kromatografi afinitas Teknik kromatografi yang memanfaatkan kemampuan molekul biologis untuk membungkuk dengan ligan tertentu secara khusus dan reversibel; digunakan dalam biokimia protein.
Kromatografi Afinitas Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap reseptornya Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. J adi, dalam 2) kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang b erikatan spesifik . Tujuan dari afinitas kromatografi adalah untuk memisahkan semua molekul dari kekhususan tertentu dari keseluruhan seluruh molekul dalam campuran Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tah ap (one (one step purification)) Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan purification interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Dalam kasus ini. pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk men gisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks'2'. Skema yang paling urnum untuk melakukan krmatografi afinitas adalah dengan melakukan tahap elusi gradien Skema ini melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom afinitas dengan adanya adan ya fase gerak (dengan pH yang tepat) dan komposisi pelarut untuk ikatan solut-ligan. Pelarut ini, yang menggambarkan fase geraklemah pada kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi. Selama fase aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan ligan afinitas akan berikatan karena sampel dilewatkan kolom dengan bufer aplikasi. Meskipun demikian, karena selektifitas interaksi solut-Iigan yang tinggi, sampel-sampel lain yang tidak terikat akan melewati kolom tanpa tertahan. Setelah komponen-komponen yang tidak t'ertahan telah tercuci secara sempurna dari kolom, solut yang tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut yang mampu mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu memecah kompleks ligan-solut. Pelarut ini merupakan fase gerak yang kuat dan seringkali dikenal sebagai bufer elusi. Begitu solut yang dikehendaki keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom selanjutnya diiregenerasi dengan cara mensetimbangkan kembali menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut Komplementer molekul yang mengikat (ligan) pertama pe rtama kovalen digabungkan ke larut matriks, seperti kecil agarosa manik-manik, dan matriks dituangkan ke dalam kolom. Suatu campuran tidak murni mengandung protein untuk diisolasi ini kemudian diterapkan pada kolom dan
memungkinkan untuk berinteraksi dengan ligan amobil Pada tahap ini, protein yang akan diisolasi mengikat secara khusus untuk ligan amobil sementara sisa molekul dalam aliran campuran melalui kolom. Protein kepentingan kemudian dapat dielusi dari kolom di bawah kondisi yang mengganggu interaksinya dengan ligan bufer pengelusi mengandung zat yang berfungsi untuk memutuskan ikatan antara protein yang akan diambil dengan lingannya. Jadi, buffer pengelusi ini dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat, sehingga protein lepas dan selanjutnya k eluar bersama eluen. Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein hasil pemurnian tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara ligan dengan protein, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar. Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein yang dihasilkan lebih banyak Bahan terisolasi oleh Kromatografi Affinity dan Ligan komplementer Zat Terisolasi oleh Afinitas Ligan Chromatography Kromatografi
Enzim Substrat, kofaktor Antibodi Antigen, Virus, Cell Polisakarida, glikoprotein Lektin Mengikat protein asam nukleat Asam Nukleat Hormon reseptor Hormon Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap. Namun Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan adanya teknologi fusi protein. Idenya adalah membuat suatu protein fusi yang terdiri dari protein yang akan dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan ligan tertentu. Afinitas Kromatografi Metode
Kromatografi afinitas dirancang untuk memurnikan protein tertentu dari sampel campuran.
Di siapkan kolom afinitas dengan matriks dan ligan yang sesuai
Sampel Protein dimasukkan k kolom dan protein akan melalui saringan matriks afinitas manikmanik.
Protein berinteraksi dengan afinitas ligan dengan beberapa protein yang mengikat dengan erat, longgar dan tak berikatan
Protein yang tidak mengikat akan tercuci oleh buffer aplikasi.
protein yang mengikat di cuci dengan buffer elusi.
protein elusi yang mengikat erat ligan dan mengumpulkan protein murni penting
KROMATOGRAFI PERMEASI GEL
Kromatografi berasal dari bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang berarti warna dan ‘G rap ho s’ ya ng ber art i menulis. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu
fasa
tinggal
pada
system
dan
dinamakan
fasa
diam.
Fasa
l a i n n y a , dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa menyebabkan
perbedaan
pemisahan
tetapi
migrasi
dari
k r o m a t o g r af i
penyusun
cuplikan.
merupakan
Ada
teknik
banyak
paling
teknik banyak
digunakan. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Prosedur kromatografi masih dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat
dilakukan kare na jumlah cuplikan re ndah,kompleksita s campu ran yang hendak
dipisahkan
atau
sifat berkerabat
zat
yang
dipisah.Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas,
kromatografi
lapis
tipis,
penukar
ion,
penyaringan
gel
dan
elektroforesis. Kromatografi Pertukaran Molekul atau sering disebut dengan Kromatografi Permeasi Gel (GPC) baru,
meliputi
kromatografi
merupakan metode kromatografi
eksklusi,
kromatogeafi
penyaring
ge l,
dan
kromatografi permeasi gel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling muda h dik erja kan .Selain kesederhanaannya, teknik ini sangat berguna. M e t o d e
ini
d a p a t d i g u n a k a n t e r h a d a p s u a t u c u p l i k a n y a n g l a r u t d a n penggunaan utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini.Pertama, kromatografi g el sangat berguna untuk untk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap makro mol ekuler seper ti prot ein da n asam nukleat , kromat ografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografigel, terutama jika penyusun camp uran itu mem ilik i ber at mole kul yan g sang at berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografigel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan e ksplorasi
dari
cuplikan
yang
tak di ke t ahu i.
Pem isa han
ini
mem be rik an
ga mba ran isi cup lik an, se h ing ga dap atdiketahui dengan cepat apakah cuplikan itu memi liki ber at mol ekul ren dah ata u berat molekul tinggi.
A. Kromatografi gel memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya: 1.Pita-pita sempit. 2.Waktu pemisahan pendek. 3.Waktu pemisahan mudah diramalkan. 4.Harga Tr sesuai dengan ukuran cuplikan. 5.Tidak terjadi kehilangan cuplikan atau reaksi selama pemisahan. 6.Hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasi kolom.
B. Kromatografi gel juga memiliki kelemahan: 1.Kapasitas terbata 2.Tidak dapat d igunakan untuk cuplikan yang mempunyai ukuran hampir sama. 3.Prinsip pemisahan tidak seperti kromatografi lain.
Kekurangan yang paling menonjol adalah kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti hanya ada sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogram total, karena kromatogram cukup pendek semua senyawa terelusi sebelum total. Pada kromatografi gel jarang terlihat lebih dari enam pita pada satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi gel biasanya tidak dapat memisahkan secara sempurna suatu cuplikan kompleks, tanpa pemisahan lebih lanjut dengan metode lain. Kekurangan kedua adalah tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai ukuran hampir sama. Perbedaan pada kromatografi gel adalah prinsip pemisahan yang berbeda denganyang
digunakan
metode
kromatografi
lain.
Konsep
factor
pemisahan
α,
dan
factor ka pa sitas k’ tidak bisa digunakan. Susunan fasa gerak juga relativ e tidak pe ntin g pada kromatografi gel. Pengelompokkan berbagai penggunaan kromatografi gel biasanya dibagi dalam dua teknik yaitu teknik filtrasi gel (pelarut air) dan kromatografi permeasi gel (pelarut oragnik).
Teknik kromatografi permeasi gel (GPC) Berkembang sebagai cara penentuan bobot molekul polimer yang digunakan sejak tahun 1960-an. Kromatografi gel merupakan metode kromatografi baru, meliputi kromatografi eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasi gel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling mudah dikerjakan dan sederhana. Diantara aplikasinya dapat digunakan untuk menentukan bobot molekul polimer
Metode ini dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan penggunaan utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk untk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain dariresolusi dari setiap makromolekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari cuplikan yang tak diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu memiliki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi. Metode ini didasarkan pada teknik fraksinasi yang tergantung dari ukuran molekul polimer yang diinjeksikan ke dalam suatu kolom yang terdiri atas gel berpori berjari – jari sekitar 50 –1060A.Kolom dapat melewatkan molekul pelarut yang merupakan fasa bergerak, sedangkan molekul polimer yang lebih kecil dapat memasuki pori – pori gel, karena itu bergerak lebih lambat disepanjang kolom dibanding molekul besar. Elemen yang keluar dideteksi dengan cara spektroskopi atau cara – cara fisik lainnya dan dikalibrasi dengan larutan polimer standar untuk menghasilkan kurva distribusi bobot molekul.
FASA DIAM
Pemisahan dalam kromatografi gel sebagian besar ditentukan oleh jenisfasa diam yang digunakan. Oleh karena itu, p emilihan gel at au fasa d iam untuk suatu pemisahan
merupakan
langkah
penting.Fasa
diam
yang
digunakan
untuk
kromatografi ge l me rupakan bahandalam ukuran pori b erbeda-beda dimana setiap
ukuran
cocok
untuk
pemisahansenyawa
yang
tertentu
berat
mol e ku lny a. Ke b any aka n d e ng an kro mat ogr afi permeasi gel digunakan fasa diam polistirena berpori yang mempunyai ikatansilang divinil benzena. Poragel dan Bio-Bead dapat untuk memisahkan senyawayang relative kecil sampai dengan berat mol eku l se ki ta r 20 .000. Sty rag el u nt uk
memisahkan senyawa besar dengan berat
molekul 20 juta. Gel vinil asetat berporiserupa dengan gel polistirena, tetapi untuk senyawa
dengan berat molekul rendah.Merkogels pori kecil lebih baik digunakan untuk pe mi sa ha n se ny aw a denga n berat molekul kurang dari 2000, dan kurang dari sejuta.
FASA GERAK Dalam kromatografi gel, tidak seperti pada kromatografi cairan lainnya,fasa gerak tidak diubah – ubah untuk mengatur resolusi. Fasa gerak dipilih denganke k e n t a l a n r e n d a h p a d a s u h u p e m i s a h a n ( s u p a y a h a r g a N t i n g g i ) d a n u n t u k m el arut kan cuplikan. Fasa gerak dengan kekentalan rendah itu mempunyai titik didih sekitar 25-50°C diatas suhu kolom. Jika cuplikan sukar larut, fasa gerak dipilih supaya dapat melarutkan cuplikan.Jika d igunaka n detect or refrakto meter, fasa gerak dipili h denga n indeksrefraksi maksimum,
optimum.
Jika
diperlukan
kepekaan
detector
i n d e k s refraksifasa gerak harus berbeda besar dengan indeks refraksi
cuplikan.Pengaruh fasa gerak pada fasa diam yang tak kaku untuk kromatografi gelharus dipertimbangkan. Berbagai gel untk kromatografi permeasi gel dapat tahante r h a d a p berbagai pelarut organic, tetapi ada perkecualian untuk aseton danalcohol tidak boleh digunakan dengan fasa diam polistirena
