INFORME DE LABORATORIO Laboratorio de Bioquímica
Integrantes: Flavia Aldana Danhiella Espinoza Dafnne Pizarro Matías Rojas Aylin Vergara Docente: Luz Marina González Medicina Veterinaria 19 de junio de 2017
LABORATORIO N°3: ANÁLISIS CINÉTICO DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA PARTE I Introducción Las fosfatasas son una familia de enzimas que catalizan la hidrólisis de un grupo fosfato (desfosforilación). La actividad fosfatasa se puede medir mediante un ensayo enzimático colorimétrico basado en su capacidad de hidrólisis del pnitrofenilfosfato (pNPP) a p-nitrofenol: p-nitrofenilfosfato (pNPP) + H 2O
→
p-
nitrofenol + fosfato. A diferencia del pNPP, el producto de la reacción pnitrofenol es un compuesto amarillo que presenta un máximo de absorbancia a 405 nm en un medio alcalino que se puede monitorizar mediante espectrofotometría (IQS, 2015). En este laboratorio se determinará la actividad de la fosfatasa ácida a distintas concentraciones del sustrato p-nitrofenilfosfato.
Objetivos Objetivo general
Analizar algunos de los principales factores que afectan las reacciones enzimáticas en los sistemas biológicos.
Objetivo específico
Estudiar el efecto de la cantidad del sustrato (p-nitrofenilfosfato) sobre la acción enzimática de la Fosfatasa Ácida.
Desarrollo del práctico Reactivos:
p-nitrofenol 3,0 Mm
NaOH 0,1 M
MgCl2 25 Mm
Tampón citrato 0,1 M, pH 5,0
Agua destilada
Solución de enzima Fosfatasa ácida: Se extrae jugo de una papa, se centrifuga y se guarda el sobrenadante en el refrigerador. Para el análisis se toman 5 ml y se diluyen a 10, después se toma 1 ml de esta dilución y se diluye a 10, quedando listo para el análisis.
Materiales:
Tubos de Ensayo de 10 ml.
Gradilla para tubos de ensayo.
Vasos de precipitado.
Baño termorregulado.
Espectrofotómetro.
Cubetas para espectrofotómetro.
Agitador de tubos (Vortex).
Micropipeta P-1000.
Puntas para micropipeta P-1000.
Pipetas de 1, 2 y 5 ml.
Propipetas.
Papel milimetrado y regla.
Procedimiento: 1) Se preparó una serie de tubos adicionando los volúmenes de los componentes según la siguiente tabla
Tabla 1: Contenido de los tubos utilizados (Volumen en ml) Compuesto PNitrofenilfosfato 3,0 Mm MgCl2 25 Mm Tampón Citrato pH 5,0 Agua destilada Enzima
B
1
2
3
4
5
6
--
0,5
1,0
1,5
2,0
3,0
4,0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,0 1,0
1,5 1,0
1,0 1,0
0,5 1,0
0,0 1,0
0,0 1,0
0,0 1,0
B: Blanco (no contiene sustrato) 2) Se agitó cada uno de los tubos y luego se incubaron a 37°C por 15 minutos. 3) Mientras se incubaban, se preparó 7 tubos más, los cuales contenían 5 ml de NaOH 0,1 M, luego se rotuló cada uno respectivamente. 4) Al terminar la incubación, se transfirió rápidamente una alícuota de 1 ml de cada tubo incubado, a uno preparado con NaOH 0,1 M. 5) Desde cada uno de los tubos nuevos con NaOH y muestra incubada, se transfirió un volumen de cada tubo a una cubeta de espectrofotómetro, posteriormente estas se introdujeron en el espectrofotómetro. 6) Se ajustó el espectrofotómetro a cero de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm utilizando el tubo B. 7) Se midió la absorbancia de los tubos restantes y se registraron los valores obtenidos. 8) Se realizó una gráfica de la absorbancia a 405nm versus la cantidad de sustrato agregado (en ml).
Resultados: Tabla 2: Efecto de la concentración de sustrato en la absorbancia B
1
2
3
4
5
6
Absorbancia (eje y) 0,003
0,095
0,496
0,714
0,883
1,017
0,982
Sustrato (eje x)
0,5
1,0
1,5
2,0
3,0
4,0
0
Absorbancia v/s cantidad de sustrato 1.2 1.017 1
0.982
0.883 0.714
0.8
a i c n 0.6 a b r o 0.4 s b A
0.496
0.2
0.095 0.003
0 0
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
4.0
Sustrato Gráfico 1: Absorbancia versus cantidad de sustrato utilizado en cada tubo.
Conclusión Las enzimas son sustancias que catalizan reacciones metabólicas en los organismos, aumentando su velocidad de reacción. Existen diferentes factores que tienen directa relación con el funcionamiento de las enzimas, como por ejemplo la cantidad de sustrato que se utiliza en una reacción. La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de sustrato que se utilice, a medida que una aumenta, la otra lo hace también. Cuando hay una alta concentración de sustrato, la velocidad de la reacción se vuelve constante y ya no depende tanto de la cantidad de sustrato, ya que los centros activos de la enzima se encuentran saturados, por lo cual se dice que ha alcanzado una velocidad máxima. Luego de esto la velocidad se mantiene constante o baja.
Bibliografía Institut Químic de Sarrià (2015) Determinación de las constantes cinéticas de la fosfatasa ácida de germen de trigo y efecto del pH sobre su actividad.
Recuperado
de:
http://www.gruposelecta.com/notasdeaplicaciones/category/determinacion-delas-constantes-cineticas-de-la-fosfatasa/
LABORATORIO N° 4: ANÁLISIS CINÉTICO DE LA ENZIMA FOSFATASA ÁCIDA PARTE II Introducción La acción enzimática depende tanto de la concentración del sustrato como la de otros factores. Las enzimas son especialmente sensibles a las variaciones de la temperatura y del pH. La concentración de iones hidrógeno (expresada como pH) afecta a las enzimas de diversas formas, ya que los cambios de los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Si el pH es lo suficientemente alcalino para que el grupo pierda su protón, la actividad enzimática puede deprimirse (Nelson & Cox, 2009). Por otro lado, cualquier factor ambiental que distorsione la estructura proteínica puede alterar la actividad enzimática (McKee & McKee, 2014) En este laboratorio se estudiará el efecto de la temperatura y el pH en la actividad enzimática.
Objetivos Objetivo general
Analizar los principales factores que afectan las reacciones enzimáticas en los sistemas biológicos
Objetivo específico
Determinar/estimar el pH y temperatura óptima para la reacción de la fosfatasa ácida.
Desarrollo del práctico Reactivos:
p-nitrofenol 3,0 Mm
NaOH 0,1 M
MgCl2 25 Mm
Tampón citrato 0,1 M, pH
Agua destilada
Solución de enzima Fosfatasa ácida: Se extrae jugo de una papa, se centrifuga y se guarda el sobrenadante en el refrigerador. Para el análisis se toman 5 ml y se diluyen a 10, después se toma 1 ml de esta dilución y se diluye a 10, quedando listo para el análisis.
Materiales:
Tubos de Ensayo de 10 ml.
Gradilla para tubos de ensayo.
Vasos de precipitado.
Baño termorregulado.
Espectrofotómetro.
Cubetas para espectrofotómetro.
Agitador de tubos (Vortex).
Micropipeta P-1000.
Puntas para micropipeta P-1000.
Pipetas de 1, 2 y 5 ml.
Propipetas.
Papel milimetrado y regla.
Hielo
Mechero Bunsen con rejilla y trípode
Parafilm cortado en cuadritos de 2x2 cm.
Procedimiento: Efecto del pH de la acción enzimática: 1) Se preparó una serie de tubos adicionando los volúmenes de los componentes según la siguiente tabla:
Tabla 1: Contenido de los tubos utilizados (Volumen en ml) Compuesto PNitrofenilfosfato 3,0mM MgCl2 25mM Tampón citrato Agua destilada
b -
c 1,0
1 1,0
2 1,0
3 1,0
4 1,0
0.5 4,5
0.5 3,5
0.5 2,5/pH=3 1,0
0.5 2,5/pH=5 1,0
0.5 2,5/pH=7 1,0
0.5 2,5/pH=8 1,0
2) Luego, se agregó 1mL de enzima a cada tubo (menos el C) 3) Después se agitó suavemente cada tubo y se incubaron a 37°C por 15 minutos. 4) Mientras se incubaban, se preparó 7 tubos más, los cuales contenían 5 ml de NaOH 0,1 M, luego se rotuló cada uno respectivamente. 5) Al terminar la incubación, se transfirió rápidamente una alícuota de 1 ml de cada tubo incubado, a uno preparado con NaOH 0,1 M. 6) Desde cada uno de los tubos nuevos con NaOH y muestra incubada, se transfirió un volumen de cada tubo a una cubeta de espectrofotómetro, posteriormente estas se introdujeron en el espectrofotómetro. 7) Se ajustó el espectrofotómetro a cero de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm utilizando el tubo B. 8) Se midió la absorbancia de los tubos restantes y se registraron los valores obtenidos. 9) Se realizó una gráfica de la absorbancia a 405nm versus el pH de cada tubo.
Resultados Tabla 2: Absorbancia de los tubos tubo
Abs
B
0
C
-0.008
1
1.017
2
2.188
3
0.990
4
1.042
Absorbancia v/s pH 2.5 2.183 2
a i c n1.5 a b r o s 1 b A
1.017
0.990
1.042
7
8
0.5
0 3
5
pH Gráfico 1: Absorbancia versus pH de 4 tubos Efecto de la Temperatura en la Acción Enzimática 1) Para cada temperatura (0°C, Temperatura ambiente, 37°C y 100°C) se preparó los tubos control, blanco y T (12 en total) según la siguiente tabla:
Tabla 3: Contenido de los tubos utilizados Compuesto P-Nitrofenilfosfato 3,0mM MgCl2 25mM Tampon citrato pH 5,0 Agua destilada
B -
C 1,0
T 2,0
0,5 2,5
0,5 2,5
0,5 2,5
2,0
1,0
1,0
2) Se agregó 1mL de enzima a cada tubo (menos el C) 3) Cada tubo se agitó suavemente y se incubó por 15 minutos a las respectivas temperaturas. 4) Durante la incubación, se prepararon 12 tubos más los cuales contenían 5 ml de NaOH 0,1 M 5) Al terminar la incubación, se transfirió rápidamente una alícuota de 1 ml de cada tubo incubado, a uno preparado con NaOH 0,1 M. 6) Desde cada uno de los tubos nuevos con NaOH y muestra incubada, se transfirió un volumen de cada tubo a una cubeta de espectrofotómetro, posteriormente estas se introdujeron en el espectrofotómetro. 7) Se ajustó el espectrofotómetro a cero de absorbancia a una longitud de onda de 405 nm utilizando el tubo B elaborado para una temperatura dada. 8) Se midió la absorbancia de los tubos C y T elaborados para la misma temperatura del tubo B (por ejemplo a 0°C). 9) Luego se siguió el mismo paso para medir la absorbancia de los tubos que estaban a las otras temperaturas. 10) Se registró todos los datos de absorbancia para cada temperatura, después se procedió a realizar la siguiente corrección para eliminar el producto formado por la hidrólisis química del sustrato que es dependiente de la T° y así obtener la absorbancia real.
Absorbancia real= Absorbancia de tubo T Absorbancia de tubo C –
11) Con los datos de cata tubo se procedió a realizar un gráfico de absorbancia a 405 nm versus la temperatura de cada tubo.
Resultados Tabla 4: Absorbancia real de los tubos utilizados Temperatura 0° Temperatura ambiente 37° 100°
Absorbancia B : 0,000 C : -0,031 T : 0,374 B : 0,002 C : -0,036 T : 0,349 B : 0,001 C : 0,002 T : 1,202 B : 0,001 C : 0,034 T : 0,653
Abs. real (T-C) 0,343 0,385 1,2 0,619
Absorbancia v/s Temperatura 1.4 1.2 1.2
a 1 i c n0.8 b a r o0.6 s b A0.4
0.619
0.343
0.385
0.2 0 0
TA
37
Temperatura Gráfico 2: Absorbancia versus temperatura de los tubos
100
Conclusión La temperatura es un parámetro ambiental que afecta positivamente la velocidad de las reacciones químicas al incrementar la velocidad cinética. La velocidad aumenta junto con la temperatura, ya que generalmente la velocidad aumenta 1,5 y 5 veces por cada 10°C de aumento de temperatura. Por otro lado, la intensidad máxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH óptimo (pH en el cual la conformación es la más adecuada), con rápida disminución de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad óptima en este experimento es 5. El pH óptimo de una enzima puede guardar relación con cierta carga eléctrica de la superficie, o con condiciones óptimas para la fijación de la enzima a su sustrato.
Bibliografía Nelson, D & Cox, M. (2009) Lehninger: Principios de Bioquímica. 5ta. Ed. Ediciones Omega McKee, T & McKee, J. (2014) Bioquímica Las Bases Moleculares de La Vida . 5ta. Ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana
