebut. (Vanila.2011) Beberapa jenis pengobatan paling umum yang akan mempengaruhi hasil tes hapusan darah tepi adalah antikoagulan dan obat untuk penyakit lain. Jika Anda telah didiagnosa dengan penyakit tertentu sebelum menjalani hapusan darah tepi, pastikan bahwa dokter telah diinformasikan soal ini untuk menghindari hasil yang salah. Jika ada kelainan pada sel darah putih, ini bisa menunjukkan kondisi, seperti malaria, hepatitis C, infeksi jamur, infeksi parasit, HIV, limfoma, leukemia akut, dan gangguan limfoproliferatif. Untuk memastikan hasil temuan, dokter pendiagnosa akan menggabungkan hasil hapusan darah tepi dengan hasil tes lain untuk mengkonfirmasi gangguan tertentu. Kelainan trombosit bisa menunjukkan gangguan mieloproliferatif, trombositopenia, penyakit hati, hypothyroidism, atau penyakit ginjal. Hasil sel darah merah yang abnormal dapat mengindikasikan anemia, penyakit sel sabit, polisitemia, defisiensi vitamin B12, atau sindrom hemolitik uremik. (Joy LeFever Kee.2007)
V. ALAT DAN BAHAN a. Alat
Objek glass
Pipet tetes
Rak pewarna
Beaker glass
Pipet ukur
Ball pipet
Botol semprot
Stopwatch
Mikroskop binokuler
b. Bahan
Darah vena dengan antikoagulan EDTA
Tissue
Tissue lensa
Buffer phosfat pH 6.8
Giemsha pekat
Methanol p.a
Alkohol 70 %
VI.
Aquadest
Oil imersi
CARA KERJA a. Pembuatan sediaan hapusan darah 1. Disiapkan alat dan bahan yang akan di gunakan 2. Diteteskan sampel darah pada objek glass 3. Diratakan sampel darah dengan bantuan objek glass yang lain 4. Didorong objek glass dengan membentuk sudut 30-40 derajat 5. Dikeringkan dengan menganginkan sediaan hapusan yang telah dibuat b. Pewarnaan sediaan hapusan darah
Giemsha 1. Diteteskan sediaan darah pada rak pewarnaan 2. Diteteskan methanol pada sediaan selama 5 menit 3. Diteteskan sediaan hapusan dengan giemsha + buffer phosfat (1:4) 4. Diamkan larutan pewarna pada sediaan selama 30 menit 5. Dibilas sediaan yang diwarnai dengan aquadest 6. Dikeringkan dengan menganginkan sediaan hapusan yang telah dibuat
Wright 1. Diteteskan sediaan darah pada rak pewarnaan 2. Diteteskan methanol pada sediaan selama 5 menit 3. Diteteskan cat Wright sebanyak 20 tetes pada hapusan dan tunggu 2 menit 4. Diteteskan buffer phosfat pH 6,4 pada hapusan dan tunggu 20 menit 5. Dibilas sediaan yang diwarnai dengan aquadest atau air mengalir 6. Dikeringkan dengan menganginkan sediaan hapusan yang telah dibuat
VII. HASIL PENGAMATAN
Hapusan darah tepi sebelum dilakukan pengecatan
Hapusan dalam jembatan pengecatan
\
Hapusan dengan pengecatan Giemsha
Hapusan dengan pengecatan Wright
Gambar dibawah mikroskop dengan pengecatan Giemsha
Gambar dibawah mikroskop dengan pengecatan Wright
VIII.
PEMBAHASAN Sediaan hapusan dapat dibedakan menjadi sediaan hapusan darah tipis dan hapusan darah tebal. Kedua jenis hapusan ini biasanya digunakan untuk identifikasi parasit Plasmodium sp. yang menyebabkan penyakit malaria. Pada hematologi pembuatan hapusan darah juga sangat diperlukan untuk membantu diagnosis namun pembuatan hapusan yang digunakan hanya hapusan darah tipis. Sediaan hapusan tipis digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi morfologi sel darah (eritrosit, leukosit dan trombosit), menentukan fraksi jumlah leukosit dan mengestimasi jumlah trombosit. Sediaan ini dibuat dengan meletakkan setetes (kecil saja) darah pada kaca objek, kemudian ditempatkan ujung kaca objek didepan tetesan darah tersebut dan biarkan darah menepati seluruh ujung kaca objek lalu dorong kebelakang sedikit kemudian dorong kedepan sehingga terbentuk hapusan yang tipis yang berbentuk peluru atau lidah. Dimana hapusan ini harus memiliki daerah counting area sebagai tempat untuk penghitungan yang penyebaran eritrositnya merata tidak menumpuk dan tidak jarang.
Hal-hal yang perlu diperhatikan yaitu, Kaca objek yang digunakan harus kering, bersih dari debu dan lemak. Kaca objek yang berminyak/berlemak menyebabkan apusan berlubang-lubang. Hindari menyentuh permukaan kaca objek dengan tangan. Kotoran yang menempel pada kaca objek menyebabkan kesulitan dalam pembacaan. Pada waktu pembuatan sediaan harus memperhatikan sudut kemiringan kaca penggeser dengan kaca objek dan kecepatan penggerakan kaca penghapus sebab dapat berpengaruh pada ketebalaan sediaan yang dibuat, semakin kecil sudut penggeseran dan semakin lambat menggeser, maka semakin tipis apusan. Namun Penyebaran leukosit pada sediaan yang dibuat tidak merata, leukosit kecil-kecil selalu lebih banyak terdapat di tengah-tengah, sedangkan yang besar-besar lebih banyak dipinggir. Maka dari itu sebaiknya digunakan sudut 30-40 derajat saja. (Riswanto. 2013) Ciri-ciri sediaan apusan yang baik yaitu : 1. Memiliki bagian tebal dan bagian tipis untuk pembacan 2. Tidak melebar sampai pinggir kaca objek, panjangnya kira-kira setengah sampai 2/3 kaca objek 3. Penyebaran eritrosit dan leukosit bagus, dimana sel-sel eritrosit terletak berdekatan dan tidak bertumpuk-tumpuk atau menyusun gumpalan dan sel-sel luekosit tersebar merata, tidak terhimpun/menggerombol dipinggirpinggir atau diujung-ujung sediaan. 4. Sediaan tidak boleh berlubang-lubang atau bergaris-garis, ditepi hapusan rata tidak membentuk gerigi. 5. Bentuk seperti peluru
Selanjutnya hapusan yang sudah dibuat sebaiknya difiksasi terlebih dahulu dengan menggunakan larutan methanol selama 5 menit, fiksasi ini bertujuan untuk merekatkan sel-sel darah pada kaca objek. Namun sebelum difiksasi sebaiknya hapusan dipastikan sudah benar-benar kering sempurna. Karena jika tidak kering sempurna maka saat membilasnya dengan aquadest hapusan pada bagian yang belum kering akan ikut larut dengan aquades menyebabkan lubang pada hapusan. Setelah dibilas dengan aquades
ditunggu sampai hapusan kering sempurna kemudian bisa dilanjutkan pewarnaan ataupun disimpan. Pada praktikum kali ini hapusan yang telah difiksasi disimpan terlebih dahulu kemudian baru lakuakan pewarnaan. Pewarna yang digunakan adalah pewarna Romanowsky yang terdiri dari zat warna methylene blue, azure B (produk oksidatif dari methylene blue) dan eosin. Prinsip pewarnaan Romanowsky adalah :
Elemen seluler yang bersifat asam, seperti nucleoprotein, asam nukleat dan protein plasma bereaksi dengan zat warna basa methylene blue dan azure B
sehingga terwarnai biru. Elemen seluler tersebut dinamakan “basofilik” Elemen seluler yang bersifat basa, seperti hemoglobin dan beberapa konstituen sitoplamik leukosit bereaksi dengan zat warna asam eosin dan
terwarnai orange-merah. Mereka dinamakan “asidofilik” Elemen seluler yang bersifat netral, seperti beberapa organela seluler dapat bereaksi dengan zat warna asam maupun basa serta menunjukan warna ungu, yaitu campuran antara warna biru dan merah. Yang dinamakan “neutrofil” (Riswanto. 2013)
Pada praktikum kali ini digunakan 2 macam cat yaitu cat giemsha dan Wright. Pewarna Wright dapat dibeli dalam bentuk serbuk atau larutan siap pakai. Untuk membuat larutan sendiri, serbuk Wright harus diencerkan dengan methyl alcohol (methanol). Setiap 0,1 gram serbuk itu digerus dalam mortar dan dilarutkan dengan methanol sedikit demi sedikit sampai 60 ml. Karena sudah mengandung methanol dengan konsentrasi tinggi pewarnaan Wright tidak perlu difiksasi terlebih dahulu. Namun karena adanya penundaan pewarnaan saat praktikum sehingga hapusan sebelumnya sudah difiksasi dengan methanol. Pewarnaan Wright baik digunakan untuk tujuan penilaian morfologi sel-sel darah karena struktur plasma dan inti (nucleus) lebih jelas terlihat. Sediaan yang banyak berisi sel-sel muda dan sediaan sumsum tulang lebih baik diwarnai dengan pewarna ini. Untuk mendapatkan hasil pewarnaan yang bagus, pewarnaan dilakukan dengan menambahkan larutan penyangga (buffer) fosfat pH 6,4. Larutan buffer
ini dibuat dari kalium dihidrogen fosfat (KH 2PO4) 6,63 gr, natrium hydrogen fosfat (Na2HPO4) 2,56 gr dan 1 liter aquadest. Cara pewarnaan dengan pewarna Wright adalah teteskan 20 tetes cat Wright pada hapusan usahakan memenuhi semua bagian hapusan kemudian tunggu selama 2 menit, lalu tambahkan buffer fosfat dan tunggu 20 menit. Buffer fosfat yang sebaiknya digunakan adalah dengan pH 6,4 namun pada praktikum kali ini digunakan buffer fosfat dengan pH 7 namun penggunaan larutan buffer 7 ini tidak mempengaruhi pewarnaan tetapi sebaiknya menggunakan buffer fosfat dengan pH 6,4. Langkah terakhir dibilas menggunakan aquadest atau air mengalir tunggu hingga kering kemudian dapat dibaca pada mikroskop. Pewarna giemsa biasanya dapat dibeli dalam bentuk larutan. Sebelum digunakan, larutan ini harus diencerkan dengan larutan penyangga (buffer) fosfat pH 6,4. Pewarna Giemsa diencerkan dengan buffer fosfat pH 6,4 dengan perbandingan 1 bagian Giemsa dan 4 bagian atau 3 bagian buffer kemudian saring. Larutan ini harus dibuat dan segera digunakan. Pewarnaan Giemsa tidak mengandung methanol sehingga sediaan perlu difiksasi terlebih dahulu sebelum diwarnai. Zat warna Giemsa sama baiknya dengan zat warna Wright untuk darah yang tidak banyak kelainan morfologinya. Perbedaannya adalah pewarnaan dengan giemsa menyebabkan granula basophil tidak Nampak karena granula itu akan larut. Selain itu eritrosit berwarna abu-abu. Namun jika untuk mengamati parasite-parasit darah lebih baik menggunakan zat warna giemsa. Cara pewarnaan dengan pewarna Giemsha adalah teteskan zat warna Giemsa yang sebelumnya telah diencerkan dengan buffer fosfat dan telah disaring pada hapusan sampai semua bagian hapusan tertutupi oleh zat warna. Kemudian tunggu selama 30 menit. Buffer fosfat yang sebaiknya digunakan adalah dengan pH 6,4 namun pada praktikum kali ini digunakan buffer fosfat dengan pH 7. Langkah terakhir dibilas menggunakan aquadest atau air mengalir tunggu hingga kering kemudian dapat dibaca pada mikroskop. Cara pembacaan hapusan yang benar adalah 1. Pilih bagian yang akan dipakai (zona dimana eritrosit tersebar rata)
2. Mulailah menghitung sel pada pinggir atas kebawah 3. Mulailah menghitung dari bagian ekor Morfologi Sediaan apusan tipis Dibedakan atas : kepala dan ekor Bagian badan dibagi beberapa zona:
Zona I Zona II Zona III Zona IV Zona V Zona VI
: irregular, tidak teratur,berdesakan, 3% : tipis,tidak rata,berdesakan, 14% : tebal, bergerombol,rouleux, 45% : tipis , penyebaran rata, 18% : tidak bertumpukan,penyebaran rata,bentuk utuh,11% : sangat tipis, lebih longgar dan jarang, 9% (Rahma Yuli.2011)
Sumber Kesalahan 1. Kesalahan dalam persiapan penderita, pengambilan dan penyimpanan bahan pemeriksaan 2. Sediaan apus terlalu biru memungkinkan disebabkan oleh apusan yang terlampau tebal , pewarnaan terlalu lama , kurang pencucian , zat warna atau larutan dapar yang alkalis. 3. Sediaan apus terlalu merah mungkin disebabkan oleh sat warna sediaan atau larutan dapar yang asam. Larutan yang terlalu asam dapat menyebabkan lekosit hancur. 4. Bercak-bercak zat warna pada sediaan apus dapat disebabkan oleh zat warna tidak disaring sebelum dipakai atau pewarnaan terlalu lama sehingga zat warna mengering pada sedian. 5. Morfologi sel yang terbaik adalah bila menggunakan darah tepi langsung tanpa anti koagulan. Bila menggunakan anti koagulan sediaan apus harus dibuat segera, tidak lebih dari satu jam setelah pengambilan darah. Penggunaan antikogulan heparin akan menyebabkan latar belakang berwarna biru dan lekosit menggumpal
6. Sediaan hapus yang tidak rata dapat disebabkan oleh kaca pengapus yang tidak bersih atau pinggirannya tidak rata atau oleh kaca objek yang berdebu, berlemak atau bersidik jari. 7. Fiksasi yang tidak baik menyebabkan perubahan morfologi dan warna sediaan. Ini mungkin terjadi apa bila fiksasi dilakukan menggunakan methanol yang tidak absolut karena telah menyerap uap air akibat penyimpanan yang tidak baik. 8. Fiksasi yang tidak dilakukan segera setelah sediaan apus kering dapat mengakibatkan perubahan morfologi lekosit. (Bashar, yazhid.2013) IX. KESIMPULAN Pada praktikum kali ini dibuat hapusan dengan metode blood smear, dan dibuat hapusan setipis mungkin serta digunakan pewarna giemsha dan wright untuk pengecatan sediaan hapusan tersebut.
DAFTAR PUSTAKA Anonim.2011.Sediaan
Apus
Darah.
(online).tersedia:https://nae010693.wordpress.com/tag/sediaan-apus-darah-tepi/.[Diakses: 25 Maret 2016. 10:15] Bashar,
yazhid.2013.Pembuatan
dan
Pewarnaan
Sediaan
Apusan.[online].tersedia
:
http://yazhid28bashar.blogspot.co.id/2013/04/pembuatan-dan-pewarnaan-sediaanapus.html.[diakses 24 Maret 2016 14.45] Joy LeFever Kee.2007.Pedoman Pemeriksaan Laboratorium & Diagnostik.Jakarta : EGC Mansyur Arif.2012. Morfologi sel darah merah artikel, Bagian Patologi Klinik , Fakultas Kedokteran Unhas /UPL. Perjan RS. Dr. Wahidin Sudirohusodo, Makassar
Rahma Yuli.2011.Membuat Sediaan Apusan Darah.[Online].Tersedia : http://AnaliskesehatanIndonesia.Blogspot.Co.Id/2011/03/Membuat-Sediaan-Apus-Darah-Dengan.Html.[diakses 24 Maret 2016 13.02] Riswanto. 2013. Pemeriksaan Laboratorium Hematologi. Yogyakarta: Alfamedia Kanal Medika Vanila.2011.Sediaan
apus
darah
tepi.[online].tersedia
:
http://primavanilla.blogspot.co.id/2011/05/sediaan-apus-darah-tepi.html.[diakses 24 Maret 2016 14.12]
Denpasar, 25 Maret 2016 Praktikan
Putu Rina Widhiasih P07134014002
Lembar Pengesahan
Mengetahui,
Pembimbing I
Pembimbing II
dr. Sianny Herawati, Sp.PK
Rini Riowati, B.Sc
Pembimbing III
Pembimbing IV
I Ketut Adi Santika, A.Md.AK
Luh Putu Rinawati, S.Si
Pembimbing V
I Kadek Aryadi Hartawiguna, A.Md.AK
