Determinación de la Digestibilidad in vitro del Almidón I.
Introducción
El almidón es uno de los componentes principales de la dieta humana y hasta hace algu alguno noss años años era era cons consid ider erad ado o como como un carb carboh ohid idra rato to disp dispon onib ible le que que era era completamente digerido y absorbido en el intestino delgado de los humanos. El componente principal de reserva que se encuentra en la papa es el almidón y su obtención resulta no ser muy compleja, señala Estrada (195!. "e acuerdo con la velocidad y e#tensión de la digestión del almidón, almidón se clasi$ica en almidón de digestión r%pida (&"'!, almidón de digestión lenta ('"'!, y almidón resistente (&'! (Eng (Engly lyst st et al ., ., 199!. &"' es la $racción de almidón que han sido digeridos y absorbidos en el tracto gastrointestinal, lo que provoca un aumento repentino en el nivel de glucosa en la sangre despu)s de la ingestión r%pidamente, mientras '"' es la $racción de almidón que se digiere lentamente pero completamente y sostiene la liberación de glucosa en el tiempo. &' ha sido de$inida como la porción de almidón que no puede ser digerida en el gastrointestino superior, pero puede ser $ermentado por microorganismos en el intestino grueso, que produce %cidos grasos de cadena corta que es bene$icioso bene$icioso para la salud del colon (*hang et al ., ., ++9!. Esta resistencia a la hidrólisis puede ser e#plicada por varios $actores como grado y tipo de cristalinidad del grano de almidón, contenido de amilosa, mor$ologa del gr%nulo, la presencia de complejos almidón-lipdico y almidón-protena, etc. en/in en/inss et al . (++! menciona que el e$ecto de la glucemia postprandial de los alimentos est% relacionado con la velocidad de la digestión de hidratos de carbono y se caracteri0a de $orma $iable por el ndice gluc)mico (2!, un modelo que permite la comp compar arac ació ión n de una una vari varied edad ad de alim alimen ento toss ricos ricos en almid almidón ón.. 3a resp respue uest sta a gluc)mica se ha relacionado con la tasa de digestión y absorción de alimentos que contienen carbohidratos con ayuda de m)todos in vitro, que est%n imitando in vivo procesos de digestión ('ingh et al .,., +1+!. 3a respuesta gluc)mica depende de $actores endógenos de la matri0 del alimento (susce (suscepti ptibil bilida idad d almidó almidón, n, prote protenas nas y lpido lpidos!, s!, la suscep susceptib tibilid ilidad ad de almidó almidón n se determina por su estructura nativa, la encapsulación $sica, la cristalinidad, el grado de gelatini0ación y retrogradación de los gr%nulos de almidón, as como por la proporción de gr%nulos dañados (4ardet et al .,., ++!.
El estudio de la hidrólisis en0im%tica del almidón in vitro de esta pr%ctica permite obtener una in$ormación relativa de la biodisponibilidad del almidón in vivo. Es por ello que en la presente pr%ctica se reali0ó la determinación de la tasa de hidrólisis de almidón de pur) de papa deshidratado, para ello se hidroli0ó con -amilasa hasta reducirlo a a06cares m%s simples y reportarlos como equivalentes de maltosa mediante cuanti$icación por un m)todo espectro$otom)trico con "7'. II. OBJETIVOS
8 onocer el m)todo est%ndar para la hidrólisis del almidón con la -amilasa y su aplicación en productos alimenticios con el $in de conocer su grado de digestibilidad in vitro. 8 "eterminar el grado de digestibilidad del almidón del pur) de papa deshidratado, sometidas a cocción por di$erentes tiempos.
III. Revisión de Literatura
3os procesos en0im%ticos muestran plenamente su potencial en el campo de los carbohidratos, porque tienen el control regio-y-estereoespec$ico, lo cual los hace superiores $rente a las mismas reacciones catali0adas por tratamientos qumicos. .!. Almidón"
El almidón es un polmero de glucosa unido por enlaces glucocdicos. Este enlace es estable a p: alto pero hidroli0ado a p: bajo. ;l $inal de la cadena polim)rica se encuentra un grupo aldehdo conocido como el grupo reductor (
la amilosa y la amilopectina (4ig. 1!. 3a amilosa es un polmero lineal de apro#imadamente +++ unidades de glucosa con enlace ,1-? glucosdico. 3a amilopectina posee cadenas lineales cortas ,1-? de 1+-+ unidades de glucosa y de cadenas laterales ,1- con 15-?5 unidades de glucosa. El n6mero promedio de puntos de rami$icación es del 5@. 3a mol)cula completa de amilopectina contiene apro#imadamente +++ +++ unidades de glucosa, por lo que es considerada una de las mol)culas m%s grandes de la naturale0a (Aurleón, 199B!.
4ig.1> Estructura del almidón. 4uente> Ceña et al, ++9.
.#. En$imas de conversión de almidón
A%sicamente e#isten cuatro grupos de en0imas en el proceso de conversión del almidón> (a! endoamilasas, (b! e#oamilasasD (c! en0imas desrami$icadoras y (d! trans$erasas (
. Al%a&amilasa
3a al$a-amilasa pertenece a la $amilia 1F glicosil hidrolasas (: 1F!, de acuerdo con la clasi$icación de Ceña et al. (++9! . En esta $amilia se comparte un grupo de caractersticas comunes tales como, una estructura (G!B barril, la hidrólisis o $ormación de enlaces -glucósido y un n6mero de amino%cidos de$inido en el sitio activo. El mecanismo cataltico establecido para la $amilia -amilasa incluye dos tipos de reacciones ' 7D los amino%cidos que intervienen en la cat%lisis son lu F+ que act6a como donador de protón seguido de un ataque nucleo$lico por el ;sp +. 3a al$a-amilasa se compone de una cadena polipeptdica plegada en tres dominios> ;, A y . El ; es el dominio cataltico (G!B barril, y los dominios A y se encuentran apro#imadamente a los lados opuestos de este H2=-barril como se muestra en la 4ig . (Hripathy, ++B!.
4ig > &epresentación esquem%tica de la estructura en F" de la al$a-amilasaD obtenida de banco datos de las protenas (C"A!. .'
Digestión( absorción ) metabolismo
3a ingestión del almidón crudo no tiene valor nutritivo y causa diarrea. 3a digestión se inicia en la boca, donde la amilasa salivar empie0a a digerirlo, luego se activa la amilasa pancre%tica y luego los subproductos y el resto de los disac%ridos son atacados por en0imas de las c)lulas intestinales (maltasa, lactasa y sacarosa!, quedando trans$ormados en monosac%ridos, pasando a la sangre (Catiño, ++!. "espu)s de comer, se eleva el nivel de glucosa sangunea y este hecho induce al aumento de la secreción pancre%tica de la insulina. Esta hormona hace que la glucosa sea transportada al hgado, m6sculo y tejido adiposo. 3a glucosa tiende a almacenarse en el hgado y en el m6sculo en $orma de glucógeno, siendo este
glucógeno la $uente productora en situaciones de ayuno, pero no sirve m%s que para las primeras die0 o quince horas (Catiño, ++!. 3a mayora de los procesos de digestión se completan en el duodeno con la participación de secreciones pancre%ticas y biliares, mientras que el yeyuno e leon intervienen $undamentalmente en la absorción de nutrientes. Cor su parte, en el intestino grueso se absorben b%sicamente agua y electrolitos. ircula un residuo semisólido por absorción de 5++ a 1+++ ml. de agua, perdi)ndose por heces de 1++ a ++ ml (<%sque0 et al . ++5!. Cor 6ltimo, las bacterias presentes en el organismo reducen los alimentos que se resisten a la digestión, de $orma que todo aquello que tenga valor nutricional sea recuperadoD entonces las heces est%n compuestas por agua, c)lulas de descamación, bacterias autóctonas y grasas (<%sque0 et al . ++5!. Crevio a la etapa de absorción, los carbohidratos son hidroli0ados. 3a absorción es de tres tipos> transporte activo, di$usión mediada por transportadores y di$usión simple, siendo casi el 95@ de la glucosa absorbida de $orma activa. ;dem%s, el metabolismo de los carbohidratos se altera r%pidamente, de no suministrarse una cantidad adecuada de los mismos, el organismo utili0a las protenas como $uente energ)tica, con la idea de convertirla en metabolitos intermediarios y glucosa (Catiño, ++!.
4igura . "igestión y absorción de carbohidratos (<%sque0 et al. ++5!.
.* . Digestión del almidón en el intestino delgado
El almidón debe ser completamente despolimeri0ado a glucosa para que pueda ser absorbido en el intestino delgado. 3a despolimeri0ación es llevada a cabo por di$erentes en0imas que rompen enlaces glucosidicos (1-?! y (1-!. 3as en0imas
que act6an en especies monog%stricas son las -amilasas que rompen enlaces (1-?!, liberando maltosa y de#trinas. En la digestión de almidones la saliva que contiene en0imas que no act6an sobre el enlace (1-! por que tiene poca a$inidad por los enlaces terminales (3oI y 3ongland, 199+!. 'eg6n 4andila (+1+!, el almidón es hidroli0ado y absorbido en el intestino delgado, est%n en $unción de su hidrólisis y absorción en el intestino delgado. Croponiendo una clasi$icación del almidón en> almidón de digestión r%pida (;"&!, almidón de digestión lenta (;"3! y almidón resistente (;&!. 8 ;"& es aquella $racción en que la cantidad de glucosa es liberada despu)s de los + minutos de hidrólisis. 8 ;"3 es la $racción de almidón que no es hidroli0ado despu)s de entre + y 1+ minutos despu)s de la hidrólisis. 8 ;& es la cantidad de almidón que no es hidroli0ado despu)s de los 1+ minutos de hidrolisis .*.!. Tama+o de ,art-cula.
El tamaño de partcula a$ecta la digestión del almidón debido a que las partculas m%s pequeñas (con mayor super$icie espec$ica! $acilitan la acción de las amilasas y se digieren m%s r%pidamente (que las partculas con mayor volumen!. "e esta $orma un mayor grado de molido o masticación pueden $acilitar la digestión de los almidones. 3iljeberg et al. (199! estudiaron la digestibilidad in vivo del almidón de cereales molidos o enteros a partir del ndice glic)mico, comprobaron que los granos enteros disminuyen el ritmo de digestión del almidón y por lo tanto reducen la digestibilidad de la dieta. En consecuencia, tambi)n reducen o retrasan la glicemia e insulinemia postprandial. .*.#. atri$ ,roteica
3os gr%nulos de almidón est%n acompañados por otras materias vegetales que pueden inhibir el acceso de las amilasas al gr%nulo. En algunos casos los gr%nulos de almidón pueden estar encapsulados en una matri0 proteica y en otros casos con lpidos los cuales di$icultan el accionar de la en0ima restringiendo su actividad hidroltica (=artne0, ++!. ./. Digestibilidad en ,roductos t0rmicamente tratados. 'eg6n (arca, ++J! el an%lisis de la hidrólisis en0im%tica in vitro del almidón de
productos horneados> se reali0ó por el m)todo de :olm, el cual permitió determinar la tasa de digestión del almidón trabajó con -amilasa pancre%tica porcina, reduci)ndose este en a06cares señalados como equivalentes de maltosa, determinados por espectro$otometra. ;$irman que produce una parcial o completa destrucción de la estructura cristalina de los gr%nulos de almidón en el horneado lo que $acilita el accionar de las en0imas. ;dem%s al evaluar se observa la velocidad de hidrólisis de la en0ima - amilasa en las harinas horneadas aumenta a medida que la temperatura de horneado de la harina se incrementa en un mismo tiempo.
&ecomiendan tambi)n el uso de las harinas horneadas por convección, previamente gelatini0adas en ese e#perimento para incrementar la disponibilidad en0im%tica del almidón. .1. Im,ortancia de la digestibilidad del almidón.
3os carbohidratos tienen una gran relevancia nutricional, por la importancia de la $ibra en la salud y porque la digestibilidad del almidón es di$erente en una amplia gama, de alimentos (Englyst et al ., 199D 4;KGK=', 199!. El almidón adem%s de ser el principal componente de las plantas, es el carbohidrato dominante de la dieta humana ('/rabanja et al., 1999!. 7o todo el almidón se digiere, y e#iste una $racción resistente a la hidrolisis por las en0imas digestivas humanasD su tr%nsito contin6a por el intestino delgado llegando hasta el intestino grueso, donde es sustrato para las en0imas de la micro$lora normal del colon. Esta $racción de denomina almidón resistente (;&! y se de$ine como la suma del almidón y productos de la degradación del almidón que no pueden ser absorbidos en el intestino delgado de individuos sanos (;sp, 199!. El ;& se ha clasi$icado en> 1! ;&1 es el almidón $sicamente inaccesible, y atrapado en una matri0 celular, lo que impide su completo hinchamiento y dispersiónD ! ;& son gr%nulos de almidón nativo, no sometido a ning6n proceso, F! ;&F es el almidón retrogradado, $ormado en alimentos cocinados y almacenados, donde el $enómeno de la retrogradación se ha iniciadoD ?! ;&? son los almidones modi$icados por m)todos qumicos o $sicos (Lursh et al., 19BD Hovar et al., 199D Aello-C)re0 et al., ++!. El contenido de ;& en los alimentos, as como la velocidad y el nivel de digestión del almidón, tienen un e$ecto positivo en la salud. 2n$luyen en la reducción de la respuesta gluc)mica e insulinemica al alimento, tienen un e$ecto hipocolesterolemico, adem%s de un e$ecto protector contra el c%ncer colon-rectal (assidy et al., 199?D ;sp et al., 199!. el tipo de procesamiento del alimento, el tiempo de almacenamiento y su origen bot%nico. Cor ejemplo, algunas leguminosas contienen cantidades signi$icativas de ;& comparadas con otras $uentes, adem%s despu)s de consumir leguminosas la velocidad de digestión del almidón y la liberación de glucosa al torrente sanguneo es lenta, lo cual causa bajas respuestas glucemicas e insulinemicas posprendiales en comparación con las de los cereales o tuberculos (en/ins et al ., 19BD Hovar et al., 199!. ;quellas $uentes bot%nicas que tengan almidon de baja digestibilidad sirven como $uente importante de $ibra diet)tica, de$inida como la parte comestible de las plantas o los carbohidratos resistentes a la digestión y absorción en el intestino delgado del hombre, con completa o parcial $ermentación en el intestino grueso (;;, +++!. E#isten ejemplos como las leguminosas que su grado de integridad de sus $ibras, representan una barrera $sica para la gelatini0ación completa de almidón, que aunado a ciertos $actores antinutricionales como loa inhibidores de la amilasa, impiden su hidrolisis en0im%tica (Lursh et al., 19BD Hovar et al., 199!.
3os procesos o pre tratamientos que se puedan dar a una muestra (cocción, molienda y calentamiento a altas temperaturas! acarrea el deterioro e#tenso de la estructura tisular y de las paredes celulares, liberando al almidon de cualquier impedimento $sico para su digestión por las en0imas amiloliticas (Ajorc/ et al., 199?!. 3a velocidad de amilolisis in vitro es un elemento 6til para la predicción de la respuesta gluc)mica postprandial que inducen los alimentos y de all que su evaluación sea importante dentro de la caracteri0ación de las propiedades nutricionales de los alimentos amil%ceos (Ajorc/ et al., 199?!. En cuanto a los granulos de almidon, se ha reportado que los de $orma es$)rica presentan mayor resistencia a la digestión que los de $orma poli)drica (4reitas y Havares, ++5!. .2. 3ur0 de ,a,a
Hhe :istory hannel 3atin ;merica (+1F! nos menciona que para obtener el polvo del pur) de papas instant%neo hace $alta hervir las papas a J+M y posteriormente en$riarlo a +M. "e esta manera se rompe la estructura de la papa, para luego poder me0clarla $%cilmente con los aditivos necesarios. 3uego se calienta a 15+M y, por 6ltimo, la masa resultante se la hace polvo para $inalmente ser envasada. Cor lo que podemos decir que nuestro pur) ha sido pre-cocido. =uño0 (199+! citado por Hara0ona (1995! nos menciona que el cocimiento produce la gelatini0ación del almidón haci)ndose m%s susceptible al ataque en0im%tico durante el metabolismo ya mencionamos que para la elaboración del pur) se ha pre-cocido lo que ha $acilitado su digestión con las en0imas. Hara0ona (1995! nos menciona que la mayor o menor porcentaje de digestibilidad puede estar asociado al grado de gelatini0ación de los almidones durante el proceso de cocción, es deseable que este sea superior a 9+@ para que haya una e$iciente digestión y asimilación. 7os menciona que la digestibilidad del pur) de papa es de 95.+B@. 'eg6n ;raya (+++!, el pur) de papas posee una r%pida absorción. Hambi)n nos menciona que el pur) de papa es digerido r%pidamente y su e$ecto glic)mico es similar al de una carga equivalente de glucosa.
IV. ateriales ) 0todos '.!. uestra Alimenticia" Cur) de papa instant%nea (Nnorr!, con un contenido de
carbohidratos de F mg en F1 g de muestra. '.#. ateriales"
-
=aterial de vidrio> erlenmeyer, pipetas, tubos de ensayo. =icropipeta de + - ++ μ l =icropipeta de 1++ - 1+++ μ l
-
'.. Reactivos" α -amilasa '2=; H2CK 2; 1++ OGmg (JmgGml!. "iluir 5 μ l de en0ima con
-
1+ ml de tampón $os$ato (preparar durante los F+ minutos previos al comien0o de la hidrólisis!. Hampón $os$ato. "isolver en apro#. J++ ml de a F.+Fg de N:CK?, F.9 g de 7a:CK?.:K y +.? g de 7al. 3levar a p: .9 y a$orar a 1+++ ml. 'al de &ochelle. Creparar una solución al ?+ @ (pGv! de tartrato de sodio y potasio en agua destilada. =altosa anhidra (solución est%ndar de mgGml!. .'. E4ui,os"
-
Aalan0a analtica Aaño =ara con agitación ocina Espectro$otómetro
V. Resultados ) Discusión Tabla !. Absorbancias de las muestras de 5 a /5 minutos el blanco medidos a **5nm.
=uestra
;bsorbancia
A=
+.+15
+ min
+.++5
+.+1
5 min
+.++F
+.++F
15 min
+.+11
+.+1
F+ min
+.+1
+.+1
+ min
+.11J
+.119
Curva de maltosa 6 7 5.1#'*8 9 5.51/2 Y: ABS X: mg maltosa/ml Tabla #. Data calculada mediante el uso de la ecuación determinada con la curva est:ndar de maltosa ) %órmula ,ara la determinación del ,orcenta;e de
=uestra
oncentración (mg oncentración (mg maltosaGml!
@ :idrólisis
muestraGml!
A=
+.1J
-
-
+ min
+.119
.?J
-+.+5B
5 min
+.11+1
.?J
?.1J
15 min
+.119
.?J
?.J
F+ min
+.1
.?J
?.9
+ min
+.B9
.?J
?.BBB
=igura !. 3orcenta;e de min?
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VII. Ane@os
