Informe n 8

“Año de la consolidación del Mar de Grau”

Facultad de Medicina Humana “Fernando Cabieses Molina” BIOLOGÍA CELULAR  MOLECULAR !R"C#ICA $% &' (')* EXTRACCION DE ADN, FUNDAMENTOS DE LA L A REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR), FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS

Inte+rantes, • • •

-#EFA$ HUA!AA -A$.RA #RU/ILLO .U$IA CAR.E$A-

!ro0esor encar+ado, •

Francesca Falconi A+a1ito

#urno, Martes de ),)* a 2,** 1m

2016

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1. Introducción: Extracción: La extracción de ADN de las células y su purifcación son de primordial importancia para el campo de la biotecnologa y de la medicina !orense. El ADN se encuentra en el n"cleo de las células de nuestro cuerpo# en cada n"cleo podemos encontrar aproximadamente $ metros de ADN. La aplicación de técni cnicas molecul culares inicia con la extracción de ADN ya %ue es una importante parte del proc proce eso deb debido ido a %ue %ue el ADN ADN prim rimero ero nece necesi sita ta ser ser purif urifca cad do ale ale&'nd &'ndol olo o de otr otros compu ompue estos stos com como las protenas y otras sustancias contaminantes Es casi casi sie siempre pre el prim rimer paso paso en muc(o uc(oss caso casoss de diagnóstico clnico usado para detectar )irus y bacterias en el ambiente molecular sir)e también para el diagnóstico de en!ermedades en!ermedades y desordenes genéticos El ob&eti &eti)o )o de la extra xtracc cciión de ADN ADN es obt obtener ner ADN ADN relati)amente purifcado %ue se puede utili*ar para !uturas in)estigaciones: +,-# secuenciación# etc. 1/ +,-: La +,- es una técni cnica para la snt snte esis sis 0in )itro0 de secuencias especfcas de ADN. Es una !orma simple y muy r'pi 'pida de multi ultip plica licarr el ADN prese esente nte en di!e di!errentes ntes muestras biológica# obteniéndose millones de copias de una dete deterrmina minada da secu secuen enci cia a de ADN. ADN. En poco oco tiem tiempo po esta esta técnica (a conseguido ser ampliamente utili*ada no sólo en el campo de la genética molecular# sino en otras muc(as cien cienci cias as.. Las Las sigl siglas as +,+,- sign signif ifca can n 0+ol 0+olim imer eras ase e ,(ai ,(ain n -eaction0# -eacción en ,adena de la +olimerasa. El in)entor de esta interesante interesante técnica !ue ary 2ullis por la cual se le ad&udicó el +remio Nobel de 3umica en 1445. 6tili*ó la +,- para la amplifcación del gen de la b7globina (umana 2ullis y cols.# 1489 2ullis y ;aloona.# 148






entonces la +,- (a re)olucionado todos los campos %ue estudian y manipula los 'cidos nucleicos. 2ullis se basó en la replicación del ADN en los organismos eucariotas reali*ada por la DNA polimerasa. Estas en*imas reali*an la sntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido ?@7 5@ usando un molde de cadena sencilla# pero a partir de una región de doble cadena. +ara crear esta región doble cadena se usan los denominados cebadores primers/. =on una pare&a de oligonucleótidos sinteti*ados de manera %ue sean complementarios a cada uno de los extremos 5@ del !ragmento de DNA %ue se desea amplifcar. +artiendo de este principio# la reacción en ,adena de la +olimerasa se basa en la repetición de un ciclo !ormado por tres etapas: 1.

Desn De snat atur ural ali* i*ac ació ión n del del ADN ADN dobl doble e cade cadena na

$. Bibr Bibrid idac ació ión n de de los los ceba cebado dorres a la la *on *ona a 5@e 5@esp spec ecf fca ca de cada una de las (ebras 5. Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa En la primera etapa desnaturali*ación/ la doble (élice de ADN se separa en dos (ebras. +ara ello se reali*a una incubación de la muestra a altas temperaturas 4574






sólido por e&emplo la electro!oresis en papel o en acetato de celulosa/# o bien a tra)és de una matri* porosa electro!oresis en gel/# o bien en disolución electro!oresis libre/. Dependiendo de la técnica %ue se use# la separación obed obedec ece e en dist distin inta ta medi medida da a la carg carga a eléc eléctr tric ica a de las las moléculas y a su masa. La )ariante de uso m's com"n para el an'lisis de me*clas de protenas o de 'cidos nucleicos utili*a como soporte un gel# (abitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los 'cidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negati)a# %ue los dirigir' al polo positi)o# mientras %ue las protenas se car cargan al unirse con sustancias como el =D= detergente/ %ue incorpora cargas negati)as de una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la me*cla de moléculas y aplicar un campo eléctrico# éstas se mo)er'n y deber'n ir pasando por la malla del gel una red tridimensional de fbra fbrass cru* cru*ad adas as/# /# por por lo %ue %ue las las pe%u pe%ueF eFas as se mo)e mo)er' r'n n me&or# m's r'pidamente. As# las m's pe%ueFas a)an*ar'n m's y las m's grandes %uedar'n cerca del lugar de partida 5/.

$. Gb&eti)os: Extracción: HExtraer ADN a partir de muestras biológicas H,onocer las di!erentes técnicas de aislamiento de ADN HAnali*ar cada proceso de la técnica de aislamiento de ADN







H,onocer los !undamentos en los %ue se basa la técnica de +,-. H,onocer su importancia del uso de la técnica de +,- para el diagnóstico de en!ermedades en los seres (umanos. HExplicar cómo se genera un !ragmento especifco de ADN genómico (umano utili*ado la técnica de +,-. Electro!oresis: HApreciar la técnica de electro!oresis en gel. H,omprender los conceptos %ue est'n in)olucrados en la separación de 'cidos nucleicos en una corrida electro!orética. HGb HGbser ser)ar )ar la muest uestra ra de ADN aisl aislad ada a de la pr'ct r'ctiica anterior. 5. 2ateriales EJ-A,,IKN# EJA,,IKN# +,-  ELE,J-G;G-E=I= Hit de extracción de ADN H2icro pipetas de $71#171ul H+untas de 171ul y de 171ul HJubos ependorM de 1#? 2l H2icro pipetas de $71# 17 1 H+untas de 1 71ul y de 171ul HJubos ependor! de 1#? mL H2icrocentri!uga H2icrocentri!uga 19 rpm HJubos ependor! HJermociclador HAgua estéril H2uestra de ADN







H2arcador de peso molecular. H,'mar H,'mara a de electr electro!o o!ore resis sis y accesor accesorios ios pein peines# es# soport soporte# e# tabla ni)eladora# etc/. H;uente de poder. poder. H2icropipetas para )ol"menes de #? 7 $ l HOuantes. HOradilla para tubos de 1#? mL. +rocedimiento Extr Extrac acci ción ón de ADN ADN usan usando do >it >it de extra xtracc cció ión n +urel urelin in>7 >7 genomic in)itrogen/ EJ-A,,IKN DE ADN DE =ANO-E JGJAL 1. A un tubo ependorM# adicionar una muestra de $ ul de sangre !resca o congelada. $. Jra Jrans ns!e !eri rirr $ul $ul de célu célula lass o sang sangrre a un tubo tubo contiene $ ul proteinasa 

%ue %ue

5. AFadir $ ul de -Nasa a la muestra. =ometer a )órtex )órtex por 1? segundos e incubar a temperatura ambiente durante $ min. P. AFadir 1 ul de buMer lisis y (omogeni*ar utili*ando )órtex por 1? segundos e incubar a temperatura temperatura ambiente ambiente durante $ minutos. ?. Incubar a ?? , durante 1min. 9. AFadir 1ul de etanol 4971Q. 2e*clar en el )órtex por 1? segundos. <. Incubar la lisis por ? min a temperatura ambiente. ambiente. +-G,E=G DE +6-I;I,A,IKN:









$. ,entri!ugar la columna a 8? rpm por 1 minuto# descartar el fltrado por la columna y colocarla en un nue)o tubo de la)ado. 5. La)ar la columna con $ul de buMer de la)ado# centri!ugar a 8? rpm por 1 min y eliminar el fltrado. P. ,olocar la columna en un nue)o tubo de la)ado# adic adiciiona onar $ul ul de buMe buMerr de la)a la)ad do y cent centri ri!u !ug gar la columna a )elocidad m'xima por 5 minutos para poder fltrar cual%uier residuo del buMer de la)ado. ?. ,oloc oloca ar la col columna umna en en un nue nue)o tub tubo o de re recole colecc cciión 1#?ml/ 9.

AFad AFadiir 1 1 ul de buMe buMerr de de elu eluci ción ón a la la col colum umna na

<. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. ,entri!ugar la columna a )elocidad m'xima durante 1 min a temperatura ambiente 8. +ara ara recup ecupe erar m's m's ADN ADN# reali ali*ar una una segun segunda da eta etapa de elución utili*ando el mismo )olumen de buMer de elución opcional/. 4. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. ,entri!ugar a )elocidad m'xima por 1 minuto opcional/. 1. El tubo tubo cont contie iene ne ADN ADN genó genómic mico o puri purifcad fcado. o. 11. Almacenar el ADN purifcado a 78o, para otras aplicaciones. ,uantifcación de 'cidos nucleicos 3ubit/







+rocedimiento de electro!oresis: 1. =e preparó preparó ? ml de agarosa al $Q y se adiciono $ ul de colo colora rant nte e =ybr =ybr Oree Oreen# n# se de&ó de&ó pol polimer imeri* i*ar ar por 1 min min aproximadamente. Luego se sumergió el sistema conteniendo los geles polimeri*ados en su tan%ue c'mara electro!orética/ con el buMer JRE I para ADN. Al momento de sumergir los geles en el tan%ue# se aseguró %ue los







P. ;inal inali* i*ad ada a la colo coloca caci ción ón de las las mues muestr tras as ADN ADN en los los pocillos# se cubrió el tan%ue con la tapa y se conectó los cables de los electrodos en la !uente de poder. =e encendió la !uente de poder y se procedió a seleccionar el )olta&e adecuado puede estar comprendido entre






HEl ADN lo usa usamos para reali*ar reaccio ciones de +,reacció ción en cade adena de la polimerasa/# a/# con lo cua cual obtendremos obtendremos muc(as copias del ADN. HLa pro!esora se encargó de colocar las muestras en el termociclador y una )e* acabado el proceso ya tendramos nuestras muestras listas para el proceso de electro!oresis. electro!oresis. ELE,J-G;G-E=I= En el resultado de +,+,- en la electr ctro!or o!ore esis sis no se pudo udo obtener lo %ue busc'bamos al par parecer ecer (ubo (ubo prob proble lema mass en la comp compos osic ició ión n de de las las muestras. Jambién (ay %ue recordar %ue una de las muestras de de AD ADN no se obtu)o la necesaria sangre y se le agrego agua destilada para %ue no a!ectara la muestra. ,abe recalcar %ue también la mesa 1# $ y 5 no tu)ieron la misma cantidad de ADN# esto también puede expli xplica cars rse e con con %ue %ue no (ubo (ubo una una buen buena a (omo (omoge geni ni*a *aci ción ón antes de reali*ar la electro!oresis por ello la concentración de ADN !ue escasa y no se coloreo igual Existe también la posibilidad de %ue las otras muestras se puedan contaminar con ANDasas %ue se encuentran en el cabello# las uFas. A pesar de %ue se usó guantes guantes P/







?bp ?bp:: indi indica ca el mar marcado cadorr de peso peso mole molecu cula larr empl emplea eado do## cada banda es de un tamaFo di!erente. ?. Discusión Extra Ex tracc cció ión n: 6na )e* %ue obtu)imos los tubos de ensayo con las muestras de sangre se le agrega protenasa > %ue !unciona como !acilitador de la lisis y para degradar las protenas %ue se encuentran en la sangre obteniendo as una muestra muc(o m's pura# luego se le agrego -Nasas son en*imas %ue cortan las cadenas de A-N para su posterior degradación esta igual %ue la proteinasa > nos ayudara a conse consegu guir ir una una solu soluci ción ón m's m's puri purifc fcad ada a para para solo solo pode poderr









e)itar %ue otras moléculas interaccionen con la matri* de silica .,onti ntinuamo amos aFadiendo etanol nol %ue ayuda a incr ncreme ementar ntar la car carga del ADN ADN par para %ue teng enga may mayor afni af nida dad d a la matr matri* i* de sili silica ca # luego uego de&a de&amo moss incu incuba barr nuestra muestra durante cinco minutos para de&ar actuar el etanol y as concluimos con la parte de la extracción dando paso al siguiente paso %ue es la purifcación . +ara ara inic iniciiar la purif urifca caci ción ón se colo coloca ca la me*c me*cla la en una una columna de silica %ue !unciona como un fltro y tiene carga positi)a y se centri!uga# aplicando este este procedimiento procedimiento dos )eces para seguidamente aFadir el buMer de la)ado para eliminar sustancias %ue %uedan y luego el buMer de elución %ue permitir' %ue se libere el ADN de la columna de silica y seguidamente lo centri!ugamos para obtener el producto %ue sera el ADN genómico purifcado. ,uantifcación La obtención de los datos de ADN total de la muestra de sangre de cada uno de nuestros compaFeros !ue gracias al uso del método de uorometria %ue tiene un alto grado de sensibilidad y nos permite medir pe%ueFas cantidades de ADN# este !unciona usando un urometro donde se )a a







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el ceba cebado dorr dan dan espe especi cifc fcid idad ad y se unen unen de !or !orma especfca a la región de interés El %ue se encargó de polimeri*ar el ADN !ue el ADN polimera*a %ue es una en*ima %ue necesita la ayuda de los co!actores iones mg TT para %ue pueda !ormar la en*ima

Electro!oresis Las Las mues muestr tras as de la prot prote ena na suel suelen en diso disol) l)er erse se en una una solución de sacarosa cuya densidad impide %ue la muestra se me*cle con el amortiguador y luego se carga en los po*os con una pipeta fna. En el paso $ se aplica una corriente directa directa al gel# lo %ue ocasiona %ue las protenas se mue)an en la poliacrilamida en carriles paralelos. ,uando se reali*a en el detergente =D=# las protenas se mue)en como bandas a )elocidades in)ersamente proporcionales a su masa asa mole olecul cular. ar. 6na 6na )e* )e* %ue %ue la elect ectro!or o!ore esis sis se completa# el gel se retira del marco de )idrio y se tiFe. ?/ Nosotras pudimos obser)ar %ue en los carriles uno# siete y once del gel de poliacrilamida se encontraban los







donde se aFadió el +,- amplifcado del grupo III/ y seis el +,- amplifcado del grupo IU/ si se pudo e)idenciar los patrones de bandas# esto se debe a %ue la extracción de ADN !ue la correcta por consiguiente se (i*o un buen +,- y también se reali*ó el proceso de electro!oresis de manera correcta. +or "ltimo en los carriles oc(o y nue)e donde se les agregó ADN total T E,G- I/ pudimos obser)ar %ue si se !ormaron los !ragmentos debido a %ue la extracción de ADN !ue buena# adem's %ue las en*imas de restricción !unc !uncio iona narron de la mane manera ra cor correcta ecta cump cumpli lien endo do con con su traba&o. Las posibles causas por la %ue no se obtu)o resultados positi)os !ueron. HDeg HDegra rada daci ción ón del del ADN: ADN: esto esto puede uede ocur ocurri rirr cuan cuando do se manipula la muestra en condiciones subóptimas o cuando se (ace una autopsia# au topsia# por e&emplo# y resulta en ausencia de amplifcación o resultados parciales. 6n caso particular es el 0allele dropout0# o bien pérdida de un alelo# %ue se puede llegar a con!undir con ser (omocigótico para dic(o alelo. HIn(ibición de la +,-: puede (aber agentes %ue interferan en el correcto transcurso de la +,- -e%uerir' un







+,H=e debe de reali*ar cada paso menci ncionad nado en el procedi procedimien miento to para lograr lograr obtener obtener ADN amplifca amplifcado do y %ue cada uno de ellos re%uiere de muc(o cuidado y debe de desa desarrrolla ollars rse e con con cant cantid idad ades es exact xactas as para para obte obtene nerr el resultado deseado. Electro!oresis: •

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El tampón sir)e como conductor de la electricidad y controla el pB # lo cual es importante para la estabilidad de las moléculas biológicas Las Las mues muestr tras as e)id e)iden enci ciar aron on sus sus grad grados os de pur pure*a e*a y esta estado doss de cons conser er)a )aci ción ón nat nati) i)o o o degr degrad adad ado/ o/ # la mayora estaban en su estado degradado # lo %ue indica una mala calidad del ADN extrado +ara lograr una electro!oresis exitosa # es necesario eleg legir un buen uen gel # el cual cual permitir tir' logra grar una separación efciente de las moléculas # con su !ricción %ue dan las macromoléculas y reducir al mnimo la di!usión







P. Lópe* +# Oon*'le* 2# 6r%uidi N. Extracción cuanti ntifcac cación de ADN en leucocitos ZInternet[. pre* pre*i. i.com com.. $19 $19 Z,ons Z,onsul ulta tado do 1P no)i no)iem embr bre e $19 $19[. [. Disponible en: (ttps:VVpre*i.comVbsdb%>l (ttps:VVpre *i.comVbsdb%>lx))tiVext x))tiVextraccion7amp7 raccion7amp7 cuantifcacion7de7adn7en7leucocitosV ?. arp arp O. Riologia Riologia ,elular ,elular y molecular molecular..

Informe n 8

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