LaporanPraktikum Biokimia Fisik
Hari, tanggal Waktu PJP Asisten
: Rabu, 29 Maret-26 April 2017 : 08.00-11.00 WIB : Dr. Dimas Andrianto, Ssi. MSi. : M. Maftuchin Sholeh M Irfani Sri Novita Sagita Zurila Salas
PENGGUNAAN KROMATOGRAFI KOLOM DAN KERTAS DALAM PEMISAHAN KOMPONEN EKSTRAK DAUN GADUNG
Kelompok 8 Wafa Almulki Christian Tonapa Rr. Ike Rahmania S Ahmad Irvan P
G84140072 G84150041 G84150079 G84150083
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2017
PENDAHULUAN Kromatografi adalah teknik pemisahan dan pemurnian komponen dari campurannya yang umum. Teknik kromatografi merupakan teknik pemisahan suatu campuran yang berdasarkan kepada kesetimbangan fase, yaitu fase diam dan fase bergerak. Fase diam merupakan lapisan cairan pelarut (pengembang) yang teradsorpsi pada permukaan kertas, sedangkan fase bergerak merupakan bagian pelarut (pengembang, eluen) yang berfungsi menggerakkan komponen. Fase diam dan fase gerak memiliki tingkat kepolaran yang berbeda agar senyawa dapat terpisah secara difusi. Teknik ini didasarkan pada perbedaan kecepatan migrasi senyawa saat diberi eluen tertentu. Secara umum, ada beberapa macam teknik kromatografi, yaitu kromatografi kertas (KK), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom, kromatografi gas, dan kromatografi kinerja tinggi (KKT) (Pambudi et all . 2014). Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu senyawa menggunakan prinsip dua pelarut yang memiliki perbedaan fase. Pelarut yang digunakan dalam kromatografi terdiri atas fase diam dan fase gerak. Fase diam dan fase gerak memiliki tingkat kepolaran yang berbeda agar senyawa dapat terpisah secara difusi. Senyawa berpisah dan berpindah secara difusi karena senyawa tersebut lebih menyukai salah satu fase. Teknik pemisahan kromatografi dibedakan menjadi dua yaitu kromatografi adsorbsi dan kromatografi partisi. Kromatografi adsorpsi adalah teknik pemisahan yang memanfaatkan gaya tarik kuat gase diam terhadap senyawa yang akan dipisahkan. Gaya tarik ini disebabkan konsentrasi zat yang lebih besar pada perbatasan dibandingkan gaya di setiap fase. Contoh kromatografi adsorpsi adalah kromatografi kolom (Fitriya et al. 2009). Kromatografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang didasarkan pada perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu kromatografi gas dan kromatografi cair (Lie 2001). Menurut Setiawan et al. (2013), kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis memiliki tujuan yang berbeda dalam penggunaannya. Kromatografi kolom bertujuan memisahkan senyawa menjadi beberapa fraksi agar dapat dianalisis secara langsung, sedangkan kromatografi lapis tipis bertujuan memisahkan senyawa menjadi beberapa spot dan memiliki kemurnian yang tinggi. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa yang berbentuk serbuk, sedangkan kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan senyawa berbentuk pasta atau berwujud cair. Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang mudah, sederhana, dan murah. Kromatografi lapis tipis memakai fase diam yang berbentuk tipis atau lembaran. Fase diam yang dipakai biasanya kertas selulosa atau selulosa asetat. Fase gerak yang dapat dipakai hanya pelarut cair saja (Santiago 2013). Kromatografi dapat dilakukan untuk tujuan analisis, baik analisis kualitatif maupun kuantitatif (Bigdeli et al. 2007). Ekstraksi merupakan proses pemisahan bahan dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel dengan penyaringan. Ekstrak awal sulit dipisahkan melalui teknik pemisahan tunggal untuk mengisolasi senyawa tunggal. Oleh karena itu, ekstrak awal perlu dipisahkan ke dalam fraksi yang memiliki polaritas dan ukuran molekul yang sama. Praktikum ini bertujuan untuk memisahkan komponen dari senyawa organik menggunakan berbagai teknik kromatografi. Teknik kromatografi yang dipakai adalah pemisahan dengan kapur kalsium karbonat, kromatografi kolom, dan kromatografi kertas.
Sampel yang dipakai adalah simplisia daun gadung. Praktikum ini diharapkan bisa menjadi dasar dari penggunaan teknik kromatografi.
METODE
Waktu dan Tempat
Praktikum dilakukan pada hari Rabu, 26 April-3 Mei 2017 pukul 08.00-11.00 WIB bertempat di Laboratorium Pendidikan Biokimia, Lt. V, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan yaitu peralatan gelas, glass wool , kain saring, microplate, nanospektrometer, corong plastik, penjepit tabung, blender, penangas air, dan pisau. Bahan yang digunakan yaitu saliva, asam asetat, iod, pati, pengempuk daging komersial (PAYA), putih telur, akuades, buah nanas, kentang, apel, dan jeruk nipis.
Prosedur Percobaan
Ekstraksi Daun Gadung Daun gadung yang telah didapat, dipotong kecil-kecil, diletakkan di atas loyang. Setelah itu, dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 37°C sampai kering. Setelah daun gadung kering, dihaluskan menggunakan blender dan diayak dengan saringan agar mendapatkan bubuk simplisia yang paling halus. Bubuk simplisia ditimbang sebanyak 50 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Etanol dituang ke dalam gelas ukur sebanyak 250 mL dan dicampurkan dengan simplisia secara hati-hati dan bertahap sambil dikocok. Setelah itu, erlenmeyer ditutup menggunakan aluminium foil dan dimaserasi. Setelah dimaserasi, disaring menggunakan kertas saring. Hasil saringan simplisia setelah itu dirotav dengan pelarut etanol 95% menggunakan rotary evaporation sampai filtrat berubah menjadi serbuk, kemudin serbuk daun gadung disimpan untuk praktikum selanjutnya. Kromatografi Kolom Pembuatan fase diam pada kromatografi kolom dilakukan dengan menggunakan Kristal alumina, kalsium karbonat, dan sukrosa. Kristal alumina, kalsium karbonat, dan sukrosa diukur dalam tabung kromatografi kolom berturut-turut setinggi 5 cm, 7 cm, dan 7 cm kemudian masing-masing ditimbang. Kristal tersebut kemudian dilarutkan masing-masing ke dalam heksana hingga terbentuk homogenat. Selanjutnya, homogenat tersebut dimasukkan ke dalam tabung kromatografi kolom dengan urutan alumina, kalsium karbonat, dan yang paling atas adalah sukrosa. Masing-masing homogenat dalam tabung dipisahkan dengan kertas saring.
Selanjutnya sebanyak 0.5 g bubuk ekstrak daun pisang dilarutkan dalam n-heksana 100% kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Larutan ekstrak daun pisang dimasukkan ke dalam kolom kromatografi sampai setinggi 0.5 cm. Pembuatan fase gerak dengan menggunakan campuran eluen n-heksana dan etil asetat 25 mL dengan perbandingan n-heksana 100%, 6:4, 7:3, dan 8:2. Selanjutnya eluen sebagai fase gerak dimasukkan ke dalam kolom kromatografi dengan hasil akhir berupa beberapa fraksi. Kromatografi Kertas Fase gerak dibuat dengan campuran eluen etanol dan kloroform dengan perbandingan 6:4 sedangkan fase diamnya berupa kertas kromatografi. Selanjutnya kertas kromatografi berukuran 20x10 cm dimasukkan ke dalam chamber untuk mendeteksi penjenuhan eluen. Sampel disiapkan sambil menunggu eluen jenuh. Kemudian fraksi yang diperoleh dari hasil kromatografi kolom o
dipanaskan dengan suhu 50 C. Sebanyak 0.5 gram pasta ekstrak daun pisang dan 0,5 gram pasta ekstrak daun mahoni masing-masing dilarutkan ke dalam 1 mL kloroform. Sebuah kertas kromatografi berukuran 6 cm x 20 cm disiapkan, diberi jarak 1 cm dari bawah dan 0,5 cm dari bagian atas menggunakan pensil. Spot dari masing-masing sampel dibuat dari batas garis bawah dan setiap spot diberi jarak 0,5 cm. Kertas kromatografi yang sudah diberi spot dimasukkan ke dalam toples yang telah berisi eluen jenuh dengan posisi spot berada di bawah. Selanjutnya,akan terjadi pemisahan akibat pergerakan fase gerak sepanjang fase diam. Kromatografi Kapur Sebuah kapur tulis dicelupkan ke dalam campuran (larutan ekstraksi daun gadung) hingga campuran naik.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi merupakan suatu proses penyarian suatu senyawa aktif dari suatu bahan atau simplia nabati atau hewani dengan menggunakan pelarut tertentu yang cocok. Pembuatan ekstrak (ekstraksi) bisa dilakukan dengan berbagai metode sesuai dengan sifat dan tujuannya adsorben (Zulharmita et all. 2013). Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan kromatograsi kolom pada prinsipnya sama. Pemisahan ini didasarkan pada perbedaan distribusi zat terlarut diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur (khopkar 2007). KLT merupakan suatu teknik pemisahan dengan menggunakan adsorben (fase stasioner) berupa lapisan tipis seragam yang disalutkan pada permukaan bidang datar berupa lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Pengembangan kromatografi terjadi ketika fase gerak tertapis melewati (Mukhriani 2014). Terdapat beberapa jenis metode ekstraksi yang dapat digunakan diantaranya Maserasi, yang merupakan metode sederhana yang paling banyak digunakan. Cara ini sesuai, baik untuk skala kecil maupun skala industry. Ultrasound - Assisted Solvent Extraction Merupakan metode maserasi yang dimodifikasi dengan menggunakan bantuan ultrasound (sinyal dengan frekuensi tinggi, 20 kHz). Perkolasi, pada metode ini serbuk sampel dibasahi secara perlahan dalam sebuah percolator. Soxhlet Metode ini dilakukan dengan menempatkan serbuk sampel dalam sarung selulosa (dapat digunakan kertas saring) dalam klonsong yang ditempatkan di atas labu dan di bawah kondensor. Reflux dan Destilasi Uap Pada metode reflux, sampel dimasukkan bersama pelarut ke dalam labu yang dihubungkan dengan kondensor. Pelarut dipanaskan hingga
mencapai titik didih (Mukhriani 2014). Maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling sederhana. Bahan simpilisia yang digunakan dihaluskan berupa serbuk kasar. Prinsip dari metode ini dilakukan dengan memasukkan serbuk tanaman dan pelarut yang sesuai ke dalam wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar. Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel dengan penyaringan (Damanik et all . 2014). Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Istilah kromatografi berasal dari kata “chroma” dan “graphein” yang berarti warna dan menuliskan. Prinsip kromatografi adalah adanya distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan. Kromatografi dapat digunakan untuk menganalisa data kualitatif dan kuantitatif (Ardianingsih 2009). Nilai Rf didefinisikan sebagai kecepatan suatu senyawa saat bermigrasi dalam proses kromatografi. Nilainya dapat ditentukan dengan membagi jarak yang ditempuh suatu senyawa dengan jarak yang ditempuh oleh garis. Nilai Rf suatu senyawa spesifik, sehingga dengan mengetahui nilai Rf dapat diketahui jenis senyawa yang terkandung dalam suatu sampel (Damanik et all . 2014). Tabel 1 Pemisahan kromatografi kertas sampel simplisia Eluen
1
Sampel
Jarak eluen (cm)
Meja 1
-
Meja 2
4.15
Meja 3
16.1
Meja 4
4.2
0.227
1.4 6.4 2.8 2.3 11.3 9.8
0.076 0.348 0.152 0,125 0.614 0.533
10.5
0.571
2.1
0.114
Meja 1 Meja 2
Meja 3
Meja 4 2
9.6 Meja 5 Meja 6
Jarak spot (cm)
Rf 0 0.224
18.5
18.4
0.870
0.522
6.5
0.353
6.6 12.4 0.4 3.5
0.359 0.674 0,022 0,190
4
0.217
Meja 7
Berdasarkan percobaan, data pada Tabel 1 menunjukan fraksi kasar hasil pemisahan menggunakan kromatografi kertas memiliki nilai faktor retensi paling kecil dibandingkan ekstrak hasil isolasi daun gadung kromatografi kolom. Hal ini menunjukan fraksi kasar tersebut lebih menyukai fase diam dibandingkan fase geraknya. Fase gerak dalam kromatografi lapis tipis sangat berpengaruh dalam proses pemisahan karena sifat fase gerak akan hampir sama dengan senyawa yang dipisahkan dalam hal kelarutan. Hal ini menunjukan bahwa fase gerak tersebut lebih bersifat non-polar, sedangkan fraksi kasar tersebut dilarutkan ke dalam n-heksan yang bersifat non-polar. Selain itu, hasil pemisahan ekstraksi daun gadung memiliki faktor retensi yang mendekati satu. Hal ini menunjukan fase gerak yang digunakan kurang baik. Fase gerak tersebut kurang baik karena tidak mampu menghasilkan pemisahan yang baik (Fitriya et al. 2009). Spot yang didapat pada percobaan kali ini menggunakan penyinaran sinar UV. Hasil kromatografi sebelumnya sudah diberikan zat warna flouresence sebelum disinari UV. Penyemprotan H2SO4 diikuti dengan pemanasan juga dapat dijadikan sebagai teknik pendeteksian spot. Spot akan menghitam dan mengarang dan dapat diambil untuk kepentingan analisis kuantitatif (Saman 2014). Uap iod juga dapat digunakan untuk pendeteksian spot yang tidak berwarna atau tak berpendar saat disinari UV. Kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas dilakukan menggunakan fase diam berupa kertas selulosa asetat dan fase gerak berupa senyawa volatil yang disebut dengan eluen. Eluen yang digunakan dalam kromatografi kertas untuk analisis fraksi kasar dan hasil ekstraksi simplisia adalah n-heksana:etil asetat dan klorofom:etil asetat dengan perbandingan (1:1). Eluen ini memberikan hasil yang tidak baik karena tidak terjadi pemisahan pada senyawa ekstraksi daun dan nilai faktor retensi yang diperoleh mendekati satu, tepatnya 0. Hal ini disebabkan kombinasi senyawa sebagai eluen kurang tepat. Eluen tersebut akan memiliki pemisahan yang baik jika perbandingannya diubah atau senyawa yang digunakan diganti menjadi kloroform, nheksan dan etil asetat. Hal ini disebabkan kombinasi tersebut memberikan hasil pemisahan yang baik dalam kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (Surita et al. 2007). Tabel 2 Pemisahan kromatografi kolom sampel simplisia Pengelompokan
Fraksi
1
1 dan 2
2
3
3
4
4
5 dan 6
5
7
6
8
7
9
8
10
9
11 dan 12
10
13
Berdasarkan percobaan, data pada Tabel 2 menunjukan fraksi ekstrak kasar yang diperoleh sebanyak sepuluh buah. Fraksi ekstrak kasar tersebut berbeda beda warna dengan menggunakan pelarut n-heksan, . Hal ini menunjukan fraksi tersebut merupakan senyawa yang bersifat non polar. Senyawa tersebut diidentifikasi sebagai senyawa non-polar karena senyawa yang dipisahkan menggunakan kromatografi kolom dipengaruhi oleh fase gerak yang berfungsi sebagai pembawa larutan tersebut. Eluen yang dipakai adalah etil asetat, n-heksana, sebesar 20 mL dengan berbagai perbandingan campuran keduanya 100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80, 0:100. Selain itu, disiapkan juga metanol sebanyak 20 mL dengan perbandingan 100:0. Etil asetat merupakan pelarut semipolar (Astuti 2013) sedangkan n-heksana adalah pelarut nonpolar (Marwoko 2013). Campuran kedua eluan tersebut kemungkinan bersifat nonpolar karena konsentrasi n-heksana masih lebih banyak dibanding etil asetat. Kloroform merupakan senyawa nonpolar sedangkan etanol adalah senyawa polar. Campuran tersebut kemungkinan bersifat nonpolar karena komposisi kloroform lebih banyak dibanding etanol. Kromatografi kolom memiliki fase diam yang berfungsi sebagai agen adsorpsi dalam proses pemisahan senyawa. Fase diam yang digunakan dalam proses pemisahan senyawa simplisia adalah sukrosa, kalsium karbonat, dan alumina. Selain senyawa tersebut, fase diam yang dapat digunakan dalam proses pemisahan senyawa adalah silika gel. Silika gel merupakan fase diam yang paling baik untuk analisis senyawa. Hal ini disebabkan silika gel memiliki ketahanan yang lebih tinggi dibandingkan senyawa lain dan memiliki kemampuan adsorpsi paling baik secara umum (Sitorus et al. 2011). Pada praktikum ini menggunakan sukrosa alumina CaCO3 yang memiliki fungsi yang sama dengan silika. Menurut Sitorus et al. (2011) silika gel dapat digunakan sebagai fase diam dalam pemisahan senyawa yang baik untuk analisa, karena silika gel memiliki ketahanan yang lebih tinggi dibanding senyawa lain da memiliki kemampuan adsorpsi paling baik secara umum. Silika gel dapat menggantikan alumina karena kedua senyawa tersebut memiliki sifat yang sama (Erin 2009 ). Kromatografi mimiliki aplikasi dalam berbagai bidang salah satunya bidang industri. Kromatografi dalam bidang industri berfungsi untuk memurnikan senyawa tertentu dari bahan alam. Contoh kromatografi tersebut adalah pemurnian senyawa linoleat dari minyak jarak. Senyawa ini dimurnikan karena merupakan asam lemak tidak jenuh. Oleh karena itu, senyawa ini memiliki nilai ekonomi yang lebih tinggi dibandingkan senyawa campurannya (Sitorus et al. 2011). Kromatografi juga memiliki aplikasi dalam bidang kesehatan. Kromatografi dalam bidang kesehatan berfungsi untuk mengisolasi senyawa aktif tertentu dari suatu bahan. Contoh kromatografi tersebut adalah isolasi senyawa flavonoid dari daun matoa (Rahimah et al . 2013).
SIMPULAN
Pemisahan komponen-komponen pada sampel organik dapat dilakukan dengan berbagai jenis kromatografi. Fraksi yang berhasil dipisahkan dari simplisia menggunakan kromatografi kolom sebanyak sepuluh fraksi dengan warna yang berbeda-beda. . Menghitung nilai Rf didapat dari jumlah spot yang ada. Semakin tinggi nilai Rf maka semakin banyak spot yang terbentuk. Komponen pada ekstrak daun gadung dapat dipisahkan baik dengan kalsium karbonat, kolom alumina-kalsium karbonat-sukrosa.
DAFTAR PUSTAKA Ardianingsih Retno. 2009. Penggunaan High performance liquid chromatography (HPLC) dalam proses analisa deteksi ion. Jurnal Dirgantara. 10(4) : 101-104. Astuti KW, Artini, Warditiani NK. 2013. Uji fitokimia ekstrak etil asetat rimpang bangle ( Zingiber purpureum R). Jurnal Farmasi Udayana. 2(4): 1-7. Bigdeli M, Falahat-Pishes HR, Neyestani TR. 2007. Simple and rapid gas-chromatograpic method for quantitation of total free valproic acid in human serum. Acta Medica Iranica. 45(2): 85-90. Damanik Desta Donna Putri, Nurhayati Surbakti, Rosdanelli Hasibuan. 2014. Ekstraksi katekin dari daun gambir (Uncaria gambir roxb) dengan metode maserasi. Jurnal Teknik Kimia USU. 3(2) : 10-14. Erin DR, Nurwaini S, Wilisa OY, Mohandani IP. 2009. Formulasi tablet effervescent ekstrak herba sambiloto ( Andrographis paniculata N) dan daun dewandaru (Euginia uniflora L.): uji sifat fisik dan respon rasa. Pharmacon. 10(1): 1-6. Fitriya, Anwar L, Sari F. 2009. Identifikasi flavonoid dari buah tumbuhan mempelas. J Penelit Sains 12(3): 1-5. Khopkar. 2007. Konsep dasar kimia analitik. Jakarta (ID) :UI Press. Lie LCC. 2011. Optimasi metode analisis asam valproat secara kromatografi gas [skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia. Marwoko MTB. 2013. Isolasi, identifikasi, dan uji aktivitas senyawa alkaloid ( Anredera cordifolia S). Chem.info Journal. 1(1): 196-201. Mukhriani. 2014. Ekstraksi, pemisahan senyawa aktif. Jurnal Kesehatan. 7(2) : 361-367.
senyawa,
dan
daun binahong
identifikasi
Pambudi Arief, Syaefudin, Noriko Nita, Swandari R, Azura R. 2014. Identifikasi Bioaktif Golongan Flavonoid Tanaman Anting-Anting ( Acalypha indica L.). Jurnal AL-AZHAR INDONESIA SERI SAINS DAN TEKNOLOGI. 2(3): 178-187. Rahimah, Sayekti E, Jayuska A. 2013. Karakterisasi senyawa flavonoid hasil isolat dari fraksi etil asetat daun matoa ( Pometia pinnata). J KK 2(2): 84-89. Saman SI. 2014. Isolasi dan karakterisasi senyawa flavonoid dan uji aktivitas antioksidan ekstrak metanol rimpang jeringau [tesis]. Gorontalo (ID): Universitas Negeri Gorontalo. Santiago M, Strobel S. 2013. Thin layer chromatography. Methods in Enzymology. 533: 303-324.
Setiawan ASR, Wuryanti, Amini ALN. 2013. Purifikasi L-Asparaginase dari bawang bombay ( Alium cepa I.,) menggunakan kromatografi filtrasi gel sephadex G-100. J Chem Info 1(1): 27-34. Sitorus M, Ibrahim S, Nurdin H, Darwis D. 2011. Isomerasi linoleat dalam minyak jarak hasil hasil dehidrasi menjadi linoleat terkonjugasi dan pemisahannya dengan kromatografi kolom fasa diam silika gel yang diimpregnasi perak nitrat. J Matema Sains 16(1): 1-11. Surita IW, Puspawati NM, Gumiati NK. 2007. Isolasi dan identifikasi senyawa aktif larvasida dari biji mimba ( Azadirachta indika A. Juss) terhadap nyamuk demam berdarah ( Aedes aegypt ). J Kim 1(1): 47-54. Zulharmita, Afrina Reni , Rina Wahyuni. 2013. Ekstraksi asam lemak dari daging buah alpukat. Jurnal Farmasi Higea. 5(1) : 91-98.
