IDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORME

Laboratorio N°6: Identificación del Grupo Coliforme 54

"Año de la consolidación del Mar de Grau""Año de la consolidación del Mar de Grau"LABORATORIO N°6:LABORATORIO N°6:DOCENTE:JORGE TELLO CEBREROSCURSO:MICROBIOLOGIA SANITARIA IALUMNO:SALAZAR TORRES, JOSHEPDOCENTE:JORGE TELLO CEBREROSCURSO:MICROBIOLOGIA SANITARIA IALUMNO:SALAZAR TORRES, JOSHEPIDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORMEIDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORMEESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA SANITARIAESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA SANITARIAFACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTALFACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTALUNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍAUNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍAJoshep salazar torresJoshep salazar torres22/11/201622/11/20162016 2016

"Año de la consolidación del Mar de Grau"
"Año de la consolidación del Mar de Grau"
LABORATORIO N°6:
LABORATORIO N°6:

DOCENTE:
JORGE TELLO CEBREROS

CURSO:
MICROBIOLOGIA SANITARIA I

ALUMNO:
SALAZAR TORRES, JOSHEP

DOCENTE:
JORGE TELLO CEBREROS

CURSO:
MICROBIOLOGIA SANITARIA I

ALUMNO:
SALAZAR TORRES, JOSHEP

IDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORME
IDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORME

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA SANITARIA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA SANITARIA
FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL
FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA
Joshep salazar torres

Joshep salazar torres

22/11/2016

22/11/2016

2016

2016

PARTE I:
Técnica de fermentación en tubos múltiples: Fase Presuntiva y Recuento de Bacterias Heterotróficas.

OBJETIVOS
Investigar la presencia de bacterias del grupo Coliforme en agua de consumo humano mediante la técnica del Número Más Probable (NMP), usando tubos de fermentación múltiple.
Realizar el recuento de colonias formadas (UFC) con la auxilia de un contador de colonias.
FUNDAMENTO TEÓRICO
INDICADORES BACTERIOLOGICOS DEL AGUA
En los diferentes tipos de agua, pueden encontrarse diversas bacterias, de las cuales algunas son indígenas o nativas y por lo tanto pueden ser benéficas, ya que de éstas depende en gran medida el proceso de auto purificación de los cuerpos de agua y, otras que tienen su origen en las excretas de humanos y animales de sangre caliente (animales domésticos, silvestres y aves) que contaminan el agua.

En la evaluación microbiológica de la calidad del agua, sistemáticamente se realizan pruebas de laboratorio que permiten estimar la magnitud de la contaminación. Estas pruebas sistemáticas consisten en la determinación de los indicadores bacteriológicos de contaminación o de calidad del agua.

Los indicadores bacteriológicos, son organismos de un grupo específico, el cual por su sola presencia demuestra que ocurrió contaminación y en ocasiones, sugiere el origen de dicha contaminación.

La cantidad y variedad de bacterias patógenas y potencialmente patógenas, difiere de acuerdo al área geográfica, estado de salud de la comunidad, naturaleza y grado de tratamiento de los desechos, capacidad de auto purificación de los cuerpos de agua y características físicas y químicas del agua.

Debido a los altos costos que representa la caracterización bacteriológica de las aguas, es necesario realizar pruebas que permitan evidenciar la magnitud y origen de la contaminación bacteriana, esto es, la determinación de indicadores bacteriológicos de contaminación. Tradicionalmente, los col if orines totales, col i formes fecales y estreptococos fecales, son los grupos de bacterias indicadoras que se consideran en los estudios y trabajos de evaluación de calidad del agua.

De manera general, idealmente un indicador de contaminación por excretas humanas y de animales de sangre caliente debe poseer las siguientes características:

Ser aplicable a todo tipo de agua
Estar presente cuando existen bacterias patógenas de origen fecal
La cantidad de bacterias estar directamente relacionada con el grado de contaminación fecal
El tiempo de sobrevivencia debe ser más prolongado que el de los patógenos entéricos
Desaparecer rápidamente del agua, una vez que han desaparecido los patógenos durante los procesos de auto purificación o de tratamiento.
No reproducirse en el ambiente No deben estar presentes en agua potable
Poder ser determinado cuantitativamente en forma rutinaria, sin interferencia por otras bacterias
No ser patógeno al hombre o animales

La determinación de indicadores es de utilidad en múltiples ocasiones:

Evaluación de la calidad del agua para definir su uso (agrícola, doméstico, recreativo, potable, riego de áreas verdes, entre otros)
Evaluación de la eficiencia de plantas de tratamiento de aguas residuales y plantas potabilizadoras
Determinación del efecto de agentes tóxicos y orgánicos en la flora bacteriana
Identificación de fuentes de contaminación
Diagnósticos relativamente rápidos de calidad bacteriológica del agua

Los indicadores también son de utilidad cuando el laboratorio no cuenta con recursos suficientes para realizar de manera sistemática la determinación de patógenos. De hecho las pruebas de patógenos se justifican únicamente en investigaciones, en brotes epidémicos y en situaciones específicas.

COLIFORMES

Escherich, en 1885, aisló en heces humanas bacterias que se encontraban de manera consistente y en gran cantidad, por lo que las llamó "organismos característicos de las heces humanas", dándoles el nombre de Bacterium coli commune y Bacterium lactis aerogenes. Migula en 1895, designó a la primera Escherichia coli commune r posteriormente, se demostró que estas especies en realidad eran un conjunto bacteriano de especies y variedades de especies. En la actualidad, el grupo coliforme se define como todos aquellos bacilos cortos, gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con producción de gas en 48 horas a 35 °C.

Y los coliformes fecales se definen como todos aquellos bacilos cortos, gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, capaces de fermentar lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas.
La principal diferencia entre los coliformes totales y fecales es la capacidad de estos últimos de crecer a mayor temperatura en condiciones de laboratorio.

Desde el punto de vista salud, este grupo es más importante que los coliformes totales, dado que se relaciona más con la probabilidad de encontrar patógenos excretados (bacterias, parásitos y virus entéricos).

Las ventajas de este grupo como indicador son:

El 95% de los coliformes fecales, dan positiva la prueba de temperatura
Pueden estar ausentes si la contaminación no es de origen fecal
Sobreviven menos tiempo que los coliformes totales, por lo que permiten suponer contaminación reciente, si se encuentran en concentraciones altas
Son más exigentes que los coliformes totales para reproducirse en el ambiente extraintestinal
Los procedimientos de laboratorio para su cuantificación son relativamente sencillos

Sin embargo, algunas cepas dan negativa la prueba de temperatura en el laboratorio; se ha visto que tienen la capacidad de reproducirse en aguas ricas en nutrimentos, en sedimentos y aún en aguas poco contaminadas; algunas cepas de Escherichia coli sobreviven menos tiempo que Salmonella en aguas a bajas temperaturas y algunas son patógenas al hombre.

FASE PRESUNTIVA
Utilícese un medio liquido de Lauril triptosa en la porción presuntiva de la prueba de tubo múltiple. Como alternativa, puede emplearse un medio líquido de lactosa, siempre que se haya demostrado que no aumenta la frecuencia de resultados positivos falsos ni enmascara los coliforme que existen en las muestras de agua potable. Si se ha refrigerado el medio día después de su esterilización, se incubara de un día a otro a 35°C antes de utilizarlo. Para la prueba presuntiva:

Añádanse los ingredientes deshidratados al agua destilada, mézclese cuidadosa mente y caliéntese para disolverlos. El pH debe ser 6.8 después de la esterilización .Antes de esterilizarlo, colóquese en tubos de fermentación con un vial invertido una cantidad suficiente de medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. También es posible prescindir del vial invertido y añadir 0,01 G/L de purpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba.
Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
Hágase el medio de Lauril triptosa con fuerza suficiente como que para que al añadir 100 ml o 10 ml de muestra, la concentración de los ingredientes no sea menor que la del medio estándar. Ciérrese los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.

Añádanse los ingrediente deshidratados al agua, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlos .El pH debe ser de 6.9 después de la esterilización
Previamente colóquese la mezcla en tubos de fermentación en unas dimensiones que permitan que el líquido, en el tubo ya inoculado, cubra al menos parcialmente el vial invertido después de la esterilización. Se puede también prescindir del vial y añadir 0.01 g/l de purpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido, lo que indicaría un resultado positivo en esa parte de la prueba. Ciérrese con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
Hágase el medio de lactosa con fuerza suficiente como para que, al añadir 100 ml o 10 ml de la muestra al medio .La concentración con las directrices de la tabla anterior.
CÁLCULO Y REGISTRO DEL NMP
Calcúlese y regístrese el número de hallazgos positivos de microorganismo del grupo coliforme (ya sea en pruebas confirmatorias o completa) en termino del Numero Más Probable (NMP). Las tablas mostradas (1 y 2) indican los valores del NMP para distintas series de siembras y resultados. En estas tablas, se contemplan límites de confianza del 95 por 100 para cada valor del NMP. Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas, comuníquese el valor correspondiente al número de resultados positivos y negativos en la series en forma de NMP/100ml.

Luego se calcula de acuerdo con la siguiente formula:
Valor del NMP (de la tabla) x 10mayor volumen estudiado=NMP/100ml
Ocurrencia de resultados improbables
Muchos de los posibles resultados de tubos múltiples son omitidos de las tablas del NMP, así, los códigos 0-0-3, 0-0-4 y 0-0-5 junto con muchos otros, no están incluidos. Esto se debe a que la probabilidad de su ocurrencia es muy baja. Si en un laboratorio estos resultados improbables aparecen con una frecuencia mayor del 1%, es posible que esto se deba a procedimientos de laboratorio defectuosos, por lo que deben ser revisados. Cuando el código del NMP no aparezca en la tabla, el NMP puede ser calculado utilizando la fórmula:
NMP= N° de tubos positivos x 100ml muestras tubos negativos x ml muestra total

PRUEBA DE PRESENCIA-AUSENCIA (P-A) DE COLIFORMES
La prueba de presencia-ausencia (P-A) de coliforme es una sencilla modificación del procedimiento de tubos múltiples. La simplificación que se deriva de utilizar una sola porción grande (100 ml) en una sola botella de cultivo para obtener una información cualitativa sobre la presencia o ausencia de coliforme, se justifica por la teoría de la falta de estos microorganismos en una muestra de 100 ml de agua potable. La prueba de P-A proporciona además una oportunidad opcional para hacer una detección sistemática posterior del cultivo y aislar otros indicadores (coliforme fecales, Aeromonas, Staphylococcus, Pseudomonas, estreptococos fecales y Clostridium), también de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidad de estudiar un mayor número de muestras por unidad de tiempo y hacer estudios comparativos con el procedimiento de filtro de membrana, que indica que la prueba de P-A puede aumentar al máximo la detección de coliforme en muestras que contiene microorganismos que podrían sobrepasar en su crecimiento al de las colonias de coliforme, provocando problemas para su detección.

La prueba de P-A se recomienda para el estudio habitual de las muestras obtenidas en los sistemas de distribución o en las plantas de tratamientos de aguas. En principio, se estudian alrededor de 100 muestras por los métodos del filtro de membrana o de los tubos múltiples, además de la prueba de P-A. Una vez establecidos que los métodos cuantitativos suelen dar resultados negativos para coliformes, se pueden utilizar únicamente la prueba de P-A.
Cuando una muestra produce un resultado positivo en esta prueba, se estudiaran las posteriores muestras repetidas mediante un método cuantitativo, hasta que se vuelvan a obtener resultados negativos en dos muestras consecutivas. Las muestras tomadas en localizaciones poco habituales, como los pozos privados, se analizaran con métodos de tubos múltiples o de filtro de membrana.

Prueba de P-A Para coliformes

Hágase la formula con una fuerza triple en caso de que vayan a estudiarse muestras de 100 ml .Disuélvanse los ingredientes del medio de lactosa y el de Lauril triptosa, uno tras otro, en agua destilada sin calentar, utilizando un instrumento de agitación. Disuélvase el púrpura bromocresol en 10 ml de NaOH al 0.1 N y añádase a la solución del medio.

Viértanse 50 ml del medio en una botella de dilución con tapón de rosca de 250 ml de volumen .No es necesario introducir un tubo de fermentación .Se pasa 12 minutos por el autoclave a 121 °C , limitando el tiempo total de autoclave a 30 minutos o menos. El pH debe ser de 6.8 después de la esterilización.

PROCEDIMIENTO:

Agítese la muestra unas 25 veces e inocúlese 100 ml en el medio de cultivo P-A .Mézclese cuidadosamente, invirtiendo la botella cuatro o cinco veces para conseguir una distribución uniforme del medio en la totalidad de la muestra .Incúbese a 35 y obsérvese a las 24 y 48 horas para detectar posibles reacciones acidas. Cuando se producen, la fermentación de la lactosa adquiere un claro color amarillo. Si también se producen gas, la suave agitación de la botella producirá espuma. Cualquier cantidad de gas acido o ambos constituyen un resultado presuntamente positivo, que requiere confirmación. Todos los cultivos que muestran reacción acida o formación de gas se pasan a un medio de verde brillante lactosa bilis (VBLB), que se incuba a 35
.
INTERPRETACION:

La aparición de gas en el medio VBLB en 48 horas confirma la presencia de bacterias coliformes, los resultados se comunican como prueba de presencia-ausencia positiva o negativa para coliformes totales en 100 ml de muestra.

Pruebas opcionales de P-A

La detección de coliformes fecales, estreptococos fecales u otras bacterias indicadores puede hacerse mediante una prueba de P-A, seleccionando adecuadamente los medios confirmatorios y el tiempo y temperatura de incubación. El tratamiento del agua y otras condiciones ambientales adversas suelen provocar alteraciones en las bacterias indicadoras, ampliando su fase de reposo antes de que se produzca el crecimiento logarítmico.

Si se amplía la incubación de la prueba de P-A a 72 o 96 horas, es frecuente que puedan aislarse otros microorganismos indicadores .No se deben aislar bacterias indicadoras .No se deben aislar bacterias indicadoras para regularlas después de los habituales 48 horas de incubación .No obstante, esta información podrá servir al laboratorio para advertir a la planta de tratamiento del agua de que esta presenta potenciales problemas de calidad.
Usos del recuento heterotrófico en placas
El recuento heterótrofico en placas (RHP) es un procedimiento sencillo que se puede realizar por el método de placa fluida, difusa o filtración por membrana (FM) y es una herramienta muy útil. Aunque no es esencial para evaluar la seguridad del agua potable, los resultados del RHP proporcionan información que complementa los resultados de los coliformes totales. El RHP se puede usar para indicar la composición bacteriana general del agua de la fuente y la eficacia y eficiencia de los procesos de tratamiento del agua, como la sedimentación, coagulación, filtración y cloración. El monitoreo del RHP en el agua distribuida puede proporcionar información sobre la limpieza del sistema de distribución, desarrollo de bacterias después del tratamiento, efectos de los cambios de temperatura en el agua y del cloro residual en la población bacteriana.

METODOLOGIA
Materiales

Caldo Lauril tiptosa
Pipeta
Tubos de ensayo
Agua peptonada
Inoculador
Autoclave
Incubadora
Gradilla
Mechero
Tubos Durham

PROCEDIMIENTO
Extraer con la misma pipeta, usada inicialmente, 1.1 ml de la muestra de agua y colocar 0.1 ml en un tubo con caldo Lauril triptosa y el 1ml restante en otro tubo con el mismo medio. Repetir este procedimiento para 5 tubos (5 de 1ml y otros tubos de 0.1 ml de muestra) obteniendo de esta manera muestras de caldo Lauril triptosa con concentraciones de 1 y 10-1.
Extraer 1 ml de la muestra de agua diluida en los 99 ml de agua peptonada y colocando en un tubo con caldo Lauril triptosa. Este paso se realiza para 5 tubos.
Los tubos inoculado se incuban a 35°C ± 0.5°C tras 24 ± 2 horas agitese cada tubo suavemente y si se observa si se produce gas o un incremento de ácido (color amarillo) y en caso contrario reincubarse y vuélvase a examinar al final de 48 ± 3 horas. Regístrese la presencia o ausencia de algas, ácidos, si no se ha utilizado el vial, un incremento con acidez significa una presunta reacción positiva.

INTERPRETACIÓN
La aparición de gas o ácidos en los tubos a las 48 ± 3 horas constituye una presunta reacción positiva. Los tubos con este tipo de reacción deben ser estudiados en la fase confirmativa.
La ausencia de crecimiento acido o de formación de gas al finalizar las 48 ± 3 horas de incubación indica una reacción negativa. El límite arbitrario de 48 horas para la observación excluye sin ninguna duda a los miembros ocasionales del grupo coliforme que crecen de manera muy lenta.
RESULTADOS
Muestra
T(°C)
Dilución(ml)
N.M.P. Coliforme Totales / 100 ml

1
10-1
10-2

Grifo baño FIC
23,5
5/5
5/5
5/5
>16000
Grifo baño FIA
21
5/5
5/5
5/5
>16000
Estanque de Arquitectura
19.5
5/5
2/5
5/5
-

Grupo N°1: Fecha: 11 de Octubre del 2016

Grupo N°3:

Grupo N° 5:

DISCUSIÓN
Después de haber realizado el experimento, se discutió sobre los resultados debido a que nunca se habían obtenido esos resultados en los laboratorios pasados. Por lo que en la tabla de NMP no se encuentran dichos resultados, solo se puede aproximar los valores de acuerdo a la tabla.
OBSERVACIONES
El grupo 5 obtuvo resultados incoherentes debido a que no puede haber 2 tubos de 10-1 con muestras de gas y en la dilución de 10-2 los 5 tubos se encuentren con muestra gas. En las tablas de NMP, estos valores no se encuentran por lo que no se puede calcular el Número más Probable de Coliforme / 100ml.
Los resultados obtenido por los otros dos grupos no son comunes, por lo que no se puede hallar el NMP exactamente, se debe hacer una aproximación.
CONCLUSIONES
Los resultados del grupo 1 y 3 fueron los mismos, el NMP de cada grupo fue mayor a 16000 debido a que sus 5 tubos se observó muestra de gas, no se pudo hallar un valor exacto debido a que esos resultados en la tabla no se encuentran.
El resultado del grupo 5, el NMP no se puede calcular debido a que es incoherente lo obtenido, por lo que no se puede ni aproximar usando la tabla. Se debió haber realizado mal el procedimiento del experimento.
De los tubos obtenidos positivos se puede proceder a realizar la siguiente fase de la técnica de fermentación por tubos múltiples, la cual es la fase confirmativa.
RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar el laboratorio una vez más, debido a que los resultados obtenidos por cada grupo no dejan claro los valores del NMP y puede afectar a los resultados siguientes.
Se debe tener cuidado al momento de elaborar el medio de cultivo y al momento de transportarlo al autoclave.

METODOLOGIA
MATERIALES
Agar nutritivo
Muestra
Pipeta estéril
Autoclave
Inoculador
Incubadora
Placa Petri
Contador de colonias
Mechero bunsen

PROCEDIMIENTO
Extraer, con una pipeta estéril de 1.1 ml, agua de frasco de muestreo y agregar 0.1 ml en una placa estéril Petri y el 1ml restante en esta placa.
Agregar agar nutritivo en las placas interiores. Esperar 5 minutos para la solidificación.
Las placas se incuban a 35°C durante 48 horas.

RESULTADOS
Muestra
Dilución(ml)
Unidad de Colonias Formadas (U.F.C/ml)

1
10-1
10-2

Grifo baño FIC

Grifo baño FIA

-

142
57
6
142

Grupo N°1:

Grupo N°3:

Grupo N° 5:

DISCUSIÓN
Despúes de haber realizado el laboratorio, se discutió acerca de la cantidad de colonias que se pudo contar en cada placa de los 3 grupos. Los grupos 1 y 3 no obtuvieron resueltados, solo el grupo 5 con la ayuda del contador de colonias puede calcular la UFC.
OBSERVACIONES
El grupo 1 y 3, no puedieron realizar el conteo de colonias por tal motivo no se pudo obtener resultados en el cuadro, esto debido a diferentes como que no pueden utilizar de manera adecuada el contado de colonias o que no podian visualizar los diferentes tamaños de colonias que se encontran en la placa.
Los resultados del grupo 5 son esperados debido a que el UFC de la placa debe estar entre un rango de 30-300 colonias.
CONCLUSIONES
Se debe realizar de nuevo el laboratorio ya que no se encontraron resultados concretos por parte del grupo 1 y 3, lo que no ayuda para proseguir con las siguientes fases del experimento.
La UFC calculada por el grupo 5 es 142 UFC/100ml, es una cantidad alta debido a que su muestra proviene de un estanque de agua en el cual no hay mantenimiento constante.
RECOMENDACIONES
Extraer una muestra grande para que se pueda realizar el conteo de colonias al final del experimento y obtener resultados esperados.
Realizar esta parte del laboratorio una vez mas para poder continuar con las siguientes fases del laboratorio debido a que puede afectar en los resultados provenientes.

BIBLIOGRAFIAS
http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan/013761/013761-02.pdf
http://www.ircwash.org/sites/default/files/245.11-91AD-9090.pdf
http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p17.pdf
http://www.bvsde.paho.org/bvsala/e/fulltext/recuento/recuento.pdf

METODOS NORMALIZADO. EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

PARTE II:
Técnica de fermentación en tubos múltiples: Fase Confirmativa

OBJETIVOS
Confirmar la presencia de los microorganismos (bacterias) presentes en los tubos positivos tras una prueba en el agar BVLB.

FUNDAMENTO TEÓRICO
Fase Confirmativa
Reactivos y medios de cultivo: En esta fase se utilizaran tubos de fermentación con un medio líquido de verde brillante lactosa bilis.

Añádanse los ingredientes deshidratados al agua, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlos. El pH debe ser de 7.2 ± 0.2 después de la esterilización. Antes de esta, coloques e en tubos de fermentación suficiente cantidad de medio como para cubrir al menos parcialmente un vial invertido después de la esterilización. Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
CALDO EC:
USO
Medio de cultivo selectivo para determinar la presencia de organismos coliformes y Escherichia coli a partir de diversas muestras.
PRINCIPIO
La lactosa es la fuente de energía para los microorganismos lactosa positiva, especialmente coliformes y Escherichia coli con producción de gas. Las sales biliares inhiben el crecimiento de Gram positivos. La peptona de caseína proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo de las bacterias y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. De acuerdo al volumen de la muestra en estudio, se siembra en el medio de cultivo. Si es de 1 ml, se incorpora directamente al Caldo de concentración sencilla y si es mayor, al Caldo de concentración doble para que la concentración final sea la adecuada. Incubar 48 h a 35ºC.

Añádanse los ingredientes al agua, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlos. El pH debe ser de 6.9 ± 0.2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, colóquese la mezcla en los tubos de fermentación, cada uno con un vial invertid, y con una cantidad de medio suficiente para que cubra, al menos parcialmente, al vial después de la esterilización. Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.
MEDIO LES ENDO:
El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo utilizado para la detección de coliformes y otros microorganismos entéricos.

Preparación
Suspender 41,5 g del polvo deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir durante 1 minuto para disolver completamente los ingredientes. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Dejar enfriar a 45-50°C y re suspender el precipitado por agitación antes de su uso. Se recomienda preparar exactamente la cantidad de Agar Endo que se va a utilizar.

Para la prueba confirmativa de coliformes fecales
Se realizan inoculaciones en caldo EC, provenientes de los tubos del ensayo previo que mostraron formación de gas, incubar durante 24p_2 horas a 44.5b_0.2%C. Bajo estas condiciones la formación de gas en caldo EC indica el origen fecal de las bacterias coliformes.
Cuando se analizan muestras de agua potable, se utilizan 5 tubos de fermentación, cada uno con contenidos de 10 o 100ml de la muestra y mínimo 3 diluciones. Pero resulta impráctico usar porciones de 100ml.
Cuando se trata de agua no potable, se inoculan los tubos con cantidades decimales del agua. La selección de éstas va a depender de la densidad probable de coliformes y la experiencia del analista.
Esta técnica puede también ser usada para sedimentos, haciendo una dilución de 10-1 . Se pesan 50 gr de muestra (sólida o semisólida) y se adicionan 450 ml de agua de dilución y se agita por 1 ó 2 minutos.
Los resultados del análisis de los tubos de réplica y diluciones son reportados en términos del Número Más Probable (NMP).
El valor numérico de la estimación del contenido bacteriano es determinado por la dilución que mostró ambos resultados positivos y negativos.
La mejor evaluación de la calidad sanitaria del agua depende de la interpretación de resultados de la técnica de los tubos múltiples o de otros métodos, posiblemente más precisos y de toda la demás información relativa al agua que pueda ser obtenida por reconocimiento de la zona.
En la Tabla 1. Se muestra la metodología para el análisis de los coliformes totales, coliformes fecales y estreptococos fecales.

METODOLOGIA
MATERIALES
Tubos de la fase presuntiva
Tubos de ensayo
Cultivo verde brillante bilis
Inoculador
Incubadora
Tubos de Durham
Caldo EC
Medio LES Endo
Mechero bunsen

Prueba Confirmativa
PROCEDIMIENTO: Medio verde brillante de lactosa bilis
Llévense a la fase de confirmación todos los tubos primarios en los que haya aparecido cualquier cantidad de gas o de crecimiento acido a las 24 horas de incubación. Si se observa una fermentación activa o un crecimiento de ácido antes de las 24 horas, los tubos se llevaran al medio de confirmación sin esperar a que transcurran las 24 horas. Si hay otros tubos primarios con crecimiento acido después de 48 horas de incubación, también se llevaran a la fase de confirmación
Agítense suavemente o háganse rotar los tubos primarios que muestren gas o crecimiento acido suficiente para que se produzca una re suspensión de los microorganismos.
Con un asa estéril de 3mm de diámetro, pásese un asa completa de cultivo al tubo de fermentación que contiene el medio verde brillante de lactosa bilis o introdúzcase un aplicador de madera estéril en el cultivo, de al menos 2.5 cm, retírese rápidamente e introduzca hasta el fondo en el tubo de fermentación del medio mencionado.
Repítase y deséchese el aplicador. Repítase esta operación en todos los tubos posiblemente positivos.
Incúbese el medio de verde brillante de lactosa bilis a 35 ± 0.5°C durante 48 ± 3 horas.
La formación de cualquier cantidad de gas en el vial invertido en el medio de fermentación verde brillante de lactosa bilis a las 48 ± 3 horas constituye un resultado positivo en la fase confirmativa.

PROCEDIMIENTO: Medio LES Endo
Siémbrese asépticamente una placa de agar LES Endo por cada tubo de medio verde brillante lactosa bilis que haya producido gas; la operación debe realizarse lo antes posible tras la detección del gas. Siémbrese las placas de forma que se asegure la existencia de algunas colonias aisladas, separadas por menos de 0.5cm.
Incúbese las placas invertidas a 35 ± 0.5 °C durante 24 ± 2 horas.
Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden ser típicas (rosas a rojo oscuras con un brillo verde metálico superficial), atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 de incubación o negativas (todas las demás).

Prueba para Coliforme Fecales
PROCEDIMIENTO: Medio EC
Estúdiense todos los tubos de fermentación presuntivos que hayan mostrado alguna cantidad de gas o un fuerte crecimiento durante las 48 horas de incubación en la prueba de confirmación.
Agítense suavemente o gírense los tubos de fermentación que muestran gas o un fuerte crecimiento. Con un asa estéril de metal de 3mm de diámetro o un aplicador de madera estéril, pásese el cultivo de cada tubo de fermentación al medio EC.
Incúbese los tubos con medio EC inoculados en un baño de agua a 44,5 ± 0.2 °C durante 24 ± 2 horas.
Deposítense todos los tubos con EC en un baño de agua antes de que transcurran 30 minutos de inoculación y manténgase a una profundidad suficiente como para que el agua del baño este a un nivel superior al que tiene el medio en los tubos.
INTERPRETACIÓN: Se considera como reacción positiva a la aparición de gas en un medio EC a las 24 horas o menos de incubación. La falta de gas (a veces se produce crecimiento) constituye un resultado negativo, que indica que el origen de los microorganismos no es el aparato digestivo de los animales de sangre caliente. El NMP en los tubos de medio EC positivos se calcula.

RESULTADOS
Prueba Confirmativa:
Muestra
T(°C)
Dilución(ml)

1
10-1
10-2
Grifo baño FIC
23,5
-
-
-
Grifo baño FIA
21
1/5
1/5
0/5
19.5
-
-
-

Grupo N°3:

RESULTADOS
Medio LES Endo:
Muestra
Tipo de Colonia

Grifo baño FIC
Colonia Atípica
Grifo baño FIA
Colonia Atípica
Colonia Típica

DISCUSIÓN
Después de haber realizado el laboratorio, se discutió sobre los resultados obtenidos en la prueba confirmativa ya que los grupos 1 y 5 no obtuvieron resultados, se puede deber a que los tubos en la fase presuntiva no fueron realizados correctamente o que en el procedimiento de este laboratorio no fue el indicado o no se tomó las precauciones debidas y fue contaminada las muestras. El grupo 3 solo obtuvo 2 tubos con reacciones positivas.

OBSERVACIONES
Los medios de cultivo en este laboratorio se encontraban vencidos.
Es posible calcular el NMP del grupo 3 debido a que esa combinación de reacciones positivas se halla en la tabla de NMP.
El grupo 1 y 5 no pudieron obtener resultados por lo que no es posible calcular el NMP en estos casos.

CONCLUSIONES
Se confirma la presencia de coliformes en la muestra obtenida del Grifo del Baño FIA.
La colonia de la muestra del baño FIA es Atípica
El NMP de coliformes en el grupo 3 es 40.
En el Baño FIC existe una incongruencia debido a la aparición de gas sin mostrar algún tipo de crecimiento por lo que se deberá volver a realizar la prueba para levantar dicha incongruencia.
La colonia de la muestra del baño FIC es Atípica

En el estanque de Arquitectura no se puede confirmar la presencia de coliformes debido que no obtuvimos resultados coherentes en ninguna de las fases, por lo que se debe a realizar una vez más el laboratorio.

La colonia de la muestra del Estanque de Arquitectura es Típica

Dado los resultados tendremos que determinar el tipo de coliforme mediante una PRUEBA COMPLEMENTARIA.

RECOMENDIACIONES

Para el grupo 1 y 5, se debería realizar el laboratorio una vez más ya que los resultados obtenidos no son concretos y no podemos confirmar o negar la presencia de coliformes.

Se recomienda que al realizar una vez el trabajo, se trabaje con medios de cultivo que se encuentren en vigencia debido a que puede ser uno de los factores por el cual los resultados no son los esperados.

BIBLIOGRAFIA
http://www.dibico.com/fichast/1159.pdf
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_AgarEndo.pdf
http://www.ircwash.org/sites/default/files/245.11-91AD-9090.pdf

PARTE III:
Técnica de fermentación en tubos múltiples: Prueba Complementaria

OBJETIVOS
Determinar la presencia de bacterias gran no esporuladas procedentes de los cultivos con agar (Demostración del grupo coliforme).

Confirmar si el tipo de coliforme es fecal o no fecal.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Prueba Complementaria
Para establecer definitivamente la existencia de bacterias y obtener datos sobre el control de calidad, practíquese la prueba completa en todos los tubos positivos confirmados. Puede utilizarse la doble confirmación en medio líquido de verde brilloso de lactosa bilis para coliformes totales y el medio EC para coliformes fecales. Considérense como respuesta positiva de la prueba completa a los resultados positivos en medio liquido EC a temperatura elevada 44,5° C. Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y negativos en medio EC indican la presencia de coliformes no fecales y, por tanto, deben ser sometidos a la prueba completa para obtener un valor del NMP.
MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS

Añádanse los ingredientes al agua, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlos. El pH debe ser 6.8 ± 0.2 después de la esterilización. Antes de esterilizar póngase el medio en tubos con tap n de rosa. Tras la esterilización, colóquense inmediatamente en posición inclinada, de forma que el agar, solidifique formando una pendiente. Ajústense los tapones después que se hayan enfriado y consérvense en una zona fría y protegida.
MEDIO LES ENDO:
El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente selectivo utilizado para la detección de coliformes y otros microorganismos entéricos.

Preparación
Suspender 41,5 g del polvo deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir durante 1 minuto para disolver completamente los ingredientes. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Dejar enfriar a 45-50°C y re suspender el precipitado por agitación antes de su uso. Se recomienda preparar exactamente la cantidad de Agar Endo que se va a utilizar.
Tinción de Gram

Usar laminas limpias y pasarlas varias veces cortando la llama del mechero Bunsen. No tocar con los dedos la superficie plana del portaobjeto.
Dejar enfriar la lámina y colocar sobre ella una gotita de suero fisiológico con el inoculador.
Con el inoculador estéril, tocar ligeramente el cultivo que ha de ser examinado y transfiere un poquito de él sobre la gotita de suero fisiológico.
Esterilizar el inoculador y dejarlo enfriar.
Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo sobre el porte central del portaobjeto, cuidando de que se forme una película delgada.
Dejar que la película seque en el aire.
Fijar la preparación sobre el porta-objeto pasándolo por la llama del mechero tres veces, manteniendo la película hacia arriba de la llama. Dejar enfriar.

Cubrir la película con el colorante cristal violeta y dejar así cubierto por espacio de 1 minuto

Lavar el colorante de la lámina con la solución Lugol durante 1 minuto.

Lavar la lámina con agua.

Decolorarla con Alcohol-Acetona hasta que quede incolora

Lavar la lámina con agua

Contra colorear con Safranina y dejar que se tiña por espacio de 1 minuto

Lavar la lámina con agua

Dejar de secar y examinar el microscopio y la preparación. Un organismo Gram positivo retendrá el color cristal violeta y aparecerá teñido de azul y un organismo Gram Negativo tendrá el color rojo de la Safranina.

METODOLOGIA
MATERIALES
Medio LES Endo
Lugol
Safranina
Cristal violeta
Microscopio
Mechero Bunsen
Alcohol acetona
Agar Nutritivo
Caldo Lauril Triptosa
Incubadora
Autoclave
Inoculador
Tubos de las fases anteriores

PROCEDIMIENTO
Las colonias que se desarrollan en el Agar Les Endo pueden ser típicas (rosa o rojo oscuro con brillo metálico superficial), atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 horas de incubación o negativas (todas las demás).
Tomar de cada placa una o más colonias típicas bien definidas, y si no existen, dos o más entre los que se consideren como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se pasan a un tubo de fermentación con medio caldo Lauril triptosa y a uno con agar inclinado.
Sembrar las placas de forma que se asegure la existencia de algunas colonias aisladas, separadas por al menos 0.5 cm.
Escoger una colonia discreta: Típica o atípica separada 0.5 cm de las otras
Incubar los tubos con medio de caldo Lauril triptosa con viales de fermentación invertidos a 35° C ± 0.5°C durante 24± 2 horas, si no se produce gas entre este periodo se prolonga la incubación hasta 48 horas ± 3 horas.
Si hay formación de gas en el tubo con caldo Lauril triptosa, hacer la coloración Gram del tubo con cultivo en el Agar inclinado.
La presencia de bacilos Gram negativos y la ausencia de esporas constituye una prueba completa positiva. La presencia de bacilos Gram negativos acompañados de esporas o ausencia de bacilos Gram negativos viene a ser una prueba completa negativa.
Si no hay producción de gas en los tubos con caldo Lauril triptosa se tiene una prueba negativa completa.

RESULTADOS
Muestra
Formación de gas en caldo Lauril triptosa
Coloración Gram
Grifo baño FIA
-
Gram positivo
Bacilos
Grifo baño FIC
-
Gram positivo
cocos
+
Gram negativos
Bacilos

Grupo N° 3:

Grupo N°5:

Grupo N° 1:

DISCUSIÓN
Después de haber realizado el laboratorio, se discutió los resultados obtenidos por lo que que el grupo 1 y 3 obtuvieron reacciones negativas en esta prueba. Puesto que el grupo 3, en las anteriores fases se confirmó la presencia del grupo coliforme en esta fase se comprueba que no, debido a que se obtuvo cocos Gram Positivos. Por otra parte el grupo 5, en esta fase obtuvo una reacción positiva, y se confirma la presencia del grupo coliforme, a pesar de que en las anteriores pruebas no se estuvo seguro. El grupo 1 obtuvo una reacción negativa por lo que se confirma la usencia del grupo coliforme en su muestra.

OBSERVACIONES
El grupo 3 obtuvieron resultados diferentes, contrarios. Por lo que puede deberse que realizó mal la Tinción de Gram.
Los colorantes no se encontraban en buenas condiciones, por lo que pudo afectar los resultados de alguno de los grupos.

CONCLUSIONES
El estanque de Arquitectura contiene coliformes, debido a que no tienen un mantenimiento constante.
El Baño de la FIC no hay presencia del grupo coliforme esto puede deberse a la presencia de cloro en las aguas que salen de sus grifos.
En Baño de la FIA no hay presencia del grupo coliforme, por lo que debería realizarse una vez más el laboratorio debido a que en la fase presuntiva y confirmativa, si se obtuvieron datos que indicaban la presencia de grupo coliforme.
En el estaque de Arquitectura se encuentran Bacilos Gran negativos.

RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar el laboratorio una vez más para confirmar si los resultados obtenidos son correctos.
Se recomienda usar un microscopio en buen estado, porque podría ser tedioso observar la muestra.

BIBLIOGRAFIA
http://www.qo.fcen.uba.ar/quimor/wp-content/uploads/2013/02/Guia-Micro-Alim-Mod-II_2013.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf

PARTE IV:
Diferenciación del Grupo Coliforme: Fecal o no Fecal (Prueba IMViC)

OBJETIVOS
Confirmar que tipo de bacteria se presenta en las muestras mediante una prueba IMVIC

FUNDAMENTO TEÓRICO
Pruebas IMVIC:

Son un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas que sirven para caracterizar bacterias de los diferentes géneros que existen en la naturaleza. Estas pruebas son utilizadas para identificar bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, las cuales son indicadores biológicos de contaminación en alimentos y agua principalmente. Estas cuatro pruebas son Indol, Rojo de Metilo, Voges - Proskauer y Citrato.

Prueba del Indol.

Fundamento:

Esta prueba permite determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de la molécula de triptófano a través de la enzima triptofanasa. El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar 3 metabolitos principales: Indol, escatol e indolacético. En este proceso interviene un sistema completo de enzimas llamado triptofanasa.

Procedimiento:

El medio de cultivo para realizar este prueba es agua peptonada (rica en triptofano), la peptona se agrega al 1%. Se distribuye en tubos de hemólisis a razón de 3 ml y de 8 ml en tubos de ensayo según se utilice y se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Se siembran los microorganismos problemas y se incuban a la temperatura adecuada durante 48 horas.

La lectura se realiza con el reactivo de Kovacs, cuya composición es la siguiente:
p-dimetilaminobenzaldehido 5 g
Alcohol isoamílico 75 ml
Hcl concentrado 25 ml

Resultados:

Si se produce Indol, se formará un complejo con el aldehído, de color rojo. El HCl es para favorecer la formación del complejo, que ocurre a pH ácido. El alcohol amílico es para concentrar el color en la superficie del tubo.

Anillo rojo en la superficie del tubo...................... Indol +
Si no se presenta coloración................................ Indol –

Ejemplos:
Escherichia coli es Indol +
Enterobacter aerogenes es Indol –

Prueba del rojo de Metilo

Fundamento:

Conocer si el microorganismo tiene la capacidad de producir y mantener estables los productos ácidos de la fermentación ácido mixta de la glucosa (ác. Acético, fórmico, láctico y succínico), y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. El rojo metilo es el indicador de pH utilizado para determinar la concentración de iones hidrógeno después de la fermentación de la glucosa. Se utiliza el medio de cultivo Caldo Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP), cuya composición es la siguiente:
Peptona 7 g
Glucosa 5 g
K2HPO4 5 g
Agua destilada 1000 ml

Este medio es líquido y se prepara y distribuye a razón de 5 ml por tubo de ensayo y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. La lectura se realiza agregando solución de rojo de metilo, en solución alcohólica al 0,2% (p/v).

Procedimiento:

Se siembra con asa en loop. Una vez que se siembra y se deja incubar por 48 horas, se leen los resultados. Si el microorganismo ha producido ácidos a partir de la glucosa, se mantendrá rojo el indicador.

Resultados:

Medio ácido...............indicador rojo.........................RM+
Medio neutro............. indicador amarillo naranja….RM-

Ejemplos:

Escherichia coli es RM +
E. arogenes es RM –

Prueba de Voges-Proskauer.

Fundamento:

La reacción de V.P. se basa en la detección de acetoína a partir de la fermentación butanodiólica de la glucosa. A partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir muchas vías según su sistema enzimático, una de éstas es la fermentación butanodiólica, cuyo producto final es el 2,3 butanodiol, en que la acetoína es el precursor. La prueba V.P. se basa en la detección de éste último. La acetoína que se produce en la fermentación, cuando reacciona con el hidróxido de potasio (KOH al 40% p/v) es oxidada a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos guanídicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio, dando una coloración rojiza.

Procedimiento:

Para esta prueba se utiliza el mismo medio que para el rojo metilo. El microorganismo se siembra e incuba por 48 horas. La lectura se realiza agregando el cultivo crecido 6 a 8 gotas de una solución de KOH y 1ml de solución alcohólica de alfa-naftol al 5% p/v. Se debe esperar hasta 20 minutos para realizar la lectura, tiempo en el cual se deja en estufa el cultivo con los reactivos agregados.

Resultados:

Formación de un anillo rojizo ------------ V.P. (+)
Formación de un anillo incoloro --------- V.P. (-)

Ejemplos:
Escherichia coli es VP –
E. aerogenes es VP +

Prueba del citrato.

Fundamento:

Determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono. Algunas bacterias pueden obtener energía empleando el citrato como única fuente de carbono. En las bacterias la utilización del citrato comprende un sistema enzimático que incluye, por una parte, la enzima citrato permeasa, que permite el paso del citrato a través de la membrana, y por otra, la enzima citrato liasa, que desdobla el citrato en acetato y oxalacetato. El acetato es excretado y el oxalacetato es descarboxilado para generar piruvato.

Procedimiento:

El medio a utilizar para esta prueba de el Koser Citrato (líquido) o el Citrato de Simmon (sólido). Estos medios contienen citrato como única fuente de carbono, sales de amonio inorgánicas como única fuente de nitrógeno, sales minerales y un indicador de pH, el azul de bromotimol. El medio, en un principio, es de color verde y cuando el microorganismo utiliza el citrato vira a color azul por alcalinización de él.

Resultados:

Color azul en el medio, prueba del citrato +
Color verde en el medio, prueba del citrato –

METODOLOGIA

MATERIALES
Tubos de ensayo
Muestra Caldo triptona
Reactivo de Kovacs
Inoculador
Caldo RM-VP
Rojo de Metilo
KOH (40%)
Solución alfa-naftol
Caldo citrato de Koser
Incubadora
Autoclave
Mechero Bunsen

RESULTADOS TEÓRICOS
CONCLUSIÓN
El presente laboratorio no se realizó, solo se busco los resultados teóricos como se muestra en el cuadro de arriba. Si obtuviéramos esos resultados podríamos identificar el tipo de bacteria que es como la E.coli, Salmonella, etc.
BIBLIOGRAFIA
http://javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis203.pdf
http://www.qo.fcen.uba.ar/quimor/wp-content/uploads/2013/02/Guia-Micro-Alim-Mod-II_2013.pdf
Universidad técnica Federico santa María. (S/f). Laboratorio de introducción a la microbiología. Extraído de:
http://www.ramos.utfsm.cl/doc/530/sc/LABORATORIO_5.pdf

PARTE V:
Técnica de Filtro de Membrana para Coliforme Totales

OBJETIVOS
Comprobar la eficacia de la técnica por filtración de membrana para la determinación del grupo coliforme.

FUNDAMENTO TEÓRICO
TECNICA DEL FILTRO DE MENBRANA PARA MIENBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES
La técnica de filtro de membrana (FM) es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numéricos más rápidos que el método de los tubos múltiples. La técnica del filtro de membrana es extraordinariamente útil para controlar las posibles situaciones de urgencia en relación con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales .Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones, sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contenga bacterias no coliformes. Para esta agua, y también en caso de que no se haya utilizado anteriormente la técnica de filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante la técnica de fermentación en tubos múltiples demostrar la aplicabilidad y comparabilidad de aquella.
DEFINICION
En lo que se refiere a la técnica de filtro de membrana, el grupo coliforme puede definirse como el formado por las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas y de forma alargada, que desarrollan una colonia roja con un brillo metálico en un medio tipo Endo que contenga lactosa tras una incubación de 24 horas a 35°C .Al estudiar cultivos purificados de bacterias coliformes , se observa una reacción de citocromo oxidasa(CO) negativa y una de (ONPG) positiva. En esta técnica, todas las colonias rojas, rosadas, azules blancas o incoloras que no tienen brillo suelen ser consideradas como no coliformes.
APLICACIONES
La turbidez producida por la existencia de algas u otro tipo de material puede impedir el estudio de un volumen de muestra suficiente para obtener resultados significativos. La presencia de un elevado número de no coliformes o de sustancias toxicas puede dar lugar a un cálculo de coliformes inferior al real .La técnica del FM es aplicable al estudio de las aguas saladas, pero no al de aguas residuales que solo han recibido un tratamiento primario, seguido de cloración, debido a su turbidez en muestras de grandes volúmenes o a su contenido en metales o compuestos orgánicos tóxicos del tipo de los fenoles.
Para detectar los coliformes totales alterados en el agua potable tratada y en las aguas residuales secundarias o terciarias cloradas, utilícese el método destinado a recuperar los microorganismos en condiciones anómalas para los coliformes fecales , se recurre a la técnica de fermentación en tubos múltiples, siempre que los resultados deban utilizarse para obligar al cumplimiento de las normas.
Puede emplearse una modificación para coliformes fecales de la técnica del filtro de membrana, si los estudios paralelos con la técnica de fermentación en tubos múltiples muestran resultados comparables para tipos de muestra específicos de una localización.
El volumen estándar que se va a filtrar en las muestras de agua potable es de 10 ml que, si es necesario, puede distribuirse a lo largo de varias membranas. El agua potable tratada no debe contener coliformes por 100 ml, por lo que las plantas de tratamiento de agua deben tomar en consideración el estudio de muestras de 1.1 de agua terminal, siempre que no existan partículas que interfieran en la filtración o el desarrollo de colonias aisladas.
En estos casos, divídase las muestras en cuatro porciones de 250 ml y comuníquese la totalidad de coliformes observados en todas las membranas .Para otro tipo de aguas o en análisis especiales, pueden utilizarse muestras de mayor o menor volumen.
La comparación estadística de los resultados obtenidos con el método de los tubos múltiples y el de filtro de membrana muestran la mayor precisión de este último, Aunque los datos de ambas pruebas den resultados bastante precisos sobre la calidad del agua , los resultados numéricos no son idénticos. En el caso de aguas naturales, es lógico esperar que el 80 por 100 de los análisis de filtro de membrana estén dentro de los límites de confianza del 95 por 100 de los resultados de la prueba completa de tubos múltiples .Es de esperar que los resultados de la prueba de tubos múltiples superen los del filtro de membrana, debido a una desviación estadística positiva.
Procedimiento estándar de filtro de membrana para coliformes totales
Instrumental de Laboratorio
Los análisis del filtro de membrana requieren instrumental de vidrio y otros aparatos fabricados sin agentes que pueden producir efectos adversos sobre el crecimiento bacteriano. Anótense cuidadosamente todas las desviaciones que se produzcan sobre las recomendaciones expuestas más adelante y háganse pruebas cuantitativas para demostrar que estas desviaciones no han introducido agentes o factores que den lugar a condiciones menos favorables para el crecimiento bacteriano.
Antes de esterilizarlos, tápese la boca de los cilindros graduados con papel metálico u otro papel adecuado.
Envases del medio de cultivo: Para reducir la contaminación bacteriana, utilícense matraces de vidrio boro silicato limpios y pre esterilizados. Se pueden utilizar matraces de cualquier forma y tamaño, pero para conseguir una buena mezcla del medio y para su conservación los más recomendables son los erlen meyer de tapones metálicos, los cubiertos con papel metálico o los que tienen tapón de rosca.
Placas de cultivo: Utilícense placas estériles de vidrio boro silicato o desechables del tipo Petri de 60 mm u otro tamaño adecuado. Las placas de vidrio para cultivo, limpias y envueltas por separado o en número adecuado en papel metálico, se esterilizan con calor seco o en papel adecuado en caso de que la esterilización se realice en autoclave.
Las placas de cultivo de vidrio y algunas de plástico desechables tienen a veces tapaderas mal ajustadas, lo que se procurara evitar durante perdida de humedad por evaporación, que provocaría la desecación del medio y la pérdida del ambiente húmedo adecuado para un óptimo desarrollo de las colonias.
También pueden utilizarse placas de plástico desechables que ajustan bien y cumplan las normas antes expuestas.
Existen en el mercado placas de plástico estériles que son adecuadas para este método.
Unidades de filtración: El equipo de soporte de filtro (fabricado en vidrio, plástico resistente al autoclave, porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo sin junturas, unido a una base por un artefacto de cierre o manteniendo en su lugar mediante una fuerza magnética. El diseño debe permitir que el filtro de membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa del receptáculo, sin que sufra daño mecánico, de manera que todo el líquido pase a través de la membrana durante la filtración.
Para esterilizarlo en el autoclave antes de guardarlo, ensuélvase en papel fuerte, separando ambas partes del equipo.
También se puede tratar con luz ultravioleta (sin envuelto en papel) antes de volver a utilizarlo, en caso de que se estén llevando a cabo serie de filtraciones.
Las unidades de campo pueden desinfectarse con una llama de alcohol metílico o sumergiéndolas en agua hirviendo durante 5 minutos .Las partes plásticas no se esterilizan a la llama. Pueden utilizarse unidades de campo estériles desechables.
Para la filtración, móntese el receptáculo del equipo del soporte del filtro en un matraz de 1.1 con un tubo latral y presión diferencial (34-51 KPa) sobre el filtro de membrana. Conéctese el matraz a una bomba eléctrica de vacío con un filtro de bomba actuando sobre la presión del agua, un aspirador manual u otro medio para asegurar la presión diferencias (138-207 kPa). Conéctese un matraz de la misma capacidad entre el matraz de filtración y la fuente de vacío para atrapar el agua que se escape.
Filtro de membrana: Utilícense filtros de membrana con un diámetro de poro que permita una completa retención de las bacterias coliformes.
Solo se emplearan filtros en los que se dé una velocidad de filtración satisfactoria (en 5 minutos), ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no más de y que no produzca un aumento en el número de colonias confluentes o expansivas, en comparación con los filtros de membrana de control .Las membranas marcadas con una trama se utilizaran de forma que no inhiban ni estimulen el crecimiento bacteriano cuando se incuben con las bacterias retenidas en un medio adecuado.
Es preferible utilizar filtros de membrana recientes y, si es necesario guardarlos, se hará en un ambiente sin cambios extremos de temperatura o humedad. No deberán comprarse en cantidades anuales superiores a las necesarias.
Es preferible utilizar filtros de membrana pre esterilizado cuyos fabricantes garanticen que la técnica de esterilización no ha inducido toxicidad no alterada las propiedades físicas o químicas de la membrana. Si se esterilizan las membranas en el laboratorio .Pásense 10 minutos por la autoclave a 121 ° C .Al finalizar la esterilización, déjese que el vapor escape rápidamente para reducir en lo posible la acumulación de agua de condensación en los filtros.
Las almohadillas absorbentes consisten en discos de papel de filtro u otro material garantizado por el fabricante en lo que se refiere a la alta calidad y a la ausencia de sulfitos u otras sustancias que puedan inhibir el crecimiento bacteriano .Utilícense almohadillas de 48 mm de diámetro y un grosor suficiente para absorber 1,8-2,2 ml de medio. Las almohadillas absorbentes esterilizadas o las esterilizadas posteriormente en el laboratorio deben liberar menos de i mg de acidez total (calculada como) al titularlas titularlas al punto extremo de fenolftaleína, pH 8.3 utilizando NaOH al 0.02 N Y producir valores de pH 7 las almohadillas se esterilizan al mismo tiempo que los filtros de membrana envueltos en papel fuerte resellable o bien de forma separada en envases adecuados.
Antes de utilizarlas, deben estar secas y sin restos visibles de humedad.
Pinzas. Utilícense pinzas sin dientes, que se esterilizaran antes de utilizarlas, sumergiéndolas en alcohol etílico al 95 por 100 o en alcohol metílico absoluto y a la llama.
Incubadoras: Utilícense incubadoras a una temperatura de 35 que mantengan una humedad elevada (alrededor de un 90 por 100 de humedad relativa).
Microscopio y fuente de luz: El recuento de las colonias que existen en los filtros de membrana se realiza mediante una lupa de 10 a 15 aumentos y bajo una fuente de luz fluorescente fría ajustada para que de un discernimiento máximo del brillo .Lo mejor es emplear una lupa estereoscópica binocular de campo amplio.
No se debe utilizar un iluminador de microscopio con un sistema óptico de concentración de luz por una fuente de luz incandescente cuando se trata de estudiar las colonias de coliformes en un medio de tipo Endo.

METODOLOGIA

MATERIALES

PROCEDIMIENTO
Colocar con pinzas estériles un filtro de membrana estéril (con la trama hacia arriba) sobre la placa de porosa del receptáculo.
Situar con cuidado el embudo sobre el receptáculo.
Agregar en el embudo 100ml de muestra de agua y encender el equipo para que el agua pueda pasar a través del filtro.
Retirar el embudo y colocando en la placa a 65°C con la finalidad de desinfectar el embudo para que no contamine la muestra analizaste.
Quitar el filtro de membrana con unas pinzas. Colocándolo en un aplaca con el medio de cultivo, agar LES Endo.
E limpiar el embudo con agua peptonada, retirando del repticulo y volver a colocarla en agua 65°C
Colocar el filtro de membrana y luego el embudo.
Agregar los 100 ml de la 2da muestra de agua. Repetir el procedimiento para las 3 muestras.
Invertir las placas e incubarlas a 35±0.5°C durante 22- 24 horas

RESULTADOS

Muestra
Fecha
Temperatura
Colonias de Colofirme totales /100ml
Grifo Baño FIA
25 de octubre del 2016
20.5°C
0
Grifo Baño FIC
23°C
0
21°C
0

Grupo N°1:

Grupo N°3:

Grupo N°5:

Escriba aquí la ecuación.

IDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORME

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