PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE QUIMICA DEPARTAMENTO DE QUIMICA FISICA
INFORME INFORME N°2
QIM-117 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA T-P
AISLAMIENTO AISLAMIENTO Y PROPIEDADES PROPIEDADES QUÍMICAS DE LA HEMOGLOBINA
NOMBRE: Manuel Matus Q..
OBJETIVOS -Conocer el comportamiento de las células de la sangre previamente lavadas cuando se encuentran en disoluciones con distintas concentraciones de cloruro de Sodio. -Analizar, conocer y aislar las distintas especies de la Hemoglobina presentes en la sangre. -A partir de una disolución de oxihemoglobina obtener disoluciones de desoxihemoglobina, nitrosilhemoglobina y metahemoglobina para estudiar su afinidad con la hemoglobina y su comportamiento a través de un análisis espectrométrico. -Obtener un gráfico espectrofotométrico que permita analizar la cinética de formación de la metahemoglobina. -Observar la velocidad de elusión de la metahemoglobina a través de una filtración a través de una columna de exclusión molecular (Sephadex) y los cambios que durante este proceso ocurren.
DESARROLLO EXPERIMENTAL Una vez lavado el volumen inicial de sangre, se separan de este volumen 2 mL para realizar el efecto de concentración salina, y el resto de las células se hemolizan por la adición de agua y tolueno, con el fin de extraer la oxihemoglobina. •Test del efecto de concentración salina:
Tubo N° VNaCl % 20 V H2O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
0.3
0.4
0.5
1
3
5
8
10
10
9.7
9.6
9.5
9
7
5
2
0
A cada tubo se le agregan 2 gotas de células lavadas. Observaciones de los tubos de ensayo: Tubo N° 1: La solución es de color roja intensa y en el fondo se observa más concentrada. Tubo N° 2: Al igual que el tubo 1 se observa solución de color roja y en el fondo un poco ás concentrada. Tubo N° 3: En este tubo se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente. Tubo N° 4: Se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente, pero con un poco de turbidez. Tubo N° 5: Se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente, aunque al igual que el anterior con cierta turbidez. Tubo N° 6: Se observa precipitado rojo y sobrenadante parcialmente transparente. Tubo N° 7: En este tubo la solución ya no es transparente ni parcialmente transparente, es absolutamente roja con presencia de un poco más de precipitado. Tubo N° 8: Este tubo presenta las mismas características que el tubo anterior. Tubo N° 9: La solución es roja y se observa una especie de aconchado precipitado rojo.
Espectros de absorción de las diferentes especies de hemoglobina: Todas las Absorbancias fueron leídas en el rango 450 – 650nm cada 5nm. La solución de oxihemoglobina utilizada fue diluida hasta que se obtuvo una absorbancia de 0.519. 1- Espectro de absorción de oxihemoglobina Presenta 2 picos:
- 542 nm (absorbancia de 1.042) - 576 nm (un poco más alto que el primer pico de absorción, y una absorbancia de 1.113)
2- Espectro de absorción de desoxihemoglobina Presenta 1 pico:
- 555 nm ( señal muy ancha y de absorbancia de 0.967)
3- Espectro de absorción de nitrosilhemoglobina Presenta 2 picos: - 517 nm (absorbancia de 0.600) - 633 nm (absorbancia de 0.281) 4- Espectro de absorción de metahemoglobina Presenta 2 picos: - 502 nm (absorbancia de 0.678) - 631 nm (absorbancia de 0.286)
Cinética de formación de la metahemoglobina A una solución de Oxihemoglobina de 3 ml y que presentaba una Absorbancia de 0.397, se le agregó 3 ml de fosfato potásico y 0.2 ml de una solución de nitrito de sodio 0.025 M (tiempo cero) con el fin de transformar esta proteína en Metahemoglobina. Para observar la cinética de este cambio, se midió la Absorbancia cada 5 segundos a 560 nm, los resultados fueron los siguientes: Absorbancia 0.397 0.36 0.342 0.307 0.291 0.281 0.273 0.266 0.259 0.254 0.247 0.244 0.238 0.235 0.234 0.232 0.231 0.229 0.228
Tiempo 0 5 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Se observa que la absorbancia va disminuyendo hasta que llega al punto donde se hace constante. Esto se representa con el siguiente gráfico:
Gráfico Absorbancia v/s Tiempo 0
Absorbancia v/s Tiempo
5 15 20
0.45
25
0.4
30
i 0.35 35 c 0.3 40 n a 0.25 45 b r 50 o 0.2 s 55 b 0.15 A 60 0.1
Serie1
65 0.05 70
0
75 80 85
0
50
Tiempo (s)
100
Filtración a través de una columna de exclusión molecular: Por una columna de Sephadex, se hizo pasar una muestra de metahemoglobina. Al bajar por la columna, inicialmente se observaron tres colores; café (el original de la muestra de metahemoglobina), rojo y amarillo. Luego de unos segundos, desde la parte superior a la inferior, se observó el color amarillo, luego el café, rojo, y por último un rojo mucho más intenso. Luego, el color amarillo quedó en la parte superior de la columna, mientras que el café seguía avanzando hasta alcanzar la zona del ditionito de sodio, donde apareció un tercer color: rojo oscuro (debido a que la metahemoglobina se redujo a hemoglobina de color rojo). Al ir creciendo esta banda, el color café fue desapareciendo, mientras que la amarilla desaparecía más lentamente en la parte superior. Al salir la muestra por la manguera de la columna, ésta ya no era del mismo color rojo observado, sino que se convirtió en rojo escarlata (color propio de la oxihemoglobina). El color amarillo fue el último en emerger de la columna. La línea de transición entre la hemoglobina y la oxihemoglobina se mueve más rápido que el ferricianuro porque éstas moléculas son más grandes que los poros del gel , por lo tanto, pasan por fuera, en la fase líquida. En cambio, el ferricianuro es más pequeño y por éste motivo penetra en la red o partículas de gel quedando atrapado, y por ésta razón no desciende con tanta facilidad como la hemoglobina y oxihemoglobina.
DISCUSIÓN Test del efecto de concentración salina: El test salino tiene como finalidad demostrar la influencia de distintas concentraciones de NaCl en los glóbulos rojos de la sangre. A una concentración aproximada de 1.2% NaCl, el volumen de las células es el mismo que el que ocupan en el plasma. Esta concentración se dice que es isotónica con respecto a los eritrocitos. Una solución que contenga una concentración menor que la existente en el plasma, se llama hipotónica. Los hematíes en este ambiente, se hinchan, aumentando su tamaño, pero llega un momento al cual estallan, liberando la Hemoglobina contenida en ellos. Si por el contrario, el entorno que rodea a la célula tiene una concentración mayor que la isotónica, es decir, es una solución hipertónica, las células se retraen para igualar las presiones osmóticas, lo cual conlleva a un cambio brusco en las propiedades de la membrana de éstas y la hemoglobina sale hacia el exterior.
Espectros de Absorción de las diferentes especies de Hemoglobina: Gráficos absorbancias vs longitud de onda: -Oxihemoglobina: El gráfico Absorbancia vs λ obtenido para la oxihemoglobina nos muestra 2 absorbancias máximas a 542nm y 576nm. Los valores de absorbancias máximas descritas son: 540nm y 574nm. -Desoxihemoglobina: El gráfico Absorbancia vs λ obtenido para la desoxihemoglobina nos muestra una absorbancia máxima a 555nm. El valor de absorbancia máxima descrita es: 555nm. -Nitrosilhemoglobina: El gráfico Absorbancia vs λ obtenido para la nitrosilhemoglobina nos muestra 2 absorbancias máximas (no muy perceptibles) a 517nm y 633nm. Los valores de absorbancias máximas descritas son: 545nm y 565nm.
-Metahemoglobina: El gráfico Absorbancia vs λ obtenido para la metahemoglobina nos muestra 2 absorbancias máximas a 502 nm y 631nm. Los valores descritos de absorbancias máximas son: 500nm y 630nm. Nota: Los valores descritos de absorbancia fueron tomadas de la bibliografía. Las absorbancias pueden haberse visto afectadas por factores como la temperatura, la manipulación de las celdas, etc, aunque nuestros espectros son bastantes similares a los teóricos, excepto los valores de la nitrosilhemoglobina, esto pudo haber ocurrido por no haber homogenizado de manera correcta la preparación de este.
Cinética de Formación de Metahemoglobina: La formación de la Metahemoglobina ocurre lentamente en un principio, luego este cambio se hace más rápido para luego estabilizarse, indicando que toda la oxihemoglobina se transformó en metahemoglobina. El gráfico que se obtuvo, confirma esa tendencia, por lo tanto, los resultados fueron los esperados, aunque en el gráfico del paper la coordenada del tiempo está en minutos.
Filtración a través de una columna de exclusión molecular:
La línea de transición entre hemoglobina y oxihemoglobina se mueve más rápido que el ferricianuro, porque éste último tiene una estructura más pequeña y como la columna es de exclusión, el ferricianuro se demora más en recorrer el relleno, debido a que penetra en la partícula de gel de Sephadex por su tamaño y forma, en cambio, moléculas grandes como metahemoglobina o hemoglobina, eluyen más rápido porque al no poder penetrar en el gel, pasan por fuera arrastrados en la fase líquida. En el experimento, se observó muy bien este principio, el último elemento en salir fue el Ferricianuro, mientras que se veía la velocidad mayor con la que la metahemoglobina bajaba.
CONCLUSIÓN Gracias a esta experiencia del laboratorio pudimos aislar la hemoglobina y, además aislar las distintas especies que pueden formarse a partir de esta. El test de concentración salina, en el cual se pudo observar como van reaccionando las células a cierto tipo de concentraciones de NaCl. También, se pudo obtener espectros bastantes similares a los estándares de las distintas especies de hemoglobina. Mediante la cinética de formación de la metahemoglobina se pudo observar lo rápido e instantáneo que ocurre el cambio de la absorbancia lo que indicó la formación de este compuesto Y por último; se observó con claridad la relación existente entre el tamaño de las moléculas con la velocidad de elusión en un filtro de exclusión molecular. Al analizar las transformaciones realizadas de la disolución de oxihemoglobina a nitrosilhemoglobina y metahemoglobina nos damos cuenta de los riesgos que se corre al haber en el medio ambiente excesos de nitrato y nitrito; ya que éstos compuestos interactúan rápidamente con la hemoglobina ocupando el lugar en el que se transporta el oxígeno. Debido a esto, es muy importante tener en cuenta que existen sustratos como el CO, los nitratos y los nitritos, que interactúan con la hemoglobina, que, al estar presentes en cantidades elevadas en nuestro organismo tienen una mayor afinidad con la hemoglobina que el oxígeno, algo letal para nuestro organismo.
BIBLIOGRAFÍA S. F. Ruso y R. B Sorstokke, Hemoglobina. Isolation and Chemical properties. J. Chem. Ed. 50, 347-350 (1973)
