Universidad Estatal Del Sur De Manabí
TEMAS:
Prueba de la Antiglobulina Directa e Indirecta Factores +ue A,ectan A "a Anti lobulina Pa el De Integrantes:
Ponce Santistevan María Parraga Cedeño Isaac Fienco Uribe Andrea Rodrígue Evelin Catedr!tico: "cdo# $avier Re%es &to Se'estre ()*
U.I/ERSIDAD ESTATA" DE" SUR DE MA.A)I Creada mediante Ley Nº 2001-38, publicada en el Registro Ocial 2!1 del " de #ebrero del 2001
Unidad Acad0'ica de Ciencias de la Salud Carrera de "aboratorio Clínico
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA DIRECTA Es usada para detectar la sensibilización in vivo de los glóbulos rojos, es de gran valor en el diagnóstico de la: 09/10/14 • • • •
Enfermedad hemolítica del recién nacido Anemia hemolítica autoinmune Anemia hemolítica y sensibilización inducida por drogas Investigación de reacciones transfusionales
Procedimiento !
En un tubo de ensayo de " o # $ %&mm, colocar una gota de células rojas al &' suspendida en solución salina fisiológica ())*+! Agregar suficiente ))* al tubo, tratando de obtener una suspensión uniforme de las células! -entrifugar durante # minutos a "" rpm para empa.uetar los glóbulos rojos en el fondo del tubo! Decantar completamente toda la salina. Agregar unas gotas de salina fresca al tubo, resuspender las células y luego agregar m0s salina para realizar el segundo lavado! -entrifugar nuevamente y repetir el mismo procedimiento hasta completar / lavados! Inmediatamente después del cuarto lavado, agregar # gotas de reactivo de antiglobulina humana y mezclar! -entrifugar a /"" rpm $ & segundos, o """ rpm $ minuto E$aminar el tubo para observar si hay aglutinación, graduarla en cruces y anotar los resultados tubo en manos! 3ara facilitar la lectura es recomendable emplear ayuda visual! 5as pruebas negativas deben confirmarse con células control de -oombs! Al tubo de la prueba negativa se agrega una gota de células de control de -oombs, mezclar, recentrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano!
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Interpretación
)i la prueba de antiglobulina muestra aglutinación, se interpreta positiva, significa .ue hubo sensibilización in vivo de los eritrocitos y se informa: prueba de antiglobulina o de -oombs directo positiva, se6alando en cruces la intensidad de la reacción por ejemplo, /7! )i no hubo aglutinación la prueba es negativa y significa .ue no e$iste Autosensibilización eritrocitaria! 5a prueba de antiglobulina negativa ser0 v0lida, solamente, si la prueba control de -oombs es positiva! En este caso, se informa: prueba de antiglobulina o de -oombs directo negativa!
Comentarios •
Actualmente, la circular de instrucciones de los reactivos recomienda .ue las pruebas negativas se deben incubar durante un lapso de & a " minutos a temperatura ambiente, para luego a recentrifugar y leer! Algunas veces, una reacción negativa puede hacerse positiva8 este procedimiento es de utilidad cuando se desea detectar sensibilización por complemento! 9o se debe recentrifugar la prueba de antiglobulina si esta ha sido positiva débil, por.ue puede nagativizarse si la reacción es debida a Ig! 1
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Carrera de "aboratorio Clínico 3ara facilitar la lecturas de las pruebas es recomendable emplea una ayuda visual, por ejemplo una lupa o una l0mpara de leer aglutinaciones, la cual debe estar provista de espejo amplificador! Algunos autores recomiendan leer las pruebas negativas al microscopio para detectar aglutinación no visible a simple vista! Es de primordial importancia controlar las pruebas de antiglobulina negativas, con células presensibilizadas con Ig!
Al principio de esta prueba se basa en .ue si el lavado de las células de la prueba de antiglobulina fue adecuado, deber0n haberse eliminado las inmunoglobulinas libres o no fijadas a los glóbulos rojos! )i la prueba ha sido negativa, el suero de antiglobulina conservara su actividad anti;Ig y aglutinara las células de control de -oombs! El resultado se interpretara así: a+ )i la prueba control de -oombs es positiva, demuestra .ue la técnica de lavado fue correcta y .ue el reactivo de antiglobulina tiene actividad anti;Ig, por lo tanto, la prueba de antiglobulina es v0lida! b+ )i la prueba control de -oombs es negativa, la prueba de antiglobulina .uedara invalidada y deber0 repetirse (correctamente+ todo el procedimiento!
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA INDIRECTA Esta permite detectar la sensibilización in vitro de los glóbulos rojos! El suero en estudio es incubado con los glóbulos rojos por el tiempo adecuado, luego se lavan para eliminar los anticuerpos y otras globulinas .ue no se han fijado al eritrocito, si la adición del reactivo de antiglobulina causa aglutinación de los glóbulos rojos, la conclusión es .ue en el suero e$isten anticuerpos irregulares específicos para los antígenos presentes en los eritrocitos! 5a detección de anticuerpos presentes en el suero se pueden efectuar con: !
#!
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-élulas rojas especialmente seleccionadas, en las cuales se encuentran presentes los antígenos de grupos sanguíneos correspondiente a los anticuerpos de mayor frecuencia e importancia clínica! -on células de genética conocida (panel+ .ue permite hacer la identificación del anticuerpo presente! El panel se emplea una vez .ue se ha comprobado .ue en el suero e$iste un anticuerpo irregular, demostrando mediante las células detectoras! -on células desconocidas, como en las pruebas de compatibilidad!
5a prueba de antiglobulina indirecta se usa en:
PROCEDIMIENTO 2
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Carrera de "aboratorio Clínico En un tubo de ensayo de " o #$%&mm colocar # gotas de suero fresco en estudio! Agregar gota de una suspensión de células lavadas una vez y preparadas al &' en ))*! Agregar # gotas de albumina bovina polimerizada o albumina al ## ' o al "'! >ezclar, centrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano! Incubar a %?- por & a " minutos! -entrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano! 5avar / veces con suficiente ))* como en la prueba indirecta, decantando cada vez toda la salina! Agregar # gotas del reactivo antiglobulina humana poliespecífico y mezclar! -entrifugar, leer y anotar los resultados, tubo en mano! -omprobar las pruebas negativas con células control de -oombs!
INTERPRETACION 3rueba de antiglobulina negativa 7 prueba control de -oombs positiva! Interpretación: prueba de antiglobulina negativa! 3rueba de antiglobulina negativa 7 prueba de control de -oombs negativa! Interpretación: 3rueba no v0lida! @epetir todo el procedimiento! Averiguar la causa del error!
FACTORES UE AFECTAN LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA Fase de sensi!i"i#ación $in %itro& 5os siguientes factores afectan la unión del anticuerpo con el antígeno:
Temperatura 5os anticuerpos de la clase Ig reaccionan ópticamente a %?-! la incubación a temperaturas menores puede reducir la unión del anticuerpo a su antígeno respectivo8 las temperaturas mayores de %?- pueden da6ar las células o el anticuerpo!
Medio de Reacción El medio de suspensión para los glóbulos rojos puede ser ))*, albumina, suero inerte ()uero A libre de anticuerpo+ o solución de fuerza iónica baja (5I))+! El efecto potenciador de la reacción antígeno anticuerpo de estas soluciones ya ha sido discutido el capítulo #! Proporción de células y suero En la rutina del laboratorio, generalmente se emplea # gotas de suero m0s gota de una suspensión de hematíes al &', lo .ue da una proporción apro$imada de /":! )e ha demostrado .ue aumentando la proporción de suero a células (por ejemplo, "":+, algunas veces es posible .ue no aparecen en los procedimientos de rutina! En las investigaciones de reacciones hemolíticas, en las cuales no se detectaron anticuerpos irregulares en la prueba cruzada, puede ser Btil aumentar la proporción de
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Unidad Acad0'ica de Ciencias de la Salud Carrera de "aboratorio Clínico suero con el fin de incrementar la concentración del anticuerpo (por ejemplo, usar gotas de suero+!
Tiempo de Incubación Cn periodo de incubación de & a " minutos es suficiente para detectar la mayoría de los anticuerpos clínicamente importantes, cuando se emplea albumina como medio de reacción! 5a solución de fuerza iónica baja (5I))+ permite acortar el tiempo de incubación de " a & minutos sin pérdida de sensibilidad a la prueba!
FASE DE LA'ADO Danto en la prueba de antiglobulina directa como la indirecta, el lavado de las células es un procedimiento muy importante8 las siguientes consideraciones deben ser tomadas en cuenta en ambos casos:
Tiempo de Lavado Derminada la fase de incubación, el lavado de las células debe iniciarse inmediatamente y debe ser continuo, para evitar la elución del anticuerpo fijado a los glóbulos rojos!
Volumen de Salina ollison ha estimado .ue la presencia de una cantidad muy pe.ue6a de inmunoglobulinas residuales después del Bltimo lavado, del orden de #ug Igml, pueden neutralizar el reactivo de antiglobulina agregado!
Decantación de la Salina 3ara eliminar las globulinas no fijadas al glóbulo rojo, es importante .ue después de cada lavado la salina sea decantada totalmente! Ello se logra invirtiendo completamente el tubo y sacudiéndolo con un movimiento firme8 una vez .ue se ha vaciado, se termina de eliminar el residuo de salina sacudiéndolo con fuerzas varias veces! 5as células se .uedaran adheridas al fondo del tubo y podr0n ser resuspendidas agregando unas gotas de salina fresca y agitando el tubo con movimientos r0pidos8 luego, se completa el llenado del tubo hasta el nivel se6alado, descargando la salina con cierta presión por el interior de las paredes! 9o se debe introducir la punta de la pizeta dentro del tubo, por el riesgo de contaminación! 5as lavadoras autom0ticas pueden realizar este procedimiento m0s eficientemente .ue cuando se hace en forma manual, sin embargo, se deben calibrar periódicamente para asegurar un lavado adecuado! 5a eficiencia de un buen lavado, se puede apreciar en el cuadro!
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Folumen de )alina
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d& Contaminación )i se tapa la boca del tubo con el dedo para resuspender las células, se e$pone a la contaminación con proteínas provenientes de la piel, las cuales pueden inactivar el reactivo de antiglobulina! ) e ha calculado .ue en una gota de dilución de suero humano en :/""" puede neutralizar una gota de antiglobulina! e& E"(ción El anticuerpo fijado puede separarse de los glóbulos rojos muy pronto, si son dejados en suspensión salina8 por tal razón, es importante .ue una vez iniciado el procedimiento, esté no se detenga! Al finalizar el lavado, debe agregarse inmediatamente el suero de antiglobulina8 si esto no se hace, el anticuerpo se despega del glóbulo rojo y al .uedar libre, puede neutralizar el reactivo agregado dando un resultado falso negativo! )& Centri)(*ación 5a centrifugación para el lavado de células difiere de la centrifugación para acelerar la aglutinación y efectuar una lectura m0s precisa! En el lavado, se re.uiere .ue las células se precipiten y se empa.uen en el fondo del tubo para evitar .ue al .uedar células suspendidas, éstas se pierdan cuando se decante la salina! 3ara ello es suficiente centrifugar a /"" rpm durante # minutos! 3ara la lectura de la prueba, se ha especificado .ue debe ser de /"" rpm durante & segundos o """ rpm por minuto! El e$ceso de centrifugación en este paso puede conducir a interpretaciones falsas positivas sobre lectura! *& Lect(ra de "a pr(e!a 3ara una correcta interpretación, las células deben desprenderse totalmente del fondo del tubo y ello se logra manteniendo el tubo en 0ngulo agudo, haciendo coincidir el menisco del lí.uido con el borde del botón de células8 si se agita el tubo suavemente el lí.uido desprende f0cilmente el botón! -uando todas las células se han desprendido, el tubo se debe inclinar hacia la posición horizontal agit0ndolo suavemente para obtener una suspensión uniforme de las células o el desplazamiento de los
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Unidad Acad0'ica de Ciencias de la Salud Carrera de "aboratorio Clínico aglutinados! 5a agitación fuerte rompe los aglutinados o dispersa las aglutinaciones débiles, induciendo a lecturas falsas negativas!
5a intensidad o magnitud de la aglutinación debe e$presar en cruces (" a /7+ y es importante .ue todo el personal emplee el mismo sistema de lectura!
Contro"es En la rutina de laboratorio, el reactivo de antiglobulina poliespecífico es el de uso general, por.ue contiene combinadas la actividad anti; Ig y anti;-d, ambas de relevante importancia en clínica! 5a actividad anti;Ig permite detectar la gran mayoría de anticuerpos .ue conducen a la destrucción in vivo de los glóbulos rojos! 5a actividad anticomplemento permite detectar los componentes del complemento fijados en la membrana celular por efecto de la reacción antígeno anticuerpo, pudiendo estar presentes tanto el anticuerpo como el complemento! En algunas ocasiones el anticuerpo se escapa de la membrana durante el lavado pero .ueda fijado el complemento, .ue es detectado mediante la actividad anti;-d del reactivo! 5as normas de control de calidad en el banco de sangre establecen .ue el reactivo de antiglobulina debe ser controlado diariamente, al igual .ue cada frasco .ue se abre! 3ara ello se emplean las células de grupo H, <;positivo sensibilizadas con suero diluido Ig anti;
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Unidad Acad0'ica de Ciencias de la Salud Carrera de "aboratorio Clínico pues el color solamente confirma .ue el reactivo fue agregado, pero no garantiza .ue el procedimiento fue bien hecho y .ue el suero antiglobulina est0 activa!
CAUSAS DE ERROR )on causa de resultados falsos negativos ! 5avado incorrecto, por.ue conduce a inactivación del reactivo! #! -ontaminación con proteínas, por ejemplo, cuando se tapa el tubo con el dedo para mesclar o re suspender los eritrocitos! ! -ontaminación del reactivo con suero humano! /! Erección del anticuerpo durante el proceso de lavado! &! )uspensión de célula, muy fuerte o muy débil (mayor de &' y menor de #'+! 1! 5as células mal conservadas, hemolizadas, calentadas o envejecida, sufren alteración de los antígenos y perdida de la reactividad! %! En el suero viejo, el calentamiento, la descongelación repetidas, alteran la actividad de los anticuerpos y del complemento! 2! El empleo del plasma interfiere con la actividad del complemento y conduce a falsos negativos! 4! Anticuerpos .ue fijan complemento, este no se podr0 demostrar si el reactivo de anti globulina poli específicos tiene escasas o ninguna actividad anti;-d! "! Incubación inadecuada durante la fase de sensibilacion! ! 3erdida de células durante el lavado, cuando .ueda un botón celular insuficientes para una lectura adecuada! #! Hmisión del reactivo de -oombs! ! @etardo en agregar el reactivo de antiglobulina después de terminado el lavado (elución del anticuerpo+! /! El e$ceso de salina residual después del Bltimo lavado, causa dilución del reactivo de antiglobulina! &! 5os movimientos violentos para desprender el botón de células del fondo del tubo, producen la dispersión de los aglutinados débiles e interpretación errónea de la lectura!
SON CAUSA DE RESULTADOS FALSOS POSITI'OS+ ! 5a contaminación bacteriana de la muestra de sangre y de los reactivos! #! 5os glóbulos rojos provenientes de pacientes sépticos (activación de antígeno D, -oombs directo positivo+! ! 5a contaminación de la ))* con sílice coloidal proveniente de los envases de vidrio donde este se almacena, igual problema se ha se6alado cuando se usan tubos rayados8 o la contaminación con iones met0licos cuando la salina se conserva en envase de metal! /! 5os tubos de ensayo mal lavados contaminados con polvo, detergente y otros materiales (sulfato de cobre+! &! 5os reactivos de antiglobulina mal preparados, pueden contener trazas de anticuerpos especie;específicos! 1! 5as muestras de sangre coaguladas y refrigeradas provenientes de personas con anticuerpos fríos, pueden dar una prueba de -oombs directo positiva por activación del complemento! Ello se evita empleando glóbulos rojos de muestra tomadas con anticoagulante (A-<, -3<, E
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PAPEL DEL COMPLEMENTO EN LA PRUEBA DE ANTIGLOBULINA+ 5os glóbulos rojos pueden sensibilizarse con componentes del complemento sea in vivo o in vitro, a través de dos mecanismos principales: ! 3or efecto de anticuerpo .ue fijan complemento! #! 3or complejos inmunes presente en el plasma, los cuales de depositan sobre los glóbulos rojos y causan activación no especifica del complemento, cuyos componentes se fijan en el membrana eritrocitarias! -ual.uiera .ue sea mecanismo, el resultado es .ue los glóbulos rojos se sensibilizan con componentes de cascada del complemento, pudiendo llegar o no a hemolisis! )i los glóbulos rojos no se hemolizan, fracciones de componentes del complemento .uedan en su membrana, donde son detectados por el reactivo de antiglobulina! -omplemento solo, sin inmunologlobia, puede estar presentes en la membrana del glóbulo rojo en ci4ertas circunstancia, por ejemplo: a+ En presencia de anticuerpos fríos Ig>, .ue ocasionalmente sensibiliza los glóbulos rojos sin causar su aglutinación, pero, como invariablemente estos anticuerpos fijan complemento, este puede ser detectado mediante la prueba de anti globulina! puede fijar cientos de moléculas de -! b+ Cn "' al #"' de las anemias hemolíticas autoinmunes por anticuerpos calientes, tiene la prueba de antiglobulina directa positiva directa positiva (actividad anti;-+, sin demostrarse la presencia de inmunoglobulina Ig, Igm o IgA en la membrana 4! )i piensa .ue estos casos si e$isten Ig, pero en cantidades tan pe.ue6as .ue no es demostrable por el reactivo de antiglobulina! c+ En el síndrome de anticuerpo fríos, el anticuerpo Ig> se fija a los glóbulos rojos cuando hay descenso de la temperatura a " "-, lo cual sucede en la piel y en los sitios descubiertos! El anticuerpo unido a las células generalmente fija complemento y si las condiciones son óptimas, se produce la hemolisis! 3ero si los glóbulos rojos escapan al fenómeno hemolítico, ellos retornan a la circulación central donde la temperatura es de % "-! a esta temperatura, el anticuerpo Ig> usualmente de desprender de las células pero .uedan los componentes del complemento fijados firmemente, pudiendo ser detectados por la prueba de anti globulina!
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