KROMATOGRAFI AFINITAS
[email protected]
KROMATOGRAFI KROMA TOGRAFI AFIN AFINIT ITAS AS @ Fasa diam berupa senyawa biokimia (disebut Ligan afinitas) yang diamobil („immobilize‟) („immobilize‟) melalui ikatan kovalen kepada suatu padatan pendukung (support). @ Sampel dilewatkan dilewatkan pada fasa diam di dalam kolom. @ Hanya komponen tertentu yang terikat (ditahan) oleh ligan secara selektif, komponen-komponen lainnya terelusi, tidak ditahan. @ Pemisahan didasarkan pada ikatan “lock and key” (reaksi-reaksi (reaksi-reaksi dalam biokimia). @ Komponen yang terikat klemudian dielusi dari kolom dengan mengubah fasa gerak.
KROMATOGRAFI AFINITAS @ Sangat spesifik, dan cepat. @ Untuk isolasi preparatif.
KROMATOGRAFI AFINITAS Prinsip pemisahan @ Dasar: Mekanisme Lock and K ey Misal : Inhibitor-Enzim @ Pemurnian Enzim - Inhibitor digunakan sebagai ligan - Ligan diamobil pada padatan pendukung (matriks) - Zat (enzim) yang dimurnikan disebut ligate
KROMATOGRAFI AFINITAS
MATRIKS KOLOM @ Agarose @ Selulosa @ Dekstran @ Poliakrilamid @ Kombinasi polimer @ Manik gelas mikroporus
SYARAT MATRIKS @ Cukup hidrofilik untuk menghindari ikatan non-spesifik dengan solute. @ Stabil terhadap pelarut organik yang bercampur dengan air. @ Berpori sehinggga memudahkan substitusi ligan dan masuknya molekul-molekul besar.
MATRIKS SYARAT @ Inert @ Interaksi non-spesifik kecil @ Longgar dan berpori @ Stabil pH, suhu, dan kekuatan ion @ Punya gugus fungsional aktif
MATRIKS CONTOH @ Agarosa @ Selulosa @ Silika @ Poliakrilamid
AKTIVASI MATRIKS @
Matriks perlu diaktivasi dahulu fungsionalnya tidak cukup aktif.
karena
@
Metode CNBr untuk aktivasi gugus hidroksil
@
Amida diubah menjadi karboksilat
@
Silanol diubah menjadi aminopropilsilil
gugus
GUGUS FUNGSIONAL PADA MATRIKS @ Hidroksil (agarosa, selulosa, dekstran). @ Karboksil (CMC). @ Silanol (silika) @ Amida (poliakrimida). LIGAN @ Amino (-NH2) @ Karboksil (-COOH) @ Hidroksil (-OH) @ Tiol (-SH)
REAKSI PENGIKATAN LIGAN PADA MATRIKS (SUPPORT): Suatu contoh
Martiks
Ester
Polisakarida
Cyanat R = Gugus alkil atau aril
REAKSI PENGIKATAN LIGAN PADA MATRIKS (SUPPORT): Suatu contoh Gugus aktif lain •
CO-NHR
•
CH(OH)CH2NHR
•
CH2NHR
•
S-S-R
•
C6H4-N = N-C6H3(OH)R
PENGIKATAN “LENGAN” DAN LIGAN PADA MATRIKS
LIGAN AFINITAS @ Mengikat molekul-molekul analit dalam sampel secara reversibel dan selektif. @ Rintangan ruang dari matriks dikurangi dengan menyisipkan rantai alkil pendek (seperti heksametilen diamin antara ligan dan matriks). @ Bersifat spesifik atau spesifik terhadap gugus. - Ligan spesifik mengikat hanya satu solute tertentu kolom pendek ( 1 cm), elusi < 1 menit. - Ligan spesifik terhadap gugus mengikat gugus-gugus tertentu.
LIGAN AFINITAS @ Contoh: - Antibodi - Inhibitor enzim - Zat warna triazida
LIGAN SPESIFIK Ligan
Ligate
Analog substrat, inhibitor, ko-faktor
Enzim
Antigen, virus, sel
Antibodi
Basa komplementer, histon, polimerase asam nukleat
Asam nukleat
Syarat: @ Mudah tersedia @ Punya gugus fungsional untuk mengikatkannya kepada matriks.
LIGAN SPESIFIK GOLONGAN SENYAWA @
Mengikat sejumlah biomolekul yang termasuk dalam suatu kelas.
@
Selektivitas dapat diatur dengan: pH, kekuatan ion, suhu, poliritas, waktu kontak, dari ukuran pori.
CONTOH: NAD
Untuk enzim-enzim dehidrogenase
L-Lisin-Sepharose
Untuk plasminogen, DNA dan RNA ribosom
Cibacron Blue
Untuk enzim-enzim yang memerlukan ko-faktor nukleotida
ATP
Kinase yang tergantung pada ATP
“LENGAN PENGATUR JARAK” (SPACER ARMS)
TAHAPAN KERJA @
Pemilihan matriks dan aktivitasnya.
@
Pengikatan spacer arms (jika perlu).
@
Pengikatan ligan pada matriks.
@
Proses adsopsi biomolekul pada adsorben.
@
Proses desorpsi (elusi) biomolekul.
PROSES ADSORPSI @
Kondisi untuk adsorpsi dalam larutan keadaan ligan diamobil.
dalam
@
Gel diseimbangkan dahulu dengan bufer.
@
Sampel diaplikasikan diatas kolom atau gunakan cara batch.
@
Adsorpsi turun dengan naiknya suhu.
@
Suhu antara 0-100C.
@
Pada kekuatan ion cukup tinggi.
@
Waktu penyeimbangan/kecepatan alir cukup.
METODE ELUSI @
Solute yang telah terikat dielusi dengan menambahkan ligan berlebih pada fasa gerak.
@
Solute dielusi dengan menambahkan senyawa yang mempengaruhi interaksi solute-ligan.
@
Elusi secara biospesifik: fasa gerak ditambah suatu inhibitor, yakni suatu afinitas atau solute. Inhibitor berfungsi menyaingi solute merebut tempat pada ligan.
@
Elusi non-spesifik: Ligan atau analit didenaturasi dengan mengatur pH, menambahkan zat-zat seperti KSCN atau urea atau pelarut organik, atau mengubah kekuatan ion fasa gerak.
KONDISI DESORPSI (ELUSI) @
Bila adsorpsi lemah, elusi dengan bufer yang sama dengan pada proses adsorpsi.
@
Pada suhu yang lebih tinggi.
@
Bila kompleks kuat, eluen mengandung urea, garam guanidin atau kondisi denaturasi (reversibel?)
@
Dengan pengaturan konsentrasi, suhu, waktu papar.
PENGGUNAAN @
Isolasi bahan aktif dari campuran kompleks.
@
Isolasi komponen minor bioaktif.
@
Pemisahan bentuk asli (native) dari yang terdenaturasi.
TELAH DIPELAJARI @
Ezim dan protein
@
Antibodi dan antigen
@
Lektin, glikoprotein, polisakarida
@
Reseptor, binding dan transport protein
@
Asam nukleat, nulkeotida
@
Dll.
CH ROMATOGR APHI C SE PARATI ONS
TERIMA KASIH
