2. Introducción La mitosis es el proceso de división celular de las células eucarióticas no sexuales con el cual se conserva la información genética. En este proceso, el núcleo de la célula madre duplica sus cromosomas y luego se divide en dos células hijas que son copias de la célula madre; este proceso es observado en todas las células somáticas de los organismos vivientes (WiseGeek, 2003). Tradicionalmente, el ciclo celular se divide en dos etapas fundamentales: Interfase, que es cuando una célula no se encuentra en alguna de las fases de mitosis y la Mitosis; la primera se caracteriza porque el ADN se encuentra en forma de cromatina (cromosomas desenrrollados, filamentosos) por todo el núcleo celular, en esta etapa sucede la replicación, transcripción (copia) y transducción de los cromosomas, teniendo como resultado dos moléculas iguales y, la Mitosis, que ocurre posteriormente, se compone de cuatro fases: Profase, Metafase, Anafase, Telofase ( Figura 1).
Figura 1. Etapas de la división celular, con señalamiento de algunas partes importantes en cada una
La Profase es la primer fase mitótica, en esta etapa, las cromatinas duplicadas se dividen por división longitudinal produciendo dos cadenas unidas en el medio, que al condensarse totalmente forman los cromosomas, que se mantienen unidos por un estrangulamiento en el centro, en una zona denominada centrómero ( Figura 2). Los cromosomas se encuentran dispersos en el núcleo. Simultáneamente Simultáneament e al proceso anterior, el nucléolo se esfuma y los centrosomas ( Figura 3) migran por separado a cada polo de la célula y quedan unidos por fibras (microtúbulos) (Cooper & Hausman, 2010).
Figura 2. Esquema de las partes del cromosoma. (Atlas de Histologia Vegetal y Animal, 2009)
Figura 3. Esquema de los centrosomas y la migración hacia los polos (Atlas de Histologia Vegetal y Animal, 2009)
Luego, la Metafase inicia con la destrucción o desaparición de la membrana nuclear, aquí, el material genético queda expuesto en el citosol y se forma la placa metafásica o ecuatorial en la región media de la célula, sobre esta línea se orientan los cromosomas fijando el centrómero a las fibras de la placa y situando el satélite y telómero de cada cromátide hermana hacia un polo diferente ( Figura 2). Una vez, los cromosomas están situados debidamente en el centro de la célula inicia la Anafase, en este lapso, las fibras de cada centrosoma se contraen separando las cromátides hermanas (Cooper & Hausman, 2010), las cuales, guiadas por su respectivo centrómero son arrastradas hacia el centrosoma respectivo; consecutivamente, los filamentos se desvanecen y los cromosomas permanecen unidos a su centrosoma. Esta fase es de vital importancia, pues un cambio o mutación aquí puede ser causante de muchas enfermedades somáticas. Finalmente ocurre la Telofase, que es la etapa en que los cromosomas unidos al centrosoma se encapsulan dentro de una membrana nuclear dando origen al núcleo definido, donde al finalizar este proceso, los cromosomas se extienden nuevamente en forma de cromatina. Posterior a esto ocurre la citocinesis y respecto a ésta hay mucha polémica, pues muchos científicos la consideran parte de la telofase, así como muchos otros consideran que es un proceso externo a esta; sea cual sea la realidad, el huso mitótico que se estaba formando en la Metafase se encarga de la citocinesis; en células vegetales ocurre una tabicación a lo largo del huso y una vez esta formado el tabique, se observan las dos células hijas; y en células animales, ocurre un estrangulamiento, en el que los microtúbulos del huso se hacen cada vez más estrechos, hasta el punto en que separan las dos células hijas (Teijón, 2005). La presencia de diferentes alcaloides o fármacos durante la mitosis, pueden causar mutaciones, deficiencia o interrupción del ciclo celular; por ejemplo, la cafeína, es un alcaloide que, según González & López (1980), “puede impedir la creación del huso mitótico, debido a la inhibición de la actividad de cierta ATPasa que es esencial para la fusión de la membrana de las vesículas de golgi ”, por tanto, la no creación del huso conlleva a la interrupción de la citocinesis y por ende, a la creación de células binucleadas, que una vez entren en fase mitótica, generarán células polinucleadas. Otra sustancia que puede interferir en la mitosis, es la colchicina, un fármaco que obstruye la mitosis en la metafase o anafase; este fármaco no permite la separación de las dos cromátides hermanas, y esto hace que la célula madre presente más de tres juegos de cromosomas, a esta condición se le denomina poliploidía. Para este laboratorio, se usó el meristemo de las raíces nuevas de cebolla ( Allium cepa L), que anteriormente habían sido tratadas individualmente con cafeína y con agua limpia. La cebolla es comúnmente utilizada para el estudio del ciclo celular, ya que su ciclo mitótico es continuo y de corta duración, siendo este mayor en el trópico. Como objetivos principales se plantearon la preparación adecuada y exitosa de las placas teñidas con la orceína y la identificación morfológica de las células en interfase y en las fases mitóticas; también, se propuso determinar y comprender el índice mitótico y los índices de las fases durante la observación del material puro, con cafeína y con colchicina.
3. Metodología
4. Resultados Las tablas y figuras que se presentan a continuación representan los resultados obtenidos de cada uno de los puntos realizados en la práctica; las células observadas fueron de raíces de Allium cepa (cebolla) 4.1 Punto 1 Para proceder a encontrar el índice mitótico y de fases se utilizaron las siguientes fórmulas:
Índice mitótico (IM): # De células en mitosis / # de células totales
Fórmula No.1
Índices de las fases (IP), (IM), (IA), (IT): Fórmula No. 2 # De células en la fase correspondiente / # total de células en mitosis
El número total de células contadas fue de 300 de las cuales 58 estaban en mitosis. La tabla No. 1 muestra los valores de las células contadas en cada fase y el valor del índice mitótico y de cada una de las fases hallados con la formula No. 1 y 2. Tabla No. 1 Conteo de células observadas e índice mitótico y de las fases
Conteo Celular en Cada Estado Fase # Células Contadas Interfase 242 Profase 21 Metafase 9 Anafase 17 Telofase 11
Índices Mitóticos y de Fases Fase Valor de los índices Mitótico 0.1933 Profásico 0.3620 Metafásico 0.1551 Anafásico 0.2931 Telofásico 0.1896
La tabla No. 2 muestra los diferentes valores de índices mitóticos y de fases obtenidos por los distintos grupos que realizaron montaje de placa con raíces Tabla No. 2 Índices mitótico y de fases de raíces que no fueron tratadas con ninguna sustancia. Grupo No. (IM) (IP) (IM) (IA) (IT)
1 2 3 4 5 6
0.56 0.08 0.13 0.19 0.01 0.23
0.14 0.67 0.41 0.36 0.15 0.44
0.18 0.11 0.19 0.15 0.46 0.06
0.2 0.08 0.20 0.29 0.30 0.14
4.2 Punto 2 La figura mostrada a continuación representa la observación de células en Interfase.
0.18 0.12 0.20 0.18 0.07 0.36
Figura 4. Observación de células en Interfase con aumento de 400X.
La figura a continuación muestra las diferentes fases mitóticas observadas durante la práctica.
a.
b.
c.
d.
Figura 5. Observación de células en sus diferente fases mitóticas con aumento de 400 X Profase b. Metafase c. Anafase d. Telofase.
a.
4.3 Punto 3 En esta parte del práctica, se utilizaron raíces que previamente habían sido tratadas con cafeína al 0.1%; al llevar la placa realizada en la práctica, se montó al microscopio y se encontraron células binucleadas en interfase, profase y metafase, también se encontró una célula tetranucleada. La siguiente figura muestra células polinucleadas en algunas fases mitóticas que estuvieron bajo el efecto de la cafeína
a.
b.
c.
d.
Figura 6. Observación de células polinucleadas bajo el efecto de la cafeína con un aumento de 400X. a. Célula binucleada b. Célula binucleada en profase c. Célula binucleada en metafase “desordenada” d.
Célula tetranucleada.
Como se pudo observar en la placa montada, la cafeína afecta la creación del tabique de separación celular; de modo que no se produce la citocinesis quedando 2 o mas núcleos separados pero dentro del mismo citoplasma.
4.4 Punto 4 La figura mostrada a continuación muestra una célula tratada con colchicina.
Figura 7. Observación con aumento de 400x de célula en metafase “desordenada” por efecto de la colchicina.
El número total de células contadas fue de 384 de las cuales 64 estaban en mitosis La tabla No. 3 muestra los valores de las células contadas en cada fase y el valor del índice mitótico y de cada una de las fases hallados con la formula No. 1 y 2; dichas células fueron tratadas con colchicina. Tabla No. 3 Conteo de células observadas e índice mitótico y de las fases
Conteo Celular en Cada Estado Fase # Células Contadas Interfase 320 Profase 20 Metafase 44 Anafase 0 Telofase 0
Índices Mitóticos y de Fases Fase Valor de los índices Mitótico 0.16 Profásico 0.0.31 Metafásico 0.68 Anafásico 0 Telofásico 0
La tabla No. 4 muestra los diferentes valores de índices mitóticos y de fases obtenidos por los distintos grupos que realizaron montaje de placa con raíces tratadas previamente con colchicina Tabla No. 4 Índices mitótico y de fases de raíces que fueron tratadas con colchicina. Grupo No. (IM) (IP) (IM) (IA) (IT)
1 2 3 4 5 6
0.45 0.23 0.16 0.75 0.21 0.09
0.94 0.38 0.31 0.15 0.39 0.44
0.05 0.62 0.68 0.7 0.6 0.55
0 0 0 0.08 0 0
0 0 0 0.06 0 0
En esta parte de la práctica, las raíces de cebolla utilizadas fueron tratadas con colchina previamente, el efecto observado de la colchina sobre las células consistió en la inhibición de la división celular en metafase, pues hubo observación de profases normales; pero al no haber metafases correctas no se pudo hacer observación de anafases ni telofases. Con respecto a las raíces que no fueron tratadas con ninguna sustancia, se pudo decir que en éstas si se hizo la observación de todas las fases; sin embrago en las tratadas con colchicina solo se pudo hacer observación de la profase y
metafases “desordenas” que por el efecto de haber dichas
metafases no se produjo la aparición u observación de anafases y telofases.
5. Discusión: Existen varios alcaloides vegetales, de los cuales se ha demostrado que, al ser administrados en tejidos vegetales inhibe la formación del tabique de separación celular, y en el caso de las células animales la creación del huso mitótico; estos alcaloides son la teobromina, la teofilina y la cafeína entre otros, (Timson, 1972) siendo esta última la más estudiada. La inhibición que realizan estos alcaloides impide la formación de la nueva pared celular (vegetales), o membrana celular (animales) y cuando se impide la creación de estas estructuras de separación, no se lleva a cabo la citocinesis, que es la etapa posterior a la cariocinesis (profase, metafase, anafase y telofase). Al no realizarse la separación celular (citocinesis), los dos núcleos aunque separados, se conservan al interior de la célula. La presencia de dos núcleos en una misma célula se denomina binucleación. Las células binucleadas funcionan igual que aquellas uninucleadas, por tanto, pasado un tiempo estas entran también, en su respectiva mitosis y, es allí cuando podemos observar mitosis múltiple; es decir biprofases, bimetafases, bianafases y bitelofases ( Figura 6). En una segunda ronda de división celular, con una segunda exposición a la cafeína se crearán células polinucleadas. Dependiendo de la duración de la exposición de las células al alcaloide, se encuentran células con diferentes cantidades de núcleos. Respecto al método de acción de la cafeína en las células vegetales, hay varias teorías; un estudio realizado por Becerra & López-Sáenz, (1978) concluyó que la cafeína disuade el reconocimiento y fusión de la membrana teniendo como principales cofactores, la presencia de calcio y magnesio para ejercer la inhibición. Otro estudio, realizado por los investigadores González-Fernandez & LópezSaenz (1980) postula que la cafeína puede bloquear la formación del huso mitótico debido a la inhibición de la actividad de una ATPasa específica, de la cual se sabe está involucrada en la fusión de las membranas en las vesículas de golgi.
6. Bibliografía
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