LABORATORIUM BIOPROSES SEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2014/2015
MODUL
: Kinetika Pertumbuhan Bakteri dan Jamur
PEMBIMBING : Bu Rosi
Tanggal Praktikum : September 2014 Tanggal Pengumpulan Laporan : 23 Oktober 2014
Oleh Kelompok Nama
Kelas
: IV : 1. Ken Putri Kinanti KSP 131424013 2. Luthfiyah Sinatrya 131424014 3. Nabila Vidiaty Novera 131424015 : 2A - Teknik Kimia Produksi Bersih
PROGRAM STUDI DIPLOMA IV TEKNIK KIMIA JURUSAN TEKNIK KIMIA POLITEKNIK NEGERI BANDUNG 2014
Abstrak
Kata Pengantar
Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Swt. Karena dengan izin dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan laporan ini dengan lancar. Laporan ini disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Praktikum Bioproses pada semester tiga jurusan Teknik Kimia program studi D-IV Teknik Kimia Produksi Bersih Politeknik Negeri Bandung. Adapun judul dari laporan ini adalah “Laporan Praktikum Kinetika Pertumbuhan Bakteri E.colli”. Dalam menyusun laporan ini, penulis memperoleh banyak bimbingan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada: 1. Ibu Rosi selaku dosen Teknik Kimia Politeknik Negeri Bandung yang telah membimbing penulis dalam menyusun laporan ini. 2. Seluruh rekan di kelas 2A-TKPB yang telah membantu dan memberikan arahan untuk penyusunan laporan ini. 3. Orang tua yang telah memberikan dorongan moril dalam kelancaran penyusunan laporan ini. 4. Semua pihak yang telah membantu, membimbing dan memberikan arahan dalam penyusunan laporan ini. Semoga bantuan dan bimbingan serta dorongan dibalas oleh Allah Swt. Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan laporan ini terdapat banyak kekurangan karena keterbatasan kemampuan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang sifatnya membangun dari semua pihak agar penulis dapat memperbaiki dan meningkatkan kemampuan diri di masa yang akan datang. Semoga laporan ini dapat memberikan manfaat khususnya bagi penulis dan menambah pengetahuan umumnya bagi keluarga besar Politeknik Negeri Bandung.
Bandung, 20 Oktober 2014
Penulis
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Mikroorganisme yang ditumbuhkan dalam media yang mengandung nutrient essensial kemudia di tempatkan pada kondisi lingkungan seperti suhu dan PH yang tepat akan segera berkembang biak. Pertumbuhan mikroba dapat diamati dari kenaikan konsentrasi mikroba. Melalui serangkaian proses enzimatis, mikroba melakukan biosintesis molekulmolekul penyusun sel dan menggandakan selnya. Kecepatan pertumbuhan mikroba merupakan respon terhadap substrat (media pertumbuhan) yang disediakan dan kondisi lingkungannya. 1.2 Tujuan 1. Menguasai tahapan-tahapan pengembangbiakan jamur dan bakteri. 2. Menguasai dan terampil membuat media padat, inokulum/starter, dan media pertumbuhan jamur dan bakteri. 3. Menguasai dan terampil memilih metode yang tepat untuk menetukan konsentrasi biomassa jamur dan bakteri. 4. Memahai pola pertumbuhan jamur dan bakteri melalui grafik konsentrasi mikroba (X) terhadap waktu (t). 5. Menguasai dan dapat menetukan fasa-fasa pertumbuhan jamur dan bakteri. 6. Dapat menghitung dan mengevaluasi nilai laju pertumbuhan spesifik (µ) jamur dan bakteri. 1.3 Landasan Teori Stoikiometri dari pertumbuhan sel sangat kompleks tergantung pada jenis mikroba, nutrient yang digunakan dan kondisi lingkungan seperti pH dan suhu. Kerumitan menjadi nyata jika lebih daru sat nutrient mempengaruhi laju pertumbuhan mikroba. Secara umum pertumbuhan mikroba dapat dinyatakan dalam reaksi sebagai berikut :
Sel-sel + substrat
Sel-sel yang lebih banyak + produk
Sumber karbon, nitrogen, oksigen, fosfor, mineral
metabolit,CO2, H2O, enzim
Konsentrasi mikroba dapat dilakukan melalui penentuan jumlah sel (sel/vol) atau pengukuran massa sel (gr/vol). Jika reaktor yang digunakan adalah reaktor batch, maka pertumbuhan mikroba akan mengikuti pola seperti yang disajikan pada gambar 2.1
Pertumbuhan mikroba dalam reaktor batch akan melalui tahap-tahap berikut : 1. 2. 3. 4. 5.
Fase lag Fase logaritmik/eksponensial Fase perlambatan pertumbuhan Fase stasioner Fase kematian
Fase lag segera terjadi setelah inokulasi, disebut juga sebagai masa adaptasi terhadap lingkungan baru. Mikroorganisme mereorganisasi komponen molekulnya pada saat menyerap nutrient baru. Komposisi dan jenis nutrient akan mempengaruhi jenis enzim yang disintesa, enzim yang dibutuhkan akan dibentuk, enzim yang tidak diperlukan akan ditekan. “Mesin” proses di dalam sel menyesuaikan diri dengan kondisi lingkungan baru. Perubahan ini akan terefleksikan dalam mekanisme sel melalui pengaturan proses metabolisme. Selama fasa ini massa sel bertambah sedikit tanpa merubah densitas sel. Konsentrasi yang rendah beberapa nutrient dan factor pertumbuhan akan menghasilkan fase lag yang panjang. Perioda fase lag sangat bergantung pada umur dari inokulum. Inokulum yang optimum akan menghasilkan fase lag yang minimum. Untuk mempersingkat fase lag, sel harus ditumbuhkan pada media dan kondisi pertumbuhan yang optimum, sel yang harus aktif, dan volume inokulum berkisar antara 5% sampai 10% (Shuler and Kargi, 1992). Pada fase eksponensial, sel telah beradaptasi dengan lingkungannya yang baru. Sel akan tumbuh dengan cepat, sehingga massa sel dan jumlah sel akan bertambah secara eksponensial terhadap waktu, terjadi balance growth yaitu semua komponen dalam sel tumbuh dengan kecepatan yang sama. Komposisi sebuah sel mendekati konstan.
Petumbuhan mikroba pada fasa eksponensial dapat didekati dengan model tak berstrukturyang menganggap laju pertumbuhan sel merupakan fungsi dari massa selular saja. rX = dX/dt = X rX : laju pertumbuhan mikroba (g/l.jam) X : konsentrasi biomassa (g/l) t : waktu (jam)\ : laju pertumbuhan mikroba spesifik (1/jam) Integrasi persamaan di atas menghasilkan ln X =
t + ln X0
Jika kita plot ln X terhadap t akan diperoleh garis lurus dengan slope Fase perlambatan pertumbuhan terjadi setelah fase eksponensial. Pada fase ini perlambatan pertumbuhan terjadi karena berkurangnya konsentrasi satu atau lebih nutrient essensial dan terakumulasinya produk yang bersifat toksik terhadap pertumbuhan. Perubahan lingkungan yang cepat menyebabkan terjadinya imbalance growth. Pada fase eksponensial sistem pengendali proses metabolisme selular ditunjukan menghasilkan laju reproduksi yang maksimum, namun pada fase perlambatan pertumbuhan tekanan yang diakibatkan oleh terbatasnya nutrient dan lingkungan yang toksik akan merubah sistem pengendali proses metabolisme selular agar bisa tetap bertahan pada kondisi yang tidak menguntungkan (Shuler and Kargi, 1992). Setelah fase perlambatan pertumbuhan selesai, dimulailah fase stasioner. Pada fase ini laju pertumbuhan adalah nol (tidak ada pembelahan sel) atau laju pertumbuhan sama dengan laju kematian. Konsentrasi massa sel dengan tetap, namun jumlah sel yang hidup akan berkurang, terjadi lisis sel dan sebagian sel dapat tumbuh pada produk hasil lisis sel tersebut. Walaupun laju pertumbuhan adalah nol selama fase stasioner tetapi metabolisme sel masih aktif dan menghaslkan metabolit sekunder, sebagai hasil dari perubahan
pengendalian selular karena terbatasnya konsentrasi nutrient esensial. Produksi metabolit sekuder (antibiotic, hormon) justru meningkat pada fase stasioner. Selama fase stasioner, sel mengkatabolisme nutrisi yang tersimpan dalam sel (endogenous metabolism) sehingga diperoleh energy (maintenance energy) untuk pemeliharaan membrane sel, transportasi nutrient, gerak dan perbaikan struktur sel yang rusak. Pertumbuhan mikroba akan terhenti selain disebabkan oleh terbatasnya konsentrasi nutrient esensial dan terakumulasinya produk yang bersifat toksik juga disebabkan oleh terbentuknya produk yang menghambat pertumbuhan. Penghambatan ini tergantung pada jenis dan konsentrasi produk penghambatnya. Produksi etanol oleh ragi merupakan contoh produk penghambat pertumbuhan. Hal tersebut dapat dicegah dengan cara mengencerkan medium yang tercemar toksik, menambahkan secara berkesinambungan produk penghambat dan tidak termetabolisme, dan memindahkan secara berkesinambungan produk penghambat dari dalam reaktor. (Shuler and Kargi, 1992) Pada fermentasi batch, lahu pertumbuhan spesifik adalah konstan dan dipengaruhi oleh perubahan konsentrasi nutrient. Pada konsentrasi nutrient awal yang rendah akan menghasilkan laju pertumbuhan yang lebih kecil dari laju pertumbuhan spesifiknya. Hubungan laju pertumbuhan dengan konsentrasi substrat (S) ditunjukkan pada gambar 2.2. Pada daerah A terdapat pembatasan oleh substrat. Pada kondisi ini peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan laju pertumbuhan mikroba. Pada daerah B tak terdapat pembatasan, dijumpai pada fasa eksponensial. Pada daerah C terjadi penghambatan oleh substrat (Mangunwidjaja, 1994) Model unstructured yang sering digunakan untuk menggambarkan kinetika pertumbuhan adalah persamaan Monod. Model ini mengekspresikan bahwa laju pertumbuhan spesifik mikroba akan meningkat jika konsentrasi substrat meningkat. Namun laju pertumbuhan spesifik akan turun pada konsentrasi substrat yang terlalu tinggi. Persamaan Monod menggambarkan laju pertumbuhan spesifik merupakan fungsi dari konsentrasi substrat pembatas (S) :
=
m
Ks adalah tetapan kejenuhan, yaitu konsentrasi substrat pada
=
m
. Nilai Ks
bergantung pada jenis mikroba dan jenis substrat yang digunakan. Metoda pengukuran konsentrasi sel mikroorganisme dipengaruhi oleh sifat milik dan karakter dari mikroorganisme, media fermentasi dan kecepatan/keseksamaan pengukuran. Pengukuran konsentrasi sel untuk bakteri yang dibiakkan dalam media sintesis (media terdefinisi) lebih sesuai menggunakan metoda plating koloni atau optical density karena bakteri merupakan mikroorganisme uniseluler. Metode pengukuran konsentrasi sel mikroorganisme dipengaruhi oleh sifat milik dan karakter dari mikroorganisme media fermentasi dan kecepatan / keseksamaan pengukuran. Pengukuran konsentrasi sel untuk jamur yang dibiakkan dalam media sintesis (media terdefinisi) lebih sesuai menggunakan metoda berat sel kering karena sifat jamur yang multiseluler memiliki hifa dan miselium sehingga akan membentuk pellet-pelet dalam ukuran antara 1-10 mm.
BAB II PERCOBAAN
2.1 Pertumbuhan Bakteri E. colli 2.1.1 Bahan yang digunakan a.
Kultur murni bakteri E.colli dalam agar miring NA (Nutrient Agar). Dengan komposisi : beef ekstrak 3 gr, pepton 10 gr, NaCl 5 gr, agar
bacto 18 gr, aquadest 1000 ml. b. 50 ml media cair steril untuk starter/inokulum. c. 440 mL media pertumbuhan. Komposisi 500 mL media pertumbuhan (50 mL untuk inokulum, 100 mL untuk blanko, 440 mL untuk media petumbuhan ) : Nutrient Glukosa
Konsentrasi (gr) 10
Pepton
5
Beef Ekstrak
4
Yeast Ekstrak
2
KH2PO4
1
MgSO4.7H2O
0,5
Aquadest
500
2.1.2 Alat yang digunakan : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
1 buah erlenmeyer 1000 mL 1 buah erlenmeyer 100 mL untuk tempat inokulum 18 buah botol sampel 20 buah pipet steril 10 mL Spektrofotometri Laboo Pembakar Spirtus Jarum ose Kuvet Spektrofotometer Incubator Shaker
2.2 Pertumbuhan Jamur Aspergillus niger 2.2.2 Bahan yang digunakan
a. Kultur murni jamur Aspergillus niger dalam agar miring PDA (Potato Dextrose Agar). b. 100 ml media cair steril untuk starter/inokulum dengan komposisi: Nutrient Sukrosa (NH4)CO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O FeCl3 Aquadest
Konsentrasi (gr) 142 7 1,4 1 0,5 mg 1000 mL
c. 10 buah erlenmeyer 100 ml yang berisi 50 ml media cair steril sebagai media pertumbuhan dengan komposisi yang sama dengan media untuk starter. Media yang mengandung sukrosa harus disaring terlebih dahulu. Komposisi media pertumbuhan untuk 600 mL (50 mL inokulum dan 550 mL untuk media pertumbuhan) : d. Kertas saring 9 lembar. 2.2.3 Alat yang digunakan : 1. 9 buah Erlenmeyer 100 ml 2. 1 buah Gelas Kimia 1 liter 3. Corong gelas 4. Neraca analitik 5. Oven 6. Tabung reaksi 7. Incubator shaker
2.3 Keselamatan Kerja
Saat bekerja di laboratorium, baju kerja yang nyaman harus telah dikenakan. Untuk beberapa eksperimen laboratorium biasa, cukup mengenakan jas laboratorium berlengan panjang yang terbuat dari bahan tidak mudah meleleh (disarankan dari katun atau kain campuran poliester dan katun). Jas laboratorium tidak harus dikenakan di ruangan lain seperti ruang kuliah, perpustakaan, ruang makan dan lain sebagainya supaya menghindari kontaminasi dengan bahan
kimia yang melekat. Sepatu yang stabil dan tertutup harus dikenakan. Selama bekerja di laboratorium, kacamata gelas dengan pelindung samping
harus dikenakan. Saat menjalankan
eksperimen,
mahasiswa
tidak
boleh
meninggalkan
laboratorium jika suatu pengukuran yang kontinyu dibutuhkan dan tidak ada
orang lain yang tahu tentang eksperimen tersebut dan dapat menangani kegiatan tersebut. Pada kasus eksperimen yang berbahaya, maka paling sedikit dua orang
yang harus ada. Pada wilayah di laboratorium, makanan atau barang konsumsi harus disimpan
dan dilarang dimakan supaya tidak ada risiko terkontaminasi. Terkait dengan risiko akibat adanya peningkatan wadah yang biasa digunakan untuk makanan atau barang konsumsi, maka tidak boleh digunakan untuk menyimpan bahan kimia, dan juga sebaliknya (makanan tidak boleh
ditempatkan pada wadah yang biasa digunakan untuk bahan kimia). Merokok tidak diijinkan di laboratorium terkait dengan risiko bahaya pernafasan akibat rokok terkontaminasi seperti halnya dengan bahan makanan, dan terkait dengan risiko percikan api dan ledakan dengan bahan kimia yang mudah terbakar.
2.4 Garis Besar Proses Kerja
2.5 Prosedur Kerja 2.5.1 Pertumbuhan Bakteri E. Colli A. Pembuatan inokulum dan media pertumbuhan a. Pipet 5 ml media cair dari media inoculum, masukkan dalam tabung yang berisi kultur murni bakteri. Dengan menggunakan jarum ose lepaskan b. c. d. e. f.
bakteri yang menempel pada agar miring hingga terlarut semua. Tuangkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi media untuk inokulum Inkubasi dalam Incubator shaker selama 12 jam pada suhu 37oC, 150 rpm Masukkan inoculum ke dalam Erlenmeyer yang berisi media pertumbuhan Inkubasi dalam Incubator shaker selama 3 hari pada suhu 37oC, 150 rpm Ambil sampel sebanyak 10 ml setiap 3 jam Catatan : Semua pekerjaan dilakukan secara aseptis
B. Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dengan metoda optical density dengan menggunakan spektrofotometer a. Buatlah kurva baku antara berat sel kering X (mg/ml) terhadap absorbansi (A) pada panjang gelombang 620 nm, dengan data-data yang disajikan pada tabel b. Setiap sampel mulai t0 dst diukur absorbansinya (A) pada panjang gelombang 620 nm. Kemudian diplotkan pada kurva baku untuk mendapatkan konsentrasi biomassa X (mg/ml) C. Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dengan metoda plating koloni a. Cairkan media NA dan setelah siap tuangkan dalam cawan petri biarkan beku b. Pipet 1 ml sampel dan tuangkan ke atas media padat, ratakan dengan sudip dgiralski c. Inkubasi selama 24 jam dan hitung jumlah koloni yang terbentuk (jumlah sel/ml) d. Lakukan pengenceran pada pengambilan sampel ke-t3 dst, karena suspense bakteri sudah mulai pekat Catatan : Semua pekerjaan dilakukan secara aseptis
2.5.2 Pertumbuhan Jamur Aspergillus Niger A. Pembuatan inokulum dan media pertumbuhan a. Pipet 5 ml media cair dari media inoculum, masukkan dalam tabung yang berisi kultur murni jamur. Dengan menggunakan jarum ose lepaskan spora yang melekat pada koloni jamur hingga terlarut semua. b. Tuangkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi media untuk inokulum c. Inkubasi dalam Incubator shaker selama 16 jam pada suhu 37oC, 150 rpm d. Pipet 7,5 ml inoculum dan masukkan ke dalam Erlenmeyer 100 ml yang berisi media pertumbuhan 42,5 ml. Lakukan untuk semua Erlenmeyer yang berisi media pertumbuhan. Setiap Erlenmeyer mewakili satu interval waktu. e. Inkubasi dalam Incubator shaker selama 5 hari pada suhu 37oC, 150 rpm f. Lakukan sampling setiap 6 jam dengan cara disaring dengan kertas saring. Catatan : Semua pekerjaan dilakukan secara aseptis B. Pembuatan kurva pertumbuhan dengan metoda berat sel kering
a.
Beri nomor setiap kertas saring atau tabung sentrifuge plastic kosong, dari
b.
t0 s/d t10 Timbang setiap kertas saring atau tabung sentrifuge plastic kosong, catat
c.
beratnya Jika menggunakan kertas saring, tuangkan 50 ml sampel hingga semua
d.
miselia tersaring Jika menggunakan tabung sentrifuge, ambil sampel sebanyak 10 ml,
e. f. g.
sentrifuge pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit Keringkan dalam oven suhu 60oC selama 36 jam Timbang sampai beratnya konstan Berat biomassa = (Berat kertas/tabung sentrifuge + biomassa) – (Berat kertas/tabung sentrifuge kosong)
BAB III HASIL DAN PENGAMATAN 3.1 Data Pertumbuhan Bakteri E.Coli Waktu (jam ke-) 0 5’ 15’ 45” 18’ 4” 21’ 16” 23’ 14” 24’ 14” 27’ 29’ 2” 30’ 5” 33’ 5” 37’ 40’ 42’ 35” 48’ 35” 53’ 5” 56’
Konsentrasi (gr/ml) 1,19 2,5 2,29 2,26 2,25 3,523 3,2 3,6 5,19 4,99 5,15 5,3 5,29 5,28 3,72 3,02 2,89
Absorbansi 0,198 0,393 0,493 0,408 0,407 0,471 0,493 0,546 0,808 0,783 0,797 0,833 0,83 0,828 0,566 0,474 0,446
3.2 Data Pertumbuhan Jamur Aspergillus Niger Waktu (jam ke-)
t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8
0 18 24 42 48 53 58 63 81
Berat kertas
Berat kertas
kering kosong +
kering kosong
Biomassa (gr) 0,7457 0,6414 0,6901 0,6862 0,6745 0,6520 0,7594 0,7367 0,6871
(gr) 0,4501 0,4491 0,4501 0,4486 0,4445 0,4346 0,4458 0,4444 0,4432
Selisih (gr)
0,2956 0,1923 0,24 0,2376 0,23 0,2174 0,3136 0,2923 0,2439
Menentukan µ (Laju Pertumbuhan Mikroba Spesifik (1/jam)) T T0 T1 T2 T3 T4
Waktu
Berat Sel
Volume
Konsentrasi/ X
(jam)
Kering (gram)
(mL)
(gr/mL)
Ln X
BAB IV PEMBAHASAN
BAB IV SIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
