GUÍA DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS EDITADA POR EL COLEGIO NACIONAL DE QUÍMICOS FARMACÉUTICOS BIÓLOGOS MÉXICO, A. C.
OBJETIVO: Establecer los lineamientos generales mínimos necesarios para llevar a cabo el proceso de validación de métodos analíticos. JUSTIFICACIÓN: Un método analítico es la descripción de la secuencia de actividades, recursos materiales y parámetros que se deben cumplir, para llevar a cabo el análisis de un componente específico(analito) de una muestra. La validación es el proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada; esta actividad se justifica por los siguientes aspectos: Moral y Ética, Aseguramiento de calidad, Económica, y Regulatoria. DEFINICIONES:
Adecuabilidad del sistema.-Verificación de que el sistema opera con base a criterios que permitan asegurar la confiabilidad de los resultados de un método analítico. Analito.-Componente específico de una muestra a medir. Calibración.-Conjunto de operaciones que determinan la relación entre los valores indicados por un instrumento de medición y los valores conocidos correspondientes a un patrón de referencia. Documentación.-Conjunto de información que sustenta una actividad realizada. Especificaciones.-Descripción del material que incluye la definición de sus propiedades y características, con las tolerancias de variación de los parámetros de calidad. Especificidad.-Capacidad de un método analítico para obtener una respuesta debida únicamente al analito de interés. Estudio colaborativo.-Reproducibilidad realizada en distintos laboratorios, por diferentes químicos. Exactitud.-Concordancia entre un valor obtenido empleando el método y el valor de referencia. Estabilidad analítica de la muestra.-Propiedad de una muestra preparada, de conservar su integridad fisicoquímica y la concentración del analito, después de almacenarse por un tiempo y condiciones determinadas. Intervalo.-Concentraciones incluidas entre la concentración superior e inferior del analito (incluyendo éstas), para las cuales se ha demostrado que el método es preciso, exacto y lineal. Límite de cuantificación.-Concentración mínima del analito que se puede determinar con precisión y exactitud aceptables. Límite de detección.-Concentración mínima del analito que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada.
Linealidad.-Habilidad para asegurar que los resultados obtenidos directamente o por una transformación matemática, son proporcionales a la concentración del analito. Metodología de prueba.-Procedimiento para determinar si un producto o materia prima cumple con las especificaciones establecidas. Método analítico.-descripción de la secuencia de actividades, materiales y parámetros que se deben cumplir para llevar a cabo el análisis de un componente específico de la muestra. Método analítico desarrollado internamente.-Método desarrollado por el propio laboratorio. Método analítico indicativo de estabilidad.-Método cuantitativo capaz de detectar variaciones en las propiedades del material evaluado, debido a las condiciones de almacenaje. Método analítico oficial.-Método que aparece en la literatura oficial reconocida. Método analítico no oficial.-Método que no aparece en la literatura oficial reconocida. Muestra.-Porción del material a evaluar. Muestra analítica.-Porción del material a evaluar de acuerdo al método analítico. Muestra adicionada.-Porción representativa del material a evaluar, a la que se le adicionan cantidades conocidas del analito. Parámetros de desempeño.-Parámetro específico a estudiar en un protocolo de validación. Placebo analítico.-Muestra que contiene todos los componentes de un producto a excepción del analito. Placebo adicionado.-Muestra e un placebo analítico al cual se le adiciona una cantidad conocida del analito. Precisión.-Grado de concordancia entre resultados analíticos individuales, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de una muestra homogénea. Precisión intermedia.-Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia relativa obtenida entre determinaciones independientes realizadas en un mismo laboratorio, por diferentes analistas, en distintos días. Proporcionalidad.-Relación establecida por una ecuación matemática entre los resultados obtenidos por dos métodos analíticos. Protocolo de validación,.Descripción de pruebas específicas para demostrar que un proceso da resultados que cumplen con los criterios preestablecidos de manera consistente. Recobro.-Cantidad del analito determinada en el placebo adicionado, empleando el método analítico. Repetibilidad.-Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia obtenida entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista, usando los mismos instrumentos y métodos. Reproducibilidad.-.Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia entre determinaciones independientes realizadas por diferentes laboratorios. Revalidación.-comprobación de que el método analítico mantiene su desempeño cuando existen cambios en la composición del producto, en el método analítico. Robustez.-Capacidad del método analítico de mantener su desempeño al presentarse variaciones pequeñas pero deliberadas, en los parámetros normales de operación del método.
Sustancia de referencia.-Sustancia de uniformidad reconocida destinada a utilizarse en comprobaciones analíticas físicas, químicas o microbiológicas en el transcurso de las cuales se comparan con la sustancia en evaluación. Sustancia de referencia primaria.-Sustancia que es designada por tener la más alta calidad microbiológica, cuyas propiedades se aceptan sin referencia a otras sustancias. Sustancia de referencia secundaria.-Sustancia cuyas propiedades se asignan por comparación con una sustancia de referencia primaria, o bien, cuando es certificada mediante un procedimiento científicamente reconocido. Tolerancia.-Reproducibilidad de los resultados analíticos obtenidos por el análisis de la misma muestra bajo diferentes condiciones normales de operación. La robustez y la tolerancia son conceptos diferentes, ya que el primero se refiere a la influencia de factores internos del método, mientras que la tolerancia se refiere a factores externos del método. Validación del método analítico.-Proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada.
CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS: Los métodos se clasifican bajo los siguientes criterios: En función de su estado regulatorio: a) Métodos farmacopeicos b) Métodos no farmacopeicos En función de su aplicación (NOM-059-SSA1 y NOM-073-SSA1): a) Métodos para producto a granel, b) Métodos para producto terminado, c) Métodos para muestra primaria, y d) Métodos indicadores de estabilidad. En función de la naturaleza de la respuesta analítica: a) Métodos físico-químicos.- cuando la respuesta es de carácter físico (absorción de luz, emisión de luz, voltaje, etc.) o químico(consumo de iones –OH, consumo de un acomplejante, etc.) b) Métodos biológicos.- cuando la respuesta es de carácter biológico (crecimiento de microorganismos, protección, muerte, etc.) En función de su propósito analítico: a) Métodos para cuantificar el analito(contenido o potencia) b) Métodos para establecer la presencia del analito a un limite. c) Métodos para identificar el analito. Esta clasificación se utiliza para establecer los parámetros de desempeño a estudiar en la validación del método analítico. Cualquier método analítico puede estar constituido por técnicas de separación, extracción, etc. , y por técnicas de medición (espectrofotometría, volumetría, colorimetría, potenciometría, etc.) que permiten medir la respuesta del analito en la muestra. A esta técnica se le denomina Sistema de Medición. En función de la naturaleza del sistema de medición: a) Métodos en los cuales el instrumento de medición de la respuesta analítica, permite medir una señal de ruido (cromatógrafo de líquidos y de gases, espectrofotómetros, etc.) b) Métodos en los cuales el instrumento de medición no permite medir una señal de ruido (buretas, medidor de halos, potenciómetros, etc.)
PARÁMETROS DE DESEMPEÑO: En función de la aplicación analítica de un método, se indican los parámetros de desempeño a estudiar. PRUEBAS DE IMPUREZAS PARÁMETRO DE DESEMPEÑO PRECISIÓN/ ADECUABILIDAD DEL SISTEMA LINEALIDAD DEL SISTEMA ESPECIFICIDAD2 EXACTITUD Y REPETIBILIDAD LINEALIDAD DEL MÉTODO PRESICIÓN DEL MÉTODO O PRECISIÓN INTERMEDIA2 ESTABILIDAD ANALÍTICA2 DE LA MUESTRA LIMITE DE DETECCION LIMITE DE CUANTIFICACION ROBUSTEZ TOLERANCIA
CONTENIDO/ CONTENIDO/ POTENCIA / VALORACIÓN VALORACIÓN SÍ SÍ
LIMITE
IDENTIFICACIÓN
SÍ
*
SÍ SÍ SÍ SÍ SÍ
SÍ SÍ SÍ SÍ SÍ
NO SÍ NO NO NO
NO SÍ NO NO NO
*
*
NO
NO
NO NO * *
NO SÍ * *
SÍ NO * *
NO NO NO NO
*Puede ser requerido dependiendo de la naturaleza del método. 1. La falta de especificidad de un método analítico, puede ser compensada por otra alternativa analítica de soporte, como por ejemplo cromatografía de capa fina. 2. También es definido como un estudio de tolerancia. 3. Un método que es exacto y lineal, por definición es específico al placebo analítico o a los otros componentes de la muestra. DETERMINACIONES, METODOLOGÍA Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:
Precisión del Sistema: Metodología.- Preparar por lo menos un sextuplicado de soluciones a la concentración del analito que represente la concentración de la solución de referencia utilizada o en ciertos casos, la concentración que represente el 100% de la muestra procesada para su medición; preparadas por dilución o por pesadas independientes. Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones. Calcular S y CV de la respuesta analítica; Criterios de aceptación: CV 1.5% para métodos físico-químicos CV 3% para métodos biológicos Valores superiores u otro criterio de aceptación deben ser justificados. Las formulas y el procedimiento se encuentra en el anexo 1.
Adecuabilidad del sistema (Métodos cromatográficos): Metodología.- Inyectar por quintuplicado la solución de adecuabilidad, reportar la respuesta del analito, calcular el CV y para cada inyección: Factor capacidad (K’), resolución (si procede, R), retención relativa (si procede, Rr), factor de coleo (T), número de platos teóricos (N).
Criterios de aceptación: CV 2% para respuesta analítica. Valores superiores deben ser justificados. Para cada inyección, se recomienda: K’>2 ; R>2 ; T<2 Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 2. La evaluación de adecuabilidad del sistema permite verificar que el sistema de medición funcione adecuadamente, independiente de las condiciones ambientales. Antes de la validación del método analítico deben establecerse los criterios para la operación del sistema para ser evaluados en la validación y verificados de manera rutinaria al emplear el método analítico. Por ejemplo en el caso de método volumétricos, el volumen de la titulación de blancos y/o de un volumen específico de la solución de referencia; en el caso de métodos fotométricos la lectura de soluciones blanco.
Linealidad del sistema: Metodología.- Preparar por lo menos por triplicado 5 niveles de concentración (intervalo) de la solución de referencia ya sea por dilución o por pesadas independientes. La concentración central debe ser igual a la que se prepara la solución de referencia en el método o la que represente el 100% en la muestra procesada para su medición. Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones de medición, reportar la relación concentración vs respuesta analítica. Calcular b1, b0, r2, IC(1). El intervalo esta en función del propósito del método y se expresa como % de la concentración de la solución de referencia o en función del contenido del analito en la muestra. Para contenido/potencia/valoración se sugiere un mínimo de 20% Para contenido/valoración de impurezas desde un nivel apropiado hasta un 20% por arriba de la especificación. Para métodos indicadores de estabilidad desde un nivel apropiado hasta un 120% Es critico que el intervalo no excluya valores de concentración que potencialmente puedan dar lugar al contenido del analito en la muestra. Criterios de aceptación: r2 0.98 IC(1), no debe incluir el cero Otro criterio de aceptación debe ser justificado.
Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 3. Es conveniente trazar la gráfica de la concentración (x) vs la respuesta analítica (y), incluyendo en ella la ecuación, línea de ajuste y el coeficiente de determinación.
Especificidad: Metodología.- Establecer las posibles sustancias interferentes y adicionar cantidades conocidas de éstas, solas o combinadas a la muestra y evaluar su respuesta bajo las mismas condiciones de análisis. En métodos de identificación seleccionar sustancias que potencialmente interfieran en la determinación con base en la estructura del analito. Para métodos de contenido/ potencia/ valoración, se analizan placebos del producto y cuando proceda sustancias relacionadas, precursores, homólogos y una mezcla de ellos con el producto. Para métodos de contenido/ valoración de impurezas, se adicionan éstas al analito en niveles que incluya la especificación. Cuando no se dispone de las impurezas, el analito se somete a condiciones que generen su inestabilidad química y aplicar el método. Para métodos de límite de impurezas se analizaran las muestras de impurezas individualmente, el producto y la mezcla de éstos. Para métodos indicadores de inestabilidad, si se cuenta con los productos de degradación, preparar muestras con placebos adicionado de éstos, el placebo adicionado de analito, el placebo adicionado de analito y productos de degradación y se analizan con el método. Si no se cuenta con los productos de degradación se puede favorecer la inestabilidad del analito en la muestra: 1) Someter el analito, el placebo y la muestra a temperaturas de 20°C por debajo del punto de fusión del analito de 2 a 4 semanas. 2) Exponer el analito, placebo y muestra a luz UV, fluorescente y/o humedad relativa. 3) Hacer soluciones del analito, ajustando el pH de 1 a 2 y/o de 10 a 12 y someterlas a 60°C – 80°C. 4) Adicionar peróxido de hidrógeno para favorecer la oxidación del analito. El tiempo y las condiciones se seleccionan con el fin de degradar al analito a niveles del 15 al 30%. Estos estudios no se realizan en analitos con propiedades reactivas. Para métodos no selectivos, la especificidad se sustenta con los resultados de exactitud y linealidad, si el método cumple con los criterios de aceptación. Criterios de aceptación:
La respuesta del método solo se deberá al analito.
Exactitud y Repetibilidad del método: Metodología: A)Conociendo los componentes de la muestra se preparará el placebo analítico. A la cantidad de placebo analito equivalente a una muestra analítica por sextuplicado, se adicionara la cantidad de analito correspondiente al 100% de este en la muestra. Seleccionar dos niveles superior e inferior de la cantidad por sextuplicado, se adicionara la cantidad de analito correspondiente al 100% de este en la muestra. El mismo analista analizara los placebos adicionados utilizando de referencia la sustancia empleada en la adición al placebo analítico en las mismas condiciones. Determinar la cantidad recuperada del analito. B)Si no se conocen los componentes de la muestra, con el método se determina el contenido del analito y se preparan 6 muestras adicionadas del analito hasta completar el 100% de éste en la muestra. Las muestras adicionadas se analizan usando como referencia la sustancia empleada en la adición de la muestra. Determinar la cantidad recuperada del analito. La adición del analito debe ser en las primeras etapas del método. Calcular el porcentaje de recobro de cada placebo analítico, al obtener el cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje. Calcular ŷ, S, CV e IC() del porcentaje de recobro. Criterios de aceptación:
IC() debe incluir el 100% o que el promedio aritmético del % de recobro se incluya en el intervalo: 98-102% método cromatográfico 98-102% método volumétrico 97-103% método químico o espectrofotométrico 95-105% método microbiológico CV del porcentaje de recobro: No mayor de 2% en método cromatográfico No mayor de 2% en método volumétrico No mayor de 3% en método químico o espectrofotométrico No mayor de 5% en método microbiológico No mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la muestra. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 4. Linealidad del método: Metodología: A) Conociendo los componentes de la muestra se preparará el placebo analítico. A la cantidad de placebo analito equivalente a una muestra analítica por
triplicado, se adicionara la cantidad de analito correspondiente al 100% de este en la muestra. Seleccionar dos niveles superior e inferior de la cantidad del analito (intervalo) y preparar el placebo adicionado por triplicado a cada nivel manteniendo constante la cantidad de placebo analítico en los tres niveles. El mismo analista analizara los placebos adicionados utilizando de referencia la sustancia empleada en la adición al placebo analítico en las mismas condiciones. Determinar la cantidad recuperada del analito. B) Si no se conocen los componentes de la muestra, con el método se determina el contenido del analito y se preparan 3 muestras adicionadas del analito hasta completar el 100% de éste en la muestra. Seleccionar dos niveles superior e inferior de la cantidad del analito (intervalo) y preparar la muestra adicionada por triplicado a cada nivel manteniendo constante la cantidad de muestra en los tres niveles Las muestras adicionadas se analizan usando como referencia la sustancia empleada en la adición de la muestra. Determinar la cantidad recuperada del analito. La adición del analito debe ser en las primeras etapas del método. El intervalo de la concentración del analito adicionado depende del propósito del método y debe incluir la especificación. La siguiente tabla sugiere intervalos para el estudio de linealidad, en la cual la especificación se maneja como porcentaje, por ejemplo el 100% puede representar 100mg/g de muestra, 10ppm, 5mg/ml, etc. PROPÓSITO CONTENIDO/ POTENCIA/ VALORACIÓN
ESPECIFICACIÓN LÍMITE INFERIOR (LI) LIMITE SUPERIOR (LS)
INTERVALO MÍNIMO LI –10% A LS +10%
EJEMPLO VALORACIÓN
90% - 110%
80% a 120% Por lo tanto los niveles podrían Ser 80%, 100% y 120%
UNIFORMIDAD DE DOSIS
75% - 125%
60% a 140% Por lo tanto los niveles podrían Ser 60%, 100% y 140%
DISOLUCIÓN
Q = 75% 40% a 130% En el caso conservador de llegar Por lo tanto a los niveles podrían tercera etapa, ninguna unidad es menor Ser 40%, a 100% y 130% Q –25%
CONTENIDO/ VALORACIÓN PARA PRUEBAS DE IMPUREZAS
LIMITE SUPERIOR (LS)
LS – 20% a LS +20%
EJEMPLO Sustancias Relacionadas
80% a 120% No debe contener más de 100% Por lo tanto los niveles podrían Ser 80%, 100% y 120%
Reportar la relación cantidad adicionada vs cantidad recuperada. Utilizar el método de estimación por mínimos cuadrados y calcular b1, b0, r2, IC(1), IC(0) y CVy/x. Calcular el porcentaje de recobro de cada placebo o muestra adicionada al obtener el cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje. Calcular ŷ, S, CV, IC() del porcentaje de recobro. Criterios de aceptación:
1) Cantidad adicionada vs cantidad recuperada: r2 > 0.98 El IC(1) debe incluir la unidad
El IC(0) debe incluir el cero El CVy/x del porcentaje de recobro: No mayor de 2% en método es cromatográfico No mayor de 2% en método volumétrico No mayor de 3% en método químico o espectrofotométrico No mayor de 5% en método microbiológico No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del analito en la muestra. 2) Porcentaje de recobro: El IC() debe incluir el 100% o el promedio aritmético del % de recobro se incluya en el intervalo: 98-102% método cromatográfico 98-102% método volumétrico 97-103% método químico o espectrofotométrico 95-105% método microbiológico CV del porcentaje de recobro: No mayor de 2% en método cromatográfico No mayor de 2% en método volumétrico No mayor de 3% en método químico o espectrofotométrico No mayor de 5% en método microbiológico No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del analito en la muestra. Otro criterio de aceptación debe ser justificado. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 5. Es conveniente trazar la gráfica de la cantidad adicionada (x) vs la cantidad recuperada (y), incluyendo en ella la ecuación, línea de ajuste y el coeficiente de determinación.
Precisión del Método (Precisión Intermedia o Tolerancia interdía / analista): Metodología.- Analizar por triplicado una muestra homogénea del producto que tenga un nivel cercano o igual al 100% (para contenido/potencia/valoración) o una muestra cuyo contenido este incluido en el intervalo lineal de concentración de linealidad de método (para impurezas) en dos días diferentes y por dos analistas diferentes. Reportar el contenido/potencia/valoración del analito de todas las muestras. Calcular ŷ, S, CV del contenido/potencia/valoración, utilizando todos los resultados obtenidos. Criterios de aceptación: CV 2% para métodos cromatográficos y volumétricos
CV 3% para métodos químicos o espectrofotométricos CV 5% para métodos biológicos No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del analito en la muestra. Valores superiores deben ser justificados. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 6. Los resultados pueden ser analizados utilizando otros métodos estadísticos apropiados que permitan sustentar que la precisión del método es aceptable. Puede ser utilizado un modelo estadístico lineal de diseño experimental ya que es de utilidad cuando se quiere determinar el grado de tolerancia del método a fuentes de variación como estimar la variabilidad entre analistas o entre días.
Estabilidad Analítica de la Muestra: Metodología.- Establecer la etapa de análisis en la cual se desea evaluar la estabilidad, determinar si en dicha etapa es posible fraccionar (muestras dependientes) o no (muestras independientes) y las condiciones de almacenaje. En muestras dependientes, determinar la estabilidad analítica procesando hasta la etapa preestablecida por triplicado una muestra homogénea, fraccionar cada preparación de acuerdo a las condiciones de almacenaje de interés. Terminar el análisis de una de las fracciones de cada preparación (contenido/potencia/valoración), seguir el análisis de cada una de las fracciones al término de cada condición de almacenaje utilizando una solución de referencia recientemente preparada. Reportar el contenido/potencia/valoración de cada fracción. En muestras independientes, determinar la estabilidad analítica a partir de una muestra homogénea, analizando por triplicado (contenido/potencia/valoración inicial). Simultáneamente y de la misma muestra, procesar el número de muestras necesarias para cada condición de almacenaje hasta la etapa preestablecida (preparaciones) por triplicado, seguir el análisis de cada una de las preparaciones al término de cada condición de almacenaje utilizando una solución de referencia recientemente preparada. Reportar el contenido/potencia/valoración de cada preparación. Calcular ŷ0, ŷ1, di.
Criterios de aceptación: di 2% métodos cromatográficos y volumétricos di 3% para métodos químicos o espectrofotométricos di 5% para métodos biológicos No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del analito en la muestra.
Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 7. Los resultados pueden ser analizados con otros métodos estadísticos como la distribución t de Dunnett.
Límite de Detección: 1)LD con base en señal de Ruido: Metodología.- Se aplica en métodos que utilizan instrumentos para medir la respuesta analítica y presentan una señal de ruido basal. Determinar la respuesta de blancos (reactivos. Placebos analíticos, etc.) y la respuesta de muestras analíticas (analitos, placebos adicionados, etc.) en un intervalo del analito que incluya la especificación de la prueba de impureza limite. Determinar la cantidad del analito que genere una respuesta con respecto al blanco en una proporción de 3 a 1, lo que corresponde a la concentración asociada al limite de detección. Criterios de aceptación: El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas limite. 2)LD con base en curva de calibración y desviación estándar de los blancos: Metodología.Se aplica tanto a métodos instrumentales como no instrumentales. Preparar 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos, etc.) a valores menores o que incluya la especificación de la prueba de impurezas limite, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Simultáneamente preparar 5 blancos. Medir las respuestas analíticas. Para la curva de calibración, sin incluir los blancos, calcular b1, r2 e IC(1). Para los blancos, calcular Sb de los blancos. Calcular el límite de detección: LD=(3.3 Sb) /b1 El valor estimado LD debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal de ruido.
Criterios de aceptación: r2 0.98 IC(1), no debe incluir el cero. El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas limite. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. 3)LD con base en la curva de calibración y la desviación estándar de regresión:
Metodología.Se aplica tanto a métodos instrumentales como no instrumentales. Preparar 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos, etc.) a valores menores o que incluya la especificación de la prueba de impurezas limite, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular b1, r2, Sy/x, IC(1). Calcular el límite de detección: LD=(3.3 Sy/x) /b1 El valor estimado LD debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal de ruido. Criterios de aceptación: r2 0.98 IC(1), no debe incluir el cero. El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas limite. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. 4)LD con base en la curva de calibración y la desviación estándar de la ordenada al origen: Metodología.Se aplica tanto a métodos instrumentales como no instrumentales. Preparar 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos, etc.) a valores menores o que incluya la especificación de la prueba de impurezas limite, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular b1, r2, Sbo, IC(1). Calcular el límite de detección: LD=(3.3 Sbo) /b1
El valor estimado LD debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal de ruido. Criterios de aceptación: r2 0.98 IC(1), no debe incluir el cero. El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas limite. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 8. Limite de cuantificación: 1)Señal de Ruido: Metodología.- Se aplica en métodos que utilizan instrumentos para medir la respuesta analítica y presentan una señal de ruido basal. Determinar la señal de blancos (reactivos. Placebos analíticos, etc.) y la señal de muestras analíticas (analitos, placebos adicionados, etc.) a concentraciones conocidas del analito, inferiores o que incluya la especificación del contenido / valoración de la prueba de impurezas. Determinar la cantidad del analito cuya
señal sea similar o mayor al blanco en una proporción de 10 a 1, lo que corresponde a la concentración asociada al limite de detección. Verificar que dicha cantidad corresponda al limite de cuantificación, evaluando la exactitud y Repetibilidad del valor estimado. Criterios de aceptación: El LC debe ser menor a la especificación del contenido/ valoración de la prueba de impurezas. 2)LC con base en curva de calibración y desviación estándar de los blancos: Metodología.Se aplica tanto a métodos instrumentales como no instrumentales. Preparar 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos, etc.) a valores menores o que incluya la especificación de contenido/ valoración de la prueba de impurezas, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Simultáneamente, preparar 5 blancos. Medir las respuestas analíticas. Calcular b1, r2 e IC(1). Para los blancos, calcular Sb de los blancos. Calcular el límite de cuantificación: LD=(10 Sb) /b1 Evaluar la exactitud y Repetibilidad del valor estimado del limite de cuantificación. Criterio de aceptación: r2 0.98 IC(1), no debe incluir el cero. El LC debe ser menor a la especificación del contenido/ valoración de la prueba de impurezas. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. 3)LC con base en la curva de calibración en la desviación estándar de regresión: Metodología.Se aplica tanto a métodos instrumentales como no instrumentales. Preparar 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos, etc.) a valores menores o que incluya la especificación de contenido/ valoración de la prueba de impurezas, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular b1, r2, Sy/x, IC(1). Calcular el límite de cuantificación: LC=(10 Sy/x) /b1 Evaluar la exactitud y Repetibilidad del valor estimado del limite de cuantificación. Criterios de aceptación:
r2 0.98 IC(1), no debe incluir el cero. El LC debe ser menor a la especificación del contenido/ valoración de la prueba de impurezas. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. 4)LC con base en la curva de calibración y la desviación estándar de la ordenada al origen: Metodología.Se aplica tanto a métodos instrumentales como no instrumentales. Preparar 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos, etc.) a valores menores o que incluya la especificación de contenido/ valoración de la prueba de impurezas, ya sea por dilución o pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular b1, r2, Sbo, IC(1). Calcular el límite de cuantificación: LC=(3.3 Sbo) /b1 Evaluar la exactitud y Repetibilidad del valor estimado del limite de cuantificación. Criterios de aceptación: r2 0.98 IC(1), no debe incluir el cero. El LC debe ser menor a la especificación del contenido/ valoración de la prueba de impurezas. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 9.
Robustez: Metodología.- Establecer los factores instrumentales (temperatura y presión de la columna) y/o no instrumentales (pH de fases) relacionados al método y sean críticos. En condiciones normales y distintas de operación, analizar la muestra por triplicado. Reportar el contenido/potencia/valoración del analito en la muestra de condiciones normal y distintas, expresadas como %. Calcular ŷ0, ŷ1, di. Criterios de aceptación: di 2% métodos cromatográficos y volumétricos di 3% para métodos químicos o espectrofotométricos di 5% para métodos biológicos No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del analito en la muestra. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 10.
Los resultados pueden ser analizados con otros métodos estadísticos como la distribución t de Dunnett (para 3 o más condiciones) o t de Student (para 2 condiciones), incluyendo la condición normal.
Tolerancia: Metodología.- Establecer los factores ajenos al equipo (diferentes equipos, lotes de reactivos) que se presentan al reproducir el método en otras condiciones de uso. Fijar 2 condiciones de uso y analizar la muestra por triplicado a cada condición. Reportar el contenido/potencia/valoración del analito en todas las muestras. Calcular y, S y CV del contenido/potencia/valoración. Criterios de aceptación: CV 2% métodos cromatográficos y volumétricos CV 3% para métodos químicos o espectrofotométricos CV 5% para métodos biológicos No mayor a una magnitud preestablecida acore a la especificación del analito en la muestra. Cualquier otro criterio de aceptación deberá ser justificado. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 11. Los resultados pueden ser analizados con otros métodos estadísticos. Uno de ellos es aplicar un análisis de varianza con un criterio de clasificación para determinar si al menos una de las condiciones de uso es diferente, si se concluye que si, se realiza una prueba estadística de comparaciones múltiples para identificar aquellas condiciones que dan lugar a resultados diferentes.
SUSTANCIAS DE REFERENCIA: Las sustancias de referencia constituyen un componente propio del método y una herramienta en la evaluación de los parámetros de desempeño, lo que permite establecer la confiabilidad de la metodología. Para su adquisición se debe contar con procedimientos para su manejo y aplicación, así como registros del uso y con la documentación que avale una buena práctica de manejo de dichas sustancias.
Manejo.- Cada sustancia de referencia debe almacenarse, manejarse y utilizarse de acuerdo con las especificaciones correspondientes. Cualquier condición especial de almacenamiento debe indicarse en el marbete y (o) certificado analítico. Todas las sustancias deben contar con su identificación y registro, teniendo como mínimo las siguientes: Para sustancias de referencia primarias: A) Nombre de la sustancia de referencia, B) Cantidad,, C) Lote del producto, D) Clave (para uso interno) E) Fecha de adquisición, F) Pureza (potencia),
G) Fecha de caducidad H) Riesgo potencial de manejo, e I ) Indicaciones especiales. Para sustancias de referencia secundaria: A) Nombre de la sustancia de referencia, B) Cantidad certificada, C) Lote interno, D) Clave, E) Fecha de certificación, y F) Potencia en relación con la sustancia de referencia. La información mínima para su registro es: A) Nombre, B) Lote, C) Clave de identificación interna, D) Procedencia (USP, BP, COSUFAR, etc.), E) Fecha de adquisición, F) Fecha de empleo, G) Uso, H) Cantidad empleada, I) Cantidad remanente, J) Analista que la utiliza, y K) Caducidad Para las sustancias de referencia secundaria, conviene además: A) Nombre, B) Lote, C) Cálculos para obtener la potencia, D) Gráficas, E) Certificado de análisis del material En la validación de métodos, estos registros son críticos. Se debe contar con lineamientos que aseguren la no-utilización de sustancias de referencia caducas.
Tratamiento: Cualquier tratamiento previo al que deba someterse la sustancia de referencia lo debe contemplar la propia metodología, o en su caso, debe especificarse en su marbete. Si la sustancia de referencia debe secarse antes de utilizarse, se deberán seguir las instrucciones de la etiqueta o certificado de análisis; se realizará en otro envase al original y el excedente se desechará.
Procedencia: Algunos centros especializados que proveen sustancias de referencia son: *British Pharmacopoeia (BP), European Pharmacopoeia (EP) *European Pharmacopoeia Chemical Refernce Substances (EPCRS), *Comité de Sustancias Farmacéuticas de Referencia (COSUFAR) *Organización Mundial de la Salud (OMS) *Secretaría de Salud (SSA), y
*United States Pharmacopeia (USP) REVALIDACIÓN: Se deben establecer y justificar criterios apropiados para revalidación de métodos analíticos, así como mantener un control de cambios. Cualquier cambio crítico a un método analítico da lugar a uno nuevo y por lo tanto requiere de una validación como tal. La siguiente tabla establece cambios en el método, su impacto y el parámetro de desempeño a revalidar: CAMBIO DISPOSITIVO DE MEDICIÓN DEL INSTRUMENTO DE MEDICIÓN CONCENTRACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE REFERENCIA FORMULACIÓN DEL PRODUCTO
EQUIPOS PROVEEDOR DE COLUMNAS
IMPACTA VARIACIÓN EN SISTEMA DE MEDICIÓN
PARÁMETRO A REVALIDAR PRECISIÓN DEL SISTEMA ADECUABILIDAD DEL SISTEMA
EXACTITUD DEL MÉTODO
LINEALIDAD DEL SISTEMA Y EXACTITUD DEL MÉTODO EXACTITUD Y REPETIBILIDAD DEL MÉTODO LINEALIDAD DEL MÉTODO ESPECIFICIDAD TOLERANCIA TOLERANCIA
EXACTITUD DEL MÉTODO
VARIACIÓN DEL MÉTODO VARIACIÓN DEL MÉTODO
COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS: Cuando se quieren comparar 2 métodos para aplicaciones de contenido/potencia/valoración, se emplean los siguientes procedimientos:
Estudio de Comparación de Parámetros de Desempeño: Se utiliza cuando los dos métodos han sido validados y se quiere comparar sus parámetros de desempeño. En función a su aplicación analítica se indican los parámetros de desempeño a estudiar: CAMBIO
PARÁMETROS DE DESEMPEÑO
CONTENIDO/POTENCIA/VALORACIÓN PARÁMETRO A REVALIDAR ESPECIFICIDAD EXACTITUD Y REPETIBILIDAD LINEALIDAD DEL MÉTODO PRECISION DEL MÉTODO O PRECISIÓN INTERMEDIA
Los parámetros analíticos a comparar, así como los criterios para establecer la igualdad de dichos parámetros, son los siguientes:
1) Especificidad: Debe cumplir para cada método analítico, demostrando su especificidad o exactitud. 2) Repetibilidad en exactitud: Metodología.- De los datos de exactitud y Repetibilidad utilizar la información del porcentaje de recobro. Calcular S2 del porcentaje de recobro de cada método.
Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la razón de varianzas, debe incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación deberá justificarse. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 12. 3) Repetibilidad en Linealidad del Método: Metodología.- De los datos de linealidad del método, utilizar la información del porcentaje de recobro. Calcular la S2 del porcentaje de recobro de cada método. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la razón de varianzas, debe incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación deberá justificarse. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 13. 4)Exactitud: Metodología.- De los datos de exactitud y Repetibilidad, utilizar la información del porcentaje de recobro. Calcular la S2, ŷ del porcentaje de recobro de cada método. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la diferencia de las 2 medias poblacionales del porcentaje de recobro, debe incluir el valor de cero. Cualquier otro criterio de aceptación deberá justificarse. El análisis estadístico de los resultados, presenta 2 situaciones: a)Los métodos tienen la misma Repetibilidad (varianzas iguales) b)Los métodos tienen diferente Repetibilidad (varianzas diferentes); por lo tanto se tiene que realizar el estudio de comparación de Repetibilidad de ambos métodos. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 14. 5) Linealidad del Método: Metodología.- De los datos de linealidad utilizar la información del porcentaje de recobro así como la cantidad adicionada y la cantidad recuperada de cada método. Calcular la Criterios de aceptación: Anexo 15. 6) Precisión del Método: Metodología.- De los datos de precisión del método, utilizar la información del contenido/potencia/valoración del analito de cada método. Calcular S21 y S22. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la razón de varianzas, debe incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación deberá justificarse. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo16.
Estudio de Correlación: Se utiliza cuando se comparan dos métodos cuyos resultados se expresan en unidades diferentes. Se aplica a métodos de contenido/valoración/potencia y los parámetros a evaluar son: 1) Proporcionalidad:
No necesariamente establecen equivalencia de resultados, sino proporcionalidad, ya que en muchas ocasiones la respuesta analítica es diferente. a) Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar un placebo analítico. Metodología.-Preparar una cantidad suficiente de placebo analítico con los componentes que están comúnmente en la muestra, de tal modo que pueda ser analizado por ambos métodos en tres diferentes niveles del analito, que incluya la especificación. Del placebo analítico preparado adicionarle analito al nivel inferior. Fraccionar en tres muestras y analizar cada muestra por ambos métodos bajo las mismas condiciones de cada método para determinar el contenido/valoración/potencia. Repetir este procedimiento con el nivel del 100% superior. Reportar la relación contenido/valoración/potencia de cada método en cada muestra del método a comparar (y), método de referencia (x). Calcular b1, b0, r2, IC(1), CVy/x. b) No se conocen los componentes de la muestra. Metodología.- Seleccionar 9 muestras del producto cuyo nivel del analito cumpla con la especificación, fijar una etapa de los métodos analíticos en los cuales transfiera una mayor o menor cantidad e la muestra con el objeto de poder variar el nivel del analito. Tener 3 muestras con nivel bajo, 3 niveles correspondientes al 100% y 3 con un nivel alto del analito. Las 9 muestras se analizan por ambos métodos en las mismas condiciones analíticas de cada método. Determinar el contenido/valoración/potencia de cada muestra. Reportar la relación contenido/valoración/potencia del método a comparar (y), el método de referencia (x). Calcular b1, b0, r2, IC(1), CVy/x. Criterios de aceptación: El IC(1) no debe incluir el cero. Cualquier otro criterio de aceptación deberá justificarse. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo17. 2) Precisión: El método no oficial deberá tener una precisión igual a mejor que el método oficial, o que su precisión sea aceptable para la aplicación analítica. Inicialmente se debe establecer el método de referencia y el método a comparar. Metodología.-Tanto con el método de referencia como el método a comparar, dos analistas en dos días deben analizar por triplicado muestras independientes (pesadas o alícuotas) de un lote homogéneo de producto, cuyo nivel de analito esté incluido dentro de la especificación. Reportar el contenido/potencia/valoración del analito de todas las muestras en % para ambos métodos. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza unilateral inferior, para la razón de varianzas del método a comparar respecto del método de referencia, no debe exceder el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación deberá justificarse. Las formulas y el procedimiento se encuentran en el anexo 18.
DOCUMENTACIÓN: Las actividades de la validación de un método analítico deben ser sustentadas por los siguientes documentos: a) Protocolo, cuyo contenido es: 1. Titulo 2. Propósito u Objetivo, 3. Responsabilidades, 4. Plan de prueba describiendo los parámetros de desempeño que permitan verificar la aplicación analítica deseada, 5. Criterios de aceptación para cada parámetro, 6. Formato de registro de resultados. b) Reporte, cuyo contenido es: 1. Titulo, 2. Resultados, 3. Análisis de resultados, 4. Confrontación contra los criterios de aceptación, 5. Conclusión Es crítico documentar los registros analíticos; dicha documentación deberá estar ordenada y disponible, en responsabilidad del área de calidad. CONCORDANCIA CON GUIAS INTERNACIONALES: Esta guía es equivalente a: Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures ICH-Q2Q, March 1995 Guideline on the Validation of Analytical Procedures, Methodology, Availability. Notice ICHQ2B. USP24. Validation of Compendial Methods. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods CDER. November 1994, CMC 3.
BIBLIOGRAFIA: Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 7a Ed. México (2000). Métodos Analíticos Validación Guías Generales de Validación de la DGCIS, SSA (1989). Ley General de Salud (1997) NMX-CC-1-1990 Sistemas de Calidad Vocabulario
NMX-CC-2-1990 Sistemas de Calidad- Gestión de Calidad, Guía para la Selección, el Uso de Normas de Aseguramiento de Calidad. Reglamento de Insumos para la Salud (1998). Norma Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-1993. Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos. NOM-177-SSA1-1998 “Que establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable” Guidance for Industry Bioanalytical methods Validation for Human Studies, December, 1998 FDA. Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures ICH-Q2A, March 1995. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods, CDER, November 1994, CMC 3. Guideline for Industry Analytical Procedures and Methods Validation, August 2000, FDA. Guideline for submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation, February 1987, FDA. ICH Harmonised Tripartile Guideline Validation Analytical Procedures Methodology 6 Nov 1996. USP24, Validation of Compendial Methods. Norma Oficial Mexicana NOM-073-SSA1-1993, Estabilidad de medicamentos. Diseño y Análisis de Experimentos, Montgomery D. C., Grupo Editorial Iberoamérica, 3ª Ed. México (1991).
ANEXOS:
NUMERO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
18 19 20 21
ANEXO 1.
CONTENIDO FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISIÓN DEL SISTEMA FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA ADECUABILIDAD DEL SISTEMA FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA EXACTITUD Y Repetibilidad DEL MÉTODO FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LINEALIDAD DEL MÉTODO FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISION DEL MÉTODO (PRECISIÓN INTERMEDIA) FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA ESTABILIDAD ANALÍTICA DE LA MUESTRA FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LIMITE DE DETECCIÓN FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LIMITE DE CUANTIFICACION FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA ROBUSTEZ FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA TOLERANCIA FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA REPETIBILIDAD Y EXACTITUD PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA REPETIBILIDAD EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN EXACTITUD PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN PRECISIÓN DEL MÉTODO PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PROPORCIONALIDAD DE MÉTODOS EN ESTUDIOS DE CORRELACIÓN PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS FORMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISIÓN DEL MÉTODO EN ESTUDIO DE CORRELACIÓN PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS TABLA ESTADÍSTICA DE LA DISTRIBUCIÓN t DE Student TABLAS ESTADÍSTICAS DE LA DISTRIBUCIÓN F DE FISHER COMENTARIOS RESPECTO A LOS CÁLCULOS Y REGLAS DE REDONDEO
FÓRMULAS Y PROCEDIMEITN O DE CÁLCULO PARA PRECISIÓN DEL SISTEMA. A)FORMULAS: Media Aritmética
y
y n
Desviación Estándar
S
n y 2 y 2 nn 1
Coeficiente de variación
CV
S *100 y
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n. Calcular ŷ y S Calcular el CV
ANEXO 2.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO ADECUABILIDAD DEL SISTEMA. A)FORMULAS: Media Aritmética
y
DE
CALCULO
PARA
y n
Desviación estándar
S
n y 2 y 2 nn 1
Coeficiente de variación
CV
S *100 y
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n. Calcular ŷ y S Calcular el CV ANEXO 3.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA. A)FORMULAS: Pendiente
b1
n xy x y n x 2 x 2
Ordenada al origen b0
y b x 1
n Coeficiente de determinación n xy x y 2 r2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb1 1 Sb1 Sy / x x 2 x2 n
Sy / x
y 2 b xy b y 1
o
n2 t0.975, n-2 = Referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student. B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, b0, r2 Calcular el Sy/x y Sb’ Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1)
ANEXO 4.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA EXACTITUD Y REPETIBILIDAD DEL MÉTODO. A)FORMULAS: Media aritmética y y n Desviación estándar
S
n y 2 y 2 nn 1
Coeficiente de variación
S *100 y Intervalo de confianza para la media poblacional CV
S n Referirse al anexo 19 para determinar el valor de t de
IC ( μ ) y t 0.975, n 1 t0.975, n-1 Student n = numero de recobros.
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n. Calcular ŷ y S Calcular el CV Determinar en el anexo 19 t0.975, n-1 y calcular IC()
ANEXO 5.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LINEALIDAD DEL MÉTODO. 5.1 CANTIDAD ADICIONADA VS CANTIDAD RECUPERADA A)FORMULAS: Pendiente n xy x y b1 n x 2 x 2 Ordenada al origen y b1 x b0 n Coeficiente de determinación
r2
n xy x y 2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb’ 1 Sb ' Sy / x x 2 x2 n Sy / x
y 2 b xy b y 1
o
n2 t0.975, n-2 = Referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student.
Intervalo de confianza para la ordenada al origen IC(o) = bo t0.975,n-2Sbo
Sbo Sy / x
x
1 n
x 2
x2
x 2 n
x
n Coeficiente de variación de regresión
CVy / x
y
Sy / x 100 y
y n
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, b0, r2 Calcular el Sy/x y Sb’ Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) Calcular x y Sbo Calcular IC(b0) Calcular el CVy/x 5.2 PORCENTAJE DE RECOBRO A)FORMULAS: Media aritmética y y n Desviación estándar
S
n y 2 y 2 nn 1
Coeficiente de variación
S *100 y Intervalo de confianza para la media poblacional CV
IC ( μ ) y t 0.975, n 1 B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n.
S n
Calcular ŷ y S Calcular el CV Determinar en el anexo 19 t0.975, n-1 y calcular IC()
ANEXO 6.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISIÓN DEL MÉTODO (PRECISIÓN INTERMEDIA). A)FORMULAS: Media aritmética y y n Desviación estándar
S
n y 2 y 2 nn 1
Coeficiente de variación
CV
S *100 y
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n. Calcular ŷ y S Calcular el CV
ANEXO 7.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE ESTABILIDAD ANALÍTICA DE LA MUESTRA. A)FORMULAS: Media aritmética del análisis inicial y0
y
y1
y
CALCULO
PARA
0
no no = número de muestras del análisis inicial Media aritmética del análisis de cada condición de almacenaje 1
n1 n1 = número de muestras del análisis de la i-ésima condición de almacenaje Diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición de almacenaje respecto de la media aritmética del análisis inicial di y1 y 0
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y0, y1, y2, y3 y determinar no, n1, n2, n3 Calcular ŷo, ŷ1, ŷ2, ŷ3 Calcular di
ANEXO 8.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LIMITE DE DETECCIÓN. 8.1 SEÑAL RUIDO Tabular los resultados. 8.2 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADO EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS A)FORMULAS PARA LA CURVA DE CALIBRACIÓN: Pendiente n xy x y b1 n x 2 x 2 Coeficiente de determinación
r2
n xy x y 2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 Sy / x
x2 Sy / x
x 2 n
y 2 b xy b y 1
o
n2
b0
y b x 1
n Intervalo de confianza para la pendiente t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student
B)FORMULA PARA LOS BLANCOS Desviación estándar de los blancos
Sb
n y 2 y 2
nn 1 n = numero de blancos
C)FORMULA PARA EL LIMITE DE DETECCIÓN
LD
3.3 Sb b1
D)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACIÓN Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, r2 Calcular el Sy/x y Sb1, bo Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) E)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA LOS BLANCOS Tabular los resultados Calcular y, y2, y determinar n. Calcular Sb Calcular el LD 8.3 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADA EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REGRESIÓN A)FORMULAS Pendiente n xy x y b1 n x 2 x 2 Coeficiente de determinación
r2
n xy x y 2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 Sy / x
x2 Sy / x
x 2 n
y 2 b xy b y 1
n2
o
b0
y b x 1
n
t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student Limite de detección
LD
3.3 Sy / x b1
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, r2 Calcular el Sy/x y Sb’, bo Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) Calcular el limite de detección 8.4 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADO EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN A)FORMULAS Pendiente n xy x y b1 n x 2 x 2 Coeficiente de determinación
r2
n xy x y 2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 Sy / x
x2 Sy / x
x 2 n
y 2 b xy b y 1
o
n2
b0
y b x 1
n t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student
Desviación estándar de la ordenada al origen
1 n
Sbo Sy / x
x
x 2
x2
x 2 n
x n
Limite de detección
LD
3.3 Sbo b1
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, r2 Calcular el Sy/x y Sb’, bo Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) Calcular x y Sbo Calcular el LD
ANEXO 9.
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LIMITE DE CUANTIFICACIÓN. 9.1 SEÑAL RUIDO Tabular los resultados. 8.2 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADO EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS A)FORMULAS PARA LA CURVA DE CALIBRACIÓN: Pendiente n xy x y b1 n x 2 x 2 Coeficiente de determinación
r2
n xy x y 2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb1
Sb1 Sy / x
1
x2
x 2 n
y 2 b xy b y 1
Sy / x
o
n2
b0
y b x 1
n t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student
B)FORMULA PARA LOS BLANCOS Desviación estándar de los blancos
Sb
n y 2 y 2
nn 1 n = número de blancos
C)FORMULA PARA EL LIMITE DE CUANTIFICACIÓN
LC
10 Sb b1
D)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACIÓN Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, r2 Calcular el Sy/x y Sb’, bo Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) E)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA LOS BLANCOS Tabular los resultados Calcular y, y2, y determinar n. Calcular Sb Calcular el LC 9.3 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADA EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE REGRESIÓN A)FORMULAS Pendiente n xy x y b1 n x 2 x 2 Coeficiente de determinación
r2
n xy x y 2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 Sy / x
x2 Sy / x
x 2 n
y 2 b xy b y 1
o
n2
b0
y b x 1
n t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student
Limite de cuantificación
LC
10 Sy / x b1
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, r2 Calcular el Sy/x y Sb’, bo Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) Calcular el LC 9.4 CURVA DE CALIBRACIÓN BASADO EN LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN A)FORMULAS Pendiente n xy x y b1 n x 2 x 2 Coeficiente de determinación
r2
n xy x y 2 n x2 x2n y 2 y 2
Intervalo de confianza para la pendiente IC(1) = b1 t0.975,n-2Sb1
1
Sb1 Sy / x
x2 Sy / x
x 2 n
y 2 b xy b y 1
o
n2
b0
y b x 1
n t0.975, n-2= referirse al anexo 19 para determinar el valor de la t de Student
Desviación estándar de la ordenada al origen
Sbo Sy / x
1 n
x
x 2
x2
x 2 n
x n
Limite de cuantificación
LC
10 Sb b1
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO Tabular los resultados Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, r2 Calcular el Sy/x y Sb’, bo Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) Calcular x y Sbo Calcular el LC
ANEXO 10. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA ROBUSTEZ. A)FORMULAS: Media aritmética de la condición de operación. y0 yo n0 no = numero e muestras de la condición normal de operación Media aritmética del análisis de cada condición de operación diferente a la condición normal y1 y1 n1 n1 = numero de muestras de la i-esima condición de operación Diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición respecto de la media aritmética de la condición normal.
di y1 - y0 B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y0, y1, y2, y determinar no, n1, n2. Calcular ŷo, ŷ1, ŷ2. Calcular di
ANEXO 11. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO TOLERANCIA A)FORMULAS: Media aritmética y y n Desviación estándar
S
n y 2 y 2 nn 1
Coeficiente de variación
CV
S *100 y
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n.
DE
CALCULO
PARA
Calcular ŷ y S Calcular el CV
ANEXO 12. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA REPETIBILIDAD EN EXACTITUD PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS. A)FORMULAS: Varianza n y 2 y 2 S2 nn 1 Nota: Calcular la varianzas de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer. S12= varianza menor S22= varianza menor Intervalo de confianza para la razón de varianzas.
S 22 F 0.025, n 2 1, n1 1 σ 22 σ 12 S 12
S 22 F 0.975, n 2 1, n1 1 S 12
F0.025,n2-1, n1-1 y F0.975, n2-1, n1-1 = Referirse al anexo 20 para determinar el valor de la F de Fisher n2-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n1-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador. .n1 = numero de recobros del método de varianza menor .n2 = numero de recobros del método de varianza mayor B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n para cada método analítico Calcular la varianza de cada método Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S12) Determinar en el anexo 20 F0.025, n2-1, n1-1y F0.925, n2-1, n1-1 Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas. ANEXO 13. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO REPETIBILIDAD EN LINEALIDAD DEL MÉTODO COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS. A)FORMULAS: Varianza
S2
PARA PARA
n y 2 y 2 nn 1
Nota: Calcular la varianzas de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer. S12= varianza menor S22= varianza menor
Intervalo de confianza para la razón de varianzas.
S 22 F 0.025, n 2 1, n1 1 σ 22 σ 12 S 12
S 22 F 0.975, n 2 1, n1 1 S 12
F0.025,n2-1, n1-1 y F0.975, n2-1, n1-1 = Referirse al anexo 20 para determinar el valor de la F de Fisher n2-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n1-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador. .n1 = numero de recobros del método de varianza menor .n2 = numero de recobros del método de varianza mayor B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular el porcentaje de recobro de cada muestra en cada método (y), al obtener el cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje. Calcular Sy, Sy2 y determinar n para cada método analítico Calcular la varianza de cada método Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S12) Determinar en el anexo 20 F0.025 n2-1, n1-1y y F0.925, n2-1, n1-1y Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas.
ANEXO 14. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN EXACTITUD PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS. 14.1 COMPARACIÓN DE Repetibilidad DE AMBOS MÉTODOS: A)FORMULAS: Varianza
S2
n y 2 y 2 nn 1
Nota: Calcular la varianzas de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer. S12= varianza menor S22= varianza menor Intervalo de confianza para la razón de varianzas.
S 22 F 0.025, n 2 1, n1 1 σ 22 σ 12 S 12
S 22 F 0.975, n 2 1, n1 1 S 12
F0.025,n2-1, n1-1 y F0.975, n2-1, n1-1 = Referirse al anexo 20 para determinar el valor de la F de Fisher n2-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n1-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador. .n1 = numero de recobros del método de varianza menor .n2 = numero de recobros del método de varianza mayor
14.2 IGUAL REPETIBILIDA (VARIANZAS EQUIVALENTES): A)FORMULAS: Media aritmética del método 1.
y1
y
1
n1
Media aritmética del método 2.
y2
y
2
n2
Varianza del método 1.
S 12
n1 y12 y12 n1n1 1
Varianza del método 2.
S 22
n2 y 22 y 2 2
n2n 2 1 Intervalo de confianza para la diferencia de 2 medias poblacionales. IC μ 1 μ 2 y1 - y2 t 0.975n1 n 22
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n para cada método analítico Calcular la varianza de cada método Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S12) Determinar en el anexo 20 F0.025, n2-1, n1-1y F0.925, n2-1, n1-1 Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas. Tabular otra vez los resultados. Calcular y1, y2, y12, y22, y determinar n1 y n2. Calcular ŷ1, ŷ2 Calcular S12, S22 Determinar en el anexo 19 t0.975, n1+n2 y calcular IC(1-2) 14.3 DIFERENTE REPETIBILIDAD (VARIANZAS DIFERENTES): A)FORMULAS: Media aritmética del método 1. Media aritmética del método 2. Varianza del método 1. Varianza del método 2. Intervalo de confianza para la diferencia de 2 medias poblacionales.
B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n para cada método analítico Calcular la varianza de cada método Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S12) Determinar en el anexo 20 F0.025, n2-1, n1-1y F0.925, n2-1, n1-1 Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas. Tabular otra vez los resultados. Calcular y1, y2, y12, y22, y determinar n1 y n2. Calcular ŷ1, ŷ2 Calcular S12, S22 Calcular gl Determinar en el anexo 19 t0.975, gl y calcular IC(1-2)
ANEXO 15. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS. 15.1 CANTIDAD ADICIONADA (x) VS CANTIDAD RECUPERADA (y): A)FORMULAS: Sumatorias Pendiente del método 1. Pendiente del método 2. Ordenada al origen del método 1. Ordenada al origen del método 2. Desviación estándar de regresión. Intervalo de confianza para la diferencia de las 2 pendientes. Intervalo de confianza para la diferencia de las ordenadas al origen B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular x1, x12, x2, x22, y1, y12, xy1, y2, y22, xy1 y determinar n1 y n2. Calcular b11, b12, b01, bo2 Calcular Sx/y y Sb11 – Sb12 Determinar en el anexo 19 t0.97523, y calcular IC(1-2) Calcular x1, x2, Sbo1-Sbo2 Calcular IC(01-02) 15.2 PORCENTAJE DE RECOBRO: 15.2.1 COMPARACIÓN DE Repetibilidad DE AMBOS MÉTODOS A)FORMULAS: Varianza Intervalo de confianza para la razón de varianzas. 15.2.2 IGUAL Repetibilidad (VARIANZAS EQUIVALENTES) A)FORMULAS: Media aritmética del método 1. Media aritmética del método 2. Varianza del método 1.
Varianza del método 2. Intervalo de confianza para la diferencia de 2 medias poblacionales. 15.3 DIFERENTE REPETIBILIDAD (VARIANZAS DIFERENTES): A)FORMULAS: Media aritmética del método 1. Media aritmética del método 2. Varianza del método 1. Varianza del método 2. Intervalo de confianza para la diferencia de 2 medias poblacionales. B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n para cada método analítico Calcular la varianza de cada método Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S12) Determinar en el anexo 20 F0.025, n2-1, n1-1y F0.925, n2-1, n1-1 Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas. Tabular otra vez los resultados. Calcular y1, y2, y12, y22, y determinar n1 y n2. Calcular ŷ1, ŷ2 Calcular S12, S22 Determinar en el anexo 19 t0.975, gl y calcular IC(1-2) ANEXO 16. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO EN PRECISIÓN DEL MÉTODO PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS. A)FORMULAS: Varianza Intervalo de confianza para la razón de varianzas. B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados Calcular y, y2 y determinar n para cada método analítico Calcular la varianza de cada método Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S12) Determinar en el anexo 20 F0.025, n2-1, n1-1y F0.925, n2-1, n1-1 Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas. ANEXO 17. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PROPORCIONALIDAD DE MÉTODOS EN ESTUDIO DE CORRELACIÓN PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS. A)FORMULAS: Pendiente Ordenada al origen Coeficiente de determinación Intervalo de confianza para la pendiente Coeficiente de variación de regresión. B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados (datos primarios) Calcular x, y, x2, y2, xy, y determinar n. Calcular b1, b0, r2
Calcular el Sy/x y Sb’ Determinar en el anexo 19 t0.975, n-2 y calcular IC(1) ANEXO 18. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA PRECISIÓN DEL MÉTODO EN ESTUDIOS DE CORRELACIÓN PARA COMPARACIÓN DE 2 MÉTODOS ANALÍTICOS A)FORMULAS: Varianza del método oficial. Varianza del método no oficial. Limite unilateral inferior de confianza para la razón de varianzas. B)PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO: Tabular los resultados (datos primarios) Calcular y1, y12, y2, y22, y determinar n1 y n2. Calcular la varianza del método oficial y del método no oficial. Determinar en el anexo 20 F0.05 Calcular el limite unilateral inferior de confianza para la razón de varianzas. ANEXO 19. TABLA ESTADÍSTICA DE LA DISTRIBUCIÓN t DE Student. GRADOS DE LIBERTAD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
t0.975 12.706 4.303 3.182 2.776 2.571 2.447 2.365 2.306 2.262 2.228 2.201 2.179 2.160 2.145 2.131 2.120 2.110 2.101 2.093 2.086 2.080 2.074 2.069 2.064 2.060
GRADOS DE LIBERTAD 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
t0.975 2.056 2.052 2.048 2.045 2.042 2.040 2.037 2.035 2.032 2.030 2.028 2.026 2.024 2.023 2.021 2.020 2.018 2.017 2.015 2.014 2.013 2.012 2.011 2.010 2.009
GRADOS DE LIBERTAD 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75
t0.975 2.008 2.007 2.006 2.005 2.004 2.003 2.002 2.002 2.001 2.000 2.000 1.999 1.998 1.998 1.997 1.997 1.996 1.995 1.995 1.994 1.994 1.993 1.993 1.993 1.992
