UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA Médico cirujano Laboratorio de Microbiología Modulo: Cardiovascular Cardiovascular Mesa: 4 Integrantes: Angel Montoya Karla Gisel Campos Badillo Julio Adán Díaz Quintero Dulce Karen Fernández Hernández Héctor Gonzales Sánchez Armando Guerrero Ibarra Imelda Macias Pérez Citlalli Jessica Johanna Romero Iturbide Arturo Roldan Tinoco José Practica 6: IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Grupo: 1305
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR PRUEBAS BIOQUÍMICAS OBJETIVO 1.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons. 2.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en el medio de cultivo líquido Caldo con urea o en el medio sólido Agar con urea de Christensen. 3.- El alumno aplicará las técnicas de siembra en tubos para los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons y agar con urea de Christensen de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo. 4.- El alumno aplicará la técnica de siembra en tubos para el medio de cultivo líquido Caldo con urea de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo. 5.- El alumno interpretará las pruebas positivas y reportará a los géneros y especies bacterianas identificadas como posibles patógenas.
INTRODUCCIÓN Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
MARCO TEORICO Prueba TSI (Triple SugarIronó SugarIronó Triple Azúcar Hierro) El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae , con objetivo de diferenciar entre: bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacteriasaerogénicas bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre. Prodedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm.del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados:
Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomona ssp. Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigellaspp. Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. S almonela almonelaspp. P ico ico ácido/fondo ácido: Gluco sa y lacto sa y/o sacarosa fermentada s. P uede uede producir se SH2 o no. E sc heric hiacoli . A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. SIMONS CITRATO
Agar Citrato
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiellaspp. ( - ) EscherichiaColi E scherichiaColi
Resultados-Positivo: crecimientoycolorazulenelpico,alcalinidad. Negativo: elmediopermanecedecolorverdedebidoaquenohaydesarrollobacterianoynohayca mbiodecolor.
Microorganismo
Citrato permeasa
Color del medio
Klebsiellapneumoniae Klebsiella pneumoniae S. typhimurium
Positivo Positivo
Azul Azul
E. coli
Negativo
Verde
S. flexneri
Negativo
Verde
LIA
Prueba LIA (LysineIron Agar ó Agar Lisina Hierro) Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° . Interpretación y Resultados:
Resultados1-Decarboxilacióndelalisina: -PruebaPositiva:Picovioleta/fondovioleta. -PruebaNegativa:Picovioleta/fondoamarillo.
2-Desaminacióndelalisina:
Picorojizo/fondoamarillo.EstosucedeconcepasdelgéneroProteus,Providenciayalgunacepas deMorganellaspp .3-Produccióndeácidosulfhídrico: -Pruebapositiva:Ennegrecimientodelmedio(especialmenteenellímitedelpicoyfondo)
Microorganismos
Color en el Color en la Ennegrecimiento del pico de flauta base del tubo medio
P roteu roteusmirabili s
Rojo
Amarillo
Negativo
S almonella almonella ty phimurium
Púrpura
Púrpura
Positivo
S almonella almonella enteritidi s
Púrpura
Púrpura
Positivo
P rovidencia rovidencia spp.
Rojo
Amarillo
Negativo
C itrobacterfreundii itrobacterfreundii
Púrpura
Amarillo
Positivo
Morganellaspp.
Rojo
Amarillo
Negativo
Edwar siellaspp.
Púrpura
Púrpura
Positivo
K leb lebsiella pneumoniae
Púrpura
Púrpura
Negativo
Escherichiacoli
Púrpura
Púrpura
Negativo
Indol El indol es uno de los productos de degradación degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. Resultados: (+ ) Escherichiacoli
( - ) KlebsiellaPneumoniae MIO positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá Resultados1-Movilidad: -Resultado positivo: de l línea de siembra.-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. 2-Ornitina
decarboxilasa: -Resultado positivo: color púrpura.-Resultado negativo: color
amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.
3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento.
MATERIAL 1 tubo de agar TSI 1 tubo de agar LIA 1 tubo de citrato de Simmons 1 tubo de plasma citrato 1 tubo con caldo urea 1 tubo con medio de MIO 1 tubo con peróxido de hidrogeno Microscopio Reactivos para tinción de Gram Mechero Asa bacteriológica Porta y cubreobjetos
PROCEDIMIENTO Tomar colonias aisladas de las placas de agar sangre y agar chocolate, observar si hay hemolisis reportar la presencia de estreptococos y confirmar con peróxido de hidrogeno para descartar estafilococos. Hacer frotis y teñir por la técnica de Gram. Si hay crecimiento en agar EMB sembrar en los tubos pruebas bioquímicas siguiendo el procedimiento de la práctica de exudado faríngeo. Los tubos de LIA y TSI se siembran por estría simple y picadura. Si se obtiene desarrollo en las cajas de S-110 efectuar la prueba de la cuagulasa (plasma citrado) Discutir resultados
RESULTADOS
Lisina hierro agar (LIA)
Citrato de Simmons
Triple azúcar hierro (TSI)
Caldo urea
Movilidad indolornitina (MIO)
CUESTIONARIO 1.- Describa la técnica de siembra en el medio TSI. El Agar TSI inclinado se debe inocular a partir de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey o de otras fuentes apropiadas. EL cultivo se debe estriar en la porción inclinada y picar hasta un centímetro antes del fondo. Los cultivos se leen después de 18 a 48 horas de incubación a 37° C. 2.-
Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio de TSI.
Metabolismo de Carbohidratos.- Fundamento.- El metabolismo bacteriano de alguno o de los tres carbohidratos da como resultado la producción de ácido pirúvico y ácido láctico (fermentación ácida), por lo que medio de cultivo se acidifica, esta acidez se evidencia por un cambio de color del medio de rojo o rosa intenso al color amarillo por la acción del indicador rojo de fenol. Si el medio se conserva alcalino no hay cambio de color, conservándose el medio de cultivo de color rojo. Producción de Sulfuro ferroso en TSI.-Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína desulfhidrasa y tiosulfatoreductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, sodio, este último es el primer primer sustrato que utiliza utiliza la enzima tiosulfatoreductasa tiosulfato reductasa bacteriana para formar ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Las especies del género Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso que se evidencia por un precipitado de color negro en el medio. E. Coli y Shigellas son negativas.
3.- Describa la Técnica de siembra en el medio SIM. El Agar SIM se debe inocular por picadura en el centro hasta la mitad o un centímetro antes del fondo. Las muestras muestras se toma de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey
4.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio SIM. Sulfuro ferroso.ferroso .- Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína desulfhidrasa y tiosulfatoreductasa. Indol.- Fundamento.- El alto contenido de trypticase (triptófano) en el medio SIM, lo hace ideal para la producción de indol. El triptófano puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos (indol, escatol y ácido indolacético) por reacciones específicas de la enzima, liberando una molécula de amoniaco. Movimiento positivo en el medio SIM.- Gracias a sus flagelos perítricos los géneros Salmonella, Proteus, Escherichiacoli se desplazan alejándose de la picadura dando un aspecto de remolino o turbidez alrededor de la picadura.
5.-
Describa la técnica de siembra en el medio LIA.
Técnica de siembra.- Con el asa bacteriológica bacteriológica recta, estriar el pico pico de flauta y punzar el fondo del medio dos veces. Dejar las tapas del medio de cultivo ligeramente flojas. Incubar durante 18 a 24 hrs., a 35° C.
6.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio LIA. Descarboxilación de la lisina.- La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas, atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y CO2. Estas descarboxilasas descarboxilasas son enzimas adaptativas adaptativas o inducidas y solo se activan cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente ácido en presencia de un sustrato especifico. Los productos de la descarboxilación de estos aminoácidos cambian el pH a limites alcalinos. La descarboxilación descarboxilación que producen producen estas enzimas, esta esta restringida a los aminoácidos que poseen por lo menos un un grupo químicamente activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminoácidos que tienen un grupo carboxilo (COOH). Este tipo de descarboxilación ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la glicólisis se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas. La descarboxilación es irreversible no oxidativa y por lo general requiere requiere una coenzima común, fosfato de piridoxal, piridoxal , que refuerza la actividad de las descarboxilasas. descarboxilasas. El aminoácido L-lisina L-lisina es descarboxilado para formar cadaverina, una diamina y dióxido de carbono, por la acción de la enzima especifica lisina descarboxilasa. descarboxilasa.
7.- Describa la técnica de siembra en el medio MIO. Los tubos se siembran por punción con asa recta hasta un centímetro antes del fondo. Incubar por 24 horas a 37° C.
8.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio MIO. Movilidad. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la línea de inoculación, mientras en las no móviles crece a lo largo de la línea de siembra. Indol.- Fundamento.- El triptófano que contiene el medio MIO puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias, utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos (indol, metilindol y ácido indolacético) y liberando una molécula de amoniaco. La desaminación del triptófano produce Indol. La inmediata aparición de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amílico o butílico + Dimetilaminobenzaldehído + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas, indica la presencia de Indol. La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad bacteriana. Descarboxilación de la ornitina.- La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y CO2.
9.- Describa la técnica de siembra en el medio Citrato de Simmons.
Se pueden hacer cultivos en placa con técnica de aislamiento o si se prefiere el medio inclinado, se inocula estriando la superficie y picando el fondo.
10.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en Citrato de Simmons. Fundamento.- Solo los organismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono crecen en el Agar Agar Citratado de Simmons. El citrato es obtenido del citrato de sodio que contiene el medio para ser incorporado directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Krebs) para su metabolismo y producción de energía. Esta reacción es catalizada por la citrato desmolasa o citratasa enzimas bacterianas que requieren de un medio alcalino y de cationes divalentes como magnesio para su activación.
11.- Describa la técnica de siembra en Caldo Urea. Se debe estriar superficialmente con un inóculo grande, el fondo sirve como control del color, por lo que no debe puncionarse.
12.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en caldo Urea. El Agar con urea de Christian elimina la necesidad de que los microorganismos utilicen el amoníaco como única fuente de nitrógeno para su metabolismo, la glucosa que contiene el medio permite el crecimiento de un buen número de géneros que además podrán evidenciar la producción de ureasa alcalinizando el medio de cultivo haciendo que cambie cambie del color normal al rojo por el indicador Rojo de fenol. La mayor parte de las especies del género Proteus dan una reacción fuertemente positiva a las 24 horas de incubación. Otros géneros de bacterias paracólicas dan una pequeña reacción positiva desde las 6 primeras horas de incubación que se intensifica hasta 4 cruces hasta después de tres días. Otros géneros menos positivos a la ureasa dan una reacción leve después de 6 días.
BIBLIOGRAFÍA Brooks, Geo F. Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg 16ª ed. México, D.F: Manual Moderno; 1999. Romero Cabello R. Microbiología Microbiolog ía y Parasitología Parasitolog ía Humana. 3ª ed. México D.F: Panamericana; 2007. Picazo, J.J. / García Rodríguez, J.A. compendio de microbiología medica 1ª ed. Barcelona: Harcourt; 1999.
