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La ferroptosis es un proceso de muerte celular autofágica Minghui Gao 1 , 2 , Prashant Monian Xuejun Jiang 2 1.
1
2.
2 Cell
3.
3 Departamento
4.
4
2
, Qiuhui Pan
2,3
, Wei Zhang
4
, Jenny Xiang
4
y
Departamento de Laboratorio Clínico, Décimo Hospital Hospital del Pueblo, Escuela de Medicina de la Universidad de Tongji, Shanghai, China Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York, Nueva York 10065, EE.UU.
de Medicina de Laboratorio, Centro Médico de Niños de Shanghai, Escuela de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiaotong, Shanghai, China Centro de recursos genómicos de recursos, Weill Cornell Medical College, Nueva York, EE.UU.
Correspondencia: Correspondencia: Minghui Gao, E-mail:
[email protected] ; Xuejun Jiang, E-mail: jiangx@msk E-mail:
[email protected] cc.org Recibido el 14 de junio de 2016; Revisado el 23 de julio de 2016; Aceptado 25 de julio de 2016 Publicación en línea anticipada 12 de agosto de 2016 Iniciode página
Abstracto
La ferroptosis es una forma dependiente del hierro de necrosis regulada. Está implicado en varias enfermedades humanas, incluyendo daño isquémico de órganos y cáncer. Aquí, se reporta el papel crucial de la autofagia, en particula la degradación autofágica de las proteínas celulares de almacenamiento de hierro (un proceso conocido como ferritinofagia), en la ferroptosis. Usando el cribado de RNAi junto con el análisis genético subsecuente, identificamos múltiples genes relacionados con la autofagia como reguladores positivos de l ferroptosis. La inducción de la ferroptosis f erroptosis llevó a la activación de la autofagia la consecuente degradación de la ferritina y el receptor de carga de ferritinofagia NCOA4. De manera consistente, la inhibición de la ferritinofagia por bloqueo de la autofagia o eliminación de NCOA4 anuló la acumulación de hierro lábil celular asociado a la ferroptosis y las especies de oxígeno reactivo ası como la eventual muerte celular ferroptótica. Por ferroptótica. Por lo tanto, Palabras clave: ferroptosis; autofagia; ferritinofagia; homeostasis del hierro; especies de oxígeno reactivas Iniciode página
Introducción
La muerte celular programada es crucial para diversos procesos fisiológicos en organismos multicelulares 1 , 2 , 3 . La desregulación de la muerte celular programada contribuye al desarrollo de múltiples enfermedades humanas, como el cáncer y la neurodegeneración. Aunque la apoptosis es la forma más estudiada de muerte celular programada, estudios recientes demuestran que ta mbién hay procesos d Sign up to vote on this programados title 4,5,6,7 muerte celular que no son apoptosis . Por ejemplo, la necroptosis y la Not useful Useful bajo ferroptosis son dos vías de necrosis reguladas distintas que están control genético preciso y pueden funcionar en diversos contextos fisiológicos y patológicos 8 , 9 ,10 .
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Aunque no se define la función fisiológica de la ferroptosis, se ha establecido su papel en las enfermedades humanas. Por ejemplo, la ferroptosis está implicada en la lesión orgánica inducida por isquemia, y la inhibición de la ferroptosis ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de la isquemia / reperfusión inducida por daño orgánico en múltiples modelos experimentales [ 14 , 16 , 17] . La ferroptosis también se ha investigado en cáncer y cáncer 11 , 13 . Es importante destacar, la ferroptosis contribuye a la función supresora de tumores de p53 [ 18] . La pérdida de p53 conduce a la sobre-regulación transcripcional del transportador de cistina SLC7A11, haciendo así que las células cancerosas sean más resistentes a la ferroptosis.
La autofagia es un proceso catabólico intracelular conservado que entrega componente celulares al lisosoma para la degradación 19 . La maquinaria principal de la autofagia consiste en más de 30 genes relacionados con la autofagia (ATGs). La autofagia es generalmente un mecanismo de supervivencia que responde al estrés. Sin embargo, una teoría controvertida desde la observación original de la autofagia es que la autofagia también puede ser un mecanismo de muerte celular (muerte celular autofágica) 20 , 21 . Autofagia podría promover la muerte celular en contextos específico [ 22 , 23] , pero los mecanismos subyacentes han sido elusivos.
En este estudio, demostrar que la ferroptosis es una forma de muerte celular autofágica. Mecanicamente, la autofagia promueve la ferroptosis mediante una forma de autofagia específica de la carga conocida como ferrotinofagia. Tras la privación de cistina, la autofagia se activa para degradar la ferritina de almacenamiento de hierro, l cual es mediada por el receptor de carga NCOA4. Dicha degradación autofágica mediad por NCOA4 de ferritina (ferropinofagia) 24 ,25 , 26 , 27 , manteniendo el contenido de hierro lábil celular, favorece la acumulación de ROS celulares y la consiguiente muerte celular ferroptótica. Iniciode página
Resultados
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Identificación de nuevos actores de ferroptosis por RNAi screening With Free Trial Para estudiar sistemáticamente Download los mecanismos de ferroptosis, se realizó un cribado RNAi. Una biblioteca de lentivirus de shRNA agrupada dirigida a 4 6 25 'señalización Pathway Targets' (DECIPHER shRNA Library Mouse Módulo 1: https://www.cellecta.com/products-services/cellecta-pooled-lentivirallibraries/decipher-shrna-libraries/ ) se transdujo en fibroblastos embrionarios de ratón de tipo salvaje (MEF). Las células se trataron con medio normal o e l medio inductor de ferroptosis ( Figura 1A y 1B). Posteriormente se realizó la secuenciación profunda de lo shRNAs integrados en el ADN genómico de células de control y células que sobreviviero Sign upde to secuenciación vote on this title condujo a l a la inducción de ferroptosis. La comparación de los datos identificación de shRNAs que se enriquecieron en células que sobreviven al tratamiento Useful Not useful de ferroptosis. Los objetivos genéticos de los shRNAs enriquecidos son genes potenciales que regulan positivamente la ferroptosis. Entre los golpes de la pantalla, se identificaron muchos genes de ferroptosis, como la homeostasis del hierro que regula
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La pantalla genética identifica a los reguladores de la ferroptosis. (A)RNAi estrategia de cribado para identificar nuevos jugadores de ferroptosis. (B) El diagrama de z-score (frecuencia de un shRNA específico en lecturas de secuenciación total calculadas a partir de células tratadas con ferroptosis sobre la frecuencia calculada a partir de células de control) de los resultados de la pantalla RNAi muestra el enriquecimiento de shRNAs individuales. (C) Múltiple reguladores de la ferroptosis conocidos se enriquecieron en nuestro cribado de RNAi. (D)Múltiples genes relacionados con la autofagia fueron enriquecidos en nuestro cribado RNAi. Figura completa y leyenda (77 K )
La autofagia es un regulador positivo de la ferroptosis Para examinar la relación entre la autofagia y la ferroptosis, primero probamos si las condiciones inductoras de ferroptosis estimular la autofagia. El tratamiento de You'repueden Reading a Preview MEFs y células de fibrosarcoma HT1080 humanas con inductor de ferroptosis erastin fullyaccess with a puncta free trial. formación, las características indujo una conversión de LC3I aUnlock LC3II GFP-LC3 de la respuesta de autofagia ( Figura 2A-2D ). El inhibidor lisosómico bafilomicina A1 (BafA1) puede mejorar adicionalmente la acumulación de LC3II y la formación de Download With Free Trial puncta LC3-GFP, indicando un flujo funcionalmente intacto de autofagia. Figura 2.
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El inductor de ferroptosis activa la autofagia. (A , B) La conversión de LC3 inducida por erastina en células MEF (A) y HT1080 (B) . Las células sembrad
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¿Es la autofagia una fuerza motriz para la muerte de células ferroptóticas, como sugier nuestra selección de RNAi? Esta es una cuestión importante ya que la autof agia suele ser un mecanismo de supervivencia contra la muerte. Para abordar esta cuestión, se examinó el efecto de los inhibidores farmacológicos de la autofagia en ferroptosis. En efecto, los inhibidores lisosómicos BafA1 y cloroquina (CQ) pueden bloquear significativamente la ferrroptosis inducida por erastin tanto en MEFs como en células HT1080, medido mediante tinción de yoduro de propidio (PI) acoplada con citometría d flujo ( Figura 3A-3C ). De manera similar, BafA1 también puede inhibir la ferroptosis inducida por inanición de cistina en MEFs y células HT1080 ( información suplementaria Figura S1 ). Se sugirió que la ferroptosis era independiente de la autofagia 12, lo que parece estar en conflicto con nuestro hallazgo. Esto nos impulsó a comparar cuidadosamente nuestros resultados con el informe anterior. En el estudio anterior, la muerte celular se midió en un momento relativamente tardío (24 h). Por lo tanto, se midió la ferroptosis en dos tipos de células diferentes (MEFs y células HT1080) mediant el uso de diversas concentraciones de erastina y en diferentes momentos ( información complementaria, Figura S2 ). BafA1 y CQ bloquearon la ferroptosis en puntos temporales anteriores, pero el efecto inhibidor se perdió gradualmente en puntos posteriores, especialmente cuando se usó una dosis más alta de erastina. En conjunto, la inhibición de la función lisosomal, el punto final del flujo de autofagia, puede atenuar significativamente y retrasar el proceso de ferroptosis. Figura 3.
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La autofagia regula positivamente la ferroptosis. (A - C) Los inhibidores de autofagia BafA1 y CQ inhiben la ferroptosis en células MEF (A , B) y HT1080 (C) . Las células se trataron como se indica. En A , el efecto de los inhibidores de autofagia se demostró mediante microscopía (en blanco y negro fase de contrato, rojo: tinción PI) con los inhibidores y el tiempo (h) de por tratamiento como se in dica. En B y C , la muerte celular se cuantificó Signerastina: up to vote this tinción PI junto con citometría de flujo. 1 \on mu M;title BafA _ {1}: 20 nM; CQ: 50 \ mu M. Los datos muestran medios ± SEM 3 experimentos useful Useful Not de independientes (igual para todos los resultados cuantitativos a partir de entonces). (RE)ATG13 es necesario para la ferroptosis. ATG13KO MEFs, o ATG13KO células reconstituidas con expresión ectópica ATG13, se trataron
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sensibilidad a la ferroptosis ( Figura 3D y 3E ). Consistentemente, la eliminación de otros genes de autofagia, como ULK1 / 2 y ATG5, y la inhibición farmacológica de PI3 quinasa todos condujo a niveles significativamente más bajos de ferroptosis inducida por erastin de una dosis y dependiente del tiempo ( información complementaria, la figura S3). Todos estos resultados demuestran que la mecánica canónica de autofagia juega un papel crucial en la ferroptosis. Es importante destacar que tanto la inhibición genética ( Figura 3E ) como la farmacológica ( Información complementaria, Figura S4 ) de la autofagia también previnieron la ferroptosis inducida por un inhibidor de GPX4, RSL3 de pequeña molécula. Debido a que GPX4 previene la ferroptosis a través de la depuración de los peróxidos lipídicos, es más probable que la autofagia es esencial para la ferroptosis asociada a la generación de ROS y peróxidos lipídicos. Como tal, el bloqueo de autofagia puede prevenir que las células acumulen una cantidad letal de peróxidos lipídicos, un requisito previo para la f erroptosis, incluso cuando GPX4 es inhibido por RSL3.
La autofagia es necesaria para la acumulación de ROS asociada a la ferroptosi La acumulación de ROS es una de las características de ferroptosis. Consistentemente, los inhibidores de la ferroptosis (como la ferrostatina) y diversos antioxidantes o eliminadores de ROS pueden inhibir completamente la acumulación de ROS celular y la muerte celular ferroptótica 12 , 14 . Como la autofagia es necesaria para la fer roptosis inducida por erastin y RSL3, hemos probado si la autofagia es necesaria para la producción de ROS asociada a la ferroptosis, especialmente la acumulación de ROS de lípidos. De hecho, BafA1 y CQ inhibió significativamente la ferroptosis asociada ROS acumulación total ( Figura 4A ]. De forma similar, el nivel de ROS total fue significativamente menor en células deficientes en autofagia (ATG13-knockout (ATG13KO) y ATG3-knockout (ATG3KO)) en comparación con las células rescatadas co autofagia ( Figura 4B y 4C). Es importante destacar que la inhibición tanto farmacológica como genética deYou're la autofagia inhibió significativamente la acumulación Reading a Preview de ROS lipídico asociada a la ferroptosis ( Figura 4D-4F ). Figura 4.
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La autofagia es necesaria para la acumulación de ROS asociada a la
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trataron como se indicó durante 8 h. La GSH total se midió con o sin inhibició farmacológica de la autofagia. BafA _ {1}: 20 nM; CQ: 50 \ mu M. Figura completa y leyenda (56 K )
Debe tenerse en cuenta que, aunque la inhibición de autophagy atenuado erastin inducida por la acumulación de ROS celular, no pudo prevenir la depleción de GSH inducida por la erastina ( Figura 4G ]. Este resultado no es inesperado: la erastina impide la importación de citina y por lo tanto a gota uno de los componentes básicos de la síntesis de GSH; bajo esta condición, el agotamiento de GSH no será impedido por la inhibición de autofagia o cualquier otra intervención aguas abajo.
La autofagia regula la homeostasis del hierro celular La ferroptosis es una necrosis programada dependiente del hierro, y el hierro celular es necesario para la acumulación de ROS sobre la ferroptosis [ 12] . Por lo tanto, la autofagia promover la acumulación de ROS celular sobre la ferroptosis mediante el aumento de los niveles de hierro libre en las células? Para probar esta posibilidad, primero medimos la piscina de hierro lábil celular (LIP). El tratamiento con erastina condujo a un aumento dependiente del tiempo del LIP celular ( Figura 5A ). Posteriormente, probamos si la inhibición de la autofagia puede bloquear el aumento de LIP inducido por erastina. De hecho, BafA1 puede b loquear la ferroptosis asociada LIP aumento ( Figura 5B ]. LIP acumulación también fue significativamente menor en la autofagia deficiente de células en comparación con autophagy reconstituid células ( Figura 5C ]. Figura 5.
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La autofagia es necesaria para la acumulación de hierro lábil asociada a la ferroptosis. (A) El tratamiento con erastina causó un aumento de LIP celular. Los MEF se trataron con erastina (1 μM) durante los tiempos indicados. Las células se tiñeron con éster de calceína-acetoximetilo y LIP se cuantificó posteriormente mediante citometría de flujo. (B) La inhibición Signlaup to vote on this title farmacológica de la autofagia previene acumulación de LIP asociada a la ferroptosis. Los MEF se trataron con o sin B afA1 como se indicó durante 6 h. L useful Useful Noty LIP células se tiñeron con éster de calceína-acetoximetilo, se cuantificó posteriormente mediante citometría de flujo. BafA _ {1}: 20 nM. (DO)La disrupción genética de la autofagia previene la acumulación de LIP asociada a ferroptosis. ATG13KO MEFs o ATG13KO MEF reconstituido con expresión de
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Se ha informado que la homeostasis del hierro celular puede ser regulada por una vía específica de autofagia mediada por NCOA4 llamada ferritinofagia 24 , 25 , 26 , 27. Utilizand el NCOA4 como receptor de carga, la ferritinofagia reconoce la ferritina y la libera para la degradación lisosomal, lo que conduce a la liberación de hierro libre y, por tanto, a aumento de LIP 24 , 25 , 26 , 27 . Se encontró que en el tratamiento con erastina, el nivel de NCOA4 se redujo de manera dependiente del tiempo tanto en MEFs HT1080 y células ( Figura 6A y 6B). La disminución de NCOA4 es a través de la autofagia, ya que la degradación de NCOA4 fue ablated tanto por la inhibición farmacológica y genética de autofagia ( Figura 6C-6F ). De acuerdo con el modelo que la ferritinofagia desempeña un papel crucial en la ferroptosis, la eliminación de la expresión de NCOA4 por knockdown RNAi bloquear significativamente la ferroptosis ( Figura 6G ) y la ferroptosi asociada a la acumulación de ROS lípidos ( Figura 6H ). Figura 6.
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La ferritinofagia mediada por NCOA4 promueve la ferroptosis. (A , B) Unlockindujo full access with a free trial. La ferroptosis la degradación de NCOA4 de una manera dependiente de tiempo en células MEF (A) y HT1080 (B) . MEFs o HT1080 células fueron tratados como se indica. Se utilizó extracto de células totales para la transferencia de Western para detectar Download With Free Trialel cambio de NCOA4 durante la ferroptosis. erastina: 0,5 \ mu M (A) o 5 \ mu M (B) . (C , D) El inhibidor de autofagia BafA1 puede bloquear la degradación de NCOA4 inducida por ferroptosis en células MEF (C) y HT1080 (D). MEFs o HT1080 células fueron tratados como se indica. Se utilizó extracto de células totales para la transferencia de Western para detectar el cambio de NCOA4 durante la ferroptosis. erastina: 0,5 \ mu M (C) o 5 \ mu M (D) . BafA _ {1}: 20 nM. (E , F) La disrupción genética de la autofagia bloquea la degradación de NCOA4 inducida por ferroptosis. Se trataron MEFs (F) reconstituidos con ATG13KO y ATG13 (E) , o MEFs reconstituidos con ATG3KO y ATG3 (F) , con usó para erastina 1 μM durante los tiempos indicados. El lisado celular total se Sign upelto vote on titledurante la la transferencia de Western para detectar cambio dethis NCOA4 ferroptosis. (GRAMO)Knockdown de NCOA4 shRNAs puede bloquear la Useful por Not useful ferroptosis. MEFs infectados con shRNA no objetivo (NT) o dos shRNAs NCOA4 independientes fueron tratados con erastina 0,5 μM durante 12 h. La muerte celular se midió por tinción PI junto con citometría de flujo. (H) Knockdown d
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7C). Para probar si hubo una degradación simultánea de la proteína FTH1 en la inducción de ferroptosis, se controló el nivel de GFP-FTH1 expresado ectopicamente. Como se muestra en la Figura 7D , erastin indujo la degradación de GFP-FTH1, que podría ser prevenido por el inhibidor de autofagia BafA1. Figura 7.
Regulación de la expresión de FTH1 durante la ferroptosis. (A) Laferroptosis indujo un aumento de los niveles de proteína FTH1. Las células HT1080 se trataron con erastina 5 μM durante los tiempos indicados. El lisado celular tota se usó para detectar la expresión de FTH1. (B) La ferroptosis indujo un aumento de los niveles de mRNA FTH1. Las células HT1080 se trataron con erastina 5 μM como se indica. Se aisló ARN total y se midió el nivel de ARNm d FTH1 mediante q-PCR. (C) NCOA4 se requiere para la ARR de ARNm de FTH1 inducida por ferroptosis. Las células HT1080 con o sin depleción de NCOA4 se trataron con erastina 5 μM durante 10 h. Se aisló ARN total y se midió el nivel de ARNm de FTH1 mediante q-PCR. (RE)BafA1 inhibe la ferroptosis asociada FTH1 degradación. Las células HT1080 se trataron como se ha indicado. El lisado celular total se usó para inmunotransferencia para detectar los cambios de los niveles de proteína diana. Figura completa y leyenda (42 K )
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Colectivamente, en este estudio se demuestra que la autofagia juega un papel importante en la regulación de la ferroptosis mediante la regulación de la h omeostasis Download With Free Trial celular de hierro y la generación de ROS celular. Tras la inducción de la f erroptosis, se activa la autofagia, lo que conduce a la degradación de la ferritina de proteína de hierr celular y, por tanto, a un aumento del nivel de lábil lábil celular a través de la v ía de autofagia mediada por NCOA4, ferritinofagia. Los altos niveles de hierro celular lábil aseguran una rápida acumulación de ROS celulares, que es esencial para la ferroptosis
Debe hacerse hincapié en que el efecto de la inhibición de la autofagia en ferroptosis e más evidente en la fase temprana de ferroptosis y cuando la inducción es modesta, yt Sign up to vote on this title efecto se estabilizó en puntos de tiempo posteriores y cuando la inducción es más Useful Figura Not dramático (véase la Figura 3 y complementario información, S3useful ). Esto puede explicar por qué un efecto tan crucial de la autofagia evadió e l primer estudio de ferroptosis 12 , y por qué sólo un modesto efecto de la autofagia se observó en un
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que la autofagia desempeña un papel pro-muerte en la proceso de muerte celular. Mientras que la activación de la autofagia parece ser modesta según se mide por conjugación de LC3, es muy probable que la autofagia específica de la carga, la ferritinofagia, se active preferentemente. Nuestro hallazgo de que la autofagia es cruci para la ferroptosis es relevante para el tratamiento del cáncer y plantea preocupacione sobre las estrategias de terapia de combinación que involucran la inhibición de la autofagia. Por ejemplo, el sorafenib, un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento del cáncer de riñón primario, cáncer de hígado primario avanzado y carcinoma avanzado de tiroides resistente a yodo radiactivo,33 . Si la ferroptosis contribuye efectivamente al efecto terapéutico del sorafenib, entonces la inhibición de autofagia no debe combinarse con el sorafenib para el tratamiento del cáncer. Iniciode página
Materiales y métodos
Reactivos y anticuerpos Los anticuerpos primarios usados fueron anti-LC3 (Sigma, Cat # L7543), anti- γ tubulina (Sigma, Cat # T6557), anti-NCOA4 (Bethyl Labs, Cat # A302-272A), anti-FTH (Cell Signaling, Cat # 4393S), anti-ATG13 (Sigma, Cat # SAB4200100), anti-ATG3 (Ce Signaling, Cat # 3415S), anti-actina (Sigma, Cat # A5316), erastina (Sigma, Cat # E7781), bafilomicina A1 ( Sigma, C at # B1793), Cloroquina (Sigma, Cat # C6628), RSL3 (Selleckchem, Cat # S8155), wortmanina (Cell Signaling, Cat #9951).
Cultivo de células A menos que se especifique lo contrario, todas las células de mamífero se mantienen e DMEM con glucosa alta, piruvato sódico (1 mM), glutamina (2 mM), penicilina (U / ml), estreptomicina (0,1 mg / ml) y 10% FBS a 37 °a CPreview y 5% de CO 2. You're Reading
Medición de la muerte celular y lafull viabilidad Unlock access with acelular free trial. La muerte celular se analizó por tinción PI junto con microscopía o citometría de flujo. La viabilidad celular se determinó usando el CellTiter-Glo luminescent Cell Viabilit Download With Free Trial Assay (Promega).
Pantallas genéticas RNAi de alto rendimiento El virus del ratón de biblioteca de shRNA DECIPHER ™ Lentiviral Módulo 1 con ~ 27 500 horquillas shRNA dirigidas a 4 625 genes fue de Cellecta, Inc. El cribado de ARNi se realizó de acuerdo con el manual del usuario. Brevemente, 8 × 10 7 MEFs fueron infectados con virus a un MOI bajo (0,3) para asegurar que la mayoría de las células sólo reciben 1 construcción viral con alta probabilidad. Después de 48 h, el 20% de Signde upflujo to vote title se eficacia de transducción real se confirmó por citometría y on lasthis células dividieron por igual en 2 muestras (> 1 × 10 8células muestra). Nothoras useful más tarde, / Useful 24 se recogió la muestra A y se almacenó a -80ºC como control, y la muestra B con una confluencia del 80% se sometió a inanición de aminoácidos más la muerte de FBS durante 16 h. Se volvieron a transformar las células en medio DMEM completo y se
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altamente fluorescente es proporcional a la generación de ROS y se analizó usando un citómetro de flujo (Fortessa, BD Biosciences). Se analizó un mínimo de 10.000 células por condición.
Medición de ROS de lípido Las células se trataron como se indicó, y después se añadieron 50 μM de C11-BODIPY (Thermo Fisher, Cat # D3861) y se incubaron durant 1 h. El exceso de C11-BODIPY se eliminó lavando las células dos veces con PBS. Las células marcadas fueron tripsinizadas y resuspendidas en PBS más 5% de FBS. La oxidación de la parte de butadienilo poliinsaturado de C11-BODIPY dio como resultado un desplazamiento del pico de emisión de fluorescencia de ~ 590 nm a ~ 510 nm proporcional a la generación de ROS de lípido y se analizó usando un citómetro de flujo Lentiviral mediada por interferencia shRNA MISSION Los clones de shRNA lentivirales dirigidos a NCOA4 de ratón o humano y construcción de control no dirigida a objetivos se compraron a Sigma-Aldrich. El lentivirus se empaquetó en células 293T y se usó para infectar células diana que luego se seleccionaron con puromicina durante al menos 3 días antes del uso en experimentos. Los ID de clones para el ratón de orientación con shRNA NCOA4-sh1: TRCN0000095080; NCOA4-sh2: TRCN0000095083 y los identificadores de clon para shRNA dirigido al NCOA4-sh1 humano: TRCN0000019724 y NCOA4-sh2: TRCN0000019726.
Medición de GSH Se sembraron 2 x 10 ^ { 5} MEF en placas de seis pocillos. Un día después, las células se trataron como se indicó durante 6 h. Se recogieron las células y se determinaron los números de células. Total de glutatión se midió como se describe anteriormente [ 34]
Microscopio fluorescente You're Reading a Preview Se cultivaron células HT1080 o MEF que expresaban de manera estable GFP -LC3 sobre placas de cubierta de vidrio en una placa de seis Unlock full access with pocillos. a free trial. 24 h más tarde, las células s trataron como se indica. Las láminas de cubierta se f ijaron entonces con paraformaldehído (PFA) al 3,7% (vol / vol) en HEPES 20 mM pH 7,5 durante 30 min a DownloadseWith Free Trial temperatura ambiente. Los portaobjetos montaron entonces en portaobjetos de microscopio para su visualización utilizando el microscopio confocal Nikon usando objetivos de ampliación de 60x.
Medición de LIP LIP se midió de acuerdo con los métodos descritos por Prus y Fibach 35 . Brevemente, las células se tripsinizaron, se lavaron dos veces con 0,5 ml de PBS, y se incubaron a una densidad de 1 × 10 6 / ml durante 15 min a 37 ° C con 0,05 M de éster decalceína up to vote this title acetoximetil (AnaSpec). A continuación, las células seSign lavaron doson veces con 0,5 ml de PBS y se incubaron con deferiprona (100 μM) durante 1 ha 37 ° C o se dejaron sin Useful Not useful tratar. Las células se analizaron con un citómetro de flujo. L a calceína se excitó a 488 nm, y se midió la fluorescencia a 525 nm. La diferencia en la fluorescencia media celul con y sin la incubación de deferiprona refleja la cantidad de LIP.
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La Ferroptosis Es Un Proceso de Muerte Celular Autofágica
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Clorofila
Clase 1 - Lesión Celular
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Análisis estadístico Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism 5.0c GraphPad Software. Los valores de P se calcularon con la prueba t de Student no emparejada . Los datos se presentan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. Iniciode página
Contribuciones de autor
M Gao, X Jiang concebido y supervisado el estudio. M Gao realizó la m ayoría de los experimentos en colaboración con P Monian y Q Pan. W Zhang y J Xiang re alizaron secuenciación de alto rendimiento. M Gao y X Jiang analizaron los datos y escribieron e documento con sugerencias de otros autores. Todos los autores revisaron el document Iniciode página
Intereses Financieros Competentes Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia. Iniciode página
Referencias 1. Danial NN, Korsmeyer SJ. Muerte celular: Puntos críticos de control. Cell 2004; 116 : 205 - 219. | Artículo | PubMed | ISI | CAS | 2. Green DR, Kroemer G. La fisiopatología de la muerte celular mitocondrial. Science 2004; 305 : 626 629. | Artículo | PubMed | ISI | CAS | 3. Fuchs Y, Steller H. La muerte celular programada en el desarrollo animal y la You're Reading a Preview enfermedad. Célula 2011; 147 : 742 - 758. | Artículo | PubMed | ISI | CA Unlock full access with a free trial.
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