Guía 2017 Bioquímica y Fitoquímica 1er Cuatrimestre

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y FORESTALES http://www.agro.unlp.edu.ar

CURSO

BIOQUÍMICA Y FITOQUÍMICA AÑO 2017

Personal integrante del Curso Bioquímica y Fitoquímica: Profesora Titular: Ing. Agr. Dra. Sonia Z. Viña Jefe de T.P.: Ing. Agr. Cynthia P. Henning Jefe de T.P.: Ing. Agr. MSc. María Cecilia Arango Jefe de T.P.: Ing. Agr. Roxana Mariel Yordaz Ayudante Diplomado: Ing. Agr. MSc. Marcos A. Blanco Ayudante Diplomado: Dra. María José Zaro Personal no docente: Sr. Gabriel Crédico

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Programa del Curso Bioquímica y Fitoquímica Fundamentación: La Bioquímica es un campo multidisciplinario que trata de resolver cuestiones referidas a la naturaleza molecular de los procesos vitales. Suministra los elementos necesarios para conocer cómo un organismo vive a partir de las transformaciones moleculares que ocurren en los distintos procesos metabólicos. De acuerdo con sus contenidos, que hacen a la comprensión de los fenómenos químicos vitales, la Bioquímica se apoya en conocimientos adquiridos previamente por el alumno en los cursos de Química General e Inorgánica y de Química Orgánica, para lograr una integración de los conceptos que el estudiante utilizará en etapas siguientes de la carrera. Se trata de una asignatura básica que sirve de soporte para las disciplinas biológicas abordadas por las Ciencias Agrarias y Forestales. Durante el desarrollo del Curso se podrá observar que los procesos que generan y mantienen la vida de un organismo resultan de una compleja interrelación de reacciones químicas e interacciones moleculares. La Fitoquímica persigue los mismos objetivos que la Bioquímica, pero aplicados a organismos vegetales, e incluye además la extracción y evaluación cuali-cuantitativa de los componentes químicos de las plantas. En el Curso se hará hincapié en el estudio de los compuestos producidos por el metabolismo secundario vegetal, resaltando su implicancia en las adaptaciones bioquímicas de la planta frente al ambiente. El curso de Bioquímica y Fitoquímica pertenece al Departamento de Ciencias Exactas. En el Plan de Estudios 8 se ubica en el 2º cuatrimestre de 2º año de ambas carreras, simultáneamente con Microbiología Agrícola, Climatología y Fenología Agrícola, Topografía e Introducción a la Producción Animal. La asignatura se implementa con una carga horaria de 64 horas totales, distribuidas en 16 semanas, con 4 horas de clases semanales. Los conceptos incorporados en este Curso servirán de base para disciplinas básico-aplicadas y aplicadas tales como Fisiología Vegetal, Fitopatología, Genética y Mejoramiento, Microbiología, Agroecología, Nutrición Animal, Edafología, Agroindustrias, Oleaginosas, Cerealicultura, Fruticultura, etc. Los ejes centrales sobre los que girará el desarrollo de la asignatura son en primer lugar, el estudio de las biomoléculas y sus características generales, así como la visión panorámica del metabolismo; luego se abordará el análisis individual de los compuestos primarios comunes a organismos vegetales, animales y microorganismos: sus características, propiedades, distribución, biosíntesis y degradación; finalmente se darán las nociones básicas de Fitoquímica, caracterizando los principales grupos de compuestos secundarios, con especial énfasis en las funciones que pueden desempeñar y analizando las rutas metabólicas que les dan origen.

Objetivos: a) Caracterizar los constituyentes de los seres vivos a nivel molecular, las interacciones entre dichas moléculas y las reacciones químicas en que participan. b) Identificar las secuencias de reacciones que originan las distintas manifestaciones vitales y comprender el significado biológico de dichas reacciones.

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c) Construir una visión general de los grupos más importantes de compuestos orgánicos producidos por las plantas, integrando conceptos propios de la Química y la Biología. d) Adquirir destreza y habilidad práctica a través de experiencias sencillas en el laboratorio que puedan constituirse en aportes para la resolución de problemas en la práctica agropecuaria y forestal. e) Desarrollar la capacidad de diálogo y la actitud crítica frente a distintas problemáticas que se puedan presentar en la actividad profesional dentro de áreas estrechamente vinculadas como son la Bioquímica general, la Fitoquímica y la Fisiología vegetal. f) Valorizar el aporte que la Bioquímica y Fitoquímica realizan a la formación del futuro profesional, a partir de una actitud comprometida con el proceso de enseñanza y aprendizaje.

Desarrollo programático Unidad didáctica 1. Diseño molecular de la vida La Bioquímica como ciencia que estudia la vida en términos químicos. Características de la materia viva. Biomoléculas: composición, grupos funcionales y reactividad química. Relación entre estructura tridimensional y función biológica. Tipos de transformaciones químicas en las células. Macromoléculas biológicas y sus unidades monoméricas. Organización molecular de las células. Importancia de las interacciones no covalentes. Evolución prebiótica o prebiológica. El agua: propiedades de importancia biológica. Su efecto sobre las biomoléculas en disolución. Actividades propuestas: Resolución de problemas y planteo de preguntas de tipo discusión. Bibliografía: - Blanco, A. 1988. Capítulo 1: Elementos y sustancias componentes del organismo, Capítulo 2: Agua. Química Biológica. Ed. El Ateneo. Buenos Aires. Argentina** - Boyer, R. 2000. Capítulo 1: Bioquímica: Estableciendo las bases; Capítulo 3: Las biomoléculas en el agua. Conceptos de Bioquímica. Ed. Internacional Thomson. México.** - Campbell, M. y S. Farrell. 2004. Primera parte: Introducción a la Bioquímica (Capítulos 1 y 2). Bioquímica. 4ta. Edición. Thomson. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1995. Parte 1: Fundamentos de Bioquímica (Capítulos 1, 2, 3 y 4). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona.** - Mathews, C. K., van Holde, K. E., Ahern, K. G. 2002. Parte 1: El campo de la Bioquímica (Capítulos 1 y 2). Bioquímica. Tercera edición. Pearson Educación, S. A. Madrid. España.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 1: Diseño molecular de la vida (Capítulo 1). Bioquímica. 3ra. Edición. Ed. Reverté S. A. Barcelona. España.**

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Unidad didáctica 2. Metabolismo: visión panorámica Conceptos básicos del metabolismo celular y visión de conjunto. Etapas del metabolismo. Actividad química celular: estado dinámico-estacionario. Conceptos generales sobre regulación de los procesos metabólicos. Nociones de Bioenergética: producción y consumo de energía metabólica. El adenosintrifosfato (ATP) como unidad biológica de la energía libre; ciclo del ATP. Reacciones biológicas de óxido-reducción; transportadores electrónicos. Importancia de la Coenzima A (CoA) en el metabolismo celular. Las vitaminas como componentes de coenzimas. Actividades propuestas: Resolución de problemas y planteo de preguntas de tipo discusión. Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Parte 4: Metabolismo y energía (Capítulo 14). Conceptos de Bioquímica. Ed. Internacional Thomson. México.** - Campbell, M. y S. Farrell. 2004. Parte 4: Energía y metabolismo: carbohidratos, lípidos y compuestos nitrogenados (Capítulo 12). Bioquímica. 4ta. Edición. Thomson. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1995. Parte 1: Fundamentos de Bioquímica (Capítulo 13). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed.Omega S.A. Barcelona.** - Mathews, C. K., van Holde, K. E., Ahern, K. G. 2002. Parte 3: Dinámica de la vida: catálisis y control de las reacciones bioquímicas (Capítulo 12). Bioquímica. Tercera edición. Pearson Educación, S. A. Madrid. España.** - Stryer, L. 1990. Parte 3: Obtención y almacenamiento de energía metabólica (Capítulo 13). Bioquímica. 3ra. Edición. Tomo I y II. Ed. Reverté S. A. Barcelona. España. Unidad didáctica 3. Enzimas Estructura y propiedades de las enzimas. Clasificación. Mecanismos de acción enzimática. Energía de activación. Interacciones enzima-sustrato. Características de los centros activos. Cinética de las reacciones catalizadas por enzimas. Relación entre la concentración de sustrato y la actividad enzimática. Constante de Michaelis-Menten (Km) y Velocidad Máxima. Otros factores que afectan la actividad enzimática: temperatura y pH del medio, concentración de enzima. Inhibidores enzimáticos: tipos y efectos. Control de la actividad enzimática. Actividades propuestas: Caracterización de ureasa presente en semillas de soja y de oxidasas presentes en materiales frescos. Ensayos cualitativos a fin de evaluar sustratos, productos de reacción, efecto de altas temperaturas, etc. Aplicaciones.

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Bibliografía: - Baran, E. J. 1995. Química Bioinorgánica. Mc Graw-Hill / Interamericana de España S. A. Madrid. España.** - Blanco, A. 1988. Capítulo 7: Enzimas. Química Biológica. IV Edición. Ed. El Ateneo. Buenos Aires. Argentina.** - Boyer, R. 2000. Parte 2: Función dinámica de las biomoléculas (Capítulos 6 y 7). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Campbell, M. y S. Farrell. 2004. Parte 2: Componentes de la célula: estructura y función. (Capítulo 5). Bioquímica. 4ta. Edición. Thomson. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson,D. L.,Cox, M. M. 1993. Parte 2: Estructura y catálisis (Capítulo 8). Principios de Bioquímica.2a.Edición. Ediciones Omega S.A.Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed.Omega S.A. Barcelona.** - Salisbury, F. B., Ross, C. W. 1992. Sección 2. Enzymes, proteins and aminoacids. Capítulo 9. Plant Physiology. 4th. Edition. Wadsworth Inc. California. USA.* - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 2: Conformación, dinámica y función de las proteínas (Capítulos 8 y 9). Bioquímica. 3ra. Edición. Tomo I y II. Ed. Reverté S. A. Barcelona. España.** Unidad didáctica 4. Glúcidos (Hidratos de Carbono) Introducción. Distribución de hidratos de carbono en la naturaleza. Monosacáridos y derivados de importancia en los seres vivos. Disacáridos más frecuentes. La sacarosa como azúcar de translocación en los vegetales. Polisacáridos de reserva. El almidón, forma de almacenamiento de glucosa en las plantas. El glucógeno, polímero de reserva de carbohidratos en los vertebrados y muchos microorganismos. Polisacáridos estructurales: celulosa, hemicelulosas, quitina. Bioquímica de la pared celular vegetal: macromoléculas componentes. El papel de los polisacáridos en la estructura de la pared celular. Distribución, funciones y aplicaciones de los heteropolisacáridos: gomas, mucílagos, pectinas y hemicelulosas. Actividades propuestas: determinación de distintas fracciones de fibra. Métodos de Weende (Fibra bruta o Celulosa bruta) y de Van Soest. Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Parte 2: Función dinámica de las biomoléculas (Capítulo 8). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Campbell, M. y S. Farrell. 2004. Parte 4: Energía y metabolismo: carbohidratos, lípidos y compuestos nitrogenados (Capítulo 13). Bioquímica. 4ta. Edición. Thomson. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.***

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- Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 2: Estructura y catálisis (Capítulo 11). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a. Edición. Ed. Omega S.A. Barcelona.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 3: Obtención y almacenamiento de energía metabólica (Capítulo 14). Bioquímica. 3ra. Edición. Ed. Reverté S. A. Barcelona. España.** Unidad didáctica 5. Biosíntesis de Glúcidos Proceso de formación de carbohidratos a expensas de la energía solar: fotosíntesis. Las reacciones de la fase fotoquímica: fotosistemas I y II. Producción de ATP en la fotosíntesis (fotofosforilación). Las reacciones de la fase bioquímica de la fotosíntesis: ciclo de Calvin. Rutas alternativas para la fijación de CO2: vía de Hatch-Slack y metabolismo ácido de las Crasuláceas (CAM). Bases bioquímicas que explican el proceso de fotorrespiración a nivel celular. Biosíntesis de disacáridos y polisacáridos. Los nucleótidos-azúcar como sustratos de la dimerización y polimerización. Otros procesos de formación de glúcidos: gluconeogénesis. Actividades propuestas: análisis de la fase bioquímica de la fotosíntesis, la producción de hexosas y su vinculación con la biosíntesis de di y polisacáridos. Resolución de problemas y planteo de preguntas de tipo discusión. Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Parte 4: metabolismo y energía (Capítulos 15 y 17). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Buchanan, B. B., Gruissem, W., Jones, R. L. (Eds.). 2000. Parte 3: Energy flow (Capítulos 12, 13 y 14). Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. Rockville, Maryland, USA.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A.L., Nelson, D.L., Cox, M.M. 1993. Parte 3: Bioenergética y metabolismo (Capítulo 19). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S.A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona.** - Mathews, C. K., van Holde, K. E., Ahern, K. G. 2002. Parte 4: Dinámica de la vida: energía, biosíntesis y utilización de los precursores (Capítulos 16 y 17). Bioquímica. Tercera edición. Pearson Educación, S. A. Madrid. España.** - Salisbury, F. B., Ross, C. W. 1992. Carbon dioxide fixation and carbohydrate synthesis. Capítulo 11. Plant Physiology. 4th. Edition. Wadsworth Inc. California. USA.* - Sharkey, T. D. 1993. Capítulo 5: Fotosíntesis. Metabolismo del carbono en cloroplastos de plantas C3. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Azcón-Bieto, J., Talon, M. (coord.). Interamericana Mc Graw-Hill. Madrid. España.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 3: Obtención y almacenamiento de energía metabólica (Capítulo 22). Bioquímica. 3ª edición.. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.**

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- Taiz, L., Zeiger, E. 2002. Capítulos 7 y 8. Plant Physiology. 3rd edition. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA.** Unidad didáctica 6. Degradación de Glúcidos Degradación de polisacáridos y disacáridos. Movilización de reservas glucídicas durante la germinación de semillas. Enzimas que catalizan la escisión de la molécula de almidón. Fases de la respiración celular. Glucólisis. Oxidación del piruvato. Ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs). Transporte de electrones en la mitocondria y fosforilación oxidativa. Procesos de fermentación, diferentes tipos, su importancia para organismos y ambientes anaeróbicos. Ruta secundaria de oxidación de la glucosa: vía de las pentosas fosfato o ruta del fosfogluconato. Actividades propuestas: análisis desde el punto de vista bioquímico de las rutas de degradación de los glúcidos. Discusión de material bibliográfico Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Parte 4: metabolismo y energía (Capítulos 16 y 17). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 3: Bioenergética y metabolismo (Capítulos 14, 15 y 18). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 3: Obtención y almacenamiento de energía metabólica (Capítulos 15, 16 y 17). Bioquímica. 3ª edición. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.** Unidad didáctica 7. Lípidos Lípidos de almacenamiento. Propiedades biológicas de los triacilgliceroles. Metabolismo de los ácidos grasos y triacilgliceroles: biosíntesis y degradación. βoxidación de los ácidos grasos. Ciclo del glioxilato. Ceras. Cutina y suberina. Composición química, propiedades y función. Membranas celulares y transporte: los constituyentes moleculares de las membranas. Bases bioquímicas del transporte de solutos a través de las membranas. Actividades propuestas: Extracción de compuestos liposolubles a partir de materiales vegetales; detalle de los componentes mayoritarios. Evaluación de la actividad de lipasas en semillas oleaginosas. Valor de pH óptimo. Análisis desde el punto de vista bioquímico de la movilización de reservas lipídicas durante la germinación de semillas oleaginosas. Lectura de material bibliográfico.

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Bibliografía: - Buchanan, B. B., Gruissem, W., Jones, R. L. (Eds.). 2000. Capítulos 1 y 10. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. Rockville, USA.** - Fennema, Owen R. Food Chemistry. 1985.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 2: Estructura y catálisis (Capítulos 9 y 10). Parte 3: Bioenergética y metabolismo (Capítulos 16 y 20). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 3: obtención y almacenamiento de energía metabólica (Capítulo 20). Tomo II. Parte 4: Biosíntesis de precursores de macromoléculas (Capítulo 23). Bioquímica. 3ª edición. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.** - Stumpf and Conn. Vol. 4. Lipids. The Biochemistry of Plants. 1980.* - Taiz, L., Zeiger, E. 2002. Capítulo 11. Plant Physiology. 3rd edition. Sinauer Associates, MA, USA.** Unidad didáctica 8. Aminoácidos y Proteínas Ciclo del nitrógeno. Aprovechamiento del nitrógeno por los distintos organismos vivos. Los aminoácidos como unidades monoméricas de las proteínas. Péptidos: importancia biológica. Proteínas: distintos niveles de organización estructural; relación entre estructura tridimensional, propiedades fisicoquímicas y función biológica. Distribución. Metabolismo de proteínas. Biosíntesis de aminoácidos. Degradación proteica. Actividades propuestas: Aplicación de la metodología Kjeldahl para la estimación del contenido proteico (Proteína Bruta) en diferentes materiales vegetales. Proteínas de reserva en productos vegetales: caracterización del gluten presente en el endosperma de trigo. Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Parte 1: Las moléculas y la vida (Capítulo 4). Parte 2: Función dinámica de las biomoléculas (Capítulo 5). Parte 4: metabolismo y energía (Capítulo 19). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México**. - Campbell, M. y S. Farrell. 2004. Parte 2: Componentes de la célula: estructura y función (Capítulos 3 y 4). Parte 4: Energía y metabolismo: carbohidratos, lípidos y compuestos nitrogenados (Capítulo 20). Bioquímica. 4ta. Edición. Thomson. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 2: estructura y catálisis (Capítulos 5, 6 y 7). Parte 3: bioenergética y metabolismo (Capítulos 17 y 21). Parte 4: las rutas de la información (Capítulo 26). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.*

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- Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 1: diseño molecular de la vida (Capítulos 2 y 3). Tomo II. Parte 4: biosíntesis de precursores de macromoléculas (Capítulo 24). Bioquímica. 3ª edición. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.** Unidad didáctica 9. Ácidos Nucleicos Ácido desoxirribonucleico (DNA) y ácido ribonucleico (RNA). Unidades constitutivas: nucleótidos. Estructura molecular de los ácidos nucleicos y relación con las funciones que desempeñan. Proceso de replicación del DNA. El DNA como molde para la síntesis de RNA: proceso de transcripción. Tipos de RNA: mensajero, ribosómico y de transferencia. Proceso de traducción: decodificación de la información. Síntesis proteica y código genético. Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Parte 1: las moléculas y la vida (Capítulo 2). Parte 3: almacenamiento y transferencia de la información biológica (Capítulos 10, 11, 12 y 13). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 2: estructura y catálisis (Capítulo 12). Parte 4: las rutas de la información (Capítulos 23 al 27). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona.** - Stryer, L. 1990. Tomo II. Parte 5: información genética: almacenamiento, transmisión y expresión. Bioquímica. 3ª edición. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.** Unidad didáctica 10. Introducción a la Fitoquímica Objetivos y aplicaciones de la Fitoquímica. Criterios de clasificación de los componentes químicos de las plantas. Métodos de investigación fitoquímica. Preparación de las muestras para su análisis; estabilización. Extracción de compuestos orgánicos: relación entre solubilidad y estructura química. Técnicas usuales de separación e identificación de compuestos químicos vegetales. Actividades propuestas: Extracción de compuestos vegetales; utilización de distintos solventes. Bibliografía: - Piñol, M. T. y Palazón, J. Capítulo 11: Metabolismo secundario. En Azcon-Bieto, J y Talon, M. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Ed. Interamericana. Madrid.** - Buchanan , B., Gruissem, R., Jones, R. 2000. Natural products (Secondary metabolites). Capítulo 24. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. USA.**

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- Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Valencia Ortiz, Ciria. 1995. Constituyentes secundarios de las plantas. Capítulo 1. Fundamentos de Fitoquímica. Editorial Trillas. Méjico.** - Ringuelet, Jorge Abel, Viña, Sonia Zulma. 2013. Libro Cátedra Productos naturales vegetales. SEDICI. Repositorio institucional de la UNLP. Ed. EDULP Disponible en http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/27885 Unidad didáctica 11. Metabolismo secundario vegetal Características de los metabolitos secundarios; funciones ecológicas. Introducción a los principales grupos de compuestos secundarios vegetales. Compuestos nitrogenados: alcaloides y glicósidos cianogenéticos. Compuestos fenólicos. Terpenoides. Rutas biosintéticas de los compuestos secundarios: su interrelación con el metabolismo primario. Actividades propuestas: Reconocimiento y caracterización de compuestos fenólicos. Bibliografía: - Piñol, M. T. y Palazón, J. Capítulo 11: Metabolismo secundario. En Azcon-Bieto, J y Talon, M. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Ed. Interamericana. Madrid.**. - Buchanan , B., Gruissem, R., Jones, R. 2000. Natural products (Secondary metabolites). Capítulo 24. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. USA.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Valencia Ortiz, Ciria. 1995. Capítulos 3 al 8. Fundamentos de Fitoquímica. Editorial Trillas. Méjico. - Ringuelet, Jorge Abel, Viña, Sonia Zulma. 2013. Libro Cátedra Productos naturales vegetales. SEDICI. Repositorio institucional de la UNLP. Ed. EDULP Disponible en http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/27885 Unidad didáctica 12. Integración del metabolismo Relaciones entre las distintas rutas metabólicas primarias. Vinculación entre procesos de biosíntesis y degradación de biomoléculas y macromoléculas. Ubicación de las rutas a nivel celular. Principales diferencias entre metabolismo animal y vegetal. Relación entre rutas metabólicas primarias y secundarias en vegetales. Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2016. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.***

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- Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 1: fundamentos de bioquímica (Capítulo 2). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.* - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 2009. 5a.Edición. Ed. Omega S. A. Barcelona.** - Stryer, L. 1990. Bioquímica. 3ª edición. Tomos I y II. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.** Notas: * Bibliografía disponible en la Biblioteca Central de la Facultad. ** Bibliografía disponible en el Curso. *** Bibliografía disponible como material de lectura en el Centro de Estudiantes y en el Aula Virtual.

Metodología de enseñanza La asignatura se desarrollará bajo el siguiente esquema general: - Clases teórico-prácticas generales, con el desarrollo de conceptos teóricos a fin de contextualizar y desarrollar el tema a tratar. - Clases teórico-prácticas grupales (comisiones) que incluirán actividades prácticas de laboratorio, seminarios y/o resolución de problemas. Los alumnos se distribuirán en dos grupos con posibilidad de elección entre dos bandas horarias (mañana o tarde). Cada grupo asistirá a clases un día por semana durante cuatro horas. Las clases teórico-prácticas generales se desarrollarán durante las dos primeras horas en ambos grupos y las teórico-prácticas grupales en las dos últimas horas. Dado el carácter teórico-práctico del curso, en muchas circunstancias el proceso de enseñanza-aprendizaje implica el uso de metodologías y razonamientos de naturaleza deductiva. El alumno se iniciará en el conocimiento de cada tema con una instancia de lectura previa. En las clases generales, los docentes explicarán los tópicos fundamentales destacando cuál es el hilo conductor de cada unidad temática. Se pretende generar en las clases un contexto dinámico, donde el alumno tenga la posibilidad de plantear sus dudas, realizar las consultas necesarias, deducir las relaciones entre distintos temas, integrar conocimientos y participar de la discusión. En la instancia final, durante el desarrollo de las clases teórico-prácticas grupales, se focalizarán las aplicaciones específicas de cada tema. Durante las prácticas de laboratorio, los objetivos son que el alumno desarrolle destrezas en el manejo de material analítico, que se capacite para operar equipos sencillos de laboratorio, que lleve a cabo técnicas y protocolos, que registre, analice e interprete los resultados de las determinaciones experimentales. Otro objetivo primordial es verificar los fundamentos teóricos de cada unidad temática a través de la formulación de hipótesis y reproducción, observación y análisis de fenómenos físicos, químicos y/o biológicos, es decir, a través de la experimentación. Por medio del planteo de preguntas de tipo discusión, referidas tanto a temas teóricos como a las prácticas experimentales, también se afianzarán los conocimientos adquiridos, y se buscará suministrar las herramientas necesarias para resolver problemas reales en áreas biológicas, productivas, técnico-científicas, etc., propias de la futura actividad profesional.

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A través de los sucesivos encuentros se establecerán las pautas para la confección de un mapa conceptual del metabolismo, realizando el análisis sistémico del mismo en la Unidad final, correspondiente a “Integración del Metabolismo”. Otra estrategia adicional será, en algunos casos, la realización de lecturas guiadas de material suministrado previamente.

Evaluación Se realizará durante todo el proceso de enseñanza y aprendizaje y se implementará tanto en las clases generales como grupales como un elemento más del proceso pedagógico y no como un factor externo que interfiera en el desarrollo del mismo. La evaluación será continua y correctora e implicará la participación y disposición individual, la integración grupal, el grado de compromiso, como así también las aptitudes y destrezas durante el desarrollo del curso. Instancias y modalidades de evaluación del curso: - Prueba diagnóstica: se implementará eventualmente al inicio del curso para detectar el grado de conocimientos previos relacionados con la asignatura. - Interrogatorios escritos u orales breves ya sea antes, durante o después de finalizadas las clases. Los objetivos perseguidos son evaluar conceptos generales del tema, permitir el seguimiento continuo de los alumnos, promover la lectura y continuidad en la conceptualización y el procesamiento de conocimientos por parte de los estudiantes, detectar falencias y realizar los ajustes necesarios para el mejoramiento del dictado de la asignatura. Ni la prueba diagnóstica ni los interrogatorios de lectura previa incidirán en la acreditación del curso por parte del alumno, tal como lo estipula la Resolución 287. - Producciones grupales (lecturas guiadas, resolución de problemas y cuestionarios, etc.): tendrán por finalidad favorecer la interacción entre los estudiantes y con los docentes, para generar un ámbito de discusión y desarrollo de espíritu crítico. - Evaluaciones parciales: se realizarán al promediar y finalizar el curso, de acuerdo con la reglamentación vigente. Incluirán temas a desarrollar, preguntas de respuesta corta (múltiples alternativas, completar enunciados y cuadros, etc.), resolución de casos y problemas, etc. - Evaluación final: posibilitará profundizar, integrar y generalizar los conocimientos y habilidades para aquellos estudiantes del régimen de promoción como alumno regular con examen final y como alumno libre. Sistemas de promoción Se enumeran a continuación los requisitos para las distintas alternativas de acreditación del curso: 1- Régimen de promoción como alumno regular sin examen final: - Alcanzar una asistencia al 80% de las clases teóricas y prácticas. - Aprobar con un mínimo de siete (7) puntos el 100% de los contenidos desarrollados en el curso de la asignatura, mediante dos (2) evaluaciones parciales. - En caso de no asistir a la evaluación o de obtener una calificación inferior a siete (7) puntos, habrá una instancia de recuperación para cada evaluación, en la cual deberá obtenerse el mínimo establecido de siete (7) puntos. - Se contempla una instancia única de “recuperación flotante” para cada alumno,

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quién tendrá derecho a la misma al finalizar el curso y que podrá ser utilizada para recuperar alguna de las dos instancias de evaluación. 2- Régimen de promoción como alumno regular con examen final: - Alcanzar una asistencia al 60% de las clases teóricas y prácticas. - Aprobar con un mínimo de cuatro (4) puntos el 100% de los contenidos desarrollados en el curso de la asignatura, mediante dos (2) evaluaciones parciales. - En caso de no asistir a la evaluación o de obtener una calificación inferior a cuatro (4), habrá una instancia de recuperación para cada evaluación, en la cual deberá obtenerse el mínimo establecido de cuatro (4) puntos. - Se contempla una instancia única de “recuperación flotante” para cada alumno, quién tendrá derecho a la misma al finalizar el curso y que podrá ser utilizada para recuperar alguna de las dos instancias de evaluación. 3- Régimen de promoción como alumno libre, con examen final: En esta modalidad se implementarán dos evaluaciones escritas, focalizando los temas más importantes desde el punto de vista conceptual. En éstas se evaluarán contenidos de naturaleza teórica y práctica medulares para la Bioquímica y Fitoquímica. Por tal motivo se exigirá la aprobación de las mismas con un mínimo de siete (7) puntos sobre el 100% de los contenidos evaluados. La aprobación de dichas evaluaciones le permitirá al alumno rendir posteriormente un examen oral, con una visión integradora de todos los contenidos del curso y poniendo énfasis en las temáticas en que no haya alcanzado una calificación satisfactoria en las evaluaciones escritas. Las instancias escritas se tomarán en fechas a acordar con el alumno. La instancia oral se tomará en las fechas de examen final programadas en el calendario académico y se considerará aprobada con una calificación mínima de cuatro (4) puntos. A esta modalidad de promoción podrán acceder aquellos alumnos que hubieran cursado la materia con un rendimiento insuficiente (por parciales desaprobados). Es condición que el alumno haya asistido al menos al 60% de las clases en ese cuatrimestre. Se sugerirá a los alumnos que puedan acceder al presente régimen que concurran a las clases del curso regular, si así lo desean, para actualizar y/o aclarar temáticas del programa en vigencia. Evaluación del curso Se implementarán encuestas dirigidas a los alumnos al finalizar el curso, anónimas y no obligatorias, con el objeto de obtener información y opiniones para tender a que la evaluación esté al servicio de los cambios y ajustes necesarios para mejorar el proceso de enseñanza y aprendizaje. Se realizarán también evaluaciones internas permanentes a cargo del plantel docente, donde se expondrán en grupo, en el ámbito de las reuniones periódicas que se llevan a cabo en la cátedra, las problemáticas detectadas, se plantearán y analizarán las posibles soluciones y se realizarán nuevas propuestas.

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UNIDAD 1. DISEÑO MOLECULAR DE LA VIDA. La Química Biológica estudia los constituyentes de los seres vivos a nivel molecular, las interacciones entre moléculas y las reacciones químicas en que éstas participan. Las moléculas presentes en los organismos vivos se llaman BIOMOLÉCULAS y cumplen funciones específicas en las células. Hay muchas semejanzas en la composición química de las diferentes especies animales y vegetales. Por ejemplo, todas las moléculas de proteínas encontradas en los organismos vivientes tienen en su constitución el mismo conjunto de 20 aminoácidos. En forma similar, los ácidos nucleicos de todas las especies están formados por los mismos conjuntos de nucleótidos. LA MAYORÍA DE LAS BIOMOLÉCULAS SON COMPUESTOS DEL CARBONO La química de los organismos vivos está organizada alrededor del elemento carbono, que aporta aproximadamente la mitad del peso seco. El carbono, junto con hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, es capaz de formar enlaces covalentes, es decir enlaces originados por coparticipación de pares de electrones. El carbono puede formar enlaces simples con el átomo de Hidrógeno (H). En el metano (CH4), por ejemplo, el C comparte sus cuatro electrones de valencia con cuatro átomos de H. También puede compartir electrones con átomos de O, N o S. Pero más significativa en Biología es la habilidad de los átomos de C de compartir pares de electrones unos con otros para formar enlaces simples muy estables C-C. Cada átomo de C puede formar enlaces simples con 2, 3 ó 4 átomos de C. Además, dos átomos de C pueden también compartir dos pares de electrones uno con otro para formar enlaces dobles C=C. Gracias a estas propiedades los átomos de C unidos covalentemente pueden formar muchas clases de estructuras (cadenas lineales, cadenas ramificadas, estructuras cíclicas) para dar origen al esqueleto de las moléculas orgánicas que se presentan en una variedad casi ilimitada. Los compuestos orgánicos en la materia viva muestran una extraordinaria diversidad y muchos de ellos son extremadamente complejos. Por ejemplo, aún las más simples y pequeñas de las células, las bacterias, contienen un gran número de diferentes moléculas orgánicas. Una simple célula de la bacteria Escherichia coli contiene más de 6.000 compuestos orgánicos diferentes, entre los que se incluye un total de 3.000 proteínas y un número similar de diferentes moléculas de ácidos nucleicos. LOS GRUPOS FUNCIONALES DE LAS BIOMOLÉCULAS DETERMINAN SUS PROPIEDADES QUÍMICAS Casi todas las biomoléculas orgánicas pueden ser consideradas como derivadas de hidrocarburos, es decir, compuestas por C e H con un esqueleto que consiste en átomos de C unidos entre sí por enlaces covalentes y donde las otras uniones de los C se establecen con átomos de H. Estos hidrocarburos son muy estables ya que las uniones simples y dobles C-C comparten los electrones en forma equivalente. Uno o más de los átomos de H de los hidrocarburos pueden ser reemplazados por distintos grupos funcionales para formar las diferentes clases de compuestos orgánicos. Típicas familias de compuestos orgánicos son: alcoholes (grupo funcional: uno o más hidroxilos –OH); aminas (grupo funcional: amino –NH2); aldehídos y cetonas (grupo funcional: carbonilo –HC=O; C=O); ácidos (grupo funcional: carboxilo –COOH); otros grupos funcionales comunes también son importantes en las biomoléculas. Estos grupos funcionales de las biomoléculas son químicamente mucho más reactivos que los esqueletos hidrocarbonados saturados, los cuales no son atacados por la 15

mayoría de los reactivos químicos. Conociendo los grupos funcionales presentes en las biomoléculas orgánicas es posible analizar y predecir su comportamiento químico. Muchas de las biomoléculas que analizaremos son polifuncionales, es decir que contienen dos o más clases de grupos funcionales diferentes. Por ejemplo: los aminoácidos presentan grupos –NH2 y –COOH; los azúcares como la glucosa, grupos hidroxilo –OH y aldehído –HCO. En estas moléculas, cada tipo de grupo funcional tiene sus propiedades químicas características. Veremos que los grupos funcionales de las biomoléculas juegan roles muy importantes en sus actividades biológicas. LAS PRINCIPALES CLASES DE BIOMOLÉCULAS EN LAS CÉLULAS SON GRANDES MOLECULAS Casi toda la materia sólida de las células es orgánica y corresponde en su mayoría a cuatro clases de compuestos fundamentales: PROTEÍNAS, ÁCIDOS NUCLEICOS, POLISACÁRIDOS y LÍPIDOS Las proteínas constituyen las macromoléculas intracelulares más abundantes de la naturaleza y se hallan en todas las células y en todas sus partes (el nombre proviene del griego "proteios" = primero, primitivo). Las proteínas son productos directos de la información genética en todas las formas de vida. Muchas proteínas tienen actividad catalítica específica y funcionan como enzimas. Otras proteínas sirven como elementos estructurales en células y tejidos o bien están presentes en las membranas y promueven el transporte de ciertas sustancias hacia el exterior o el interior de la célula. Las proteínas cumplen muchas otras funciones biológicas y son tal vez las más versátiles de las biomoléculas. Los ácidos nucleicos (ácido desoxirribonucleico, ADN y ácido ribonucleico, ARN) desempeñan las mismas funciones universales en todas las células: participan de la conservación, transmisión y traducción de la información genética. El ADN actúa como depositario de la información genética, mientras que las diferentes clases de ARN colaboran en el “traslado” de la información a la estructura proteica. Los polisacáridos tienen dos funciones principales: en los vegetales, como componentes estructurales extracelulares (ejemplo: celulosa) y algunos, como el almidón, constituyen una forma de almacenar combustibles productores de energía. Los lípidos desempeñan dos funciones primordiales: son componentes mayoritarios de las membranas celulares y pueden constituir una forma de conservación de combustible rico en energía. Estas cuatro grandes clases de biomoléculas tienen una característica común: todas son estructuras relativamente grandes, con altos pesos moleculares y por eso son llamadas MACROMOLÉCULAS. Por ejemplo: las proteínas tienen pesos moleculares que varían desde 5.000 a 1.000.000; los ácidos nucleicos, del orden de varios billones; los polisacáridos , tales como el almidón, tienen también pesos moleculares del orden de los millones. Las moléculas individuales de los lípidos son mucho más pequeñas (PM: 750 a 1.500), pero como normalmente están asociadas juntas en millares para formar estructuras muy grandes que funcionan como sistemas macromoleculares, en particular en las membranas celulares, se puede incluir también a los lípidos entre las macromoléculas. LAS MACROMOLÉCULAS ESTÁN CONSTRUIDAS POR MOLÉCULAS SILLARES SENCILLAS Cada macromolécula está formada por relativamente pocas clases de moléculas sillares pequeñas. Así, aunque los organismos vivos contienen un gran número de diferentes proteínas, todas están formadas por un número variable (entre cientos, miles y

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aún millares) de sólo 20 aminoácidos distintos, que están dispuestos en diferentes secuencias lineales. Los ácidos nucleicos de todos los organismos son largas cadenas de sólo 8 diferentes unidades de nucleótidos, dispuestos en muchas diferentes secuencias. Los polisacáridos son cadenas de unidades de azúcares simples (por ejemplo, el almidón y la celulosa son largas cadenas formadas por un único azúcar simple: la glucosa). Es decir que, aunque el número y la complejidad de las biomoléculas naturales son enormes, sus estructuras son simples, porque están constituidas por un conjunto limitado de moléculas sillares. BIBLIOGRAFÍA - Blanco, A. 1988. Química Biológica. IV Edición. Ed. El Ateneo. Buenos Aires. Argentina. - Boyer, R. 2000. Conceptos de Bioquímica. Internacional Thomson Editores S. A. de C.V. México DF. México - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España. - Stryer, L. 1990. Bioquímica. 3ra. Edición. Tomo I. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.

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Transformaciones químicas que tienen lugar en las células Dentro de las células ocurren infinidad de reacciones químicas. Para su estudio se clasifican en cinco tipos generales: transferencia de grupo óxido-reducción reordenación rotura condensación Ejemplos

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Elementos esenciales o nutrientes • De los elementos descriptos en la tabla periódica , sólo 30 son esenciales para la vida. El 99 % de la masa de las células C , H , O y N.

Elementos esenciales en vegetales Macronutrientes: C – H – O – N – P – K – Ca – Mg – S Micronutrientes: Fe – Mn – Cu – B – Cl – Mo – Ni - Zn

Elementos esenciales en animales Macronutrientes: C – H – O – N – P – K – Ca –Mg – S - Cl – Na

Micronutrientes: Zn – Cu – Mn – Fe – Mo – Si – Co – Se – I Cr – V – Sn – F En algunos microorganismos: Al – As – Br – Ga - W

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UNIDAD 2. METABOLISMO: VISIÓN PANORÁMICA

¿Cómo se sintetizan y degradan las biomoléculas? En las células vivas tienen lugar millares de reacciones químicas catalizadas por las enzimas y que posibilitan la vida. Estas reacciones se consideran colectivamente como metabolismo. El metabolismo es una actividad celular muy coordinada y con propósitos definidos en el que cooperan muchos sistemas multienzimáticos. El metabolismo desempeña 4 funciones bien definidas: 1.- obtener energía química a partir de la degradación de los elementos nutritivos ricos en energía capturados del entorno, o de la procedente de la captura de la energía solar. 2.- convertir las moléculas nutrientes en precursores de los sillares de las macromoléculas de las células. 3.- reunir estos sillares a fin de sintetizar proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, polisacáridos y otros componentes celulares. 4.- formar y degradar las biomoléculas que se necesitan en la función especializada de las células. Aunque el metabolismo comprende a centenares de reacciones diferentes catalizadas por enzimas, las rutas metabólicas centrales son pocas en número y son idénticas en la mayor parte de las formas de vida. Desde luego existen diferencias en el metabolismo de los organismos autótrofos o fotótrofos (que obtienen energía del sol como los vegetales superiores) y los heterótrofos o quimiótrofos (que obtienen energía a partir de compuestos orgánicos como los animales superiores). Sin embargo, conviene tener presente que estas diferencias no se manifiestan en cada proceso en particular (por ejemplo los animales y vegetales sintetizan sus proteínas, lípidos, polisacáridos y ácidos nucleicos por medio de reacciones químicas muy parecidas) sino más bien, en la organización general de estos procesos; si autótrofos y heterótrofos emplean diferentes formas de energía, deberán también tener organizado de modo diferente algunos aspectos de su metabolismo. En los vegetales el proceso se inicia con el empleo de la energía solar para convertir las sencillas moléculas de CO2 en azúcares (primero glucosa y luego almidón) y después en el resto de las biomoléculas necesarias para el desarrollo y crecimiento de la planta. Todos los esqueletos carbonados de una planta se sintetizan a partir del CO2 atmosférico. En este caso, los procesos degradativos de proteínas no son biológicamente importantes, pero sí lo son la degradación de lípidos y especialmente polisacáridos, procesos que se emplean para la producción de energía o para la producción de moléculas sencillas que sirven de base para la biosíntesis de otras biomoléculas. En los animales, en cambio, podemos decir que el proceso metabólico se inicia con el consumo de alimentos. Estos se componen desde el punto de vista nutricional, básicamente de: lípidos, proteínas y glúcidos. Tratándose de moléculas complejas, el organismo debe reducirlas a unidades más sencillas antes de poder distribuirlas a todas las células que las necesitan. Así, las proteínas son degradadas a aminoácidos por las enzimas proteolíticas que rompen las uniones peptídicas; el almidón es degradado hasta glucosa por efecto de las amilasas y los triglicéridos son desdoblados en glicerol y ácidos grasos por las lipasas. Las unidades sencillas (aminoácidos, monosacáridos, ácidos grasos) son absorbidas por las vellosidades del intestino pasando al torrente sanguíneo, y de este modo,

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son transportadas a los lugares del organismo donde son necesarias para los procesos de biosíntesis de nuevas moléculas o para la producción de energía. Puede notarse que los animales obtienen de compuestos orgánicos no sólo la energía que requieren para vivir, sino también, los elementos químicos y esqueletos carbonados que constituyen las biomoléculas. Es obvio que en el caso de los animales, todos los procesos de degradación son tan importantes como los de biosíntesis, ya que los primeros producen las unidades sencillas que serán empleadas como precursoras para los segundos. Es importante tener en cuenta que ninguno de estos procesos ocurriría si no existiesen las enzimas que posibilitan las reacciones correspondientes. Pero el metabolismo se explica mejor refiriéndose a sistemas enzimáticos. Tales sistemas enzimáticos pueden comprender de 2 a 20 enzimas que actúan en forma consecutiva, de modo coordinado, en el que el producto de la primera enzima se transforma en el sustrato de la segunda enzima y así sucesivamente. EL METABOLISMO ESTA CONSTITUIDO POR RUTAS CATABÓLICAS (DEGRADATIVAS) Y ANABÓLICAS (BIOSINTÉTICAS): el metabolismo comprende 2 fases: catabolismo y anabolismo. CATABOLISMO: es la fase degradativa del metabolismo en la que las moléculas nutrientes orgánicas, por ejemplo carbohidratos, lípidos y proteínas, que provienen del entorno (en los animales) o de las propias reservas de las células (en animales y vegetales), se degradan a compuestos finales más sencillos y más pequeños, como monosacáridos, aminoácidos, ácido láctico, ácido pirúvico, CO2, ácido acético, NH3, urea, etc. El catabolismo va acompañado por liberación de energía que es transformada en moléculas de alto potencial de transferencia como el ATP: trifosfato de adenosina (molécula portadora de energía). Otra parte puede conservarse como átomos de hidrógeno ricos en energía, transportados por las coenzimas: dinucleótido de adenina y de nicotinamida en su forma reducida (NADH) y dinucleótido de adenina y flavina (FADH2). ANABOLISMO: llamado también biosíntesis o fase constructiva del metabolismo. Consiste en la elaboración de las moléculas simples y macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) a partir de compuestos más sencillos. La síntesis de compuestos consume energía química que es aportada por el ATP generado en el catabolismo (se produce escisión de ATP a ADP y fosfato). La biosíntesis de algunos compuestos celulares precisa también de átomos de hidrógeno de energía alta que son cedidos por el NADPH. El anabolismo y el catabolismo suceden simultáneamente en las células y sus velocidades están reguladas de modo independiente. Las reacciones que ocurren en una célula de cualquier organismo se agrupan en una serie ordenada de pasos que comúnmente se denominan vías metabólicas. Cada vía metabólica cumple una función en la célula.

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RELACIONES ENERGÉTICAS ENTRE VIAS CATABÓLICAS Y ANABÓLICAS Nutrientes que

Macromoléculas

rinden energía

celulares

Carbohidratos Grasas Proteínas

Proteínas Polisacáridos Lípidos Ácidos nucleicos

CATABOLISMO Energía Química ATP ANABOLISMO Productos finales pobres en energía CO2 H2O NH3

Moléculas precursoras Aminoácidos Azúcares Ácidos grasos Bases nitrog.

LAS RUTAS CATABOLICAS CONVERGEN HACIA UNOS POCOS PUNTOS FINALES: Vamos a ver el catabolismo desde más cerca: en el catabolismo aeróbico existen 3 fases principales, como se muestra en la figura. En la fase 1 las macromoléculas de la célula se degradan hasta sus sillares principales. Así los polisacáridos se degradan a hexosas o a pentosas, los lípidos se degradan liberando ácidos grasos, glicerina y otros componentes y las proteínas se hidrolizan y liberan sus 20 aminoácidos constituyentes. En la fase 2 del catabolismo los diversos productos formados en la fase 1 se recolectan y se transforman en un número menor de moléculas todavía más sencillas. De este modo las hexosas, las pentosas y la glicerina de la fase 1 se degradan a un intermediario más sencillo de 3 carbonos, el piruvato, que se convierte después en una unidad sencilla de 2 carbonos, el grupo acetilo del acetil-coenzima A. De modo análogo, los ácidos grasos y los esqueletos carbonados de la mayor parte de los aminoácidos se

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escinden y forman grupos acetilo en forma de acetil-CoA; este producto constituye, por lo tanto, el producto final común de la fase 2 del metabolismo. En la fase 3, el grupo acetilo del acetil-CoA se incorpora al ciclo del ácido cítrico, la ruta final común en la que se oxidan en último término la mayor parte de los nutrientes que rinden energía y los transforman en dióxido de carbono. El agua, el amoníaco (u otros productos nitrogenados) son los otros productos finales del catabolismo. Es importante observar que las rutas catabólicas convergen hacia el ciclo del ácido cítrico en la fase 3. Durante la fase 1, docenas y aún centenares de proteínas diferentes se degradan liberando los 20 aminoácidos; en la fase 2 los 20 aminoácidos se degradan en su mayor parte a acetil-CoA y amoníaco; y en la fase 3 los grupos acetilo del acetil-CoA se oxidan por el ciclo del ácido cítrico a dos productos solamente: CO2 y H2O. Análogamente, en la fase 1, se degradan muchos polisacáridos y disacáridos diferentes y rinden unos pocos azúcares simples que se convierten finalmente en acetil-CoA en la fase 2 y en CO2 y H2O en la fase 3. La ruta final del catabolismo se parece de este modo a un río que se va ensanchando por los aportes de muchas corrientes tributarias. LAS RUTAS ANABOLICAS SON DIVERGENTES A FIN DE ORIGINAR MUCHOS PRODUCTOS El anabolismo o biosíntesis se verifica también en 3 fases, comenzando con las moléculas precursoras pequeñas. Por ejemplo, la síntesis de proteínas comienza con la formación de alfa-oxoácidos y otros precursores. En la fase siguiente, los alfa-oxoácidos se aminan por los dadores de grupos amino y se forman alfa-aminoácidos. En la fase final los aminoácidos se reúnen formando cadenas polipéptidicas que originan muchas proteínas diferentes. De modo análogo, los grupos acetilo son la base para la construcción de los ácidos grasos que, por su parte se reúnen y forman diversos lípidos. Del mismo modo que el catabolismo es un proceso convergente, el anabolismo es un proceso divergente, ya que comienza a partir de unas pocas moléculas precursoras sencillas a partir de las cuales se sintetiza una gran variedad de macromoléculas diferentes. Las rutas centrales del anabolismo poseen, por tanto, muchas ramificaciones que conducen a centenares de componentes celulares diferentes. Cada una de las fases principales del catabolismo o del anabolismo de una biomolécula determinada es catalizada por un sistema multienzimático. Los cambios químicos secuenciales que tienen lugar en cada una de las rutas centrales del metabolismo son virtualmente idénticas en todas las formas de vida. Por ejemplo, el catabolismo de la D-glucosa para transformarse en piruvato se realiza mediante los mismos intermediarios químicos y mediante el mismo número de reacciones en la mayor parte de los organismos vivos.

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FASES DEL CATABOLISMO:

Biomoléculas

Proteínas

Polisacáridos

Lípidos FASE 1

Grandes Pentosas Moléculas sillares

Aminoácidos

Hexosas Glucosa

Glicerina Ácidos grasos

Piruvato

FASE 2

Productos de degradación común Acetil-CoA

FASE 3 Ciclo de Krebs Productos finales simples del metabolismo

NH3

CO2 H2O

EXISTEN DIFERENCIAS IMPORTANTES ENTRE LAS RUTAS CATABÓLICAS Y ANABÓLICAS CORRESPONDIENTES La ruta anabólica y la correspondiente ruta catabólica, de dirección inversa, que conducen desde un precursor determinado a un producto dado, no son idénticas, habitualmente. Pueden emplear intermediarios de reacción diferentes en las etapas intermedias. Por ejemplo, la glucólisis, ruta que degrada glucosa hasta pirúvico en el hígado, se realiza con la intervención de una secuencia de 10 enzimas específicas que catalizan las etapas sucesivas de la transformación. Aunque podría parecer lógico y económico que se obtuviese la glucosa, mediante gluconeogénesis, a partir del ácido pirúvico por una simple inversión de todas las etapas enzimáticas empleadas en la degradación de la glucosa, la biosíntesis de ésta en el hígado se realiza de modo diferente: 7 de las 10 reacciones enzimáticas de la gluconeogénesis son la inversa de las reacciones glucolíticas. Hay 3 reacciones de la glucólisis que son prácticamente irreversibles y no son

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utilizadas en la gluconeogénesis. De modo análogo las rutas catabólicas y anabólicas, correspondientes y opuestas, que ligan las proteínas y los aminoácidos o las que relacionan los ácidos grasos y el acetil-CoA, tampoco son idénticas. Pudiera parecer un despilfarro el que existan 2 rutas metabólicas entre 2 puntos determinados, una para el catabolismo y otra para el anabolismo, pero existen razones importantes para que esto suceda. La primera de ellas es que la ruta seguida en la degradación de una biomolécula puede ser imposible energéticamente para efectuar la biosíntesis. La degradación de una molécula orgánica es un proceso "cuesta abajo" habitualmente, que tiene lugar con pérdidas de energía libre, mientras que la biosíntesis es un proceso "cuesta arriba" que precisa del consumo de energía. Por ejemplo: "La analogía de la colina y la piedra": El catabolismo es un proceso de caída desde la cima y transcurre con pérdida de energía libre, las pérdidas de energía son especialmente grandes en los puntos en los que la piedra experimenta un mayor descenso en su cota de altitud. El anabolismo es un proceso de ascenso a la cima y precisa del consumo de energía que sólo puede aportarse en cantidades pequeñas fijas. Por eso, el tractor debe seguir una ruta más gradual hacia la cima, evitando los puntos más agudos en los que las necesidades de energía son particularmente grandes.

Existe una segunda razón para que haya diferentes rutas catabólicas y anabólicas y es que deben hallarse reguladas en forma independiente. Si sólo se emplease una ruta de modo reversible, en ambas direcciones la disminución de la velocidad de la ruta catabólica provocada por la inhibición de una de sus enzimas, repercutiría en la disminución del ritmo del correspondiente proceso de biosíntesis. Las rutas anabólicas y catabólicas paralelas deben diferir, por lo menos, en una etapa enzimática de modo que puedan regularse independientemente. En ocasiones las rutas catabólicas y anabólicas opuestas suceden en partes diferentes de la célula. Por ejemplo, la oxidación de los ácidos grasos hasta acetil-CoA en el hígado tiene lugar por la acción de un conjunto de enzimas que se halla localizado mayoritariamente en las mitocondrias en las que se hallan favorecidos los fenómenos de oxidación, mientras que la biosíntesis de los ácidos grasos a partir del acetil-CoA, que precisa del consumo de hidrógeno, es decir, de capacidad de reducción tiene lugar por un conjunto de enzimas completamente diferentes que se halla localizado en el citosol, en el que están favorecidas las reacciones de reducción. Aunque las correspondientes rutas del catabolismo y del anabolismo no son idénticas, la fase 3 del catabolismo que está constituida por el ciclo del ácido cítrico, actúa como lugar central de reunión que es accesible tanto a las rutas catabólicas como a las

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anabólicas. A este estado se le llama frecuentemente la fase anfibólica (del griego amphi= ambos). La fase 3 se emplea catabólicamente para completar la degradación de moléculas pequeñas derivadas de la fase 2 del catabolismo, pero se emplea también anabólicamente para aportar moléculas pequeñas que son precursoras de la biosíntesis de los aminoácidos, de los ácidos grasos y de los carbohidratos. Cada una de las rutas centrales del metabolismo, ya sean anabólicas o catabólicas, pueden ajustar su ritmo de acuerdo con las necesidades del momento en la economía celular. Además, se pone de manifiesto que las reacciones del anabolismo y catabolismo se ajustan para que tengan lugar del modo más económico posible, a fin de que las pérdidas de materia y de energía sean lo más pequeñas posibles. Es decir, las células oxidan a sus elementos nutritivos a velocidades que son justamente lo suficiente para atender a sus necesidades de energía en un momento determinado.

EL ATP TRANSPORTA ENERGIA DESDE LAS REACCIONES CATABOLICAS A LAS ANABOLICAS Las moléculas nutritivas complejas, tales como la glucosa, contienen mucha energía potencial debido a su elevado grado de ordenación estructural. Como la molécula de glucosa se degrada para formar los productos finales pequeños y sencillos, CO2 y H2O, se hace asequible una cantidad grande de energía libre. La energía libre es la forma de energía capaz de efectuar trabajo en condiciones de temperatura y presión constantes. Sin embargo, a menos que haya una forma de capturar o conservar la energía libre liberada, cuando se oxida la glucosa, aquélla aparecerá simplemente en forma de calor. Aunque la energía calórica es útil para mantener la temperatura del cuerpo en animales superiores, no puede emplearse para efectuar trabajo mecánico o contracción muscular o el trabajo químico de la biosíntesis. Gran parte de la energía libre que se libera de la glucosa y de otros combustibles celulares durante su catabolismo, se conserva mediante la síntesis acoplada del trifosfato de adenosina (ATP) a partir del difosfato de adenosina (ADP) y del fosfato inorgánico. El ATP, el ADP y el fosfato están presentes en todas las células y desempeñan universalmente el papel de sistema trasmisor de la energía. La energía química conservada de este modo en forma de ATP puede efectuar trabajo de 3 clases diferentes: 1.- Puede proporcionar la energía necesaria para el trabajo químico de la biosíntesis. En este proceso el grupo o grupos terminales fosfato del ATP son transferidos enzimáticamente a las moléculas sillares precursoras que, de este modo, se convierten en "energizadas" y se hallan preparadas para ensamblarse y formar macromoléculas. 2.- El ATP es también la fuente de energía para la contracción y movilidad de la célula. 3.- Es fuente de energía para el transporte de los elementos nutritivos a través de las membranas en contra de los gradientes de concentración. En cualquier circunstancia que se emplee la energía química del ATP para efectuar trabajo celular, su grupo fosfato terminal se pierde y aparece en forma de fosfato inorgánico dejando ADP, la forma descargada del sistema transportador de energía. El ADP puede recargarse después con un grupo fosfato con lo que se genera ATP, en reacciones que se hallan acopladas con la degradación de los combustibles celulares en la que se libera energía. Se tiene de este modo, un ciclo de energía en las células en que el ATP actúa como enlace que transporta energía entre los procesos celulares que liberan energía y los que lo consumen.

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TRANSPORTE DE ENERGIA EN FORMA DE POTENCIA REDUCTORA Una segunda forma de transporte de energía química desde las reacciones del catabolismo hasta las reacciones de biosíntesis que consumen energía, es en forma de átomos de hidrógeno o de electrones. Cuando se forma la glucosa a partir del CO2 durante el proceso de fotosíntesis, o cuando se forman los ácidos grasos a partir del acetato en el hígado de un animal, se necesita potencia reductora en forma de átomos de hidrógeno para reducir, por ejemplo, los enlaces dobles a simples enlaces. Para que sean eficaces como reductores, los átomos de H deben poseer una energía libre considerable. Este tipo de átomos de H se obtiene, en el caso de los organismos quimiótrofos, de los combustibles celulares por la intervención de deshidrogenasas que catalizan la separación de átomos de H de las moléculas combustibles y su transferencia a coenzimas específicas. Las formas reducidas o transportadoras de hidrógeno de estas coenzimas son transportadores de electrones ricos en energía desde las reacciones catabólicas a las reacciones biosintéticas que precisan de electrones, del mismo modo que el ATP es un transportador de grupos fosfato ricos en energía. BIBLIOGRAFIA -

Azcon, Bieto y Talon. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Ed. Interamericana. Madrid. Blanco, Antonio. 1988. Química Biológica. Ed. El Ateneo. Buenos Aires. Boyer, Rodney. 2000. Conceptos de Bioquímica. Ed. Internacional. Thomson. México. Buchanam , B., Gruissem, R., Jones, R. 2000. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. USA. Lehninger, Nelson y Cox. Principios de Bioquímica.1995. 2009 (5ª.edición). Stryer, L. Bioquímica. 1990.

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Estructura de las coenzimas NAD+, NADH, FAD y FADH2. Las formas oxidadas (NAD+ y FAD) toman dos e- y dos protones de los sustratos. Observe que las vías de reacción para oxidación de NAD+ y FAD son distintas.

Estructura de la molécula de ATP: (adenosin-trifosfato)

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Grupo reactivo tiol

Vitaminas hidrosolubles, sus coenzimas derivadas y sus funciones Vitamina Coenzima derivada Abreviatura Función Descarboxilación y Tiamina (B1) Pirofosfato de tiamina TPP transferencia de grupos acilo. Flavina FMN Portadores de hidrógeno y mononucleótido Riboflavina (B2) electrones en oxidoFlavina y adenina reducciones FAD dinucleótido Nicotinamida y NAD+ adenina dinucleótido Portadores de hidrógeno y Ácido Nicotínico electrones en oxidoNicotinamida y + reducciones adenina dinucleótido NADP fosfato Transaminación y Piridoxina, piridoxal y piridoxamina (B6) decarboxilación Ácido Pantoténico Coenzima A CoASH Transferencia de acilos Enlazada Biotina covalentemente a Carboxilación carboxilasas Ácido Fólico Tetrahidrofolato TH4 Transferencia de un carbono Coenzima de Reordenamientos, Cobalamina (B12) cobamida transferencia de metilos

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UNIDAD 3: ENZIMAS 1. Introducción. En las células vivas se llevan a cabo un enorme número de reacciones químicas que constituyen en conjunto el llamado metabolismo celular. Se trata de una actividad altamente coordinada con propósitos bien definidos en la que participan numerosos sistemas multienzimáticos. Las enzimas constituyen las unidades más sencillas de la actividad metabólica y cada una cataliza una reacción química específica. Sin embargo, el metabolismo se describe mejor en términos de secuencias multienzimáticas, cada una de las cuales promueve las etapas catalíticas esenciales que intervienen en una ruta metabólica determinada. Dichos complejos enzimáticos pueden comprender desde 2 a 20 enzimas que actúan consecutivamente de forma coordinada, donde el producto de la primera reacción se transforma en el sustrato de la segunda y así sucesivamente. Es notable que aún con un elevado nivel de complejidad, las transformaciones bioquímicas que ocurren en los organismos vivos se realicen a altas velocidades y con gran eficiencia. Si se pretendiera reproducirlas en el laboratorio se comprobaría que sólo ocurren si se suministra calor, pH extremos, grandes presiones, etc. En las condiciones reinantes en el organismo (temperatura alrededor de 37º C en seres homeotermos o bien temperatura ambiente en poiquilotermos, pH próximo a la neutralidad y presión constante), la mayoría de las reacciones transcurrirían muy lentamente o aún no se producirían. La ocurrencia de dichos procesos en los seres vivos bajo condiciones moderadas de temperatura, pH y presión se explica a través de la función de catalización que desempeñan las enzimas. Un catalizador es un agente capaz de acelerar una reacción química sin formar parte de los productos finales ni consumirse en el proceso. Las enzimas son definidas como catalizadores biológicos u orgánicos y, de acuerdo con su constitución química, se trata de proteínas de alto peso molecular, comprendido entre 40.000 y varios millones de daltons (un dalton corresponde a la masa de un átomo de hidrógeno). Poseen una extraordinaria potencia catalítica, generalmente mucho mayor que la de los catalizadores inorgánicos y un grado elevado de especificidad respecto de sus sustratos, actuando sin generar subproductos. Cada enzima actúa sobre un único sustrato o un pequeño grupo de sustratos estrechamente relacionados, con grupos funcionales idénticos. Con algunas enzimas se da una especificidad absoluta, pero con otras, se produce una gradación en sus capacidades para convertir compuestos relacionados en determinados productos. 2. Energía de activación. Mecanismos de acción enzimática. La velocidad de los procesos metabólicos depende de la energía de las moléculas reaccionantes y la dirección en que se produce está determinada por el valor de la variación de la energía libre (∆G). Sin embargo, no todas las reacciones termodinámicamente favorables se producen en forma instantánea. La oxidación de la sacarosa es un proceso espontáneo porque tiene un ∆G muy negativo, pero puede dejarse durante años sacarosa al aire en una habitación, a temperatura de 20ºC, sin que sufra combustión alguna. Toda reacción en que las sustancias reaccionantes posean un nivel energético mayor que los productos tenderá a ocurrir espontáneamente hacia el estado de menor energía. Pero para que ello ocurra, las moléculas deben estar dotadas

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de un nivel de energía igual o superior a un umbral mínimo llamado energía de activación (Ea). Independientemente de ∆G, en toda reacción es necesario suministrar energía a los reaccionantes para que puedan iniciar su transformación. Las moléculas deben alcanzar un estado de transición o estado de activación antes que la reacción pueda llevarse a cabo. Una energía de activación elevada generalmente corresponde a una baja velocidad de reacción.

El concepto puede explicarse mejor mediante una analogía mecánica como la esquematizada en la Figura 1:

Figura 1. Cambios energéticos en el curso de una reacción sin o con catalización. Se trata, por ejemplo, de una bola que debe desplazarse desde una posición A+B en la ladera de una colina hacia un nivel inferior C+D. En términos termodinámicos A+B representa un mayor contenido energético que C+D y el ∆G en el recorrido desde A+B hasta C+D tiene signo negativo. Supongamos que para llegar a la posición inferior, la esfera debe remontar primero una elevación del terreno. El recorrido no podrá cumplirse si no se le suministra a la bola la energía cinética necesaria para superar esa barrera inicial. La diferencia de nivel entre A+B y C+D corresponde al ∆G de la reacción; la diferencia entre el nivel A+B y el punto máximo de la elevación inicial, corresponde a la energía de activación. Por lo tanto existen dos alternativas para acelerar una reacción química determinada: a) Suministrar energía al sistema para que un mayor número de moléculas de reaccionantes se encuentren en un nivel igual o por encima del correspondiente al umbral de activación (Por ejemplo, el aporte de calor es un recurso comúnmente utilizado en condiciones de laboratorio para acelerar una reacción química). b) Reducir la energía de activación de forma tal que un mayor número de moléculas puedan estar en condiciones de alcanzar el estado de transición (estado activado). Este es el efecto producido por las enzimas. Si se observa nuevamente la Figura 1, la acción del catalizador equivale a disminuir la altura de la elevación inicial en el terreno. Dicho catalizador se combina 31

transitoriamente con el reaccionantes para producir un nuevo compuesto (complejo enzima-sustrato) cuyo estado de transición posee una energía de activación muy inferior a la del estado de transición del sustrato en la reacción no catalizada. El complejo enzima-sustrato reacciona entonces y forma el producto, liberándose el catalizador que puede así combinarse de nuevo y repetir el ciclo. 3. Constitución de las enzimas: Algunas enzimas son proteínas simples constituidas únicamente por aminoácidos. Muchas están formadas por asociación de varias unidades o cadenas polipeptídicas, es decir se trata de proteínas oligoméricas. Hay enzimas que sólo pueden desempeñar su función catalítica en asociación con otro componente no proteico, denominado cofactor. Cuando el cofactor es una molécula orgánica, generalmente de bajo peso molecular, se lo designa coenzima. En general, las coenzimas no están fuertemente unidas a la enzima. En ciertos casos la porción no proteica puede estar estrechamente ligada a la enzima por uniones covalentes u otro tipo de enlace fuerte, formando un complejo que no se separa fácilmente. En este caso, algunos autores prefieren designarla como grupo prostético. Varias vitaminas sintetizadas por las plantas constituyen partes de coenzimas o grupos prostéticos requeridos por las enzimas en plantas y animales, explicando en gran medida la razón por la cual las vitaminas son esenciales para la vida. Tanto la porción proteica como la no proteica son indispensables para la actividad de la enzima. El sistema completo se denomina holoenzima y comprende a la proteína, a la cual se la designa apoenzima y al o los cofactores: HOLOENZIMA (enzima completa)

=

APOENZIMA + COFACTOR (proteína) (porción no proteica)

En otros casos existen iones que generalmente son de elementos minerales menores, no ligados a las enzimas, pero que aceleran la velocidad de la reacción, posiblemente uniéndose en forma transitoria a la enzima. Muchas enzimas aparecen en más de una forma molecular en una misma especie, un tejido o aún en una misma célula. Esas diferentes formas catalizan la misma reacción, pero dadas sus distintas propiedades, pueden distinguirse y separarse por procedimientos adecuados. Estas formas múltiples reciben el nombre de isoenzimas o isozimas. Difieren básicamente en sus propiedades cinéticas y en la respuesta a variados mecanismos de control celular. La distribución de las formas isoenzimáticas de cualquier enzima puede estar vinculada a: a) Diferencias metabólicas en correspondencia con los distintos órganos. Ej.: las distintas isoenzimas de la lactato deshidrogenasa en el músculo esquelético y en el corazón responden a diferencias metabólicas de ambos órganos. b) Diferencias en la localización y función de una enzima dentro de una célula determinada. Ej.: la malato deshidrogenasa aparece bajo diferentes formas en el citosol y en la mitocondria, donde desempeña papeles algo diferentes. c) Variaciones durante el proceso de diferenciación y desarrollo de los tejidos adultos. d) Adecuación de las velocidades metabólicas por diferencia de respuesta a los mecanismos de regulación de las diferentes isoenzimas.

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En el estudio de la especificidad que muestran las enzimas con relación a los sustratos particulares se introdujo a fines del siglo pasado el concepto de complementariedad espacial o geométrica, una relación semejante a la de la “llave y cerradura”, entre la molécula del sustrato y una zona específica situada sobre la superficie de la molécula de la enzima, llamada sitio activo o sitio catalítico, a la cual se une la molécula del sustrato cuando experimenta la transformación catalítica. Con frecuencia dicho sitio activo consiste en una hendidura o depresión en la molécula enzimática, en la cual se adapta el sustrato de modo complementario. En general, resulta ser muy reducido el número de aminoácidos constituyentes de las cadenas polipeptídicas de la enzima que interacciona con dicho sustrato. Sin embargo, para que el sitio activo se mantenga con la disposición adecuada, es necesaria la contribución de toda la estructura (primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria) de la proteína. En la actualidad, una hipótesis que tiene más aceptación que la de la unión “llave-cerradura” es la introducida por Koshland que habla de una “adaptación o ajuste inducido” y la misma considera a la enzima como una estructura dotada de plasticidad y flexibilidad. El modelo deja de ser rígido e inalterable e incorpora la idea de que la enzima puede modificarse en contacto con el sustrato, adaptarse a él y orientar los residuos de aminoácidos en la posición óptima en el momento de formar el complejo ES. De esta forma, sólo el sustrato adecuado provoca en la enzima la disposición precisa de cadenas laterales necesaria para la catálisis. Una vez que el sustrato se une a la enzima, induce cambios conformacionales en la molécula de ésta, que reacomoda así los grupos funcionales directamente involucrados y logra la ubicación más efectiva. 4. Nomenclatura y clasificación: Gran cantidad de enzimas recibieron como denominación el nombre del sustrato correspondiente, al cual se le adicionaba el sufijo asa. Ej.: la ureasa y la arginasa catalizan respectivamente la hidrólisis de la urea y de la arginina. Otras han sido designadas sin guardar ninguna relación con el sustrato sobre el que actúan, como es el caso de la tripsina o de la pepsina. Esto ha llevado a una nomenclatura trivial en la que puede suceder que una misma enzima se conozca por dos o más nombres o que dos enzimas diferentes reciban la misma denominación. Por ello se ha adoptado en convenio internacional, una base sistemática para la nomenclatura y clasificación de enzimas. Se han establecido seis clases principales, divididas en subclases de acuerdo con el tipo de reacción catalizada. Dichas clases son las siguientes: 1) Oxidoreductasas: catalizan reacciones en las que se produce transferencia de electrones, es decir reacciones de óxido-reducción. Ejemplo: lactato dehidrogenasa (cataliza la reducción del piruvato a lactato durante la fermentación láctica, proceso que se lleva a cabo en varios microorganismos anaerobios y en el músculo animal durante períodos de actividad extenuante, con baja disponibilidad de oxígeno). 2) Transferasas: intervienen en reacciones en las cuales se produce transferencia de un grupo o grupos de átomos desde un sustrato a otro. Ejemplo: las aminotransferasas tales como la aspartato aminotransferasa, que cataliza el traspaso del grupo amino desde el Laspartato hacia el α-cetoglutarato para originar el L-glutamato. 3) Hidrolasas: aceleran la hidrólisis del sustrato. Ejemplo: La enzima acetilcolinesterasa, que cataliza la ruptura del enlace éster de la acetilcolina, incorporando una molécula de agua y produciendo acetato y colina como productos de reacción. La acetilcolina constituye una pequeña “molécula señal” que se une con

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proteínas receptoras en las membranas de las células nerviosas, interviniendo en la transmisión de impulsos nerviosos. 4) Liasas: catalizan la ruptura de la molécula del sustrato por un proceso distinto a la hidrólisis ya sea, por ejemplo, adicionando grupos a dobles enlaces. Ejemplo: La enzima aldolasa, que divide a la fructosa-1,6-bifosfato en dos triosas fosfato (dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehído3-fosfato). Esta reacción constituye uno de los diez pasos correspondientes a la glucólisis, proceso que consiste en la degradación de la glucosa para producir dos moléculas de ácido pirúvico. Constituye la ruta universal que utilizan los organismos vivos para extraer la energía disponible en los carbohidratos. 5) Isomerasas: transfieren grupos dentro de una misma molécula, dando lugar a la formación de isómeros de cualquier tipo (ópticos, geométricos o de posición). Ejemplo: la triosa fosfato isomerasa, enzima importante en el metabolismo de los carbohidratos, la cual cataliza la transformación de dihidroxiacetona-fosfato en gliceraldehído 3fosfato. Esta reacción también se produce durante el transcurso de la glucólisis. 6) Ligasas: son llamadas también sintetasas. Catalizan la unión de dos o más compuestos para formar otro más complejo. Inducen la formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N, mediante reacciones de condensación acopladas a la ruptura del ATP. Ejemplo: La enzima piruvato carboxilasa, que cataliza la combinación de piruvato y CO2, para producir oxaloacetato. Constituye una ruta intermedia durante el proceso de gluconeogénesis o síntesis de glucosa a partir de precursores no carbohidratos. De igual forma que la glucólisis, la síntesis de glucosa es una ruta universal, ya que todas las plantas, animales y microorganismos la llevan a cabo. El nombre sistemático completo de las enzimas incluye además un número de 4 cifras, en el que la primera se refiere al nombre de la clase a la que pertenece la enzima, la segunda cifra se refiere a la subclase, la tercera a la subsubclase y la cuarta cifra al número de orden que le corresponde a la enzima en su subclase. Ejemplo: La enzima ATP-glucosa fosfotransferasa, cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde el ATP a la glucosa, para formar glucosa-6-fosfato; su número de clasificación es 2.7.1.1; el primer dígito (2) denota el nombre de la clase (transferasa), el segundo dígito (7), la subclase (fosfotransferasa), el tercer dígito (1), indica que se trata de una fosfotransferasa con un grupo hidroxilo como aceptor y el cuarto dígito (1) señala que la D-glucosa es el aceptor del grupo fosfato. Cabe señalar que también se la conoce con el nombre trivial de hexoquinasa. 5. Cinética de las reacciones catalizadas por enzimas: En una reacción catalizada enzimáticamente, cuando la concentración de la enzima se mantiene constante, la velocidad inicial de la reacción varía en función de la concentración de sustrato. Cuando ésta sea muy baja, también lo será la velocidad de reacción, pero la misma aumentará en la medida que la concentración de sustrato aumente. Con sucesivos incrementos en dicha concentración, se comprobará que la velocidad experimenta aumentos cada vez menores, obteniéndose una gráfica como la de la Figura 2. Finalmente se alcanzará un punto más allá del cual sólo se registrarán incrementos poco significativos de la velocidad al aumentar la concentración de sustrato y se habrá alcanzado prácticamente la llamada velocidad máxima (Vmáx) de reacción, dado que la enzima se encuentra “saturada” con esas concentraciones de sustrato y no puede acelerar más la reacción.

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Existe una relación cuantitativa entre la concentración del sustrato y la velocidad de una reacción enzimática. Leonor Michaelis y Maud Menten definieron una constante (Km) que establece la relación precisa entre la concentración de sustrato y la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. El Km puede definirse como la concentración del sustrato específico a la cual una enzima determinada produce la mitad de su velocidad máxima. Esta constante representa, aproximadamente, una medida inversa de la afinidad entre una enzima y su sustrato (a menor Km, mayor afinidad por el sustrato). La forma característica de la curva de saturación por sustrato para una enzima puede expresarse matemáticamente por la ecuación de Michaelis-Menten:

V0 = V máx [ S ] Km + [ S ] Donde: V0 = velocidad inicial para una concentración de sustrato igual a [S]. Vmáx = velocidad máxima. Km = constante de Michaelis-Menten de la enzima para un sustrato particular.

Figura 2. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática. Si se conoce Km y Vmáx es posible calcular la velocidad de reacción para cualquier concentración de sustrato. El valor de Km es característico para cada enzima y sustrato específico, en condiciones definidas de pH y temperatura. Cuando una enzima tiene la capacidad de actuar sobre muchos sustratos diferentes con alguna característica estructural común, pueden presentarse valores muy distintos de Km para los diferentes sustratos. En las células habitualmente no se verifican concentraciones de sustratos tan elevadas que produzcan la saturación de las enzimas correspondientes y por ello las mismas no funcionan a las velocidades más altas y, como se verá más adelante, las variaciones en la concentración intracelular de los sustratos pueden constituir un mecanismo de regulación metabólica.

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6. Factores que afectan la actividad enzimática Como se ha visto en el punto anterior, uno de los principales factores que afectan la actividad enzimática es la concentración de sustrato y sus efectos ya han sido analizados. Consideraremos aquí la influencia que ejercen la concentración de la enzima, la temperatura y el pH del medio. # Concentración enzimática: Cuando se determina la velocidad inicial de una reacción enzimática variando la concentración de la enzima, en condiciones constantes para los factores restantes y manteniendo la concentración de sustrato a niveles saturantes, es posible establecer la relación entre cantidad de enzima y actividad. Al representar los resultados obtenidos en una gráfica actividad enzimática versus concentración de la enzima, se obtendrá una figura como la siguiente (Figura 3):

Figura 3: Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción.

La misma muestra que la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima. La cantidad de una enzima presente en una disolución determinada o en el extracto de un tejido puede determinarse cuantitativamente en relación con el efecto catalítico que produce. # Temperatura: Un incremento de temperatura determina un aumento de la velocidad de una reacción química, dado el incremento en la energía cinética del sistema. Con ciertas restricciones, las reacciones catalizadas enzimáticamente también siguen este comportamiento. Nuevamente, manteniendo constantes la concentración de la enzima, la de sustrato y los restantes factores del medio, y determinando la actividad en función de la temperatura, se obtendrán resultados como los representados en la Figura 4.

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Figura 4: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. La actividad enzimática aumenta junto con la temperatura y llega a un valor máximo que corresponde a la temperatura óptima. Por encima de ese valor, la actividad descenderá con mayor o menor rapidez. # pH: Para la mayoría de las enzimas, la actividad óptima se encuentra entre valores de pH comprendidos entre 6 y 8. Por debajo o encima de esos valores, la velocidad de reacción cae más o menos rápidamente. Sin embargo, hay excepciones, por ejemplo, la pepsina del jugo gástrico tiene un pH óptimo extremadamente ácido (alrededor de 1,5) (Figura 5). El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos esenciales poseen la carga apropiada para asegurar la formación del complejo E-S en las mejores condiciones. Por otra parte, los pH extremos provocan desnaturalización de las moléculas enzimáticas.

Figura 5: Efecto del pH sobre la actividad enzimática.

7. Inhibidores enzimáticos: Existen agentes químicos que inhiben la acción catalítica de las enzimas. La inhibición puede ser reversible o irreversible. Inhibidores irreversibles: Se produce un cambio permanente en la molécula de la enzima, que resulta en un deterioro definitivo de su capacidad catalítica. Ej.: los venenos órgano-fosforados muy utilizados como insecticidas (producen inhibición 37

irreversible de la acetilcolinesterasa, enzima fundamental para el funcionamiento del sistema nervioso). Inhibidores reversibles: los tipos principales de inhibidores reversibles son los competitivos y los no competitivos. Inhibidores competitivos: actúan aumentando el valor de Km, pero no modifican la velocidad máxima de la enzima. El inhibidor presenta generalmente similitud estructural con el sustrato y ambos compiten por el sitio activo de la enzima. Una característica de la inhibición de tipo competitivo está dada por el hecho de que puede ser revertida aumentando la concentración del sustrato. Si éste predomina en la mezcla, tiende a desplazar al inhibidor de su unión con la enzima. Inhibidores no competitivos: Se unen a la enzima en un lugar de la molécula diferente al sitio activo y provocan una disminución de la velocidad máxima, sin modificar el valor de Km. Este tipo de inhibición no puede ser revertida por aumento de la concentración el sustrato. Pertenecen a esta categoría ciertos reactivos que se unen reversiblemente a grupos sulfhidrilos (-SH) de restos de cisteína indispensables para la actividad de algunas enzimas. Ciertos iones metálicos como Cu++, Hg++ y Ag+ inhiben enzimas combinándose con grupos –SH. La unión del ión metálico provocaría cambios conformacionales que inactivan a la enzima.

8. Regulación enzimática: enzimas alostéricas. Las miles de reacciones del metabolismo celular se agrupan en secuencias y cada una tiene una determinada función de síntesis o degradación. En cualquier secuencia metabólica por lo menos un paso es catalizado por una enzima reguladora que controla la velocidad de toda la secuencia. La o las enzimas reguladoras pueden ser influenciadas por: - la concentración del o los productos finales - la concentración inicial del sustrato - concentración de intermediario formado en la secuencia - factores externos como una hormona - todos los factores mencionados.

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Las enzimas reguladoras son de varios tipos de acuerdo con su modo de acción. Pueden ser alostéricas, las que son modificadas por unión no covalente, y otras enzimas reguladoras que son modificadas por unión covalente. La mayoría de las enzimas alostéricas no muestran la cinética clásica de Michaelis-Menten, o sea no exhiben una curva hiperbólica al graficar la velocidad inicial en función de la concentración del sustrato, sino que presentan una curva sigmoidea. Bibliografía: Baran, E. J. 1995. Química Bioinorgánica. Mc Graw-Hill / Interamericana de España S. A. Madrid. España. Blanco, A. 1988. Química Biológica. IV Edición. Ed. El Ateneo. Buenos Aires. Argentina. Boyer, R. 2000. Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España. Salisbury, F. B., Ross, C. W. 1992. Plant Physiology. 4th. Edition. Wadsworth Inc. California. USA. Stryer, L. 1990. Bioquímica. Ed. Reverté.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS. 1) Demostración de la actividad enzimática de la ureasa contenida en la semilla de soja Fundamento:

enzima ureasa + H2O

CO2

+ 2 NH3

La ureasa es una enzima hidrolizante (amidasa) que descompone una solución de urea, liberando amoníaco que hace virar el indicador rojo de fenol, el cual pasará del amarillo al rojo (zona de viraje: pH 6,4 amarillo y pH 8,2 rojo). Reactivos necesarios Solución de rojo de fenol al 0,1 %. Solución de urea al 3 %. Extracto de harina de soja preparado como se indica: Tomar 30 gramos de harina de soja que se agitan con éter de petróleo durante 15 min a los efectos de desengrasarla. Se decanta el solvente y se repite el tratamiento 2 o 3 veces para desengrasar la muestra totalmente. Se coloca la misma entre papel de filtro a temperatura de 30 ó 40 ºC para secarla. La harina desecada se retoma con 4 ó 5 partes de agua, es decir con 120 a 150 ml., dejando en maceración durante 8 a 10 horas. La solución filtrada muestra actividad frente a la ureasa. 39

Control de actividad:

Preparar 4 tubos de ensayo en la siguiente forma:

Tubo Nº1:

5 ml de solución de urea + 2 gotas de solución de rojo de fenol + 1 ml de agua destilada; agitar.

Tubo Nº2:

2 ml de extracto de harina de soja + 2 gotas de solución de rojo de fenol + 1 ml de agua destilada; agitar.

Tubo Nº3:

2 ml de extracto de harina de soja + 5 ml de solución de urea + 2 gotas de solución de rojo de fenol; agitar.

Tubo Nº4:

Sumergir en baño maría hirviente durante 5 minutos un tubo de ensayo que contenga 5 ml de extracto de harina de soja. Una vez frío tomar 2 ml del extracto + 5 ml de solución de urea + 2 gotas de solución de rojo de fenol; agitar.

Sumergir los cuatro tubos en un baño de agua de 20 a 25 ºC durante 15 minutos y observar.

2) Determinación de la actividad de enzimas oxidasas: Se realizarán las siguientes experiencias: a) Comprobar que las hojas de un material vegetal recientemente recogidas, acusan reacción positiva de oxidasas, utilizando como reactivo la tintura de guayaco. Para ello en un tubo de ensayo se colocan 2 ml de tintura de guayaco (recientemente preparada) a la que se agrega gota a gota 10 ml de agua destilada, agitando la emulsión lechosa blanquecina que se obtiene. Allí se agrega una pequeña cantidad de papilla de hojas del material elegido, obtenida por trituración de la misma en un mortero, en presencia de agua destilada. Aparecerá color azul. Interpretación de la reacción: el ácido guayacónico (uno de los componentes de la resina de guayaco), se oxida dando un ozónido de color azul, llamado azul de guayaco. b) Verificar que la reacción es de carácter enzimático. Para ello repetir el ensayo anterior, pero utilizando papilla de hojas frescas que previamente ha sido calentada en un tubo de ensayo durante varios minutos en baño maría hirviente. Por su condición de termolábil, la enzima se destruye a la temperatura empleada (100ºC) y no aparecerá la coloración azul, sino que se mantiene el tono blanquecino de la emulsión de resina de guayaco.

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UNIDAD 4. GLÚCIDOS o HIDRATOS DE CARBONO. Los glúcidos o carbohidratos ocupan un lugar importante en el metabolismo de las plantas y de los animales, y por lo tanto su detección y valoración es muy importante en el estudio químico de los vegetales. Son los primeros compuestos orgánicos complejos formados en las plantas como resultado de la fotosíntesis y también proveen gran parte de la energía respiratoria. Intervienen en la reserva de energía (como el almidón), en el transporte de energía (sacarosa) y también en la estructura de las paredes celulares (celulosa). Además muchos otros constituyentes de las plantas, como los ácidos nucleicos y los glicósidos, contienen glúcidos como componentes importantes de su estructura. Juegan un rol importante en fenómenos ecológicos, en interacciones planta-animal, en protección frente a heridas e infecciones y en la liberación de sustancias extrañas. Los glúcidos se clasifican en tres grupos, de acuerdo con el tamaño de su molécula: 1) Monosacáridos simples y sus derivados. 2) Oligosacáridos. Condensación de 2 a 10 unidades de monosacáridos. 3) Polisacáridos, que consisten en largas cadenas de unidades de monosacáridos lineales o ramificados. Se debe tener en cuenta, a fin de recordar la nomenclatura, la clasificación vista en Química Orgánica. En cuanto a sus propiedades, solamente los glúcidos o azúcares de bajo peso molecular tienen varias características en común. Son ópticamente activos, compuestos polihidroxialifáticos, usualmente muy solubles en agua. Son relativamente lábiles y sufren con facilidad una isomerización, por ello deben evitarse temperaturas o pH extremos durante su aislamiento. Cuando están en pequeñas cantidades pueden ser reconocidos con adecuados reactivos cromógenos. Azúcares reductores como la glucosa, clásicamente detectados por el precipitado rojo formado con el reactivo de Fehling, son fácilmente detectados en cromatogramas usando una serie de compuestos fenólicos o reactivos aminados (ej.: resorcinol, H2SO4 o ftalato de anilina). Los azúcares no reductores responden menos a esos reactivos, y son usualmente detectados por su rápida oxidación con periodato o tetraacetato de plomo. Un reactivo general de azúcares es el AgNO3, pero no es enteramente específico, pues reacciona también con otras sustancias de las plantas, como los fenoles. OSAS O MONOSACÁRIDOS. La mayoría de los azúcares libres en las plantas son los monosacáridos glucosa y fructosa, y el disacárido sacarosa, junto a pequeñas cantidades de xilosa, ramnosa y galactosa. Otros azúcares presentes en pequeñas cantidades son los azúcares-fosfato, de gran importancia en el metabolismo. La mayor parte de los glúcidos están presentes en las plantas en forma combinada, como los oligo y polisacáridos o bien unidos a diferentes aglicones, como en los glicósidos. Cinco azúcares se encuentran comúnmente como componentes de los glicósidos y polisacáridos, y muchos análisis están relacionados a su separación e identificación. Dos son hexosas: glucosa y galactosa, dos son pentosas: xilosa y arabinosa, y una es metil-pentosa: ramnosa. Amplia distribución tienen también los ácidos urónicos: glucurónico y galacturónico, y una tercer hexosa: la manosa, que es común en polisacáridos. Las pentosas ribosa y desoxirribosa, componentes del ARN y ADN respectivamente, deben ser mencionados aquí, pero son raramente encontrados en las plantas en otra asociación.

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El único cetoazúcar común es la fructosa, no presente en glicósidos, pero componente frecuente de oligosacáridos y en los polisacáridos, bajo la forma de fructanos (ej.: inulina). Una serie de azúcares raros pueden encontrarse como glicósidos; un ejemplo es la apiosa, de 5 carbonos, presente como parte de una flavona en las semillas del perejil. OLIGOSACÁRIDOS. La mayoría de los oligosacáridos comunes de las plantas contienen desde 2 unidades de monosacáridos hasta 5. Las distintas unidades pueden estar combinadas de diferentes formas, por lo que se presentan diferentes isómeros. En el caso de disacáridos conteniendo glucosa, ocho estructuras isoméricas son posibles y todas son conocidas. Pueden sin embargo, ser distinguidos uno de otro con procedimientos cromatográficos adecuados. Disacáridos que contienen glucosa: Soforosa (beta 1-2); Celobiosa (beta 1-4); Gentibiosa (beta 1-6); Maltosa (alfa 1-4); Kojibiosa (alfa 1-2); Nigerosa (alfa 1-3) Isomaltosa (alfa 1-6); Trehalosa (alfa 1-1); Derivados alcohólicos de los azúcares y ciclitoles. El grupo aldehído de las hexosas y pentosas comunes es fácilmente reducido a alcohol por cualquier agente reductor y tal reducción es en ciertos casos usada en procedimientos de identificación. La reducción del átomo de C anomérico altera las posibilidades de isomería y el mismo azúcar-alcohol puede ser formado por diferentes azúcares reducidos. El sorbitol por ejemplo, se obtiene de la glucosa o de la fructosa. Esta obtención se lleva a cabo también en las plantas. El glicerol es sin duda el azúcar-alcohol más conocido de los vegetales. Otros, como el manitol formado por reducción de manosa, son muy comunes en algas, hongos, líquenes y también en plantas superiores. Otros relativamente frecuentes son el sorbitol (derivado de glucosa) y dulcitol (proveniente de galactosa). A los azúcares-alcoholes se les atribuye funciones tales como acumulación de energía, participación en la osmo-regulación y protección de las plantas ante la desecación. Un grupo de alcoholes relacionados con azúcares son los inositoles carbocíclicos, basados en el ciclohexano, con seis grupos -OH y uno o más -CH3, como por ejemplo: inositol, pinitol y quebrachitol. Química del dulzor: El dulzor de los tejidos vegetales viene dado por una mezcla, en proporciones variables, de tres azúcares corrientes: glucosa, fructosa y sacarosa. En el hombre, la sacarosa es usada como patrón de dulzor. Compuesto Dulzor Glucosa ................................. 0,7 Sacarosa ............................... 1 Fructosa ............................... 1,3 Ciclamato ............................. 30 Steviósido ............................ 300 Sacarina ............................... 500

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DISTRIBUCIÓN DE GLÚCIDOS. Azúcares del néctar La mayor parte de los néctares analizados son simples soluciones azucaradas. Los compuestos presentes son los tres azúcares comunes en el metabolismo vegetal: glucosa, fructosa y sacarosa. También aparecen algunos oligosacáridos en pequeñas cantidades, como el trisacárido rafinosa. Ocasionalmente aparecen en algunos néctares maltosa, trehalosa y melibiosa. El néctar en las flores no tienen otra misión que atraer a los animales polinizadores; sus propiedades nutritivas son importantes para la mayoría de los insectos polinizadores, en especial aquéllos que no consiguen alimento de otra forma, como las mariposas. En cítricos y otras frutas carnosas Los azúcares simples son importantes componentes de los jugos de frutos carnosos e influyen en la calidad comercial y organoléptica. Los sólidos solubles del jugo de los cítricos están formados por los azúcares reductores, no reductores y los ácidos orgánicos. Los principales azúcares en las naranjas son: sacarosa, glucosa y fructosa, que suman alrededor del 75% de los Sólidos Solubles Totales (SST). Durante el almacenamiento y tratamiento de los jugos se va hidrolizando la sacarosa, liberando glucosa y fructosa. Los principales monosacáridos de las drupas (duraznos y damascos) son la glucosa y la fructosa. En frutos de pepita (manzana, pera) la proporción de fructosa es mayor que la de glucosa, a diferencia de las drupas, mientras que la sacarosa experimenta un aumento constante hasta la recolección.

En las hortalizas Los glúcidos forman entre el 35% al 85% del residuo seco en las hortalizas. En contraste con los frutos, predominan los polisacáridos sobre los azúcares simples; por lo tanto el sabor no es dulce y la textura es más firme, principalmente por la celulosa, hemicelulosa y pectinas constituyentes de las paredes celulares. En forrajes Los glúcidos solubles en agua de los forrajes representan la parte más rápidamente digestible de los carbohidratos no estructurales y de reserva, encontrándose en pequeñas cantidades. La sacarosa es el principal azúcar en la savia de las plantas y su contenido es importante por su palatabilidad y facilidad para ensilarse. Alta intensidad de luz y elevadas tasas fotosintéticas incrementan el contenido de azúcares, mientras que las altas temperaturas promueven un incremento de las tasas metabólicas y un descenso del contenido de azúcares. Por lo tanto, marcadas variaciones diurnas se observan en el contenido de azúcares en las plantas vivas. El corte y el secado del forraje pueden reducir considerablemente el contenido de azúcares. Cuantitativamente, los mono y oligosacáridos no son importantes como fuente de energía. Pueden ser responsables de flatulencias y diarreas en no rumiantes. Los terneros jóvenes no poseen sacarasa (enzima que desdobla a la sacarosa) y la ingestión de sacarosa provoca diarreas. La intolerancia a la lactosa en los humanos es un problema similar. En granos de cereales Los glúcidos son los compuestos más importantes cuantitativamente. Constituyen el 77-87% de la materia seca total. Incluyen al almidón (que predomina), celulosa, hemicelulosa, pentosanos, dextrinas y azúcares simples. En los análisis con fines alimenticios es costumbre

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dividir a los glúcidos en dos fracciones: la “fibra cruda o bruta”, que incluye a los compuestos insolubles en ácidos y álcalis diluidos, tales como celulosa, hemicelulosa y pentosanos y los “extractivos no nitrogenados” que incluye al almidón y otros azúcares solubles. La lignina (aunque no se trata de un glúcido) forma parte también de la fracción “fibra cruda”. Los cariopses con cáscara de avena, cebada, arroz (vestidos) y la mayor parte de los mijos, tienen un contenido de fibra bruta 2 a 5 veces superior al del trigo, centeno, sorgo y maíz, que son cariopses desnudos. El almidón es el glúcido más importante de todos los cereales, constituyendo aproximadamente el 64% de la materia seca del grano completo de trigo y un 70% de su endosperma. Gran parte de los glúcidos del maíz dulce corresponde a dextrinas, que son polímeros de glucosa de bajo peso molecular, sustituyendo al almidón. En leche La lactosa es el único azúcar que se encuentra en la leche en cantidades importantes; otros azúcares presentes en pequeñas cantidades son la glucosa (7,4 mg/100 ml) y la galactosa (2 mg/100 ml). Aunque hay trabajos que indican la presencia de lactosa en vegetales, es un producto propio del metabolismo de los mamíferos. El contenido en la leche varía con la especie: 1% en conejo, 7% en la mujer, 4,5% en la vaca. POLISACÁRIDOS Podemos clasificarlos de acuerdo a su función en: 1. De reserva. Ej.: almidón - glucógeno - liquenina - inulina. 2. Cementantes. Ej.: hemicelulosas - mucílagos - pectinas. 3. De sostén. Ej.: celulosa - quitina. 4. De defensa. Ej.: gomas. 5. Inmunitarios. Ej.: gran parte de los polisacáridos bacterianos. Podemos clasificarlos también de acuerdo a su estructura: 1. Homopolisacáridos: a) de hexosas: - No ramificados - Ramificados b) de pentosas (arabanos, xilanos) c) de aminosas (quitina) 2. Heteropolisacáridos: pectinas hemicelulosas gomas mucílagos mucopolisacáridos

Almidón La mayor parte de los glúcidos producidos por la fotosíntesis se convierten en almidón que queda depositado en los tejidos de las plantas en forma de granos de almidón. Éstos son muy abundantes en órganos de reserva como semillas, tubérculos, bulbos, etc. No se disuelven en agua fría, y en caliente dan lugar a la formación de engrudo, por hinchamiento del gránulo. Según el lugar de origen, se denomina fécula si proviene de tubérculos y almidón, si proviene de semillas, pero químicamente corresponden al mismo polímero. Por desdoblamiento hidrolítico, ya sea mediante ácidos diluidos o por vía enzimática nos da como producto final, α-glucosa.

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El almidón está formado por dos fracciones: amilosa (no ramificada) y amilopectina (ramificada) (Figura 1)

Figura 1: estructura del almidón

Valoración del almidón En la mayoría de los métodos empleados para valorar el almidón, hay que hidrolizarlo previamente al estado de glucosa y luego aplicar cualquier método de cuantificación de ésta. Conociendo la cantidad de glucosa, se multiplica por el factor 0,9 que se obtiene de relacionar el peso molecular de la unidad glucosídica del almidón con el de la glucosa: 162/180 = 0,9

Inulina La inulina es el único fructosano bien conocido. Se acumula como producto de reserva en ciertas plantas, especialmente en miembros de la familia de las Compuestas y Liliáceas (dalia, salsifí, diente de león, achicoria, topinambur, etc.). No se localiza en las partes aéreas, pero puede llegar a constituir hasta el 15% del peso seco de partes subterráneas. Algunas especies como el topinambur acumulan almidón en las partes aéreas e inulina en las subterráneas.

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La inulina es un polímero de la beta-fructosa en unión 2 → 1, constituido por un número relativamente pequeño de unidades de fructosa (menos de 100), y por este motivo es fácilmente soluble en agua. Es un componente blanco, pulverulento, que el iodo lo colorea ligeramente de amarillo. (Figura 2) O

O

CH2

CH2

HO H

O OH

HOH2C

H

CH2 O

H

H

O

O

H

HO H

O

HO H

OH HOH2C

H

OH HOH2C

H

n

Estructura de la inulina Figura 2: estructura de la inulina

Celulosa Es un polisacárido de sostén que da rigidez a los tejidos vegetales. El porcentaje de celulosa en las plantas es muy variable: la sustancia seca de la madera contiene aproximadamente un 40-50% de celulosa, 10-30% de hemicelulosa y otros polisacáridos y 20-30% de lignina. El porcentaje de celulosa es muy importante en los forrajes en cuanto a su valor nutritivo; varía no sólo en cuanto a la especie y variedad, sino también al período de desarrollo del vegetal y a los distintos órganos considerados. La celulosa es muy abundante en fibras textiles, especialmente en el algodón que contiene más del 98% de celulosa. Se trata no sólo del polisacárido estructural extracelular más abundante del reino vegetal, sino también que es la más abundante de las biomoléculas (las proteínas son las biomoléculas intracelulares más abundantes). La celulosa como componente de la pared celular La observación microscópica de la pared celular muestra la existencia de una estructura laminar. Esta disposición está determinada por capas superpuestas de microfibrillas celulósicas de diferente orientación, las cuales pueden ser observadas luego de extraer los componentes amorfos. Estos últimos están constituidos por los polisacáridos de la matriz y la lignina. Los polisacáridos que forman la matriz son las sustancias pécticas (solubles en agua) y las hemicelulosas (solubles en álcali). Es decir que las microfibrillas de celulosa forman el material estructural básico de las paredes celulares vegetales. Estructura y propiedades La celulosa es considerada un compuesto químico de una simplicidad muy poco común. Es un homopolisacárido lineal, no ramificado, constituido por 10.000 o más unidades de Dglucosa unidas por enlaces β (1→ 4). La diferencia fundamental con la estructura del almidón es la configuración beta y esta aparentemente simple diferencia da por resultado estructuras poliméricas de propiedades muy diferentes. Debido a los enlaces beta, las cadenas de Dglucosa de la celulosa adoptan una conformación extendida, en la cual las cadenas paralelas de celulosa se mantienen unidas mediante enlaces transversales de hidrógeno y forman una sustancia muy insoluble y muy poco reactiva. Esta característica la convierte en un compuesto muy útil como material esquelético y de protección. Es decir que su estructura molecular la hace adecuada para su función biológica. (Figura 3)

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Figura 3: Conformación de las cadenas de β (1→ 4) D-glucano, mostrando los puentes de hidrógeno inter e intramoleculares. Como el tracto intestinal de los vertebrados no segrega ninguna enzima capaz de hidrolizar la celulosa, ésta no puede digerirse; sus unidades de D-glucosa no son asequibles para la alimentación de la mayor parte de los organismos superiores. Los únicos vertebrados capaces de emplear la celulosa como alimento son los rumiantes, que lo hacen de manera muy indirecta: el rumen contiene microorganismos que segregan enzimas celulasas y degradan la celulosa para dar D-glucosa, que fermenta a ácidos grasos de cadena corta, CO2 y gas metano (CH4). Los ácidos grasos son absorbidos y pasan a la corriente sanguínea del rumiante, llegando finalmente a los tejidos donde son empleados como combustible; el CO2 y el metano son liberados. Ésto representa una relación simbiótica útil para el vacuno y los microorganismos, en la que la celulosa de los forrajes es la fuente principal de combustible para el animal y los microorganismos.

Hemicelulosas El nombre de hemicelulosas se propuso a fines del siglo XIX por considerar erróneamente que se trataba de compuestos precursores de la celulosa. Constituyen el más complejo grupo de polisacáridos de la pared celular. Son solubles en álcali. Están estrechamente asociadas a la celulosa. Se encuentran compuestas por hexosas, pentosas y ácidos urónicos, unidos en diferentes combinaciones y con distintas uniones glicosídicas. En Gimnospermas los glucomananos y los galactoglucomananos son los principales componentes de las hemicelulosas. En cambio en las Angiospermas los principales constituyentes son los xilanos. Las cadenas de hemicelulosas son mucho más cortas que las de celulosa y pueden tener ramificaciones. Son totalmente insolubles en agua, lo que las diferencia de gomas y mucílagos, pero pueden extraerse de las paredes celulares con soluciones alcalinas (Ej.: KOH 15%). Uno de los grupos más estudiados de hemicelulosas es el de los granos de cereales, donde los xilanos forman el grupo predominante. Son constituyentes principales de las cubiertas de las semillas de cereales, que tras la molienda forman el salvado. En cambio, en el endosperma (base de la harina blanca), se encuentra una cantidad mucho menor de hemicelulosas (5% aproximadamente). Las hemicelulosas, una vez formadas en los vegetales, son metabolizadas muy lentamente y, como la celulosa, no representan fuente de energía en las plantas. En los animales, la digestibilidad de las hemicelulosas está estrechamente relacionada a la de la celulosa. En el rumen de los rumiantes hay microorganismos que producen enzimas hemicelulolíticas capaces de degradarlas. (Figura 4)

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Figura 4: Estructura de una hemicelulosa (heteropolisacárido)

Composición de un salvado de trigo: 30% celulosa 15% proteína 25% hemicelulosa 5% azúcares simples 10% almidón 5% lípidos 8% lignina resto: sustancias inorgánicas y otras sustancias.

Pectinas Las pectinas son sustancias cementantes que se encuentran en la pared celular y sobre todo en el material intercelular de las plantas terrestres (laminilla media). Su propiedad más importante desde el punto de vista aplicado es la extraordinaria capacidad gelificante que poseen y que hace de ellas los principales componentes de las mermeladas de frutas. También se utilizan por esta razón en múltiples usos industriales. Son parte abundante en la composición de ciertas Rosáceas (manzana, pera, membrillo, ciruela) y cítricos. Composición. Todas las pectinas poseen una cadena formada por restos de ácido galacturónico parcial o totalmente esterificado con metanol y en unión α(1→4). El polímero totalmente desmetilado se denomina ácido péctico y sus sales (cálcicas o magnésicas), pectatos. (Figura 5).

Figura 5: Ácido poligalacturónico de la pectina Sobre las pectinas actúan dos tipos de enzimas: pectinesterasas, que hidrolizan los grupos metilo disminuyendo su capacidad gelificante, y pectinasas, que rompen los enlaces fundamentales de la cadena, despolimerizándola.

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Fuentes de pectinas. Aunque las pectinas están presentes en todas las plantas, la materia prima para la fabricación industrial de las mismas proviene fundamentalmente de manzanas y cítricos. En las frutas cítricas, el albedo o parte blanca de la cáscara es la más rica en pectinas. El rendimiento y la calidad de las sustancias pécticas depende del grado de maduración de la fruta y del proceso de extracción al que son sometidas. Usos y aplicaciones. Se utilizan en la fabricación de dulces, jaleas y mermeladas. Además juegan un papel importante en la estabilización del sistema coloidal de los jugos de fruta. Se emplean en productos de lechería, como estabilizadores de cremas heladas y en productos de panadería; en preparados farmacéuticos, como agentes hemostáticos, como parte de compuestos usados para la cicatrización de heridas, etc.

Gomas y Mucílagos Ambos son polímeros que contienen más de un tipo de monosacárido, pero los ácidos urónicos están generalmente presentes. Los mucílagos se consideran constituyentes normales de las plantas. Están relacionados con la retención e imbibición de agua. Se los encuentra en plantas xerófitas, semillas y brotes tiernos. Valoración: índice de hinchamiento. Clasificación: a) urónicos: 1) de granos 2) de frutos 3) de cortezas 4) de raíces 5) de hojas b) neutros: 1) galactomananos 2) arabinomananos 3) glucomananos 4) mananos Las gomas se producen en respuesta a daños. En todas las gomas verdaderas, a excepción de la goma tragacanto, el componente ácido presente es el ácido D-glucurónico. En la goma tragacanto, es el ácido D-galacturónico. Algunas gomas son parcialmente acetiladas (Sterculia setigera, S. urens) y algunas tienen grupos metoxilos (goma mirra). Algunas contienen enzimas (la goma arábiga contiene peroxidasa). Tipos de gomas: - arabínicas - cerasínicas - basorínicas De acuerdo con los productos de hidrólisis: - glucurónicas - metilglucurónicas - galacturónicas La algarroba es una goma obtenida de las semillas del algarrobo europeo (Ceratonia siliqua). Se obtiene por eliminación del tegumento y del germen de la semilla, y se extrae del endosperma. El guar se obtiene de una leguminosa anual (Cyanopsis tetragonobulus) de regiones tropicales semiáridas (India, Pakistán, ciertas zonas de USA). La goma se extrae de tegumento y germen. Las harinas que se comercializan de guar y algarroba tienen una composición aproximada de 78-82% de galactomananos, 10-13% de agua, 4-5% de proteínas, 1,5-2% de fibra, y 0,10,9% de cenizas.

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AGAR: Los polisacáridos que forman geles son un grupo de polisacáridos de composición similar a las gomas y mucílagos. Se encuentran principalmente en algas marinas (particularmente en algas rojas) que viven en el Océano Pacífico, rodeando Japón y China. Los geles preparados con esas algas son un alimento humano en el Este de Asia. El agar se encuentra principalmente como un constituyente en la pared celular de Gelidium cartilagineum y organismos relacionados. Esta sustancia se disuelve en agua caliente y al enfriarse se solidifica (igualmente en concentraciones del 1%) con una consistencia similar a una gelatina. Es un polisacárido de naturaleza ácida similar a las gomas. Consiste mayormente de cadenas de hasta 100 unidades de galactopiranosa. Estas unidades están unidas por enlaces 1→3. Sin embargo la galactosa terminal se une al C4, mientras que el C6 está esterificado con ácido sulfúrico. Este radical sulfúrico es responsable del carácter ácido del agar, que es capaz de formar sales. Polisacáridos similares se encuentran también en otras algas marinas como la carragena de Chondrus crispus, y otros de Laminaria spp. Todos tienen componentes similares y ácido sulfúrico esterificado. GOMAS COMERCIALES Y AGENTES GELIFICANTES. Nombre comercial Goma carob o algarroba “ Ghatti “ Angico “ Ketha “ Damson “ Mirra “ Mezquita “ Tragacanto “ Karaya “ Kutira “ Cholla Agar Carragena Ác. algínico y alginatos Goma Xantana

Procedencia Ceratonia siliqua Anogeisus latifolia Piptadenia macrocarpa Feronia elephantum Prunus institia Comiphora myrrha Prosopis juliflora Astragalus sp. Sterculia urens Cochlospermun gossypiyum Opuntia fulgida Gelidium cartilagineum Chondrus crispus Laminaria, Fucus, Macrocystis pyrifera, etc Xantomonas campestris

Presente en Acacia sp.

Productos de hidrólisis Goma arábiga D-galactosa; L-arabinosa; L-ramnosa; ácido D-glucurónico. Goma mezquita Prosopis juliflora L-arabinosa; D-galactosa; Ácido 4-0-metil-D-glucurónico. Goma cherry Prunus sp. L-arabinosa; D-xylosa; D-manosa; D-galactosa; ácido D-glucurónico. Goma tragacanto Astragalus sp. D-xylosa; L-fucosa; ácido D-galacturónico; alcohol.metílico. Mucílago de Linum sp. D-xylosa; L-arabinosa; L-ramnosa; semilla de lino Plantago sp. ácido D-galacturónico. Mucílago D-galactosa; 3-0-metil-D-galactosa; del olmo Ulmus fulva L-ramnosa; ácido D-galacturónico.

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METABOLISMO DE GLÚCIDOS La degradación oxidativa de muchos carbohidratos y en especial de la glucosa, es uno de los recursos más importantes de los organismos vivos para obtener energía. Incluso para algunas células y muchas bacterias es la única fuente de energía. Al tratar el metabolismo de glúcidos o carbohidratos debemos mencionar las principales vías de síntesis y degradación que son: Síntesis: - Fotosíntesis - Gluconeogénesis - Formación de di y polisacáridos - Ciclo del glioxilato (se verá en vías degradativas de lípidos) Degradación: - Glucólisis - Fermentaciones - Ciclo de Krebs (Respiración) - Ruta de las Pentosas-Fosfato Bibliografía: - Boyer, R. 2000. Parte 2: Función dinámica de las biomoléculas (Capítulo 8). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Campbell, M. y S. Farrell. 2004. Parte 4: Energía y metabolismo: carbohidratos, lípidos y compuestos nitrogenados (Capítulo 13). Bioquímica. 4ta. Edición. Thomson. México.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2006. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 2: Estructura y catálisis (Capítulo 11). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 3: Obtención y almacenamiento de energía metabólica (Capítulo 14). Bioquímica. 3ra. Edición. Ed. Reverté S. A. Barcelona. España.**

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UNIDAD 5. BIOSÍNTESIS DE GLÚCIDOS.

FOTOSÍNTESIS Introducción. La síntesis de compuestos orgánicos a partir de precursores inorgánicos requiere energía y poder reductor. En la gran mayoría de los sistemas biológicos, la producción de moléculas orgánicas está relacionada directa o indirectamente con la energía proveniente del sol, a través del proceso de fotosíntesis. Este proceso sustenta a la mayoría de los organismos autótrofos, como así también a los consumidores heterótrofos que de ellos dependen. Además de proveer alimentos, biomasa y combustible fósil, la fotosíntesis llevada a cabo por los vegetales produce el oxígeno requerido por la actividad respiratoria de todos los organismos multicelulares y de muchos unicelulares. Estas consideraciones remarcan la importancia de analizar a la fotosíntesis como parte fundamental del denominado Ciclo del Carbono. Dicho proceso comprende una serie de complejas reacciones que involucran la absorción de luz, la conversión de energía, la transferencia de electrones y una ruta de varios pasos catalizados multienzimáticamente que convierten el CO2 y el agua en carbohidratos. Se trata de un proceso de óxido-reducción biológica, que responde a la siguiente ecuación general: hν CO2 + 2H2A → (CH2O) + 2A + H2O Donde: El CO2 es el aceptor electrónico “H2A” es algún compuesto reducido que puede servir como dador de electrones “(CH2O)” representa el carbohidrato generado por la reducción “A” equivale al producto formado por oxidación de H2A. h: constante de Planck, 0,6626 x 10-33 Js ν: frecuencia de la radiación electromagnética En el caso de la fotosíntesis que genera oxígeno (aquélla que nos interesa particularmente), el agua sirve como agente reductor. Esta molécula se oxida y los electrones liberados son "energizados" y transferidos finalmente al CO2, produciendo oxígeno y carbohidratos. Se trata de una reacción endergónica (requiere energía), siendo su ∆G0 igual a +2.840 kJ por mol de hexosa formada. Es llevada a cabo por las plantas, algas y cianobacterias procariotas. En cambio, muchos procariotas efectúan una fotosíntesis consistente con la ecuación general planteada anteriormente, pero en ella el agente reductor empleado no es el agua sino, por ejemplo el H2S, generándose finalmente azufre elemental en lugar de O2. En eucariotas, tanto las reacciones biofísicas como bioquímicas que conforman el proceso de fotosíntesis ocurren en organelas especializadas, los cloroplastos. Estos

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son los orgánulos de la fotosíntesis y tienen normalmente una longitud de 5 µm. Al igual que las mitocondrias, los cloroplastos constan de una membrana externa y una membrana interna separadas por un espacio intermembranar (ver Figura 1). La membrana interna rodea al estroma, que contiene las enzimas solubles y unas estructuras membranosas llamadas tilacoides, que son sacos aplanados. Una pila de estos sacos constituye un granum. Los diferentes grana (conjunto de varios granum) están conectados por regiones membranosas llamadas lamelas del estroma. Las membranas tilacoidales separan el espacio tilacoidal (lumen) del espacio del estroma. De esta forma, los cloroplastos tienen tres membranas diferentes (externa, interna y tilacoidal) y tres compartimentos separados (intermembranar, estroma y espacio tilacoidal o lumen).

Lamella del estroma (sitio del PSI)

Espacio intermembrana Membrana externa

Tilacoide

Lamella de los Grana (sitio del PSII) Tilacoide Estroma

Membrana interna

Lumen tilacoide

Granum (Tilacoides apilados)

Lamella del estroma

Figura1. Esquema de un cloroplasto Las membranas tilacoidales contienen la maquinaria transductora de energía: las moléculas de clorofilas que captan la luz, los centros de reacción, las cadenas de transporte electrónico y la ATP sintasa. La composición lipídica de las membranas tilacoidales es muy particular: alrededor de un 40% de los lípidos totales son galactolípidos y un 4% son sulfolípidos. Sólo un 10% son fosfolípidos. El estroma contiene las enzimas solubles que utilizan el NADPH y el ATP sintetizados por los tilacoides para transformar el CO2 en azúcares.

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Etapas que componen la fotosíntesis. El proceso fotosintético puede separarse en dos fases: las llamadas reacciones lumínicas, que producen O2, ATP y NADPH, y las reacciones ligadas al carbono (ciclo de reducción del carbono, ciclo de Calvin o reacciones oscuras), en las cuales se reduce el CO2 a carbohidratos, consumiéndose el ATP y NADPH generados en las reacciones lumínicas (ver Figura 2).

hυ

Reacciones lumínicas (membranas tilacoidales)

ATP

Reacciones ligadas al carbono (estroma)

NADPH

H 2O

O2

CO2

CH2O

Figura 2. Etapas que componen la fotosíntesis

Etapa lumínica de la fotosíntesis La primera etapa en la fotosíntesis es la absorción de la luz por una molécula fotorreceptora. El principal fotorreceptor en los cloroplastos de las plantas verdes es la clorofila a. Se trata de un tetrapirrol sustituido (Figura 3), donde los cuatro átomos de nitrógeno de los pirroles están coordinados a un átomo de magnesio. La clorofila es una porfirina que contiene magnesio (el grupo hemo de la hemoglobina es una porfirina con hierro). Otra propiedad característica de la clorofila es la presencia de fitol, un alcohol terpénico hidrofóbico de 20 átomos de carbono, esterificado en una cadena lateral acídica. La clorofila b difiere de la clorofila a en que tiene un grupo formilo en lugar de un grupo metilo en uno de sus pirroles. Estas clorofilas son eficaces fotorreceptores con una red alternante de enlaces simples y dobles. Absorben fuertemente en la región visible del espectro, en la zona en que la energía solar que llega a la Tierra es máxima. Los espectros de absorción de las clorofilas a y b son diferentes (Figura 3a). La luz que no es absorbida por la clorofila a es capturada por la clorofila b, de modo tal que se complementan mutuamente para absorber la luz solar incidente. La región del espectro comprendida entre 500 y 600 nm es débilmente absorbida por estas clorofilas, pero ello no representa un problema para la mayor parte de las plantas verdes.

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(A)

(B)

Figura 3. Espectros de absorción (A) y estructura (B) de las clorofilas y pigmentos accesorios

Un segundo grupo de pigmentos encontrados en organismos fotosintetizadores es el de los carotenoides. Los carotenoides son tetraterpenos (40 átomos de carbono) constituidos por ocho unidades de isopreno. Son responsables de los colores naranja y amarillo observados en las hojas de las plantas, absorbiendo luz entre 450 y 500 nm, rango en el que la clorofila a presenta una absorción relativamente débil. Así, los carotenoides juegan un papel accesorio en la captación de luz, absorbiendo y transfiriendo energía lumínica a las moléculas de clorofila. Además desempeñan una función indispensable en la protección del aparato fotosintético contra el daño fotooxidativo. Diversas experiencias llevadas a cabo en la década del '30 condujeron al concepto de unidad fotosintética. Hans Gaffron propuso que la luz es absorbida por cientos de moléculas de clorofila que transfieren su energía de excitación a un centro 55

donde se realizarán las reacciones químicas. Este lugar se denomina centro de reacción. La función de la mayoría de las moléculas de clorofila es la absorción de la luz en la unidad fotosintética (moléculas “antenas” o recolectoras de luz). Sólo algunas moléculas de clorofila, las de los centros de reacción, intervienen en la transformación de la energía lumínica en energía química. Hemos dejado aclarado anteriormente que el dador de hidrógeno H2A es el H2O en las plantas verdes y el H2S en las bacterias fotosintéticas. De esta forma, planteamos a la fotosíntesis en vegetales como una reacción en la que el CO2 es reducido por el hidrógeno procedente del agua. La liberación de oxígeno sería entonces consecuencia directa de este proceso de deshidrogenación. Lo esencial de este aspecto de la fotosíntesis es remarcar que la molécula de agua se escinde por la luz. Cabe señalar que la oxidación del agua y la reducción del CO2 no están obligadamente unidas. Robert Hill, en 1939, encontró que varios compuestos activos desde el punto de vista redox, incluyendo compuestos que contienen hierro tales como el ferricianuro, podían servir como aceptores de electrones (A) y por lo tanto, inducir la síntesis de oxígeno por cloroplastos iluminados, aún en ausencia de CO2. La denominada reacción de Hill es la siguiente: hν H2O + A → ½O2 + H2A La fotosíntesis en organismos productores de oxígeno depende de la interacción de dos fotosistemas. Las membranas tilacoides contienen los complejos fotosintéticos conocidos como Fotosistemas I y II (PSI y PSII), los cuales portan los centros de reacción responsables de la conversión de energía luminosa en energía química. El fotosistema I, que puede ser excitado por radiación de longitud de onda inferior a los 700 nm, genera un reductor fuerte capaz de reducir al NADP+ conduciendo a la formación de NADPH, y un oxidante débil. El fotosistema II, que requiere longitudes de onda inferiores a los 680 nm, produce un oxidante muy fuerte capaz de oxidar al agua y que da lugar a la formación de O2, y un reductor mas débil que el que se produce en el fotosistema I. La interacción de éstos genera un gradiente de protones transmembranar y la consiguiente formación de ATP, conocida como fosforilación fotosintética o fotofosforilación. El ATP se sintetiza a partir de ADP + Pi por acción de una ATPsintasa ligada a la membrana tilacoidal, proceso similar a la fosforilación oxidativa.

Caracterización y funciones del Fotosistema II. El fotosistema II está constituido por un conjunto organizado transmembranar de más de diez cadenas polipeptídicas. Cataliza la transferencia de electrones, promovida por la luz, entre el agua y la plastoquinona. Este compuesto, la plastoquinona, alterna entre una forma oxidada (Q) y una reducida (QH2 o plastoquinol). Los electrones en el QH2 están a un potencial mayor que en el H2O. El fotosistema II promueve la reacción en la dirección termodinámicamente desfavorable utilizando la energía de la luz. El fotosistema II consta de un complejo captador de luz, un núcleo con el centro de reacción y un sistema enzimático oxidante del agua (productor de oxígeno). La energía de excitación electrónica es canalizada desde estas "clorofilas antenas" a una 56

clorofila centro de reacción denominada P680 (P corresponde a pigmento y 680 indica la longitud de onda, en nm, de su absorción máxima). El estado excitado de este centro de reacción, el P680*, es un reductor mucho más fuerte que el estado basal. Al cabo de unos picosegundos de la excitación, se transfiere un electrón del P680* a la feofitina (Ph), una porfirina idéntica a la clorofila a, exceptuando que ha perdido el Mg. El centro de reacción se convierte en un radical catiónico, P680+, por haber perdido un electrón. La mayor parte de la energía del fotón absorbido se conserva en esta separación de cargas. El electrón va desde la feofitina reducida a una plastoquinona, denominada QA, y finalmente a una segunda plastoquinona en el centro QB. El QH2 (quinona reducida) proporciona sus electrones a una cadena de transporte electrónico que bombea protones y está asociada al fotosistema I. El catión P680+ formado por el fotosistema II en el primer paso de separación de cargas es un oxidante fuerte que, indirectamente, extrae electrones del agua formando oxígeno.

El nexo de unión entre los fotosistemas I y II. La siguiente asociación que interviene en la fotosíntesis es el complejo del citocromo bf, por el cual fluyen los electrones desde el fotosistema II al fotosistema I. El citocromo bf cataliza la transferencia de electrones desde el plastoquinol (QH2) a la plastocianina (PC) y bombea protones a través de la membrana tilacoidal. Caracterización y funciones del Fotosistema I. En el fotosistema I (PSI) la luz es canalizada, igual que en el PSII, desde las moléculas de pigmentos “antenas” a una molécula de clorofila ubicada en el centro de reacción, denominada P700. Del mismo modo que para el fotosistema II, el primer paso en el centro de reacción es una separación de cargas inducida por la luz. Se transfiere un electrón desde el P700*, el estado excitado de la clorofila del centro de reacción, a otra clorofila aceptora (A0), originándose un reductor muy potente (A0-) y P700+. Este catión captura un electrón de la plastocianina para regenerar P700, de manera que puede ser nuevamente excitado. El electrón captado por A0- pasa por otros intermediarios hasta ser transferido a la ferredoxina, una proteína hidrosoluble que contiene una asociación de 2Fe-2S. Los electrones de alto potencial de dos moléculas de ferredoxina se transfieren al NADP+ para formar NADPH. Esta reacción tiene lugar en el lado del estroma de la membrana tilacoide. Por ello, la toma de un protón en la reducción del NADP+ contribuye además a la generación de un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide. Este gradiente de protones a través de la membrana tilacoidal conduce a la síntesis de ATP.

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La reacción neta llevada a cabo por el fotosistema II, el complejo del citocromo bf, y el fotosistema I es la siguiente: luz

2 H2O + 2 NADP+

→

O2 + 2 NADPH + 2 H+

Esencialmente, la luz posibilita el flujo de electrones desde el H2O al NADPH y origina una fuerza protomotriz. Esta vía se denomina Esquema Z de la fotosíntesis, ya que el diagrama redox desde el P680 al P700* se asemeja a una Z (Figura 5).

Figura 5. Conexión de los fotosistemas I y II en el esquema Z. Los transportadores redox se encuentran en el potencial correspondiente a pH 7. (1) Las flechas verticales representan la absorción de fotones por las clorofilas del centro de reacción: P680 del fotosistema II (PSII) y P700 del fotosistema I (PSI). La clorofila P680* transfiere un electrón a la feofitina (Pheo). (2) El P680 oxidado por la luz en el fotosistema II es nuevamente reducido por los electrones provenientes de la oxidación del agua. (3) La feofitina (Pheo) transfiere los electrones a los aceptores QA y QB (plastoquinona). (4) La plastocianina (PC), proteína soluble, reduce al P700+ (oxidado). (5) A0 es el aceptor de electrones del P700* (clorofila del centro de reacción); A1 es el siguiente aceptor de electrones, tiene estructura de quinona. Una serie de proteínas ferro-sulfuradas solubles (FeSX, FeSA y FeSB) transfieren los electrones a la ferredoxina soluble (Fd). (6) La flavoproteína ferredoxina-NADP reductasa soluble (FNR) reduce el NADP+ a NADPH, el cual es utilizado en el Ciclo de Calvin para reducir el CO2. La línea punteada indica la fotofosforilación cíclica alrededor del PSI.

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Etapa bioquímica de la fotosíntesis. Reducción del dióxido de carbono a carbohidratos. En las plantas superiores, la mayoría de los productos del transporte electrónico fotosintético, es decir de las reacciones luminosas, son consumidos en el ciclo fotosintético de reducción del carbono. Esta es la vía más importante del metabolismo del carbono en los cloroplastos. El ciclo fotosintético de reducción del carbono. El ciclo fotosintético de reducción del carbono fue trazado por Melvin Calvin y sus colaboradores, en la década del '50. Determinaron que el primer compuesto que podía detectarse era el 3fosfoglicerato (PGA, de la sigla correspondiente a phosphoglyceric acid). Este compuesto carbonado es un ácido carboxílico. Su precursor era de hecho una molécula de 5 átomos de carbono que se escindía en dos tras la carboxilación. Hoy se sabe que la ribulosa 1,5-bisfosfato (RuBP) es el precursor inmediato del PGA. El PGA formado por carboxilación de RuBP es reducido posteriormente captando electrones para formar gliceraldehído-3-fosfato (GAP, de la sigla correspondiente a glyceraldehyde-3phosphate). Los diferentes procesos del ciclo fotosintético de reducción del carbono se dividen generalmente en tres fases: carboxilación de RuBP, reducción de PGA y regeneración de RuBP. a) Fase de carboxilación del ciclo fotosintético de reducción del carbono. El CO2, que difunde desde la atmósfera hacia los cloroplastos, se combina con la RuBP para formar dos moléculas de 3-PGA. Dicha carboxilación es catalizada por la enzima RuBP carboxilasa. Dado que esta enzima también cataliza la oxigenación de RuBP, su nombre completo es RuBP carboxilasa/oxigenasa (RubisCO). Esta reacción se desarrolla en cinco pasos diferentes, detallados en la Figura 6.

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Figura 6. Mecanismo de carboxilación de la Ribulosa 1,5-bisfosfato (RuBP).

b) Fase de reducción del ciclo fotosintético. Los azúcares presentan grupos –OH en todos los átomos de carbono excepto en uno, el cual presenta un grupo carbonilo, C=O. Por otra parte, el PGA es un ácido carboxílico, es decir que presenta un átomo de carbono unido a dos átomos de oxígeno, COO-. La mayor parte de la energía consumida en el ciclo fotosintético de reducción del carbono corresponde precisamente a la reducción del grupo ácido del PGA al grupo carbonilo del GAP. La utilización de NADPH en dicha reducción se ajusta a la regla general que dice que el NADPH es consumido en las reacciones biosintéticas y el NADH es producido en las reacciones de degradación. La gliceraldehído fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP+ es exclusiva de los cloroplastos. Las reacciones de reducción han sido representadas en la Figura 7.

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Figura 7. Reducción del 3-fosfoglicerato (PGA) a gliceraldehído-3-fosfato (GAP). Debido a que se originan dos moléculas de PGA por carboxilación, se necesitan dos moléculas de ATP y dos de NADPH por cada carboxilación producida en la etapa anterior. La única energía adicional es una molécula de ATP, requerida para convertir la ribulosa 5-fosfato en ribulosa 1,5 bisfosfato (RuBP). La energía total utilizada para fijar una molécula de CO2 insume, por lo tanto, 2 NADPH + 3 ATP. c) Regeneración de la ribulosa bisfosfato. Para completar el ciclo, se hace necesario que se regenere la molécula de RuBP a fin de fijar nuevamente el CO2. Las reacciones que ocurren son similares a las de otra ruta metabólica, la vía de las pentosas fosfato, presente en animales y vegetales, y que será tratada posteriormente dentro de esta misma Unidad. Para sintetizar un compuesto de 5 carbonos, como la RuBP, se unen primero dos compuestos de tres carbonos, que luego se rompen asimétricamente para formar un compuesto de dos carbonos y otro de cuatro. El de dos átomos de carbono se combina con el GAP para dar finalmente uno de cinco carbonos. El compuesto de cuatro carbonos se une a otro de tres carbonos separándose de nuevo una molécula de dos carbonos (ver Figura 8). Se produce la conversión de GAP en dihidroxiacetonafosfato (DHAP). Esta cetona es más estable que el aldehído, de forma que en el equilibrio hay 22 veces más DHAP que GAP. Ambos compuestos pueden combinarse para formar fructosa 1,6-bisfosfato (FBP). Luego, se elimina un fosfato de la FBP. Esta reacción es irreversible, a diferencia de las reacciones que llevan desde PGA a FBP. Una vez que el fosfato es eliminado de la FBP, la molécula queda comprometida para la regeneración de RuBP o para la síntesis de almidón. La fructosa 6-fosfato resultante de la reacción anterior se escinde de forma tal que los dos carbonos del extremo superior se unen al grupo transportador de la enzima transcetolasa. Este fragmento de dos carbonos se añade al GAP para producir xilulosa 5fosfato, que luego se isomeriza a ribulosa 5-fosfato (Ru5P). Los cuatro carbonos inferiores de la fructosa 6-fosfato forman eritrosa 4-fosfato. La enzima aldolasa cataliza la adición de eritrosa 4-fosfato a la DHAP, formándose sedoheptulosa 1,7-bisfosfato. La eliminación del grupo fosfato del carbono 1 es otro proceso irreversible, comprometiéndose este carbono exclusivamente para la regeneración de RuBP

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La sedoheptulosa 7-fosfato se escinde mediante la transcetolasa, y los 5 carbonos inferiores se convierten en ribosa 5-fosfato, la cual se isomeriza a Ru5P. El paso final de la regeneración es la fosforilación de Ru5P a RuBP.

Figura 8. Regeneración de ribulosa 1,5-bisfosfato a partir de gliceraldehído 3-fosfato.

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Fotorrespiración. Habíamos mencionado que la enzima ribulosa- 1,5-bisfosfato carboxilasa es también una oxigenasa. Cataliza la adición de oxígeno a la ribulosa-1,5-bisfosfato para formar fosfoglicolato y 3-fosfoglicerato. Las reacciones de oxigenación y carboxilación se producen en el mismo centro activo y compiten entre sí. La velocidad de la reacción carboxilasa es cuatro veces mayor que la de la oxigenasa en condiciones atmosféricas normales, a 25 ºC. El fosfoglicolato, metabolito no muy versátil, es transformado en glicolato por una fosfatasa específica y éste es luego oxidado en los orgánulos conocidos como peroxisomas. Sus sucesivas transformaciones producen finalmente CO2, entre otros compuestos. El proceso global se conoce como fotorrespiración, ya que en él se produce CO2 y se consume O2. La fotorrespiración es aparentemente un proceso detrimental, en el que el carbono orgánico se pierde como dióxido de carbono, sin producir ATP o NADPH u otra ganancia evidente. Parece ser una consecuencia de la “imperfección” de la enzima Rubisco. Plantas Carbono 3 (C3) y Carbono 4 (C4). Muchas plantas tropicales, como la caña de azúcar, poseen un mecanismo para evitar la elevada velocidad de una fotorrespiración inútil, que se ve incrementada con las condiciones de su propio hábitat (la actividad oxigenasa de la RubisCO aumenta más rápidamente con la temperatura que la actividad carboxilasa). Ello lo logran consiguiendo una elevada concentración de CO2 justo en el sitio donde se produce el ciclo de Calvin en sus células fotosintéticas. La vía que lo posibilita fue formulada por M. D. Hatch y C. R. Slack. En ella, compuestos de cuatro carbonos (malato y aspartato) llevan el CO2 desde las células del mesófilo, que están en contacto con aire, a las células de la vaina del haz, que constituyen el principal centro fotosintético. La descarboxilación de los compuestos C4 en las células de la vaina del haz eleva la concentración de CO2 en el sitio donde tiene lugar el ciclo de Calvin (Figura 9).

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Figura 9: Aspectos esenciales de la vía C4. Plantas C4: presentan dos clases de células con cloroplastos, las células del mesófilo y las células de la vaina de haz (o kranz, del alemán: “corona”).

Figura 10: Aspectos esenciales del metabolismo de fijación de CO2 en las plantas CAM Separación temporal de la incorporación de CO2 y de las reacciones fotosintéticas: incorporación y fijación de CO2 durante la noche y descarboxilación y refijación del CO2 durante el día.

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Muchas plantas que crecen en las áreas más secas de los trópicos deben sufrir, además de las altas temperaturas diurnas, las consecuencias de la sequía. Algunas plantas del desierto superan este inconveniente adoptando un hábito suculento y almacenando el agua disponible. Muchas plantas suculentas almacenan ácidos orgánicos en las hojas durante la noche (en especial ácido málico) y disipan esta acidez al día siguiente (Figura 10). Plantas con este comportamiento son muy comunes entre las Crasuláceas (en inglés, Crassulacean Acid Metabolism o CAM). Las plantas CAM son un tipo especial de plantas C4 en las que los ciclos de Hatch-Slack y de Calvin operan a tiempos diferentes a lo largo del día.

SINTESIS DE DI Y POLISACÁRIDOS. Para la síntesis de polímeros como almidón, celulosa, glucógeno, se parte de glucosa-6-fosfato que se convierte en glucosa-1-fosfato, reacción catalizada por la enzima fosfoglucomutasa: glucosa-6-P

glucosa-1-P

Gracias a los trabajos de Luis F. Leloir y colaboradores, que recibiera en 1970 el Premio Nobel de Química, se reconoce que el donador de grupos glucosilo en las reacciones biosintéticas de di y polisacáridos es un derivado nucleósido-di-fosfo azúcar (nucleósido fijado al hidroxilo anomérico del glúcido a través de un enlace éster fosfato), que se forma a partir de un nucleósido-tri-fosfato y el correspondiente azúcar1-fosfato por acción de enzimas NTP gluco-pirofosforilasas. NTP + azúcar-1-P

NDP-azúcar + PPi

NTP: nucleósido-trifosfato NDP: nucleósido-difosfato PPi: pirofosfato En la síntesis del almidón el donador del grupo glucosilo es el ADP-glucosa (base: adenina); en la celulosa GDP-glucosa (base: guanina) y/o UDP-glucosa (base: uracilo); y en la síntesis de glucógeno llevada a cabo por los animales superiores, participa la molécula de UDP-glucosa. Estos nucleósido-di-fosfo-azúcares funcionan como donadores de grupos glucosilo en la biosíntesis de poli, oligo y disacáridos. En la mayoría de los casos la unidad de glucosilo se adiciona al extremo no reductor de una cadena del polímero en crecimiento mediante la formación de un nuevo enlace glucosídico, con liberación del nucleósido-di-fosfato. Síntesis del almidón El almidón se sintetiza en los cloroplastos o leucoplastos. Comúnmente se acumula en los cloroplastos de las hojas, inmediatamente después que la fotosíntesis comienza a producirse en forma apreciable. El proceso puede ocurrir independientemente de la fotosíntesis, lo que se demuestra al dejar hojas en la oscuridad pero sumergidas en soluciones azucaradas.

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Etapas de la biosíntesis de almidón: ATP + glucosa-1-fosfato

ADP-glucosa + PPi

catalizada por la enzima ADP-glucosa-pirofosforilasa

ADP-glucosa + (glucosa)n

ADP + (glucosa)n+1

catalizada por la enzima almidón-sintasa

- Enzima Q( enzima ramificante). Puede formar amilopectina a partir de amilosa. Es una transglicosilasa, que transfiere una posición de la cadena de amilosa de una unión α (1→ 4) a otra α (1 → 6). Cataliza la separación de un fragmento del extremo no reductor de la molécula de amilosa mediante la rotura de una unión α (1→ 4). El fragmento escindido es posteriormente unido por la propia enzima al C6 de una molécula de glucosa mediante la creación de un nuevo enlace glucosídico α (1 → 6), dando lugar a un punto de ramificación de la amilopectina. Síntesis de sacarosa En la síntesis de sacarosa interviene el UTP como nucleósido trifosfato, que unido a la glucosa-1P forma el UDP-glucosa. Luego reacciona con la fructosa-6-fosfato para sintetizar sacarosa-P. La sacarosa se sintetiza en el citosol. Este disacárido es un importante transportador de carbono entre las células. La unión poco usual entre el C1 de la glucosa y el C2 de la fructosa no es hidrolizada por amilasas u otras enzimas que escinden glúcidos comunes.

GLUCONEOGÉNESIS. La gluconeogénesis explica la formación de glucosa a partir de precursores no glucídicos. Es una ruta universal que se produce en todos los animales, plantas, hongos y microorganismos. En los animales superiores la gluconeogénesis tiene lugar principalmente en el hígado y los precursores importantes son el lactato, piruvato, glicerol y la mayoría de los aminoácidos (Figura 11, gluconeogénesis a partir de piruvato). En las semillas en germinación tiene lugar una gluconeogénesis activa que proporciona la glucosa para la síntesis de disacáridos, polisacáridos y otros metabolitos derivados de hexosas. Esta formación se explica a través del ciclo del glioxalato, que utiliza a las moléculas de acetil-CoA producidas durante la β-oxidación de los ácidos grasos. Los aminoácidos procedentes de la degradación de proteínas almacenadas en las semillas también producen precursores de la gluconeogénesis. Este tema en particular, se verá con mayor detalle en la Unidad correspondiente a Lípidos.

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Es sabido que los organismos necesitan un suministro continuo de glucosa para satisfacer sus necesidades metabólicas. En animales superiores, durante los períodos de inanición y durante el ejercicio físico intenso, la glucosa de la sangre se consume más rápidamente de lo que se repone a partir de los alimentos. Una forma de restablecer el nivel de glucosa sanguínea consiste en sintetizarla a partir de moléculas orgánicas pequeñas diferentes de los carbohidratos, como el lactato, el piruvato o los aminoácidos, en un proceso denominado gluconeogénesis. La mayor parte de las reacciones que intervienen en la degradación de la glucosa a piruvato son fácilmente reversibles. Sin embargo, tres de estas reacciones (pasos 1, 3 y 10 de la vía metabólica representada abreviadamente en la Figura) son irreversibles. En realidad, la gran variación negativa de la energía libre (∆G) que ocurre en estas reacciones es la que normalmente impulsa la degradación de la glucosa (ver Glucólisis, dentro del tema “Degradación de Glúcidos”). Para que la vía progrese en la dirección opuesta (para que elabore glucosa a partir de piruvato) estas tres reacciones deben rodearse.

Este desvío se logra mediante la sustitución de un conjunto de “reacciones de rodeo” o de “by pass” alternativas, catalizadas por enzimas, que requieren el suministro de energía química (reacciones A, B, C y D de la Figura). Así, las reacciones que

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sintetizan una molécula de glucosa en la gluconeogénesis necesitan la hidrólisis de cuatro moléculas de ATP y dos de GTP, en comparación con la generación de dos moléculas de ATP (ganancia neta) por cada molécula de glucosa consumida durante la glucólisis. En los seres humanos y en otros mamíferos la gluconeogénesis ocurre sobre todo en las células hepáticas, que pueden mantener el abastecimiento de glucosa en la sangre mediante el uso de muchas moléculas diferentes como punto de partida. Un aporte común es el lactato: esta molécula producida por las células musculares agotadas, es captada por el hígado donde vuelve a convertirse en glucosa que reabastece los músculos. El equilibrio entre glucólisis y gluconeogénesis debe regularse con precisión, de modo que la glucosa se degrade con rapidez cuando se reducen las reservas de energía, pero se sintetice y se exporte a otros tejidos cuando la célula hepática tiene reservas energéticas suficientes en la forma de piruvato o ATP. En resumen, la gluconeogénesis “revierte” con eficacia las reacciones que ocurren durante la glucólisis. Se necesita un conjunto de cuatro reacciones “de rodeo” (identificadas con las letras A, B, C y D en la Figura) para eludir los pasos 1, 3 y 10 de la glucólisis, que en esencia son irreversibles. Como se puede ver, las reacciones de síntesis que ocurren en la gluconeogénesis necesitan un suministro de energía, mientras que la glucólisis en conjunto consiste en una secuencia de reacciones energéticamente favorables. Para no perder de vista la energía producida o consumida en estos procesos, téngase en cuenta que durante la glucólisis la fructosa 1,6-bisfosfato se desdobla formando dos triosas (azúcares de tres carbonos) que no aparecen ilustradas en esta Figura. Por lo tanto, en todas las reacciones que siguen, ya sean parte de la glucólisis o de la gluconeogénesis, participan dos azúcares (y el doble de la cantidad de transportadores de energía) para cada molécula de glucosa que se consume o que se produce. Bibliografía: - Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2011. Introducción a la Biología Celular. 3ra Edición. Editorial Médica Panamericana. México. - Boyer, R. 2000. Parte 4: metabolismo y energía (Capítulos 15 y 17). Conceptos de Bioquímica. International Thomson Editores S. A. de C. V. México DF. México.** - Buchanan, B. B., Gruissem, W., Jones, R. L. (Eds.). 2000. Parte 3: Energy flow (Capítulos 12, 13 y 14). Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. Rockville, Maryland, USA.** - Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2006. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP.*** - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. 1993. Parte 3: Bioenergética y metabolismo (Capítulo 19). Principios de Bioquímica. 2da. Edición. Ediciones Omega S. A. Barcelona. España.** - Mathews, C. K., van Holde, K. E., Ahern, K. G. 2002. Parte 4: Dinámica de la vida: energía, biosíntesis y utilización de los precursores (Capítulos 16 y 17). Bioquímica. Tercera edición. Pearson Educación, S. A. Madrid. España.** - Salisbury, F. B., Ross, C. W. 1992. Carbon dioxide fixation and carbohydrate synthesis. Capítulo 11. Plant Physiology. 4th. Edition. Wadsworth Inc. California. USA.* - Sharkey, T. D. 1993. Capítulo 5: Fotosíntesis. Metabolismo del carbono en cloroplastos de plantas C3. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Azcón-Bieto, J., Talon, M. (coord.). Interamericana Mc GrawHill. Madrid. España.** - Stryer, L. 1990. Tomo I. Parte 3: Obtención y almacenamiento de energía metabólica (Capítulo 22). Bioquímica. 3ª edición.. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.** - Taiz, L., Zeiger, E. 2002. Capítulos 7 y 8. Plant Physiology. 3rd edition. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA.**

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UNIDAD 6. DEGRADACIÓN DE GLÚCIDOS. DEGRADACIÓN DE POLISACÁRIDOS Y DISACÁRIDOS: El almidón acumulado en los cloroplastos como producto de la fotosíntesis, así como el almacenado en los órganos de reserva, puede formar glucosa mediante reacciones catalizadas por las siguientes enzimas: - Alfa amilasa. Es una endoamilasa que hidroliza los enlaces α 1→ 4 de la cadena de amilosa. Se encuentra en la saliva y muy distribuida en todas las plantas. - Beta amilasa. Es una exoamilasa, que actúa atacando a la amilosa en su extremo no reductor, separando moléculas de maltosa. Es exclusiva del reino vegetal. Los polisacáridos de largo de cadena intermedia que se forman durante la acción de las enzimas alfa y beta amilasas se llaman dextrinas. Las enzimas amilasas no pueden atacar los puntos de ramificación de la amilopectina (enlaces α 1→ 6), por ello el producto final de las amilasas sobre la amilopectina es un núcleo grande, muy ramificado que se llama dextrina límite. Las dextrinas son muy utilizadas en varias industrias como por ejemplo, la alimenticia. - Enzima desramificadora alfa (1→ 6) glucosidasa o isoamilasa. Hidroliza los enlaces α 1→ 6 en los puntos de ramificación. Es decir que la acción combinada de las enzimas amilasas e isoamilasa permite degradar totalmente la amilopectina a glucosa y maltosa. - Almidón fosforilasa. Separa las moléculas de glucosa de la amilosa, fosforilándola. Es decir que, mientras las amilasas introducen una molécula de agua en el enlace glucosídico (hidrólisis), las fosforilasas introducen una molécula de ácido fosfórico (fosforólisis). El producto de la reacción es glucosa-1-fosfato, compuesto disponible para seguir los pasos de la degradación, si la célula necesita energía o bien sintetizar algún compuesto. GLUCÓLISIS: Como ya hemos mencionado los carbohidratos son la principal fuente de energía para los organismos vivos. La degradación de los glúcidos presenta dos tipos de procesos: anaeróbicos y aeróbicos. La glucólisis es un proceso anaeróbico en el cual la glucosa se degrada a ácido pirúvico. Transcurre en el citoplasma. El ácido pirúvico formado puede seguir transformándose en condiciones anaeróbicas, a través de procesos fermentativos. También puede transformarse en condiciones aeróbicas, descarboxilándose a Acetil-CoA y entrar en el ciclo de Krebs (o ciclo del TCA), proceso central de la respiración celular. La glucólisis es la ruta universal que utilizan los seres vivos (plantas, animales y microorganismos) para extraer la energía disponible en los carbohidratos. Aunque la glucosa es el principal azúcar que entra en este proceso, también se pueden degradar a piruvato otros monosacáridos como fructosa y galactosa. Las enzimas que participan en la glucólisis se encuentran en el citosol. Esta vía se puede explicar a través de 10 reacciones catalizadas enzimáticamente. Desde el punto de vista energético se pueden identificar dos etapas en la glucólisis: las primeras cinco

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(5) reacciones se consideran “de inversión”, ya que esta fase requiere dos moléculas de ATP por cada glucosa que se “activa” o se prepara para la ruptura; la segunda etapa es “de ganancia”, dado que se generan cuatro moléculas de ATP por cada molécula de glucosa y además se generan dos moléculas de NADH.

Reacción neta de la primera etapa: Glucosa + 2 ATP

2 gliceraldehído 3-fosfato + 2 ADP

Reacción neta de la segunda etapa: 2 gliceraldehído 3-fosfato + 2 Pi + 4 ADP + 2 NAD+ 2 piruvato + 4 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O Por lo tanto durante la glucólisis, la energía liberada por la oxidación de la glucosa resulta en la producción de ATP y NADH. Los restos carbonados del esqueleto de la glucosa que aparecen en forma de dos moléculas de piruvato continúan su oxidación en organismos aeróbicos (ciclo de Krebs) hasta CO2 y H2O con una mayor producción de ATP y NADH. En organismos o tejidos anaeróbicos, el piruvato continúa transformándose a través del proceso de fermentación, que permite la oxidación del NADH para regenerar el NAD+ necesario en la glucólisis.

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Figura 11. Esquema general de la glucólisis y la gluconeogénesis.

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Fermentación alcohólica: en presencia de las enzimas: descarboxilasa pirúvica (E1) y deshidrogenasa alcohólica (E2)

E1

E2

Cuando el forraje verde se almacena en ausencia de aire el proceso a que es sometido se denomina ensilaje y el producto final obtenido, ensilado. El lugar donde se realiza este proceso es el silo. La finalidad del proceso es conservar el material con la mayor calidad posible, conservación que se lleva a cabo por la acción del ácido láctico producido por varias bacterias y que impide el desarrollo de microorganismos que degradan los compuestos nutritivos. Una vez que el material (forraje) es cortado pueden ocurrir distintos procesos dependiendo de la presencia o ausencia de aire. En presencia de aire se produce la respiración, la cual si es prolongada puede ocasionar una disminución apreciable de los carbohidratos presentes y un considerable aumento de la temperatura. También se produce el ataque de hongos y microorganismos, que asociado a lo anterior ocasiona una pérdida del valor nutritivo. Si el aire se elimina, por ejemplo mediante compactación del material cortado, comienza el proceso llamado ensilaje, el cual puede dividirse en tres etapas fundamentales: 1) Respiración; 2) Fermentación; y 3) Estabilización. La respiración se produce hasta el momento en que se consigue la total eliminación de oxígeno. La rapidez y eficiencia con que esto se lleve a cabo depende del estado de madurez de las plantas, del contenido de humedad, del sistema de cosecha, del grado de compactación, del tipo de silo, etc. La fermentación depende de la acción de ciertos microorganismos que emplean los carbohidratos como fuente de energía para su desarrollo y multiplicación, liberando varios productos químicos entre los cuales los más importantes son: ácido láctico, ácido acético y ácido butírico. El sustrato sobre el que actúan los microorganismos son los carbohidratos solubles y también ciertos ácidos orgánicos, como el málico y el cítrico. El forraje que se va a conservar debe tener contenido relativamente elevado de carbohidratos y bajo de proteínas, para evitar que se produzcan por degradación de estas últimas, productos nitrogenados neutralizantes del ácido láctico formado. Por eso se considera al sorgo y maíz como los productos más fáciles de conservar, en tanto que a las leguminosas como las menos aptas. El medio en que se encuentran las plantas contiene distintos tipos de bacterias, cada una de las cuales tiene diferentes requerimientos para su desarrollo. El tipo de fermentación que se produzca, y por lo tanto, el producto final obtenido dependerá de las condiciones que se creen en el silo.

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Los tipos de fermentación que se pueden producir son la fermentación láctica, la acética y la butírica. La primera es la más favorable y por lo tanto hay que crear el medio propicio para que se desarrolle. Entre las bacterias que la llevan a cabo se destacan: Lactobacillus plantarum, L. bulgaricus, L. brevis, L. casei y Streptococcus lactis. La fermentación acética es producida por bacterias coliformes, y la butírica por bacterias del género Clostridium. Si se crean las condiciones necesarias para el desarrollo de las bacterias lácticas, siempre que el ambiente sea anaerobio, el pH desciende a 4 y se inhibe el desarrollo de todo otro microorganismo. No obstante el pH puede descender a 3,7 donde cesa el crecimiento de las bacterias lácticas y la masa permanece estable. Por acción de las coliformes se forma acético. El ensilado proveniente de una fermentación acética tiene color amarronado, es menos ácido, más palatable pero de menor valor nutritivo, ya que se degradan proteínas y aminoácidos. El ácido butírico no se produce si el ensilaje ocurre en las mejores condiciones. Pero cuando hay bajo contenido de hidratos de carbono o hay exceso de humedad en el momento de ensilar, los aminoácidos continúan degradándose por acción de Clostridium, hasta el estado de aminas, tales como triptamina, feniletilamina e histamina. Muchos de estos compuestos son tóxicos para los animales si pasan a la sangre. El producto final de estas degradaciones es el NH3, que al ser volátil se pierde del silo. Es decir que hay que favorecer la fermentación láctica, lo que se logra cumpliendo lo siguiente: - Temperatura de la masa entre 5º y 60ºC (rango en que actúan las bacterias lácticas). - Humedad del forraje entre 60-75%. - Impedir la entrada de aire al silo.

Fermentación láctica: en presencia de la enzima lactato deshidrogenasa.

CICLO DE KREBS: Es la etapa final en la oxidación de las moléculas nutrientes hasta dióxido de carbono y agua, con el fin de obtener energía. Esta ruta metabólica está formada por una serie de reacciones químicas cíclicas y es conocida con diferentes nombres: ciclo del ácido cítrico, ciclo de Krebs, ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA).

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Esta ruta tiene dos objetivos importantes: a) Degradar la unidad de dos carbonos (2C) de la molécula de acetilCoA a CO2, para liberar energía que se captura en forma de ATP o GTP y energía de alto poder reductor en forma de NADH y FADH2. b) Suministrar moléculas precursoras de cuatro y cinco átomos de carbono para la biosíntesis de aminoácidos, porfirinas y bases púricas o pirimídicas que forman parte de los nucleótidos. Conviene aclarar en este momento las diferencias fundamentales entre la glucólisis y el ciclo de Krebs. La glucólisis es una ruta lineal, mientras que la segunda funciona en forma cíclica. Además, las enzimas de la glucólisis se encuentran en el citosol de la célula y el proceso es de tipo anaeróbico, mientras que las enzimas del ciclo de Krebs se localizan en la matriz mitocondrial, requiriendo oxígeno para su desarrollo. Un paso previo al ciclo de Krebs es la formación de acetil-CoA a partir de la oxidación del piruvato, ácidos grasos y ciertos aminoácidos. El acetil-CoA dona los grupos acetilo (2C) que se incorporan al ciclo de Krebs mediante su condensación con una molécula de oxalacetato (4C) para formar una molécula de citrato (6C). Luego el citrato se transforma en isocitrato que al deshidrogenarse y descarboxilarse genera una molécula de cinco átomos de carbono, el alfa cetoglutarato. Este compuesto se descarboxila nuevamente dando lugar al succinato, de cuatro átomos de carbono. A continuación el succinato es convertido mediante una secuencia de tres reacciones enzimáticas en la molécula de cuatro átomos de carbono oxalacetato, con la que se inició el ciclo. Este último está listo para reaccionar nuevamente con otra molécula de acetilCoA y comenzar la segunda vuelta del ciclo. Por cada vuelta del ciclo se incorporan dos átomos de carbono provenientes del grupo acetilo y se produce la salida de dos moléculas de CO2 de carbono. Cuatro de los pasos de este ciclo son oxidaciones, en las que la energía proveniente de las mismas se conserva mediante la formación de cofactores reducidos (NADH y FADH2). En la etapa de formación del succinato a partir del succinilCoA se genera una molécula de ATP (fosforilación a nivel de sustrato), pero gran parte del ATP de la célula se produce por fosforilación oxidativa: la oxidación de los cofactores reducidos NADH y FADH2 con transferencia de electrones al aceptor final de electrones del metabolismo, el O2, y liberación de energía para impulsar la reacción: ADP + Pi

ATP

Cuando las dos moléculas de piruvato (provenientes de una molécula de glucosa degradada en la glucólisis) se oxidan completamente a través del complejo piruvato deshidrogenasa y del ciclo de Krebs, y los electrones generados en estos procesos son transferidos al O2 a través de la cadena respiratoria, se obtienen hasta 32 moléculas de ATP. La fosforilación oxidativa produce la mayor parte del ATP requerido por las células aeróbicas y está regulada por las necesidades energéticas celulares.

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Hemos visto el papel catabólico del ciclo de Krebs: en él se degrada la molécula de acetilCoA (proveniente del piruvato, aminoácidos, ácidos grasos) y genera ATP, NADH y FADH2. Pero también tiene funciones anabólicas, o sea opera tanto en el catabolismo y anabolismo, por lo que es considerada una vía anfibólica. El ciclo de Krebs es una fuente importante de precursores biosintéticos cuyos esqueletos carbonados salen del ciclo y se utilizan para la síntesis de biomoléculas importantes, tales como aminoácidos, nucleótidos y porfirinas.

Figura 12. Ciclo de Krebs o de los Ácidos Tricarboxílicos (CAT) y reacciones anexas en la matriz mitocondrial. Normalmente los grupos –COOH están ionizados (–COO-) al pH de la matriz, formando sales.

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Ruta de las Pentosas Fosfato (o del fosfogluconato): Aunque la glucólisis y la oxidación del piruvato vía ciclo de Krebs son los caminos principales de degradación de la glucosa, hay otras rutas catabólicas seguidas por la glucosa que generan compuestos necesarios para la célula. Una de ellas muy importante es la ruta de la pentosa fosfato o ruta del fosfogluconato. En esta vía se oxida la glucosa formando la pentosa ribosa 5-fosfato y energía reductora en forma de NADPH. La ribosa 5-fosfato es un precursor para la síntesis de nucleótidos, ácidos nucleicos y varios cofactores enzimáticos. El NADPH es necesario en las reacciones reductoras de los procesos biosintéticos en muchos tejidos, siendo muy prominente en tejidos donde se deben sintetizar activamente ácidos grasos y esteroides. Al igual que en la glucólisis en esta ruta se llevan a cabo procesos de oxidoreducción, aunque los productos resultantes son diferentes: Glucosa + ATP + 2 NADP+ + H2O → ribosa5-fosfato + CO2 + 2 NADPH + 2 H+ ADP

ACTIVIDADES PRÁCTICAS A REALIZAR

- DETERMINACIÓN DE CELULOSA BRUTA O FIBRA BRUTA EN UN FORRAJE, GRANO, etc. (Metodología de Weende). DISTINTAS FRACCIONES DE FIBRA CONTENIDAS EN UN FORRAJE. A) Método de Henneberg y Stohmann de la Estación Experimental de Weende, Alemania. Este método consiste en someter el forraje desengrasado a dos ataques sucesivos (primero SO4H2 al 1,25%, luego HOK al 1,25%), cuyo residuo final se llamará celulosa bruta, fibra bruta o fibra cruda (FB). Este residuo comprende un grupo algo heterogéneo de sustancias (polisacáridos, polifenoles, y algunos minerales con predominancia de silicio), cuyo único denominador es la insolubilidad primero en ácido y luego en álcali con una concentración, temperatura y tiempo determinados; el mérito mayor consiste en el hecho de estar normalizado (estandarizado) y permite comparar parámetros analíticos de los mas variados forrajes, razón por la cual se ha generalizado en todo el mundo por mas de cien años. Pero la bioquímica de los tejidos vegetales es tan compleja que no hay análisis químico capaz de describir la biodegradabilidad de la pared celular en el rumen. No existe sistema químico que pueda separar lo digestible de lo indigestible. Tal separación solo es posible con el rumen bacteriano. Tampoco hay que olvidar que lo que es indigestible para un monogástrico puede ser digerido por un poligástrico teniendo en cuenta que la mayor eficiencia va a estar limitada por el contenido de polifenoles, principalmente la lignina. Técnica: Se debe tomar el material desengrasado (muestra proveniente del cucurucho de papel donde determinamos grasa bruta ), que se coloca en un vaso de precipitación de 1000 ml, se agrega 200 ml de SO4H2 al 1,25%, se tapa con vidrio de reloj y se calienta a ebullición durante 30 minutos. Este ácido produce hidrólisis de gomas, almidón, azúcares simples, etc., solubilizándolos. Luego se filtra “a la trompa” y se lava con agua

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caliente hasta reacción neutra. El residuo se vuelve a tratar en el vaso con 200 ml de HOK al 1,25 %, se lleva a ebullición durante 30 minutos. El HOK hidroliza las proteínas. Se filtra y lava hasta reacción neutra. El residuo se coloca en una cápsula tarada, se evapora el agua a baño maría, se seca en estufa y se pesa: cápsula + celulosa = tara cápsula = Celulosa bruta

=

g, se expresa en %.

La fracción denominada celulosa bruta o fibra bruta, del sistema de análisis de Weende, comprende celulosa, lignina, pentosanos, hemicelulosas, y minerales. Esta fracción tiene importancia en el análisis del valor nutritivo de un alimento, pues está directamente relacionada con la digestibilidad. Los demás Hidratos de C que se encuentran en un alimento o forraje, se ubican en la fracción denominada extractivos no nitrogenados (ENN), o también llamada Hidratos de Carbono totales, y se calcula por diferencia entre 100 y los demás componentes hallados en el análisis del forraje según el Sistema Weende: ENN = 100 - (Humedad + Cenizas + Grasa bruta + Prot. bruta + Celulosa bruta) Esta fracción de ENN está compuesta por azúcares simples, fructosanos, almidón, pectinas, ácidos orgánicos, pigmentos y vitaminas hidrosolubles, etc. B) Método de Van Soest y Moore. Este método parte de las siguientes consideraciones: 1. Contenido celular: azúcares, almidón, proteínas, ácidos orgánicos y lípidos + pectina que si bien pertenece a la pared celular se la incluye por ser muy digestible. Digestibilidad de esta fracción: 98 % aprox. 2. Contenido de la pared celular: 2.1. Polisacáridos estructurales: celulosa y hemicelulosa. Fracción variablemente digestible. 2.2. Lignina, cutina, silicio, taninos (estos últimos inhibidores de enzimas como la proteasa y la celulasa). Fracción prácticamente indigestible. Tales consideraciones han llevado a Van Soest y colaboradores a elaborar el sistema de detergentes con el fin de separar las tres fracciones descriptas anteriormente.

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ESQUEMA BÁSICO DEL SISTEMA DE DETERGENTES EN EL MÉTODO DE VAN SOEST. Reactivos

Proceso

Compuestos solubles

Fracción residual

1. Lauril sulfato de sodio EDTA - pH 7

hervir 1 hora

contenido celular + pectinas

FDN (pared celular menos pectinas)

2. Bromuro de cetil trimetil amonio en SO4H2 1 N

hervir 1 hora

hemicelulosa

FDA (celulosa + lignina)

3. SO4H2 al 72 %

20ºC 3 hs.

celulosa

LDA (lignina cruda)

FDN = Fibra Detergente Neutro FDA = Fibra Detergente Ácido LDA = Lignina Detergente Ácido FDN - FDA = hemicelulosa La digestibilidad de la pared está muy influenciada por el contenido de lignina y silicio, por ejemplo forrajes con el 10 % de lignina son digestibles en el 68 % y forrajes con 50 % de lignina son digestibles solo en un 13 %. En gramíneas el silicio también es importante pues hace perder un 3 % de digestibilidad por cada 1 % de silicio.

Bibliografía consultada: -

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Malkin, R., Niyogi, K. 2000. Chapter 12. ‘Photosynthesis’ in: Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Buchanan, B. B., Gruissem, W., Jones, R. L. (Eds.). American Society of Plants Physiologists. Rockville, Maryland, USA. Sharkey, T. D. 1993. Capítulo 5. “Fotosíntesis. Metabolismo del carbono en cloroplastos de plantas C3” en: Fisiología y Bioquímica Vegetal. Azcón-Bieto, J., Talon, M. (coord.). Interamericana Mc Graw-Hill. Madrid. España. Stryer, L. 1990. Bioquímica. 3ª edición. Tomo I. Editorial Reverté S. A. Barcelona. España.

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UNIDAD 7. LÍPIDOS Los lípidos son compuestos ricos en C e H que se solubilizan en solventes no polares como benceno, éter y cloroformo y raramente en agua. Están presentes en todas las células vivas. Comprenden una gran variedad de diferentes estructuras, de las cuales la mayoría contiene ésteres de ácidos grasos y alcoholes, aunque en algunos pocos casos los ácidos grasos están presentes en uniones éteres. Clasificación: Lípidos simples

Lípidos complejos (lípidos polares)

acilgliceroles (glicéridos) ceras fosfolípidos glicolípidos esfingolípidos

Asociados a los lípidos: esteroles, carotenoides, vitaminas liposolubles, etc. Distribución en los vegetales: los lípidos presentes en las partes vegetativas consisten principalmente en fosfolípidos y glicolípidos; ambos funcionan como componentes de las membranas. Por otro lado los tejidos reproductivos como las semillas, y en algunos casos frutos, acumulan gran cantidad de glicéridos que constituyen una reserva de energía metabolizable y de precursores biosintéticos. En general, los glicéridos y los lípidos complejos de las membranas contienen el mismo tipo de ácidos grasos. Función en los vegetales: 1.- Como componentes de las membranas celulares. Función desempeñada por fosfolípidos, glicolípidos y esfingolípidos. 2.- Como reserva. Es el caso de los glicéridos acumulados en las semillas que durante la germinación se hidrolizan (lipólisis) por acción de enzimas (lipasas) dando ácidos grasos que luego serán catabolizados liberando energía y precursores sencillos que serán utilizados para la biosíntesis de nuevos compuestos (especialmente carbohidratos). 3.- Como agentes de protección de células epidérmicas de hojas, frutos y otros tejidos. Es el caso de las ceras. ÁCIDOS GRASOS Son los componentes fundamentales de los lípidos, y es debido a ellos que los lípidos son más solubles en solventes orgánicos que en agua, ya que sus largas cadenas hidrocarbonados son básicamente hidrofóbicas. A pesar de que se han aislado más de 300 ácidos grasos distintos de diversas células, los más abundantes son muy pocos. Generalmente son de cadena lineal aunque existen ácidos grasos de cadena ramificada y también cíclica. Todos poseen un grupo carboxilo terminal, y en algunos casos poseen otro grupo químico que modifica la solubilidad y reactividad del ácido graso. La cadena puede ser saturada o bien contener uno o más enlaces dobles. Estos dobles enlaces no están en posición conjugada sino separados por un grupo metileno ( C CH CH2 CH C ). H

H

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Unos pocos ácidos grasos contienen triples ligaduras. Casi todos poseen un número par de átomos de carbono; los más difundidos tienen entre 12 a 24 átomos de C, siendo más abundantes los de 16 y 18 átomos de carbono. Estructura general: CH3 - (CH2)n - COOH Nomenclatura abreviada: una forma sencilla para referirse a los ácidos grasos es la siguiente: 2 números separados por dos puntos. El primer número corresponde al número de C de la cadena, y el segundo al número de dobles ligaduras. Ejemplos: Acido láurico (12 C y saturado) = 12:0 Acido oleico (18 C y monoinsaturado) = 18:1

Los ácidos grasos más comunes son los de 16 y 18 átomos de C saturados y no saturados. Los ácidos grasos de bajo número de átomos de C (hasta 10 C) se denominan ácidos del grupo butírico o de la manteca por su abundancia en los glicéridos de la leche de vaca, ellos son: butírico (4:0) caproico (6:0) -caprílico (8:0) - cáprico (10:0). Los tres últimos están presentes en el aceite de coco y palma. Los ácidos grasos de más de 20 átomos de C se encuentran especialmente en las ceras. Los lípidos de las semillas y otros tejidos de plantas de varias familias del orden Malvales se caracterizan por la presencia de ácidos grasos que contienen un anillo saturado o insaturado de 3 átomos de C (ciclopropeno). Ejemplo: ácidos grasos presentes en semillas de algodón (Gossypium hirsutum) CH 3 CH2 C 7

C CH2 COOH 6 CH 2

ácido malválico

CH3 CH2 C 7

C CH2 COOH 7 CH2

ácido estercúlico

Ácidos grasos presentes en especies de Malvaceae y Sterculiaceae

Propiedades físicas de los ácidos grasos: - Solubilidad: solamente los ácidos grasos de cadena muy corta son solubles en agua. A partir del ácido caproico (6:0) son fundamentalmente insolubles en agua. Son solubles en disolventes orgánicos. - Los ácidos grasos de 4 a 12 C son volátiles. - Los ácidos grasos de más de 12 C no son volátiles. - Punto de fusión: a la temperatura ordinaria los ácidos grasos se encuentran en estado líquido si el número de C es inferior a 10, y a partir de 10 C se hallan en estado sólido. A mayor número de átomos de C, mayor es el punto de fusión. La presencia de enlaces dobles disminuye el punto de fusión de los ácidos grasos no saturados en relación con el correspondiente ácido graso saturado. Así por ejemplo, el punto de fusión del ácido esteárico es de 69,6º C, mientras que el del ácido oleico es de 13,4° C. - Punto de ebullición: aumenta al aumentar el largo de la cadena. - Propiedades espectrales: son incoloros, no muestran absorción de luz en la zona del espectro visible.

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Propiedades químicas de los ácidos grasos: 1.- Propiedades relacionadas con la presencia del grupo carboxilo: 1.1.- Formación de sales (sales alcalinas: jabones). 1.2.- Formación de ésteres: se preparan especialmente ésteres metílicos (volátiles) que permiten la separación de los distintos ácidos grasos por cromatografía gaseosa. 2.- Propiedades relacionadas con la presencia de dobles ligaduras: 2.1.- Reacciones de adición. 2.1.a.- Adición de un halógeno: éste se adiciona en los dobles enlaces, por lo tanto, a mayor número de dobles ligaduras mayor será la cantidad de halógeno adicionado. Esta propiedad se aplica en la determinación de índice de Iodo que se utiliza para determinar la secantabilidad de un aceite. 2.1.b.- Hidrogenación: conduce a la formación del correspondiente ácido graso saturado (base de la obtención de margarinas). 2.2.- Oxidación. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDOS GRASOS Como los ácidos grasos tienen número par de átomos de C, tanto la oxidación (degradación) como la síntesis, se produce por pérdida o ganancia respectivamente de unidades de 2 C. En los tejidos animales y vegetales, la síntesis incluye: . acetil-CoA (2 C) . malonil-CoA (3 C) . una coenzima llamada proteína portadora de acilos (PPA-SH) . un conjunto de enzimas llamado complejo sintetasa de ácidos grasos. . NADPH El malonil-CoA se forma a partir del acetil-CoA y del CO2:

El sistema de enzimas cataliza la siguiente reacción global:

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Una única molécula de acetil-CoA sirve como iniciador y contribuye sólo con 2 C iniciales de la cadena del ácido palmítico. La cadena se va formando por sucesivas incorporaciones de unidades de 2 C provenientes del malonil-CoA (el tercer C del malonilCoA se pierde como CO2). Como algunas de las etapas intermedias en la síntesis de ácidos grasos implican reducción, actúa el NADPH como agente reductor.

Esquema general de la biosíntesis:

Localización intracelular de la biosíntesis: en los vegetales los ácidos grasos se sintetizan en los cloroplastos. En cambio, en los animales la síntesis se realiza en el citosol de la célula. DEGRADACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS En los animales los triacilgliceroles juegan un rol extremadamente importante en la provisión de energía. De todos los nutrientes, los triacilgliceroles, son los que poseen mayor contenido de energía (alrededor de 9 kcal/g); ellos pueden ser almacenados en los tejidos adiposos por mucho tiempo. Los carbohidratos consumidos en exceso, debido a la limitada capacidad del cuerpo para almacenar glicógeno, son convertidos en triacilgliceroles para ser almacenados. Alrededor del 95% de la energía biológicamente disponible de los trigliceroles, reside en sus 3 largas cadenas de sus ácidos grasos; sólo el 5% es contribuido por el glicerol. En los tejidos animales, la oxidación de los ácidos grasos, tiene lugar en las mitocondrias de las células y comparte un camino final común con la oxidación de los carbohidratos: el ciclo de Krebs. Es decir que en los animales los ácidos grasos son oxidados finalmente a CO2 y H2O. En los vegetales, durante el proceso de germinación (especialmente en semillas oleaginosas), los acilgliceroles acumulados, se hidrolizan por acción de lipasas y los ácidos grasos liberados se oxidan en orgánulos subcelulares propios de las semillas oleaginosas llamados glioxisomas. Este proceso está relacionado, más que con la producción de energía, como en los animales, con la conversión del aceite en carbohidratos a través del ciclo del glioxilato. El producto final de esta conversión lípido-glúcido es la sacarosa, ya que ésta es el azúcar de traslocación en los vegetales. El proceso mediante el cual carbonos no glucídicos se transforman en carbonos glucídicos se denomina gluconeogénesis.

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El proceso más importante para la degradación de los ácidos grasos tanto en animales como en vegetales, es la β-oxidación, mediante el cual los ácidos grasos son degradados hasta acetil-CoA. Este entra en el ciclo de Krebs (en animales) o en el ciclo del glioxalato (en vegetales). El proceso se llama β-oxidación porque el Cβ es atacado y oxidado primero. En este proceso, primero los ácidos grasos son activados por esterificación con la coenzima A para formar ésteres de acil-CoA.

Para remover cada residuo de acetil-CoA son necesarias 4 reacciones químicas, algunas de las cuales implican oxidaciones, por eso actúan el NAD+ y FAD como aceptores de electrones. Esquema general de la β-oxidación de los ácidos grasos

(Ácido palmítico activado)

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CICLO DEL GLIOXILATO Las plantas superiores y algunos microorganismos presentan enzimas para llevar a cabo esta vía metabólica, por la cual utilizan el acetato como fuente de energía y precursor biosintético. El ciclo del glioxilato, es una variación o modificación del ciclo de Krebs, en el cual se forma succinato (C4) a partir de dos moléculas de acetil-CoA. En las plantas los enzimas del ciclo del glioxilato en encuentran localizados en los glioxisomas, que se desarrollan en semillas ricas en lípidos durante la germinación, antes que las plantas alcancen un desarrollo como para sintetizar glucosa por medio de la fotosíntesis. En estos casos los grupos acetil-CoA provienen de la degradación de los ácidos grasos presentes en los lípidos (aceites) de las semillas. Por lo tanto, las plantas durante la germinación, pueden convertir el carbono de los lípidos en glucosa.

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Separación de ácidos grasos El análisis de las complejas mezclas de ácidos grasos obtenidas por hidrólisis de los lípidos se realiza mediante la cromatografía gaseosa. Esta técnica consiste en arrastrar los ésteres metílicos de los ácidos grasos, que son volátiles, a través de una larga columna capilar. La superficie interna de la columna se halla recubierta de una fase líquida estacionaria y el transportador que arrastra los ésteres metílicos a través de la columna es un gas que puede ser nitrógeno o helio.

GLICERIDOS (Acilgliceroles). En los alimentos son los lípidos más importantes. Son los ésteres del alcohol glicerol y los ácidos grasos. Se los llama también grasas neutras. Cuando los glicéridos son líquidos a temperatura ambiente se los acostumbra llamar aceites y si son sólidos grasas.

Los glicéridos naturales, tanto animales como vegetales, son generalmente mezclas complejas de triglicéridos (están esterificados los tres OH- de la glicerina) simples (es el mismo ác. graso que esterifica la glicerina) y mixtos (por lo menos dos de los ácidos grasos son distintos). En las grasas, la mayoría de los ácidos grasos son saturados (palmítico, esteárico, etc.); en cambio en los aceites la mayoría son no saturados como oleico, linoleico y linolénico. Los glicéridos están muy difundidos en el reino vegetal. Se encuentran en partes vegetativas y reproductivas de las plantas, aunque las estructuras vegetativas sólo contienen pequeñas cantidades, mientras que las reproductivas como semillas contienen cantidades mucho mayores y generalmente representan una importante reserva alimenticia para la germinación de la semilla. En éstas se almacenan en la mayoría de los casos en cotiledones, gérmen o endosperma o en ambas a la vez. Contenido de aceites de las principales oleaginosas: Soja ………..18% Algodón …...33% Lino ………..37% Girasol ……..42% Palma ……….47% Propiedades físicas de los glicéridos: Solubilidad: son insolubles en agua y solubles en solventes no polares (benceno, éter, cloroformo, etc.). Densidad: menor a la del agua. Punto de fusión: depende de su composición en ácidos grasos. Propiedades químicas de los glicéridos: 1.- Pueden hidrolizarse, y esta hidrólisis puede ser:

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1.1.- Enzimática: producida por lipasas de un aceite. Estas enzimas se encuentran en las semillas especialmente de oleaginosas y producen la liberación de ácidos grasos. La determinación del contenido de ácidos grasos libres en semillas oleaginosas es el fundamento de la determinación de la "acidez" de dichas semillas. En los animales, la degradación de los glicéridos en el aparato digestivo, también se produce por acción de lipasas. 1.2.- Ácida: producida por ácidos como sulfúrico, clorhídrico, etc. 1.3.- Alcalina: se llama saponificación. En este caso los ácidos grasos aparecen en forma de sal o jabón. Esta hidrólisis es de aplicación industrial. Además permite caracterizar a los glicéridos por su índice de saponificación. 2.- Pueden oxidarse. 2.1- los ácidos grasos no saturados en presencia de oxígeno se oxidan dando peróxidos, los cuales pueden secundariamente polimerizarse (mecanismo que entra en juego en el empleo de aceites secantes en pintura).

La oxidación del doble enlace puede conducir a la ruptura de la unión peroxídica, liberando aldehídos, cetonas y ácidos grasos volátiles que son la causa del olor rancio, desagradable, de las materias grasas oxidadas, es decir:

2.2.- los ácidos grasos saturados en presencia de oxígeno y por calentamiento pueden oxidarse dando lugar a la formación de ácidos cetónicos que liberarán por descarboxilación metil cetonas. Este tipo de oxidación se produce en grasas ricas en ácidos grasos de bajo peso molecular como la manteca y los aceites de coco y palma. Varios microorganismos del tipo Penicillium, utilizados en la elaboración de determinados quesos como el Camembert y el Roquefort, realizan estas transformaciones, y las metil cetonas liberados, tienen un gusto y olor bien definidos. Los antioxidantes son compuestos que demoran el comienzo de la oxidación de los glicéridos y por lo tanto mejoran la vida útil del alimento. Ejemplos de antioxidantes: tocoferoles (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), algunos compuestos fenólicos, etc.

Extracción y valoración de aceites: El método usual de análisis para determinar contenido de materia grasa es por medio de la extracción con solventes, usando extractores especiales y derminando gravimétricamente contenido de materia grasa (Ver Actividades prácticas). También se pueden utilizar métodos que insumen menor tiempo, en los cuales, la extracción se realiza también con un solvente apropiado, pero se miden ciertas propiedades físicas como índice de refracción, densidad, etc. que dependen de la concentración de la materia grasa. Otros métodos: infrarrojo cercano (NIR) y resonancia nuclear magnética. Son métodos modernos que requieren aparatos más sofisticados.

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Biosíntesis de los glicéridos “nexo de unión entre/ metabolismo de glúcidos y lípidos”

CERAS Químicamente incluyen una variedad de compuestos de alto número de átomos de carbono, ricos en hidrógeno y pobres en oxígeno. La composición de las ceras vegetales varía mucho de una especie a otra. La mayoría contienen ácidos grasos saturados de cadena larga esterificados con alcoholes de cadena larga. También contienen alcoholes libres, aldehídos y ácidos grasos libres e hidrocarburos de alto peso molecular (cadenas de 25 a 35 átomos de carbono). En los vegetales las ceras forman parte del revestimiento exterior, es decir de la cutícula, aunque también se encuentran ceras internas. En animales también están como recubrimiento protector de la piel, pelo y plumas y sobre el exoesqueleto de muchos insectos; las abejas las utilizan como material de construcción de sus panales. Propiedades: son sólidas a temperatura ordinaria y tienen un punto de fusión elevado (80ºC). Son compuestos más resistentes a la hidrólisis que los glicéridos y difícilmente saponificables (tienen bajos índices de saponificación). Como la casi totalidad de sus integrantes son saturados, carecen de la reactividad propia de los dobles enlaces. Debido a estas características es que desempeñan funciones de protección. Función: las ceras (junto con la cutina y suberina) representan una barrera entre la planta y el medio; por eso es que desempeñan un importante rol en la interacción entre ambos. La mayor función es constituir una barrera física reduciendo por lo tanto la pérdida de agua en los vegetales. Además, protegen al vegetal contra la entrada de hongos y otros microorganismos. Las ceras carecen de valor alimenticio, en los vegetales la degradación de las ceras no tiene un papel fisiológico fundamental, a excepción de los raros casos donde los ésteres de las ceras constituyen la mayor reserva de energía de la semilla, como el caso de la germinación de la semilla de jojoba.

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Biosíntesis: las largas cadenas alifáticas de los ácidos presentes en las ceras (C20 C30) son formadas por elongación de las cadenas de ácidos grasos (C18). La elongación de las cadenas requiere malonil-CoA, como agente de elongación y NADPH como agente reductor.

CUTINA Y SUBERINA Las plantas tienen como componente estructural de su envoltura exterior (cutícula) una sustancia polímera relacionada con los lípidos llamada cutina. Mientras que las partes subterráneas y las superficies lesionadas y cicatrizadas están protegidas por otro tipo de material polimérico derivado también de los lípidos llamado suberina y que se encuentra estrechamente asociada a la pared celular. En ambos casos, los polímeros están embebidos o asociados con ceras.

Representación esquemática de la cutícula de la planta:

LIPIDOS COMPLEJOS (LIPIDOS POLARES) Se los llama polares porque tienen una cabeza polar (puede tener carga) y 2 colas hidrocarbonadas no polares (tanto los fosfolípidos como los glucolípidos). Poseen en su composición, además de C, H y O (como los simples) uno o más elementos adicionales, generalmente P, N y pocas veces S. Son de composición muy variable y sólo tienen en común la existencia de ácidos grasos entre los cuales son muy frecuentes los no saturados. Fosfolípidos: están presentes en todas las células vivas como componentes de las membranas. Estructuralmente todos tienen P en la forma PO4H3 esterificado. La mayoría son fosfoglicéridos, es decir, poseen glicerol en su composición. Estructuras de los glicerofosfolípidos más difundidos en vegetales:

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El ácido fosfatídico, aunque es un metabolito intermediario muy importante, se encuentra en pequeñas cantidades. Fosfatidil colina es el principal fosfolípido en la mayoría de los tejidos vegetales. Fosfatidil serina se encuentra muy difundido pero es un glicerofosfolípido menor. Los monoacilglicerofosfolípidos (con sólo un ácido graso), llamados lisoderivados, han sido encontrados en varios tejidos, y la lisofosfatidilcolina representa un importante glicerofosfolípido en granos de cereales. Glucolípidos: son importantes especialmente en hojas verdes, donde sus concentraciones superan ampliamente a los fosfolípidos; las membranas de los cloroplastos son especialmente ricas en glicolípidos. Ellos contienen hidratos de carbonos hidrofílicos y polares. Los más importantes de las plantas son los galactosil diglicéridos, se encuentran como mono y di galactosil.

CH2OH O HO O H H OH H H H

OH

CH2 CH O OC R1

Glicolípidos

CH2 O OC R2

R1 y R2 son siempre ácidos grasos no saturados, especialmente ácidos linolénico. Los cerebrósidos son glicolípidos que también se encuentran en vegetales (antes se creía que eran exclusivamente animales). No se conoce su función en los vegetales. A los cerebrósidos se los incluye dentro de los lípidos complejos llamados esfingolípidos.

Glucocerebrósido (Glucolípido)

También se encuentran en las plantas glicolípidos que además tienen azufre; el más importante es el sulfo quinovosil-diglicérido:

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CH2 SO3 O HO O H H OH H H H

OH

Sulfo quinovosil-diglicérido CH 2 CH O OC R 1 CH 2 O OC R 2

El azúcar quinovosa (6-deoxiglucosa) lleva el grupo con S en posición 6. Se encuentra en las membranas de los cloroplastos de las plantas.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS A REALIZAR: DETERMINACIÓN DE MATERIA GRASA BRUTA EN FORRAJES, GRANOS, etc. Se opera sobre 10 gramos de sustancia (en nuestro caso muestra forrajera ya estabilizada), que se colocan en un cucurucho de papel, tratándola con un disolvente (éter, benzol, etc.) en un extractor Soxhlet hasta total agotamiento. El extractor Soxhlet se compone de: refrigerante, un extractor propiamente dicho y un matraz donde se recoge el disolvente con la materia grasa (que debe ser previamente pesado). Luego de la extracción (que puede durar una a tres horas según el material) se evapora el disolvente, se seca el matraz con la grasa en estufa a 100-105ºC, enfría en desecador y se pesa: Matraz + grasa Tara del matraz

= = ___________

Materia grasa bruta =

x 10 =

El peso encontrado corresponde a la fracción denominada grasa bruta o extracto etéreo y comprende todas las sustancias solubles en los disolventes de las grasas: glicéridos, ácidos grasos, fosfolípidos, ceras, esteroles, vitaminas liposolubles, pigmentos liposolubles, etc. Salida de agua Condensador Entrada de agua Cartucho de papel Material sólido Material en contacto con solvente

Vapores de solvente Solvente líquido

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DEGRADACIÓN DE TRIGLICERIDOS MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA LIPASA PRESENTE EN SEMILLAS DE RICINO.

Las semillas de muchas plantas contienen triglicéridos como la mayor fuente de reserva de carbono. En algunas, como en las semillas de ricino, se acumulan en el endosperma, mientras que en otras, se almacenan en los cotiledones. Durante la germinación, se produce un rompimiento masivo de estos triglicéridos de reserva insolubles, convirtiéndose finalmente en carbohidratos solubles que son transportados a los tejidos en crecimiento para aportar carbonos estructurales y energía. El primer paso en la utilización de los triglicéridos almacenados es una hidrólisis para dar ácidos grasos libres y glicerol. Esta hidrólisis es llevada a cabo por enzimas específicas llamadas lipasas (hidrolasas) que actúan en una interfase aceite-agua. O O R

CH2 O C O CH CH2

C R O

O

C R

triglicérido

lipasa

CH2 OH

+

HO CH

3 H 2O

CH2

O

3 CH 3 O HC R

OH

glicerol

ácidos grasos

Se puede comprobar la acción de las lipasas a través del análisis de los ácidos grasos liberados. En las semillas se han encontrado dos tipos de lipasas: 1) ácidas (caso de las semillas de ricino) que necesitan un pH ácido para actuar. 2) alcalinas, en donde el pH óptimo es alcalino (la mayoría de las semillas oleaginosas) Las lipasas de las semillas de ricino son las más estudiadas. Se encuentran convenientemente localizadas en relación con su sustrato en las membranas de los esferosomas (cuerpos oleosos) presentes en el endosperma.

En la siguiente experiencia se titulan los ácidos grasos liberados por la acción de la lipasa contenida en las semillas de ricino, determinándose indirectamente, la actividad enzimática. 1- Se toman 2 g de semillas de ricino y se colocan en un vaso de precipitación donde se trituran. Se le agrega 5 ml de aceite comestible y 5 ml de agua destilada, dejándolo a la temperatura ambiente durante una hora. 2- Se toman otros 2 g de la misma semilla y se repite la operación anterior. Se le agrega 5 ml de aceite, 4 ml de agua destilada y 1 ml de ácido acético 0,1 N, dejándolo a la temperatura ambiente durante una hora. 3-Se prepara un testigo colocando en un vaso de precipitación 5 ml de aceite, 4 ml de agua destilada y 1 ml de ácido acético 0,1 N, dejándolo a la temperatura ambiente durante una hora.

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Tener la precaución de preparar simultáneamente todo el sistema. Después del tiempo indicado se agrega a cada vaso 20 ml de alcohol de 95º previamente neutralizado. Se agita, se agregan unas gotas de fenolftaleína y se titula con KOH 0,1 N. (Para neutralizar el alcohol se agregan gotas de fenolftaleína y luego KOH 0,1 N hasta coloración rosada).

BIBLIOGRAFÍA - Fennema, Owen R. Food Chemistry. 1985. - Gustone, Frank D. and Frank A. Norris. Lipids in Foods. Chemistry, Biochemistry and Technology. 1983. - Lehninger, Nelson y Cox. Principios de Bioquímica. 1995. - Stryer, L. Bioquímica. 1990. - Stumpf and Conn. The Biochemistry of Plants. Vol. 4. Lipids. 1980.

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UNIDAD TEMATICA 8. AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS Ciclo del nitrógeno. Aprovechamiento del nitrógeno por los distintos organismos vivos. Por lo general los compuestos de nitrógeno soluble y utilizable biológicamente escasean en el entorno natural. Por este motivo la mayor parte de los organismos mantienen una estricta economía en el uso del amoníaco, aminoácidos y ácidos nucleicos. La fuente más importante de nitrógeno es el aire, en cuya composición hay alrededor de 80 % de nitrógeno molecular (N2). Pero muy pocas especies pueden convertir ese N atmosférico en formas utilizables por los organismos vivos. En la biosfera, los procesos metabólicos de las diferentes especies actúan de forma interdependiente para recuperar y reutilizar el nitrógeno disponible biológicamente a través del ciclo del nitrógeno. Este ciclo abarca varios pasos o etapas como la fijación del N atmosférico, nitrificación, desnitrificación, síntesis de aminoácidos y otros compuestos de nitrogenocarbono reducidos, degradación de éstos y vuelta del N molecular a la atmósfera. La fijación del N atmosférico, o sea su reducción a NH4+, solo la pueden efectuar algunas bacterias y arqueobacterias del suelo y de las aguas dulces y saladas. Entre las bacterias libres que viven en el suelo y son fijadoras de N2 hay especies de los géneros Klebsiella, Azotobacter y Clostridium, así como cianobacterias que se encuentran en el suelo y en el agua. Las principales bacterias simbióticas que también fijan N2 pertenecen al género Rhizobium y asociadas a plantas de la familia de las leguminosas. Esta fijación biológica está catalizada por enzimas especializadas del “complejo de la nitrogenasa”. La nitrificación es la oxidación del NH4+ a NO2- y NO3- por las bacterias Nitrosomonas y Nitrobacter. Las plantas superiores asimilan N como NO3- o como NH4+. El N también puede llegar al suelo durante las tormentas eléctricas, las descargas de alto voltaje catalizan la oxidación del N2 a NO3-. La desnitrificación bacteriana permite la reducción del NO3- a N2 que vuelve a la atmósfera. Otra forma de transformar N2 de la atmósfera en N asimilable por las plantas es por acción del hombre al fabricar urea y utilizarla como fertilizante, uno de los fertilizantes nitrogenados más extensamente usados en el mundo. Su síntesis se realiza a partir de aire (fuente del N), temperaturas de 400-400º C y presiones de varios centenares de atmósferas. Aminoácidos Las proteínas están constituidas, salvo excepciones, por 20 aminoácidos diferentes, los cuales responden a la siguiente estructura básica:

Se deben considerar dos aspectos en su estructura: una común a todos ellos y otra, única para cada uno. Requisito fundamental en la estructura primaria de todos los

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aminoácidos, es que sean capaces de unirse con otro aminoácido en cada uno de sus extremos para formar un polímero largo, continuo y sin ramificaciones, denominado cadena polipeptídica. A fin de efectuar el proceso de unión, cada aminoácido tiene un grupo carboxílico y un grupo amino, separados por un carbono alfa. El carbono alfa de un aminoácido, como cualquier átomo de carbono, es capaz de formar uniones sencillas con otros cuatro átomos. El arreglo que presentan los grupos alrededor del átomo de carbono se ilustra en la siguiente figura:

D - ALANINA L - ALANINA En la misma se observa que el átomo de carbono está en el centro de un tetraedro y los grupos de enlace se proyectan hacia las cuatro esquinas. Si todos los grupos enlazados al átomo de carbono son diferentes, como en el caso del carbono alfa de los aminoácidos, con excepción de la glicina, entonces existen dos posibles configuraciones, las cuales no pueden superponerse. Estos dos posibles arreglos llamados estereoisómeros o enantiómeros, representan al mismo aminoácido, pero más que una molécula idéntica son como imágenes en un espejo. Ambos presentan rotación de la luz polarizada pero en dirección opuesta; es decir, son ópticamente activos. Uno es la configuración L y otro la D. Algunos aminoácidos son dextrogiratorios (+) y otros levogiratorios (-) en cuanto a la desviación del plano de luz polarizada. Las formas isoméricas de un aminoácido son idénticas en todas las propiedades físicas y químicas excepto una, la dirección en la que provocan el giro del plano de la luz polarizada en un polarímetro. Todos los aminoácidos aislados de proteínas, independientemente de su origen, ya sean animales, vegetales, etc., son L aminoácidos (salvo la glicina). Una pregunta muy interesante y discutida es por qué no se encuentran proteínas con D-aminoácidos. Todo parece indicar que los sistemas biológicos son específicos para uno u otro enantiomorfo. Pasteur descubrió este fenómeno hace ya bastante tiempo cuando mezcló aminoácidos L y D en el medio de cultivo de bacterias, encontrando que cuando estas detenían su crecimiento, el medio carecía por completo de los L-aminoácidos y sólo permanecían los D-aminoácidos. Es obvio que las enzimas que seleccionan los aminoácidos con objeto de incorporarlos a las proteínas eran capaces de distinguir entre las dos formas sin cometer errores. Los aminoácidos dentro de una cadena polipeptídica, están unidos por sus grupos carboxilo y amino de sus extremos, para formar los enlaces peptídicos. Como resultado, las cadenas polipeptídicas se caracterizan por tener un esqueleto de la siguiente naturaleza:

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Una vez que los aminoácidos han quedado incorporados en la cadena polipeptidica, se enominan residuos. En un extremo de la cadena polipeptídica existe un residuo con un grupo carboxilo libre (no enlazado) denominado extremo C-terminal, mientras que en el extremo opuesto de la cadena hay un residuo con un grupo amino libre y dicho extremo se denomina N-terminal. El esqueleto de la cadena está formado por aquella parte de cada aminoácido común en todo polipéptido y el resto de cada aminoácido, denominado grupo R o cadena lateral, varía grandemente. Esta variabilidad, da a las proteínas su versatilidad. Al considerar todos los aminoácidos se advierte que la variabilidad de reacciones orgánicas en que pueden participar es muy grande, así como los tipos de uniones que pueden formar son muchas. Las diversas características de los grupos R de los aminoácidos son de suma importancia en las reacciones intermoleculares, las cuales son determinantes para llevar a cabo las funciones de las proteínas, como así también en las reacciones intramoleculáres, las cuales determinan la estructura de la molécula. Con 20 unidades disponibles, el número de cadenas polipeptídicas diferentes entre sí es de 20n, siendo n el número de aminoácidos en la cadena. Como la mayor parte de las cadenas polipeptídicas tienen más de cien aminoácidos, la variedad en que pueden presentarse es ilimitada; sin embargo, sólo un pequeño porcentaje de posibles secuencias tiene la estructura necesaria para realizar una actividad específica. Las proteínas que están presentes han evolucionado a través de la selección natural y, por ende, son las que están codificadas en el ADN de los organismos existentes sobre la tierra. Se considerarán a continuación las características de los aminoácidos que están relacionados con la estructura proteica y su función. Propiedades de los aminoácidos Los aminoácidos en disolución acuosa están ionizados como ácidos o como bases. El conocimiento de las propiedades ácido-básicas de los aminoácidos es extremadamente importante en la comprensión de muchas propiedades de las proteínas. Dicha propiedad se tiene en cuenta en el momento de separar, identificar y valorar los

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diferentes aminoácidos; siendo estas etapas necesarias en la determinación de la composición y secuencia de aminoácidos en una molécula de proteína. Los aminoácidos que solo poseen un grupo amino y un grupo carboxilo, pueden cristalizar de las disoluciones acuosas neutras en especies totalmente ionizadas llamadas ion dipolar o zwitterión. Aunque tales iones dipolares son eléctricamente neutros y no se desplazan en el campo eléctrico, poseen cargas opuestas en sus polos. Los aminoácidos pueden actuar como ácidos o como bases. Se define como grupo ácido aquel que es capaz de donar su protón (ion hidrógeno) y como grupo básico aquel que es capaz de aceptar un protón. Todos los aminoácidos poseen un grupo carboxílico y un grupo amino, por lo tanto son al mismo tiempo ácidos y bases, sin embargo, un aminoácido en solución acuosa nunca se encuentra en la forma sin carga, sino que varía entre tres estados ionizados:

+

R

O C

H3N C H

OH

[OH ]

O

O

+

[H ]

[OH ]

R +H N 3

C C H

R C

H2N O

[H+ ]

C

O

H

El pH del medio donde se encuentran define que una molécula exista en un estado iónico en particular. Suponiendo que un aminoácido, por ejemplo la glicina, se encuentra disuelto en una solución fuertemente ácida; en presencia de altas concentraciones de iones hidrógeno, la disociación del protón del grupo carboxílico queda suprimida y el grupo amino queda protonado; en este caso el aminoácido tiene carga positiva, si poco a poco se agrega NaOH a la solución, se incrementa en forma paulatina el número de moléculas de glicina cuyo grupo carboxílico se ha desprotonado. A medida que se disocian los protones de los grupos carboxílicos, aumenta el número de moléculas que están doblemente cargadas o que son dipolares; denominadas anfotéricas. Llegado al pH fisiológico, casi todas las moléculas son dipolares y, por lo tanto, eléctricamente neutras. Si continúa la titulación con NaOH (hacia límites alcalinos) los protones son eliminados del grupo amino, protonado con anterioridad, provocando que el aminoácido pierda su carga positiva y tenga ahora un exceso de carga negativa. Las propiedades iónicas de los grupos carboxílicos (aniónico) y amino (catiónico) del carbono alfa son de poca importancia para la estructura de la proteína, ya que, con excepción de los aminoácidos presentes en cada extremo de la cadena polipeptídica, estos grupos han desaparecido al formarse los enlaces peptídicos que forman la estructura primaria de la proteína. Sin embargo, la naturaleza de ciertas cadenas laterales de los aminoácidos (grupos R) es tal, que pueden estar parcial o totalmente ionizados a pH fisiológico y tener importancia en la reactividad de las cadenas polipeptídicas. Lo dicho de la titulación del grupo carboxílico y amino del carbono alfa, en principio también es válido para los grupos R.

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Análisis de los aminoácidos sobre la base de sus propiedades ácido-base. La primera etapa en el establecimiento de la estructura de una proteína determinada es la de efectuar su hidrólisis hasta liberar sus aminoácidos componentes y después determinar la cantidad de cada clase que se halla presente en dicha proteína. Para realizar esta tarea se dispone de métodos muy sensibles y resolutivos como son la electroforésis y la cromatografía de intercambio iónico. Ambos métodos aprovechan las diferencias en el comportamiento ácido-base de los aminoácidos; es decir, las diferencias en el signo y en la magnitud de sus cargas eléctricas netas a un pH determinado, las cuales pueden predecirse de sus valores de pK’y sus curvas de valoración. El método más sencillo para separar aminoácidos es la electroforésis sobre papel. Se coloca una disolución acuosa de la mezcla de aminoácidos sobre una tira de papel de filtro humedecida con una solución tampón (buffer) de un pH determinado. Se aplica un campo eléctrico de determinado voltaje a la tira de papel. Debido a las diferencias de pK’ los aminoácidos emigran en direcciones diferentes y a velocidades diferentes a lo largo de la tira de papel, dependiendo del pH del sistema tampón y del voltaje aplicado. Por ejemplo, a pH 1,0 la histidina, arginina y lisina poseen una carga de +2 y se desplazan más rápidamente hacia el cátodo cargado negativamente que los demás aminoácidos, los cuales poseen carga +1. Por otra parte, a pH 6 los aminoácidos con carga positiva (histidina, arginina y lisina) se desplazan hacia el cátodo y los aminoácidos con carga negativa (ácido aspártico y glutámico) hacia el ánodo. Todos los demás aminoácidos permanecerán en el origen o muy próximos a él, ya que no poseen otros grupos con carga más que el alfa carboxilo y el alfa amino y tienen por ello casi el mismo punto isoeléctrico. Para poder localizar los aminoácidos en el papel después de la corrida, este se pulveriza con ninhidrina y se calienta; aparecerán manchas azules o purpúreas, cada una de las cuales indica la presencia de un aminoácido. La cromatografía de intercambio iónico constituye el método de separación, identificación y determinación cuantitativa de aminoácidos en una mezcla, que se emplea con más profusión. Aprovecha también las diferencias en el comportamiento ácido-base de los aminoácidos, aunque otros factores contribuyen de modo importante, a la eficacia del procedimiento. La columna cromatográfica está constituida por un tubo largo lleno de gránulos de una resina sintética que contiene grupos fijos con carga. Las resinas que tienen grupos aniónicos fijos se llaman resinas intercambiadoras de cationes y las resinas que contienen grupos catiónicos fijos son las intercambiadoras de aniones. Clasificación de los aminoácidos Los aminoácidos pueden agruparse en cinco clases principales teniendo en cuenta las propiedades de los grupos R, en particular la polaridad de dichos grupos, es decir, su tendencia a interactuar con el agua a pH fisiológico (próximo a pH 7), debido a que los mismos van desde los totalmente no polares o hidrofóbicos, repelentes del agua, hasta los grupos R muy polares o hidrofílicos, que atraen al agua. 1) Grupos R apolares alifáticos: este grupo contiene a siete aminoácidos. Los grupos R de esta clase de aminoácidos son hidrofóbicos. Comprende los siguientes aminoácidos: glicina, de estructura simple, su pequeña cadena lateral no tiene una contribución real en las interacciones hidrofóbicas; alanina; valina; leucina; isoleucina;

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prolina, que tiene una cadena lateral alifática con una estructura cíclica especial y metionina, un aminoácido azufrado con un grupo tioéter apolar en su cadena lateral. 2) Grupos R polares, pero sin carga: existen cinco aminoácidos con grupos R polares y sin carga; dichos grupos R son más solubles en el agua, son mas hidrofílicos que los de los aminoácidos no polares ya que tienen grupos funcionales que forman puentes hidrógeno con el agua. Esta clase comprende a la serina, treonina, cisteína, asparagina y glutamina. La polaridad de la serina y treonina se debe a la presencia de grupos hidroxilo, la de la asparagina y glutamina a sus grupos amido (son amidas del ácido aspártico y glutámico) y la de la cisteína a su grupo sulfhidrilo o tiol. La cisteína se oxida con facilidad formando un aminoácido dimérico unido covalentemente llamado cistina, en el que las dos moléculas de cisteína están unidas mediante un enlace puente disulfuro. 3) Grupos R con carga negativa a pH 7: existen dos aminoácidos con estas características, ellos son el ácido aspártico y el ácido glutámico. Cada uno de ellos tiene un segundo grupo carboxílico. Debido a la naturaleza de su carga eléctrica los aminoácidos de este grupo se hallan involucrados en enlaces iónicos con otras moléculas también con carga. 4) Grupos R con carga positiva a pH 7: existen tres aminoácidos que poseen carga positiva neta a pH 7. Ellos son la lisina, que posee un segundo grupo amino en la posición de su cadena alifática; la arginina, que posee un grupo guanidinio con carga positiva y la histidina que contiene el grupo imidazol débilmente ionizado. 5) Grupos R aromáticos. En este grupo encontramos a la fenilalanina, tirosina y el triptófano, con cadenas laterales aromáticas relativamente apolares. El grupo hidroxilo de la tirosina puede formar enlaces puente de hidrógeno, constituyendo un grupo funcional importante en algunas enzimas. Ciertas proteínas contienen aminoácidos especiales además de los 20 aminoácidos estándar. Cada uno de estos deriva de uno de los 20 aminoácidos comunes, son ejemplo de esto la 4-hidroxiprolina, la 5-hidroxilisina, ambos se encuentran en el colágeno, proteína fibrosa del tejido conjuntivo. Existe una clasificación biológica de los aminoácidos que los divide en: a) esenciales: aquellos que los animales monogástricos y el hombre no pueden sintetizar en su organismo y necesitan obligatoriamente obtenerlos en su dieta. No los pueden sintetizar pues carecen del cetoácido precursor correspondiente: valina, treonina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, lisina y triptofano. b) semi-esenciales: aquellos que ciertos animales y el hombre pueden sintetizar a partir de aminoácidos esenciales, pero su acción es tan lenta que no se permite su total aprovechamiento y es necesario que se incluyan en la dieta: histidina, arginina, tirosina. c) no esenciales: son aquellos que pueden ser sintetizados por los animales por tener el cetoácido precursor: glicina, alanina, serina, cisteína, asparagina, aspartato, glutamato, glutamina y prolina. Aminoácidos no proteicos Existen algunos aminoácidos presentes en algunos vegetales, que no forman proteínas, que se hallan en forma libre ej: metil prolina en manzana; gamma metilenglutámico en maní; tiamina en té; canavanina en soja.

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Péptidos

Enlace peptídico Es el tipo de unión que se establece entre el grupo alfa-carboxilo de un aminoácido y el grupo alfa-amino de otro aminoácido, perdiéndose una molécula de agua y creándose un enlace C-N.

R

O

O

+

C

H2N C H

R

H N

R OH

C

C

H2N C H

OH

H2N H

R

O C

C

C

O

H

OH

Enlace peptídico Desde el punto de vista químico, la función resultante de la unión de un grupo ácido y otro amino recibe el nombre de amida; cuando este tipo de unión se verifica entre aminoácidos, se denomina específicamente unión o enlace peptídico. Si intervienen dos moléculas de aminoácidos se está en presencia de un dipéptido; la reacción puede repetirse adicionándose una nueva molécula de aminoácido mediante otra unión peptídica, con formación de un tripéptido. La incorporación de un número más elevado de aminoácidos conduce a la obtención de polipéptidos. En la formación de un péptido pueden intervenir moléculas del mismo o de distintos aminoácidos. Algunos péptidos aparecen en forma libre en las células y en los tejidos y desempeñan funciones biológicas específicas. Se encuentran entre ellos hormonas, antibióticos y otros agentes que tienen actividad biológica intensa.

Proteínas La gran cantidad de funciones que se realizan dentro de una célula pueden considerarse como consecuencia directa del enorme número de proteínas con que ellas cuentan. Las proteínas son las macromoléculas más abundantes de la célula y constituyen más del 50% del peso seco de las mismas, se encuentran en todas las células y en todas sus partes constituyentes. Las proteínas desempeñan numerosas funciones en los sistemas vivos; en su papel más estudiado, estas son enzimas que catalizan todas las reacciones metabólicas. Las proteínas proporcionan el soporte estructural dentro y fuera de la célula, en el espacio extracelular. Las proteínas estructurales mejor estudiadas son: el colágeno del tejido conectivo, las queratinas de la piel y el pelo. Las proteínas tienen funciones reguladoras dentro de la célula y entre estas. Las proteínas incluyen a las moléculas encargadas de los procesos de selección por medio de las cuales un determinado gen puede estar activo en cierto tipo de célula o quedar inactivo en otra. Dentro de este tipo también pueden incluirse hormonas como la insulina y el glucagón.

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Las proteínas también actúan en la unión y transporte de otras moléculas. Dicho transporte puede efectuarse dentro de la célula; por ejemplo, entre el citoplasma y el núcleo, o a través de la membrana plasmática, como en el caso de los sistemas de transporte iónico; o entre una célula y otra, como sucede con las proteínas de la sangre que se unen al oxígeno o a los lípidos. Hay muchas funciones que requieren de proteínas específicas, por ejemplo la contractilidad, que requiere específicamente de actina y miosina. Los anticuerpos son proteínas al igual que muchas toxinas; el interferón, una sustancia con mucha actividad antiviral también es una proteína. Las proteínas pueden realizar gran variedad de funciones, ya que hay una gran variedad de proteínas diferentes; sin embargo, dentro de cada grupo, cada tipo de proteína está hecha de una forma tan ordenada como para realizar una función específica. Se supone que una célula típica de mamífero tiene por lo menos 10 mil proteínas diferentes. La clave de la estructura de los millares de proteínas diferentes lo constituye un grupo de moléculas sillares, relativamente sencillas, a partir de las cuales se construyen las mismas. Todas las proteínas ya sean las de las bacterias, plantas o animales están constituidas a partir del mismo conjunto de 20 aminoácidos, unidos covalentemente originando secuencias características. Cuando las proteínas se componen de aminoácidos unidos con algún otro tipo de molécula, se dice que la proteína está conjugada. Entre ellas encontramos las unidas a ácidos nucleicos, denominadas nucleoproteínas; unidas a lípidos, lipoproteínas; a glúcidos, glucoproteínas; o diversas sustancias de menor peso molecular incluyendo metales o moléculas que las contengan. En ciertos aspectos, las características de una proteína se pueden explicar por las propiedades de sus componentes, los aminoácidos. Los datos que se obtienen en relación con la química de cada aminoácido ayudan a explicar el papel que desempeñan en la realización de la función de una macromolécula completa. Además, surgen nuevas propiedades potenciales cuando diversos aminoácidos individuales se encuentran unidos en un nivel de organización más alto. Para empezar a comprender su función se debe considerar primero la estructura de los aminoácidos y después la de las proteínas que forman. Las proteínas pueden dividirse en dos grandes clases teniendo en cuenta su forma y ciertas características físicas; son estas globulares y fibrosas. En las proteínas globulares la o las cadenas polipeptídicas se hallan plegadas de un modo compacto, adoptando formas esféricas o globulares. Estas son habitualmente solubles en los sistemas acuosos y se difunden con facilidad, muchas desempeñan una función móvil o dinámica. Casi todas las enzimas son proteínas globulares, lo mismo que las proteínas de la sangre, anticuerpos y proteínas de reserva. Las proteínas fibrosas son insolubles en el agua, y poseen moléculas finas y alargadas, con las cadenas polipeptídicas extendidas a lo largo de un eje en lugar de hallarse plegadas en forma globular. La mayor parte de este tipo de proteínas desempeña un papel protector o estructural. Las proteínas fibrosas típicas son las alfa-queratinas, del cabello y de la lana, fibroína de la seda y el colágeno de los tendones. En esta clase de proteínas se pueden incluir las proteínas filamentosas que participan en los episodios contráctiles tanto en las células musculares como en las que no lo son, tales como la actina y la miosina, así como los protofilamentos con que se construyen los microtúbulos.

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Las proteínas son biomoléculas muy grandes, algunas como el citocromo c está constituida por 104 aminoácidos y forma una sola cadena polipeptídica, mientras que otras pueden estar constituidas por un número mayor de aminoácidos como es el caso de la hemoglobina humana con cuatro cadenas polipeptídicas y un total de 574 aminoácidos. Existen proteínas formadas por más de mil aminoácidos. Sin embargo las proteínas no son meramente mezclas de un cierto número de polipéptidos de longitud diferente, composición o secuencia. Todas las moléculas de un tipo determinado de proteína son idénticas en su composición aminoácida, secuencia y longitud de la cadena polipeptídica. Ciertas proteínas sólo poseen una cadena polipeptídica, pero otras llamadas oligoméricas, poseen dos o más cadenas; así la ribonucleasa posee una sola cadena y la hemoglobina 4 cadenas. Características moleculares de algunas proteínas

Insulina Ribonucleasa Hemoglobina Seroalbunina Hexoquinasa Glutamato deshidrogenasa

PM 5733 12640 64500 68500 96000 1000000

N° de residuos 51 124 574 550 800 8300

N° de cadenas 2 1 4 1 4 40

Propiedades de las proteínas a) Peso molecular Es elevado, aunque varía dentro de un rango muy amplio que va desde 6000 daltons, como es el caso de la insulina, formada por 51 aminoácidos, hasta varios millones de daltons como es el caso de los agregados de gluteninas del grano de trigo. b) Solubilidad La mayoría de las proteínas son más o menos solubles en agua o en soluciones salinas diluidas, formando dispersiones coloidales. Las diferencias en cuanto a solubilidad han sido frecuentemente utilizadas para clasificar estas sustancias. c) Propiedades eléctricas Al estar constituidas por aminoácidos, las proteínas también existen como iones dipolares, por lo que a distintos valores de pH podrán hallarse cargadas positivamente o negativamente. De la misma manera existirá un pH en el cual la proteína carecerá de carga y por lo tanto no migrará hacia ninguno de los dos polos de un campo eléctrico; este valor de pH representa el punto isoeléctrico y constituye una característica de cada proteína. Al considerarse las propiedades eléctricas de los aminoácidos, se atribuyó especial importancia al hecho de que los grupos ácidos y amino pudieran o no disociarse; sin embargo, en una proteína casi todos los grupos ácido y amino de los aminoácidos que la integran están formandos parte de uniones peptídicas, a excepción de un grupo amino y otro ácido ubicados en ambos extremos de la cadena polipeptídica, que son los únicos susceptibles a disociarse (grupo ácido y amino terminales).

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Grupo amino terminal

O

R

C

C

H R N

R H2-N C H

N H

H C

C

O

H

O C O-H

Grupo ácido terminal

Todas las proteínas presentan en su molécula un grupo amino y otro ácido terminales, por lo que, si no existieran otros grupos susceptibles de disociarse, las propiedades eléctricas de todas las proteínas serían iguales; sin embargo, esto no ocurre, ya que cada proteína posee un punto isoeléctrico particular, diferente al de las demás. La explicación debe buscarse en los grupos R unidos al carbono alfa, que como ya se ha visto pueden tener otro grupo ácido, amino, o grupos SH u OH, entre otros, que podrán presentarse disociados o no, de acuerdo con el pH del medio. Queda claramente establecido, entonces, que las propiedades eléctricas de una proteína dependen fundamentalmente del comportamiento de los grupos ubicados sobre las cadenas laterales (grupos R). En el pH correspondiente al punto isoeléctrico de una proteína dada, el número total de cargas positivas es igual al de cargas negativas y la molécula resulta eléctricamente neutra. En el punto isoeléctrico, y a raíz de la compensación de las cargas en el interior de la molécula, las proteínas presentan un mínimo valor de solubilidad, propiedad que se aprovecha para separarlas de sus soluciones. d) Precipitación Las proteínas pueden ser precipitadas de sus soluciones, o separadas de una mezcla compleja, mediante el uso de distintas técnicas de precipitación, entre las que pueden consignarse: 1- Ajustar el pH de la solución de la proteína al valor de su punto isoeléctrico, pues como ya se ha mencionado, las proteínas muestran su menor solubilidad al alcanzar este valor. 2- Agregando sales neutras como NaCl, SO4 (NH4)2, etc. Por lo general, a concentraciones muy bajas de estas sales la solubilidad de las proteínas aumenta, pero luego de superada una concentración límite se produce la precipitación. 3- Agregando solventes orgánicos tales como la acetona, alcohol, etc. en frío, también provoca la precipitación de las proteínas, probablemente por disminuir el valor de la constante dieléctrica de la solución. e) Hidrólisis Mediante este tratamiento se consigue atacar la estructura primaria de las proteínas, provocándose la ruptura de los enlaces peptídicos que mantenían unidos los aminoácidos entre sí. Generalmente la hidrólisis progresa por pasos, obteniéndose primero polipéptidos de menor peso molecular que el de la proteína original, hasta que finalmente se llega a tripéptidos y dipéptidos, liberándose por último cada uno de los aminoácidos constitutivos. La hidrólisis es el método obligado para iniciar el estudio de los aminoácidos que integran una proteína, pudiéndose llevar a cabo por alguno de estos tres procedimientos:

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a) Por acción de ácidos minerales como el HCl o H2SO4. Es el método más utilizado. Tiene la desventaja de que destruye totalmente un aminoácido: el triptofano. b) Por acción de álcalis como el (HO)2 Ba; durante el proceso se destruyen total o parcialmente varios aminoácidos pero el triptofano permanece inalterado, por lo que este método se reserva exclusivamente para determinar la presencia de este aminoácido. c) Por acción enzimática. Se utilizan enzimas de origen animal (pepsina, tripsina) o vegetal (papaína, bromelina). Por este método no se destruye ninguno de los aminoácidos, pero el procedimiento es muy lento y requiere precauciones especiales, por lo que prácticamente no se lo utiliza. Clasificación de las proteínas Aunque actualmente se tiende a agrupar a las proteínas de acuerdo con las funciones biológicas que desempeñan (enzimas, proteínas de reserva, toxinas, hormonas, etc.) sigue resultando de utilidad el siguiente ordenamiento: 1) Proteínas simples: Son las que por hidrólisis originan exclusivamente aminoácidos. Este tipo de proteínas se las suele clasificar en base a su solubilidad diferencial en: a) Albúminas: solubles en agua; precipitan con sulfato de amonio a saturación. Se encuentran presentes en tejidos animales y vegetales. b) Globulinas: poco solubles en agua, pero solubles en soluciones salinas diluidas; precipitan con sulfato de amonio a media saturación. Presentes en tejidos animales y vegetales. c) Prolaminas: son insolubles en agua y soluciones salinas; pero solubles en alcohol al 50 - 70 %. Son típicas proteínas vegetales, están presentes especialmente en los granos de cereales. d) Glutelinas: son insolubles en agua, pero solubles en soluciones ácidas o básicas diluidas. También son proteínas vegetales, presentes en las semillas de los cereales. e) Protaminas: son proteínas sencillas de bajo peso molecular; en su composición predominan los aminoácidos de carácter básico y generalmente forman parte de las nucleoproteínas. Presentes en tejidos animales. f) Histonas: son de carácter básico; forman complejos con ácidos nucleicos. Son solubles en agua e hidróxido de amonio diluído. g) Escleroproteínas: Son muy insolubles y se hallan presentes en tejidos animales. Ejemplo de las mismas: queratinas, colágeno y elastina. 2) Proteínas conjugadas: están constituidas por una porción proteica y otra no proteica llamada grupo prostético. Estas se clasifican de acuerdo a la naturaleza de su grupo prostético en: a) Nucleoproteínas: el grupo prostético es un ácido nucleico. b) Glucoproteínas: el grupo prostético es un glúcido. c) Lipoproteínas: el grupo prostético es un lípido. d) Cromoproteínas: el grupo prostético es un metal unido a un ciclo orgánico complejo, como la hemoglobina y la clorofila.

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ESTRUCTURA PROTEICA Existen varios niveles de organización para describir la estructura proteica, y cada una recala en un aspecto diferente, ya que cada uno depende de distintos tipos de interacciones. Por lo general, se describen cuatro niveles: primario, secundario, terciario y cuaternario. Mientras la estructura primaria se basa en la secuencia de aminoácidos de una proteína, los otros tres niveles estudian su organización en el espacio, es decir la conformación de partes de la molécula o la molécula completa en sí. Estructura primaria Por estructura primaria se entiende la secuencia, orden de sucesión u ordenamiento lineal específico de los aminoácidos en una determinada cadena polipeptídica. El ADN de un organismo provee la información para la secuencia de aminoácidos y, a su vez esta secuencia de aminoácidos proporciona la información para la estructura de la proteína. Como se verá más adelante se cree que las diversas conformaciones tridimensionales de las cuales se compone una proteína son una consecuencia directa de su estructura primaria. Por esto, la secuencia de aminoácidos es muy importante y los cambios que se presentan (como resultado de una mutación) pueden no ser totalmente tolerados. En muchos casos el cambio de aminoácidos en la secuencia primaria tiene poco efecto. El grado en que los cambios llegan a no ser permitidos depende del grado de alteración de la geometría total de la proteína o de los residuos funcionales críticos. La información obtenida de la secuencia de aminoácidos es muy importante para entender la estructura de las proteínas, su mecanismo de operación y algo sobre su evolución. Estructura secundaria Las proteínas forman agregados y sus relaciones y formas a nivel molecular son complejas. El término conformación se refiere al arreglo tridimensional de los átomos de una molécula en el espacio. Se entiende por estructura secundaria aquello referente a la conformación de las piezas de la cadena polipeptídica, es decir, a la interrelación geométrica de los aminoácidos adyacentes en la secuencia lineal. La conformación de la cadena polipeptídica depende de la longitud de los enlaces y de los ángulos que forman a lo largo del esqueleto de la cadena. Pauling y Corey analizaron por primera vez los enlaces y sus consecuencias en la estructura secundaria. La determinación de la longitud del enlace peptídico entre los aminoácidos adyacentes indicó que este enlace era de carácter intermedio entre un enlace sencillo (C-N) y uno doble (C=N); en otras palabras, el enlace peptídico tiene un carácter parcial de doble enlace (aproximadamente 40%). En el enlace peptídico, la característica de doble enlace tiene importantes consecuencias en la conformación de la cadena polipeptídica, dado que impone rigidez a los átomos participantes, de manera que no pueden rotar en relación uno con el otro. Estos investigadores analizaron la conformación de la cadena polipeptídica por medio del estudio de los patrones de difracción de rayos X de los aminoácidos y de los péptidos simples, construyendo modelos apropiados, llegando a la conclusión de la existencia de ángulos de enlace preferenciales para la cadena. Por consiguiente, las

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cadenas polipeptídicas no eran simples polímeros extendidos, ni estaban enrollados al azar en el espacio, por lo que propusieron conformaciones. En uno de los casos, la forma adquirida sería una hélice o espiral enrollada, denominada alfa-hélice, la cadena forma así el contorno de una hélice bien dibujada y de dimensiones regulares, que encierra a un cilindro en el espacio. La otra conformación se conoce con el nombre de hoja plegada beta. Estructura terciaria Mientras que la estructura secundaria trata fundamentalmente de la conformación de los aminoácidos adyacentes en la cadena polipeptídica, la estructura terciaria describe la conformación íntegra de la proteína. En cierto sentido, la estructura secundaria y terciaria son temas estrechamente relacionados; por ejemplo si una cadena polipeptídica existe aislada en una conformación de alfa-hélice, esto definirá su estructura terciaria, esto sería una larga estructura cilíndrica. Sin embargo la mayor parte de las proteínas son globulares y sus cadenas de polipéptidos están plegadas y enrolladas en organizaciones mucho mas complejas. Esto es debido a que puntos distantes de la secuencia lineal de aminoácidos se aproximan entre sí, conociéndose una gran variedad de interacciones entre los grupos R de los aminoácidos que forman la cadena. Se emplea el término de estructura terciaria para designar la manera en que se hallan plegadas las cadenas polipeptídicas de las proteínas globulares, es decir su distribución en el espacio (estructura tridimensional). Estructura cuaternaria Existen proteínas llamadas oligoméricas, las cuales se hallan formadas por más de una cadena polipeptídica. Cuando esto sucede podemos decir que existe una organización superior en las proteínas, llamada estructura cuaternaria. Ella se refiere a la organización de las cadenas polipeptídicas, llamadas subunidades proteicas, en relación mutua, es decir como se adaptan o empaquetan conjuntamente en la conformación nativa. Fuerzas que estabilizan la estructura de las proteínas Cuatro clases de interacciones cooperan en mantener reunidos los lazos de las cadenas polipeptídicas de las proteínas globulares, en la posición apropiada en las condiciones biológicas de temperatura, pH y concentración iónica. a) Puentes de Hidrógeno entre los grupos R de los residuos situados en los lazos adyacentes de la cadena. Por ejemplo: el H de un residuo de serína situado en un segmento de una cadena polipeptídica puede formar un puente H con un átomo de N del anillo de un residuo de histidina situado en el lazo adyacente de la misma cadena. b) Atracciones iónicas entre grupos R con carga opuesta. Por ejemplo: el grupo carboxílico con carga negativa de un residuo de ácido glutámico que puede ser atraído por el grupo amino, con carga positiva, de un residuo de lisina situado en el segmento adyacente.

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c) Interacciones hidrofóbicas entre los grupos R hidrofóbicos de algunos aminoácidos que repelen el entorno acuoso y se asocian dentro de la estructura globular, separados del agua. d) Enlaces covalentes transversales. Los plegamientos adyacentes de la cadena polipeptídica de algunas proteínas, tales como la ribonucleasa, contienen residuos de cisteína intracadena, los cuales establecen enlaces covalentes transversales. Este tipo de uniones son muy fuertes, y forman los llamados puentes disulfuro S-S.

Niveles de estructuración de las proteínas

Estructura primaria

Estructura terciaria

Estructura secundaria

Estructura cuaternaria α helice

hoja β plegada

Desnaturalización proteica Cuando una disolución de proteínas, tal como la ovoalbúmina, se calienta lentamente a temperaturas que superan los 60 ° C aproximadamente, la disolución se enturbia gradualmente y se forman coágulos alargados. Este es un proceso familiar que ocurre cuando se cocina un huevo. La clara del huevo que contiene albúmina se coagula y origina un sólido blanco por calefacción. Después de la coagulación por calor, éste no se disolverá al enfriarlo originando una disolución clara lo mismo que la clara de huevo

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original que no había sido calentada. La calefacción ha transformado a la ovoalbúlmina de un modo irreversible. Este efecto del calor se produce virtualmente con todas las proteínas globulares, independientemente de su tamaño y función biológica, aunque puede variar la temperatura a la que se produce la transformación. El cambio producido en su estado natural recibe el nombre de desnaturalización. Las proteínas en su estado natural reciben el nombre de proteínas nativas, y después del cambio son proteínas desnaturalizadas. Se registra una segunda consecuencia importante de la desnaturalización: la proteína pierde casi siempre su actividad biológica característica. Así, cuando se calienta la disolución de una enzima, por unos minutos, ésta pierde su actividad catalítica. Otros factores desnaturalizantes son: valores extremos de pH, disolventes orgánicos, algunos solutos como la urea, detergentes. Los experimentos directos realizados sobre extractos proteícos demuestran que cuando una proteína se ha desnaturalizado no se rompen los enlaces covalentes (enlaces peptídicos) del esqueleto de la cadena polipeptídica. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de la proteína queda intacta, en cambio, se destruye la estructura tridimensional de la proteína ( la que determina sus propiedades), adquiriendo una estructura al azar. Como consecuencia de ello, la actividad biológica de la mayor parte de las proteínas se pierde. Durante muchos años se creyó que la desnaturalización de las proteínas era irreversible; sin embargo, se ha encontrado que algunas pocas proteínas globulares, desnaturalizadas por el calor o pH extremos, recuperaban efectivamente sus estructuras nativas y su acción biológica si se enfriaba lentamente o volvían lentamente a su pH normal. Este proceso recibe el nombre renaturalización. Un caso clásico de renaturalización es el proporcionado por la ribonucleasa; esta enzima puede ser desnaturalizada por la exposición con una solución de urea concentrada y un agente reductor. En estas condiciones la enzima pierde su actividad biológica. Si eliminamos gradualmente estos agentes del medio, la ribonucleasa desnaturalizada, lenta y espontáneamente, adoptará su estructura tridimensional correcta, recuperando su actividad.

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Esquema general de la biosíntesis de aminoácidos. Se observan los precursores de la glucólisis, del ciclo de Krebs y de la vía de las pentosas fosfato junto con los aminoácidos que derivan de ellos (en el recuadro) Gucosa

Gucosa 6- fosfato

Ribosa-5fosfato

Histidina Eritrosa 4-P

Fenilalanina Triptofano Tirosina

3- Fosfoglicerato

Serina

Fosfoenolpiruvato

Glicina Cisteína

Piruvato

Alanina Valina Leucina

citrato

Oxalacetato

Aspartato

Asparagina Metionina Treonina Lisina Isoleucina

Ciclo de Krebs

α cetoglutarato

Glutamato

Glutamina Prolina Arginina

Cisteína 109

Principales vías de degradación de aminoácidos

Leucina Lisina Fenilalanina Triptofano Tirosina

Glutamato

Asparagina Glutamina Histidina Prolina

Isocitrato α Cetoglutarato Acetoacetil-CoA Citrato

Ciclo de Krebs

Acetil-CoA

Succinil- CoA

Asparagina Glutamina Histidina Prolina

Succinato Oxalacetato Fumarato

Fenilalanina Tirosina

Malato Piruvato

Leucina Isoleucina Treonina Triptofano

Alanina Cisteína Glicina Serina Triptofano

Asparagina Aspartato

ACTIVIDAD PRÁCTICA A REALIZAR - Determinación del contenido de proteínas totales:

Método de Kjeldahl Es un método muy utilizado aún hoy día, a pesar de que esta técnica data de 1883, ha sufrido desde entonces una serie de modificaciones ya sea en el proceso digestivo como en la determinación cuantitativa del amonio liberado, manteniendo vigente su utilidad. En este método se mide la cantidad de Nitrógeno total presente en la muestra. Esta técnica es aplicable a cualquier órgano vegetal: hojas, tallos, frutos, granos, etc.; alimentos: leche, harinas, carnes, bebidas, etc.

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El método consta de tres etapas: 1) Digestión de la muestra: el material se calienta a altas temperaturas (330 °C - 350 °C) en presencia de ácido sulfúrico. Las sustancias se oxidan. Este proceso debe acelerarse usando catalizadores como el selenio o el mercurio y sales de sulfato de cobre penta-hidratado. El Nitrógeno se fija como sulfato de amonio. El tiempo de digestión necesario para producir la total oxidación del material orgánico dependerá de la relación sal / ácido (sulfato de potasio o sodio / ácido sulfúrico concentrado). Se ha establecido que si la relación es 0,3 g / mL o menos, se debe aumentar el tiempo de digestión por varias horas para que la misma sea total. Por el contrario si la relación es muy grande (1,0 g / mL) se acorta el tiempo, pero se corre el riesgo de solidificación de la muestra. El catalizador juega un rol importante en cuanto a la velocidad de digestión cuando la concentración de sal es baja, pero prácticamente no tiene ningún efecto cuando esta concentración es alta. Se recomienda el uso de 0,35 g a 0,40 g de sal por ml de ácido sulfúrico y el uso de algún catalizador que puede ser selenio u óxido de mercurio o cobre. 2) Destilación: se utiliza el método clásico de destilación por arrastre con vapor de agua. El amonio formado se libera alcalinizando la solución con hidróxido de sodio concentrado. En este paso se utilizan pequeñas perlas de vidrio para controlar la ebullición y se le agrega un indicador (fenolftaleína) para comprobar que el medio se ha alcalinizado. El destilado es recogido en un erlenmeyer que posee una cantidad exactamente medida y conocida de ácido sulfúrico valorado (normalidad conocida). 3) Titulación y evaluación: El destilado resultante se titula con una base valorada, en presencia de rojo de metilo que actúa como indicador. En esta etapa, el amoníaco destilado se combina con el ácido sulfúrico valorado, y el exceso de ácido no combinado es titulado con una base también valorada. De este modo por diferencia entre el volumen total de ácido sulfúrico y el volumen combinado con la base, se obtiene el combinado con el amoníaco durante la destilación. Durante la digestión Kjeldahl pueden ocurrir pérdidas de nitrógeno cuando la concentración inicial de sulfato de potasio es alta y la temperatura de digestión excede los 400 °C. También pueden ocurrir pérdidas de nitrógeno si hay un exceso de catalizador, como sería el caso del selenio, o de una prolongada digestión. Se reconoce que el mercurio (OHg) es el catalizador más efectivo. Sin embargo su uso se ve restringido por sus dificultades prácticas conocidas (formación de complejo mercurioamonio) y su peligro en el manipuleo. El uso del método de macro-Kjeldahl esta siendo reemplazado por sistemas semimicro-Kjeldahl y micro-Kjeldahl debido a razones económicas y al menor tiempo empleado; a esto se debe el uso masivo de estos últimos. En estos métodos la muestra debe estar finamente molida para ser lo más homogénea posible para minimizar posibles errores. Actualmente las digestiones semimicro y micro se realizan en tubos cilíndricos de vidrio resistentes al calor en lugar de los clásicos balones Kjeldahl de 800 mL del sistema macro-Kjeldahl, utilizando un block de aluminio con perforaciones adecuadas para cada tubo. El block se calienta eléctricamente o por gas, y allí se realiza la digestión de la muestra. Hablamos de macro-Kjeldahl cuando las muestras analizadas pesan aproximadamente 1 gramo; semimicro, con muestras de 200 mg a 1g y micro-Kjeldahl con menos de 200 mg. En algunos sistemas micro-Kjeldahl se ha reemplazado el ácido sulfúrico 0,1 N por ácido bórico saturado. En este caso el destilado se recoge en solución de ácido

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bórico mezclado con colorante (ej. verde de bromo cresol, rojo de metilo o azul de metileno). Se forma borato de amonio, el que está casi completamente hidrolizado en solución acuosa. Por consiguiente el amoníaco destilado en medio alcalino puede ser cuantitativamente titulado con ácido clorhídrico a pH 5,6. Equipos necesarios: 1) Digestor para balones Kjeldahl de 800 mL. Fuente de calor a gas natural. 2) Aparato de destilación por arrastre de vapor. Reactivos: 1- Ácido sulfúrico concentrado. PM: 98.08, Densidad: 1,84 2- Hidróxido de sodio en escamas. PM: 40.00 3- Fenolftaleína 4- Rojo de metilo Mezcla catalizadora: 5- Selenio metálico 6- Sulfato de potasio 7- Sulfato cúprico penta-hidratado Soluciones valoradas: 1- Ácido sulfúrico 0,1 N 2- Hidróxido de potasio 0,1N Procedimiento: Pesar 1 gramo de muestra molida (que pasa por una malla de 1 mm), previamente secada y acondicionada para su análisis y colocarla en el balón Kjeldahl. Agregar luego 7 a 8 gr de mezcla catalítica y entre 25 a 30 mL de ácido sulfúrico concentrado. Calentar durante 60 minutos, o hasta que la solución se torne transparente. Dejar enfriar; y luego agregar 100 a 150 mL de agua destilada, agitar permitiendo que el digerido diluido se enfríe hasta temperatura ambiente. Colocar 50 ml de la solución de ácido sulfúrico 0,1 N con rojo de metilo como indicador, en un erlenmeyer de 250 mL de capacidad. Llevar este erlenmeyer al aparato de destilación y colocarlo debajo del condensador de tal forma que el extremo del condensador permanezca debajo de la solución de ácido sulfúrico. Luego colocar gotas de fenolftaleína en el tubo de digestión y conectarlo al aparato de destilación y agregar lentamente 40 a 50 mL de NaOH al 40 % por el tubo de descarga superior. Comenzar inmediatamente la destilación cerrando la llave superior de descarga a la trampa de vapor. El amoníaco que se desprende es arrastrado por el vapor de agua y recogido en el erlenmeyer con ácido sulfúrico con el que se combina formando sulfato de amonio. El exceso de ácido sulfúrico valorado, que no se combinó con el amoníaco, es titulado con una solución valorada de hidróxido de potasio. El punto final de la titulación se observa por el cambio de color del indicador rojo de metilo que vira al amarillo. Por diferencia entre el volumen total y los ml gastados en la titulación se obtienen los ml de ácido sulfúrico combinados con el amoníaco.

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Cálculos:

Tener en cuenta que 1 mL de H2SO4 0,1N equivale a 0,0014 g de Nitrógeno

- fórmula para calcular % de nitrógeno: ml de H 2SO 4 combinados x 0,0014 x 100 = % Nitrógeno De esta manera se llega a obtener el % de Nitrógeno de la muestra, sin embargo, se desea conocer el % de proteínas de la misma. Para transformar este valor en % de proteínas se utiliza un factor de conversión que depende del tipo de muestra analizada. Por ejemplo: 5,7 para granos 6,25 para forrajes y carne 6,38 para leche, etc. 6,68 para huevos Estos factores han sido calculados en función de la proporción de nitrógeno dentro de la molécula de proteína. Recordemos que una proteína está constituida por C, O, H y N, con menores cantidades de P y S. Asimismo dependiendo del tipo de proteína, varía la proporción de nitrógeno dentro de la molécula. Por ejemplo: 100 / 17,54 = 5,7 factor de conversión para granos y harinas. 100 / 16 = 6,25 factor de conversión para tallos, hojas y forrajes en general. 100 / 15,67 = 6,38 factor de conversión para leche. De esta forma, con el método Kjeldahl se determina el % de N total que multiplicado por el factor correspondiente, se transforma en % de proteínas. Se determina así el % proteína bruta de la muestra. Se denomina así porque se evalúa el “Nitrógeno total”, es decir el proveniente de las proteínas y aquel que está formando parte de otros compuestos no proteicos como las amidas y aminas, ácidos nucleicos, etc.,

Determinación del contenido de proteína pura En el análisis químico de los vegetales suele ser necesario conocer, no sólo el contenido total de N y el % de proteína bruta, sino el % de nitrógeno proteico de la muestra. Con dicho objetivo se realiza el método de Stuzer modificado por Barnstein, basado en la coagulación del N proteico por el tratamiento con Cu(HO)2; que se conoce con el nombre de determinación de proteína pura. Se trabaja sobre 1 g de sustancia, que se coloca en un vaso de precipitado de 250 mL, se le agregan 50 mL de agua destilada y se calienta lentamente a ebullición con agitación constante, manteniendo la ebullición durante 5 min., se retira la fuente de calor y se agregan 25 mL de KOH al 1,25 % y 25 mL de CuSO4 al 6 %, se agita vigorosamente, se enfría y filtra. Luego se lava con agua destilada fría hasta que el líquido de lavado pase a incoloro o hasta que con solución de ferrocianuro de potasio o cloruro de calcio, no forme precipitado. El papel con el precipitado se coloca en un balón Kjeldahl y se determina el Nitrógeno orgánico por el método de Kjeldahl, descripto anteriormente.

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Después de realizar este tratamiento queda en la muestra sólo el N proveniente de las proteínas que se evalúa de la misma manera que el N total. Se expresa como % de proteína pura, multiplicando por los factores de conversión conocidos.

Extracción y Formación del Gluten Las proteínas del endosperma del grano de trigo (Triticum aestivum L.) han sido motivo de prolongados estudios, debido a la capacidad de formar un complejo viscoelástico llamado “gluten”, responsable de la calidad panadera de las harinas. El gluten otorga elasticidad y viscosidad a las masas formadas a partir de este cereal. Estas masas poseen la característica única y específica de retener el dióxido de carbono formado durante la fermentación, rindiendo un producto esponjoso luego de la cocción. El complejo gluten está constituido fundamentalmente por dos fracciones proteicas: 1) Gliadinas: proteínas del tipo de las prolaminas, solubles en etanol al 70 %. Poseen un peso molecular medio de 40.000 Daltons, son monoméricas (de cadena simple) y están relacionadas con la extensibilidad de las masas. Estas son deficientes en lisina, glicina y triptofano y ricas en prolina, ácido glutámico y glutamina. 2) Gluteninas: Pertenecen al tipo de las glutelinas, insolubles en alcohol y solubles en ácidos y álcalis diluidos. Su peso molecular oscila entre 100.000 a varios millones y son poliméricas (varias cadenas polipeptídicas). Estas proteínas están formadas por subunidades cuyo peso molecular varía de 16.000 a 133.000 Daltons las cuales están unidas entre sí por puentes disulfuro formando macrounidades. Es por este motivo que para lograr aumentar la solubilidad de estas proteínas se suele agregar un agente reductor como el mercaptoetanol, que rompe los puentes disulfuro que se hallan presentes en su estructura. Esta fracción proteica confiere fuerza y elasticidad a las masas. Formación del gluten Para que el gluten se forme es necesario realizar una masa con harina de trigo y agua. El trabajo mecánico efectuado para lograr dicha masa es fundamental en la formación de este complejo. Por lavado constante de la masa se elimina el almidón quedando el gluten, constituido por un 80-85 % de proteínas, 2-5 % de lípidos y 5-10 % de glúcidos. Procedimiento para el cálculo del % de gluten Tomar 10 gr de harina y colocarlos en una cápsula. Agregar gota a gota agua común hasta que se forme una masa, sacarla de la cápsula y amasarla con la mano. Luego colocarla debajo de una corriente fina de agua, y continuar con el amasado suave hasta que se elimine todo el almidón y sustancias hidrosolubles. Luego del lavado se escurre bien el gluten, que queda como una pelota gomosa, y se coloca en una cápsula de porcelana. Se lleva la misma a estufa a 120 °C durante media hora, se seca y pesa. Existen máquinas lavadoras de gluten que realizan este proceso o bien equipos automáticos específicos para esta determinación.

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Cálculos:

Cápsula + gluten Tara de la cápsula ______________ Gluten Húmedo

x 10 (% de gluten húmedo)

Llevar la cápsula con el gluten húmedo nuevamente a la estufa 2 horas, secar y pesar. Cápsula + gluten seco Tara de la cápsula ______________ Gluten seco x 10 (% de gluten seco) Solubilidad de las proteínas del gluten Tomar un poco de harina y obtener el gluten en la misma forma indicada más arriba, escurrirlo bien, colocarlo en un vaso de 100 mL y agregar 20 mL de etanol al 70 %, desmenuzar el gluten con una varilla, facilitando así el contacto entre el gluten y el solvente. Esta operación se puede repetir 2 o 3 veces. De esta manera se solubilizan las gliadinas. Probar la presencia de proteínas con la reacción de Biuret. Las gluteninas continúan insolubles y para solubilizarlas tratar el residuo con KOH o NaOH al 10% en el mismo vaso, repetir 2 o 3 veces y observar la formación de una solución viscosa que contiene las gluteninas. Probar la reacción de Biuret. Nota: El reactivo de Biuret se utiliza para determinar la presencia de péptidos. Este reactivo contiene CuSO4 en una solución acuosa alcalina (NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu++ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, formándose un compuesto color violeta. La reacción da positiva en aquellos compuestos que presenten dos o mas enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

Bibliografía -American Association of Cereal Chemists. Approved Method of the A.A.C.C., 8th de. (1983). -Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis, of the A.O.A.C., 13 th de.(1980). -Química Moderna de los Cereales. Kent Jones, D.K. y A.J. Amos (1975).

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UNIDAD 9. ACIDOS NUCLEICOS. Los ácidos nucleicos (ácido desoxiribonucléico, DNA y ácido ribonucléico, RNA), biomoléculas importantes por el papel que desempeñan en el almacenamiento, transferencia y expresión de la información genética, son polímeros lineales que se construyen con cuatro monómeros diferentes llamados nucleótidos. Recordemos que estructuralmente cada nucleótido está constituído por una base (purínica o pirimidínica), una pentosa (ribosa o desoxiribosa) y un grupo fosfato. Cuando la molécula no contiene el fosfato se denomina nucleósido. Nomenclatura de nucleótidos y ácidos nucleicos Base Purinas Adenina Guanina Pirimidinas Citosina Timina Uracilo

Ácido nucleico

Nucleósido

Nucleótido

Adenosina Desoxiadenosina Guanosina Desoxiguanosina

Adenilato (AMP) Desoxiadenilato (dAMP) Guanilato (GMP) Desoxiguanilato (dGMP)

RNA DNA RNA DNA

Citidina Desoxicitidina Timidina Desoxitimidina Uridina

Citidilato (CMP) Desoxicitidilato (dCMP) Timidilato o (TMP) Desoxitimidilato (dTMP) Uridilato (UMP)

RNA DNA DNA RNA

Un nucleótido se forma cuando el ácido fosfórico reacciona con el grupo HO del carbohidrato (pentosa) de un nucleósido. La adenosina monofosfato (AMP) es el mononucléotido más importante y abundante en las células. Éste y otros mononucleótidos se pueden combinar con más ácido fosfórico y formar un nucleósido difosfato o trifosfato. Recordemos que la adenosina trifosfato (ATP) es el principal transportador de energía química en la célula. La interconversión de ADP y ATP está ligada a la transferencia de energía en el metabolismo: ATP + H2O

ADP + Pi + energía

Para formar ácidos nucleicos, los nucleótidos se enlazan a través de sus grupos fosfato. El grupo 5’-fosfato de un nucleótido se une con el grupo 3’-hidroxilo del siguiente nucleótido; ese puente entre cada unidad monomérica es un enlace 3’,5’fosfodiéster. Los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son los depositarios moleculares de la información genética. La estructura de cada una de las proteínas y por lo tanto de cada uno de los componentes celulares, es producto de la información programada en la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos de la célula. La molécula de DNA. La cadena de DNA es un heteropolímero largo, no ramificado, construido de sólo 4 tipos de subunidades monoméricas de nucleótidos. En 1952, Watson y Crick utilizando modelos y datos de difracción de rayos X, descubrieron que la molécula está constituida por dos hebras entretejidas en una estructura helicoidal tridimensional, la 116

“doble hélice”. Las bases se ubican hacia el interior de esa doble hélice. Las bases adyacentes de la misma hebra se apilan unas sobre otras, esto permite la formación de interacciones hidrofóbicas y de van der Waals. Las bases de las hebras opuestas también están cerca, permitiendo que se formen pares de bases complementarias mediante puentes de hidrógeno. La adenina (A) se aparea con la timina (T), y la guanina (G) con la citosina (C). El lenguaje empleado para almacenar la información en el DNA consiste en un alfabeto de cuatro letras: A, T, G y C. El formato para almacenar esta información es una secuencia lineal de los nucleótidos que varía en tamaño y ordenamiento para cada especie viva. Las moléculas de DNA que contienen los genes en las células, son las mayores macromoléculas y normalmente se encuentran empaquetadas en los cromosomas. El DNA es el único componente cromosómico dotado de información genética en las células vivas. La mayor parte de los virus y las bacterias tienen un solo cromosoma, mientras que los organismos eucarióticos suelen tener muchos. Un cromosoma suele contener miles de genes individuales. Se puede definir a un gen, desde el punto de vista bioquímico, como aquel segmento de DNA (o de RNA en algunos casos) que codifica la información necesaria para producir un producto biológico funcional. El conjunto de todos los genes y del DNA intergénico de todos los cromosomas de una célula se conoce como genoma celular, estructura receptora de la información genética. El genoma humano por ejemplo, tiene 1 metro de longitud aproximadamente y contiene un nº estimado de 3 mil millones de pares de nucleótidos. En cambio la molécula de DNA de la bacteria E. Coli mide cerca de 2 µm de largo y contiene alrededor de 4 millones de pares de nucleótidos. Procesos de replicación del DNA, transcripción y traducción. La utilización celular de la información genética se puede explicar a través de tres pasos principales: replicación, transcripción y traducción, conocido como dogma central de la biología molecular. El proceso llamado replicación es un copiado de las moléculas de DNA; esta duplicación es un proceso autodirigido porque con ayuda de varias proteínas accesorias dicta y dirige la construcción de DNA idéntico para las células hijas. Se inicia con el desenrrollamiento de un corto segmento de las hebras complementarias (ver figura). Cada hebra se usa como molde para hacer una nueva hebra complementaria. Por medio de la enzima DNA polimerasa, cada nueva unidad de nucleótido se une covalentemente a la cadena de DNA que va creciendo. Así el DNA se duplica originando dos moléculas idénticas, una permanece en la célula progenitora y la otra será para la célula hija. De ahí se dice que la replicación es semiconservadora. La transcripción implica la transformación del mensaje del DNA en RNA. Una parte importante del mensaje que lleva el DNA se expresa como RNA. Este proceso de transcripción para formar RNA es semejante al de la replicación de DNA (ver figura), con las siguientes diferencias: - en lugar de desoxiribonucleótidos se utilizan ribonucleótidos como unidades monoméricas para construir el RNA. - La base timina se cambia por uracilo, que también se aparea con adenina. - El producto híbrido RNA:DNA se desenreda, se libera el RNA de una hebra y la hebra de DNA molde se vuelve a enrollar en una doble hélice. - La enzima que une los nucleótidos en el nuevo RNA es la RNA polimerasa.

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En el proceso conocido como traducción, el mensaje genético codificado en el RNA se traduce en los ribosomas en forma de proteína, caracterizada por una secuencia de aminoácidos específica. Las proteínas son los productos finales de la expresión del DNA en la célula. El mensaje que contiene el DNA está organizado en forma de una secuencia lineal de los nucleótidos (A,T,G,C), mientras que en el RNA formado a través de la transcripción es un conjunto algo distinto de nucleótidos (A,U,G,C). Por otro lado, las proteínas son secuencias lineales de moléculas estructuralmente distintas: los aminoácidos. Esto implica que la información que pasa del DNA y RNA a las proteínas está en “lenguas” distintas. Esa traducción es a la que nos estamos refiriendo. Los bioquímicos han encontrado una relación directa entre la secuencia de bases de nucleótidos de cientos de genes y la secuencia de aminoácidos de las proteínas formadas a partir de esos genes. La secuencia de bases de un gen está dispuesta en un orden que se corresponde con el de los aminoácidos de la proteína formada. Al estudiar en profundidad este proceso de traducción se ha descifrado un conjunto de reglas, denominado código genético, entre las cuales cabe mencionar: • que el código es de tripletes, ya que la correspondencia de codificación es un conjunto de tres nucleótidos por aminoácido incorporado a la proteína. • Es redundante, en el sentido que cada aminoácido puede tener más de un código de tripletes (codones). En células eucariotas muchos genes tienen uno o mas segmentos intercalados que no codifican la secuencia de aminoácidos del producto polipéptido o proteína formada. Estas regiones del gen que no codifican se denominan intrones, mientras que los segmentos codificantes se denominan exones.

Tipos de RNA. Se produce una mezcla heterogénea de tres tipos de RNA durante la transcripción del DNA. En células eucariotas los tres tipos son producto de la acción de las enzimas RNA polimerasas, normalmente son de una sola hebra y cumplen alguna función en la síntesis de proteínas. El denominado RNA ribosomal (rRNA) es el más abundante y se encuentra combinado con proteínas formando los ribosomas, lugar de la célula donde se lleva a cabo la síntesis proteica. La mayoría son de gran tamaño. El RNA de transferencia (tRNA) se combina con una molécula de aminoácido y la incorpora en una molécula de proteína en crecimiento. Funcionan como moléculas acopladoras Existe por lo menos un tipo de tRNA para cada uno de los 20 aminoácidos utilizados en la síntesis proteica. Es el más pequeño de los tres, con 73 a 93 nucleótidos cada uno. El RNA mensajero (mRNA), que es de tamaño variable, transporta el mensaje contenido en un gen o unos pocos genes. La secuencia de nucleótidos del mRNA es complementaria a la secuencia de bases del DNA molde. Lleva el mensaje transitorio del DNA nuclear para la síntesis proteica a los ribosomas. Cada molécula lleva las instrucciones de un gen o conjunto de genes, que habitualmente codifica un tipo de producto polipéptido. De ahí que en la célula se encuentren moléculas de mRNA de muchas secuencias de bases distintas.

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Bibliografía. - Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. “Principios de Bioquímica”. 5a.Edición. Ed.Omega S.A. Barcelona, 2009. - Lehninger, A.; Nelson,D. y M. Cox. “Principios de Bioquímica”. 2ª. Edición.Ediciones Omega. Barcelona, 1995. - Boyer, Rodney. “Conceptos de Bioquímica”. International Thomson Editores. México, 1999. - Vázquez, Martín. “La intimidad de las moléculas de la vida. De los genes a las proteínas”. Colección Ciencia Joven. Ed. EUDEBA. Buenos Aires, 2006.

Estructura de los componentes originarios: pirimidina y purina, y de las bases pirimidínicas y purínicas que forman parte de los ácidos nucéicos.

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Estructuras del esqueleto covalente del DNA y del RNA, que muestran cómo los puentes fosfodiéster unen las sucesivas unidades nucleotídicas. Tanto en el DNA como en el RNA, el esqueleto de los grupos alternantes de pentosa y de fosfato es muy polar, mientras que las bases son no polares e hidrofóbicas.

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Modelo de la doble hélice de Watson y Crick

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123

124

Diccionario de las palabras del código de los aminoácidos en los mRNA:

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UNIDAD 10. INTRODUCCIÓN A LA FITOQUÍMICA.

La Fitoquímica, o Química de las Plantas, se ha desarrollado como una disciplina particular, entre la química de los productos orgánicos naturales y la bioquímica de las plantas, y estrechamente relacionada con ambas. Se ocupa de la enorme variedad de sustancias orgánicas que son elaboradas y acumuladas por las plantas, en la estructura de esas sustancias, sus biosíntesis, metabolismo, su distribución natural, su función biológica y su evaluación. En estos estudios son necesarios métodos para separación, purificación e identificación de los diferentes compuestos presentes en las plantas. Así, avances en nuestros conocimientos sobre fitoquímica están directamente relacionados con las sucesivas apariciones de conocimientos técnicos, y el continuo desarrollo de nuevas técnicas para resolver los principales problemas que de ellos surgen. Uno de los desafíos de la fitoquímica es llevar a cabo dichas operaciones con pequeñas porciones de material. Frecuentemente, la solución a problemas biológicos, como la regulación del crecimiento en las plantas, la bioquímica de la interacción planta-animal, o el entendimiento del origen de las plantas fósiles, depende de identificar estructuras químicas complejas, de las cuales tenemos sólo microgramos de muestra. La Bioquímica Ecológica estudia las interacciones químicas entre los seres vivos y entre ellos y el medio. Trata de explicar o analizar fenómenos como la alelopatía (interacción planta-planta), adaptación de las plantas a la sequía (interacción plantamedio), polinización (interacción planta-animal), estudio de las feromonas (interacción animal-animal), en los que están implicados productos naturales, generalmente pertenecientes al metabolismo secundario. El número de las estructuras moleculares distintas producidas por las plantas es enorme. Por ejemplo se estima que hay actualmente mas de 10.000 alcaloides de vegetales, y tal es el interés farmacológico que despiertan estos compuestos que continuamente se descubren y describen nuevos alcaloides. Las plantas poseen rutas metabólicas por las cuales sintetizan y utilizan ciertos compuestos orgánicos: azúcares, aminoácidos, ácidos grasos comunes, nucleótidos y polímeros derivados de ellos (polisacáridos, proteínas, lípidos, DNA, RNA, etc.) estas rutas constituyen su metabolismo primario, y los componentes indicados, esenciales para la supervivencia de los organismos vegetales, son los metabolitos primarios. Además de las rutas del metabolismo primario, idénticas o similares en todos los organismos vivos, las plantas pueden seguir otras rutas metabólicas que llevan a la formación de compuestos usualmente peculiares de un grupo taxonómico determinado (especie, género, familia). Estas rutas constituyen el metabolismo secundario, y sus productos se denominan metabolitos secundarios. Estos compuestos o metabolitos secundarios cumplen generalmente funciones ecológicas, es decir, están involucrados en las interacciones químicas de las plantas con el medio y, por lo tanto, son motivo de estudio de la Bioquímica Ecológica. Los alcaloides, los compuestos fenólicos y la mayoría de los terpenoides son ejemplos de metabolitos secundarios típicos. Aunque los métodos fitoquímicos son obviamente esenciales en todos los estudios químicos y bioquímicos, su aplicación en las esferas estrictamente biológicas ha tenido lugar sólo en las últimas décadas. Aún en disciplinas muy remotas a un laboratorio químico como sistemática, fitogeografía, ecología y paleobotánica, los métodos fitoquímicos se han vuelto importantes para solucionar ciertos tipos de problemas e indudablemente su importancia va a ir creciendo en el futuro.

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Las aplicaciones más importantes en producción agropecuaria se refieren a aspectos como nutrición animal, industrias de los alimentos y aplicaciones farmacéuticas de compuestos vegetales. Pero también los estudios fitoquímicos contribuyen en disciplinas como fisiología vegetal, fitopatología, paleobotánica, genética vegetal, sistemática vegetal (quimiotaxonomía), etc.

PREPARACION DEL MATERIAL VEGETAL PARA SER ANALIZADO. ESTABILIZACION. La composición química de los vegetales varía en las diferentes especies, en las distintas partes de la planta y sus estados fisiológicos, por lo tanto, el método de muestreo es fundamental en el momento de enviar para su análisis al laboratorio una muestra representativa de lo que se quiere estudiar. La forma de tomar la muestra depende del objetivo que se persigue. Es fundamental evitar la contaminación de las plantas en estudio con plantas enfermas, con heces, orina, tierra, etc. La identificación botánica del material en estudio es fundamental en los análisis fitoquímicos. Se han cometido muchos errores en el pasado sobre la identidad de las plantas, por eso es esencial la correcta identificación botánica, ya sea para el estudio de nuevas sustancias de plantas o de sustancias ya conocidas de plantas nuevas. La planta recién cosechada continúa viviendo durante cierto tiempo; así se producen reacciones profundas donde la planta aprovecha sus reservas merced a la acción de enzimas que pueden provocar reacciones de hidrólisis, oxidaciones, reducciones, etc. Las alteraciones que se producen las podemos agrupar de la siguiente manera: a) modificación de estructura; b) caramelizaciones; c) pérdida de compuestos volátiles; d) fermentaciones; e) oxidaciones. A fin de mantener una muestra sin cambios desde el momento en que la tomamos, debemos detener los procesos enzimáticos que comienzan en el mismo momento del corte. La fijación relativa de la composición química de la planta se llama estabilización. Antes de encarar un análisis químico el material debe ser estabilizado tratando de fijar la composición química del vegetal, procurando que la misma sea lo mas parecida posible a la que tenía al estado vivo. Para ello hay varias alternativas o tratamientos: - Desecación al aire. - Tratamiento por calor: * calor seco * calor húmedo * calor húmedo a presión - Conservación por frío. EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS En la extracción y purificación de compuestos orgánicos mediante el empleo de solventes, se suelen seguir ciertas reglas basadas en las analogías estructurales existentes entre la sustancia a extraer y el disolvente que se emplearía para tal fin. De este modo, las sustancias tales como hidratos de carbono, lípidos, alcaloides, pigmentos, etc. se extraerán de los tejidos vegetales o animales que las contienen (o de líquidos orgánicos provenientes de ellos) mediante disolventes cuya estructura sea lo mas parecida posible a la de las sustancias que se quieren obtener.

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La polaridad de ambos compuestos es otro elemento a tener en cuenta al considerar la solubilidad de un soluto en un solvente dado. Es así que los solventes fuertemente polares disuelven solutos iónicos o altamente polares, mientras que los solventes poco polares no disuelven de manera eficiente los solutos iónicos pero sí solutos poco polares. Otro factor vinculado a la polaridad de un solvente es su capacidad para formar uniones de tipo puente hidrógeno. Los solventes con posibilidad de formar este tipo de uniones facilitan la disolución de sustancias que también pueden participar en este tipo de unión. Desde el punto de vista general los solventes pueden clasificarse en polares y no polares, existiendo además algunos de polaridad intermedia. - Disolventes polares: Se caracterizan por presentar alta constante dieléctrica y capacidad de formar uniones de tipo puente de hidrógeno. Los solventes fuertemente polares disuelven solutos iónicos o altamente polares. Los compuestos con grupos funcionales polares son solubles en este tipo de disolventes, siempre que el componente hidrocarbonado no sea relativamente grande (no más de 4 átomos de C). Entre ellos encontramos al agua, los alcoholes de bajo peso molecular (metanol, etanol), la dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) y algunos ácidos de bajo peso molecular como el fórmico y el acético. -Disolventes no polares: poseen estructura de hidrocarburos, sin grupos que confieran una marcada polaridad a la molécula. En su estructura predominan las uniones químicas de tipo enlace covalente. Entre estos y en orden de polaridad creciente encontramos al éter de petróleo, tetracloruro de carbono, ciclohexano y benceno. -Disolventes de polaridad intermedia: Son aquellos disolventes cuya estructura molecular es eléctricamente asimétrica. Es el caso típico de la molécula de cloroformo, donde la distribución de polaridades creadas por los distintos tipos de uniones (de tipo covalente) crea una zona con carga negativa (átomos cloro) y otra con carga positiva (átomo de hidrógeno) formando un dipolo. Entre este tipo de compuestos se encuentran también los disolventes oxigenados, que al no poseer hidroxilos como los alcoholes, no se pueden asociar por medio de uniones hidrógeno, como por ejemplo el éter, acetona y acetato de etilo. AGOTAMIENTO SELECTIVO Y SUCESIVO DEL MATERIAL UTILIZANDO SOLVENTES DE DIFERENTES POLARIDADES El método clásico para obtener distintos constituyentes orgánicos de tejidos vegetales secos (madera, semillas, raíces, hojas) es una extracción continua del material pulverizado en un aparato Soxhlet con distintos solventes que permiten extraer las sustancias buscadas con un mayor o menor grado de pureza. El material vegetal (seleccionado y pulverizado) es agotado en primer lugar con un solvente de tipo no polar o de polaridad intermedia: éter de petróleo, benceno, cloroformo, éter etílico etc. Luego el material vegetal es tratado con distintos alcoholes como etanol, metanol (solventes de tipo polar) y finalmente con agua (el solvente de mayor polaridad). Los extractos obtenidos se pueden dividir de la siguiente forma: A) Extracto etéreo. B) Extracto alcohólico. C) Extracto acuoso. En el extracto etéreo se encuentran los compuestos químicos lipófilos, y en los otros dos, los compuestos hidrófilos.

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A) El extracto etéreo contiene compuestos liposolubles. Ejemplos: - Materia grasa (lípidos) - Aceites esenciales - Esteroles (triterpenos) - Carotenoides - Alcaloides (bases) - Clorofila - Vitaminas liposolubles B) En el extracto alcohólico se puede encontrar: - Azúcares simples - Glucósidos triterpénicos. - Compuestos fenólicos ( taninos, pigmentos flavonoides) C) Con el agotamiento del material con agua se obtienen compuestos hidrosolubles. Ejemplos: - Glúcidos simples - Glucósidos. - Alcaloides (sales). - Vitaminas hidrosolubles Generalmente, cuando el agotamiento con alcohol o metanol ha sido total, no es posible identificar los mismos compuestos químicos en el extracto acuoso. Cuando se requiere aislar compuestos hidrosolubles de tejidos de hoja, los lípidos deben ser removidos al principio, lavando el extracto repetidamente con éter de petróleo. Para identificar los compuestos extraídos, los tres extractos son analizados separadamente a través de una metodología conforme a las características físicoquímicas de cada grupo de principios activos. Los extractos obtenidos pueden ser clarificados por filtración a través de celite en una bomba de agua y luego concentrados en vacío. Esto se hace generalmente en un evaporador rotatorio, en el cual se concentran voluminosas soluciones en pequeños volúmenes a temperaturas entre 30 a 40ºC. Los extractos concentrados deben ser almacenados en heladera y con el agregado de tolueno para prevenir crecimiento de hongos y evitar así pérdidas y alteración del material. Las extracciones de compuestos volátiles de las plantas requieren precauciones especiales y procedimientos específicos. MÉTODOS DE SEPARACIÓN La separación y purificación de los compuestos químicos de las plantas se llevan a cabo mediante las técnicas cromatográficas. Se puede usar una sola o una combinación de ellas. Las técnicas básicas de separación son: cromatografía sobre papel, cromatografía en capa fina, cromatografía gaseosa (GC) y cromatografía líquida de alta presión (HPLC). La elección de cada una de ellas depende principalmente de las propiedades de solubilidad y volatilidad de los compuestos a separar. La cromatografía sobre papel es aplicable a los compuestos hidrosolubles de las plantas, principalmente carbohidratos, aminoácidos, ácidos orgánicos, compuestos fenólicos. La cromatografía en capa fina se utiliza para separar lípidos, esteroides, carotenoides, clorofilas. La cromatografía gaseosa se aplica para separar compuestos volátiles, ácidos grasos, mono y sesquiterpenos. Muchas veces estas técnicas se utiliza en forma combinada, por

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ejemplo: cromatografía en capa fina-cromatografía gaseosa, para separar una clase de compuestos en particular de las plantas. Las técnicas cromatográficas pueden usarse en micro o en macro escala. En el último caso es común la cromatografía en columna. Otra técnica muy común de separación de compuestos en fitoquímica es la electroforesis. En un primer momento esta técnica se aplicó sólo para separar sustancias con carga como aminoácidos, algunos alcaloides, aminas, ácidos orgánicos y proteínas. Otras clases de compuestos neutros (azúcares, fenoles) también pueden ser separados en un campo eléctrico previa conversión de los mismos en complejos metálicos. A parte de estas técnicas, otras pocas son ocasionalmente usadas en la investigación fitoquímica. Por ejemplo, la separación de proteínas requiere a veces de técnicas especiales como la centrifugación diferencial. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN Una vez extraído y purificado un compuesto, es necesario determinar primero a qué clase general de compuestos químicos pertenece para después identificar la sustancia en si. La clase general es determinada mediante la respuesta a tests de coloración, solubilidad, Rf cromatográfico y propiedades espectrales. Los tests bioquímicos pueden ser en algunos casos muy útiles, por ejemplo, la presencia de un glucósido puede ser confirmada por la hidrólisis con una β-glucosidasa. Para el caso de la identificación de reguladores de crecimiento generalmente se realizan bioensayos. La identificación completa dentro de la clase general depende de la determinación de otras propiedades que deben ser comparadas con las que están presentes en la bibliografía. Estas propiedades incluyen: punto de fusión (para compuestos sólidos), punto de ebullición (para compuestos líquidos), rotación óptica (para compuestos activos ópticamente) y Rf cromatográfico. Sin embargo, la información obtenida a través de las características espectrales de una sustancia son suficientes para su identificación; éstas incluyen: espectroscopía ultravioleta, espectroscopía infra-roja, resonancia magnética nuclear y espectroscopía de masa. La identificación de un nuevo compuesto, muchas veces se confirma a través de su degradación química o mediante su síntesis en el laboratorio. ACTIVIDADES PRÁCTICAS A REALIZAR: -

Extracción de pigmentos hidrosolubles a partir de remolacha y repollo con un solvente polar (metanol, etanol, agua) Extracción de clorofilas a partir de acelga con acetona (solvente de polaridad intermedia) Obtención de carotenoides a partir de pimentón empleando un solvente no polar (benceno, éter de petróleo, etc.). Utilización del extractor Soxhlet.

Bibliografía: - Piñol, M. T. y Palazón, J. Capítulo 11: Metabolismo secundario. En Azcon-Bieto, J y Talon, M. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Ed. Interamericana. Madrid. - Buchanan , B., Gruissem, R., Jones, R. 2000. Natural products (Secondary metabolites). Capítulo 24. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. USA.

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- Guía de Estudio y Actividades Prácticas. 2006. Curso Bioquímica y Fitoquímica. Impresa por el Centro de Estudiantes de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. UNLP. - Valencia Ortiz, Ciria. 1995. Constituyentes secundarios de las plantas. Capítulo 1. Fundamentos de Fitoquímica. Editorial Trillas. Méjico. - Ringuelet, Jorge Abel, Viña, Sonia Zulma. 2013. Libro Cátedra Productos naturales vegetales. SEDICI. Repositorio institucional de la UNLP. Ed. EDULP http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/27885.

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UNIDAD 11. METABOLISMO SECUNDARIO VEGETAL Las plantas producen una gran variedad de compuestos orgánicos que no participan directamente en el proceso metabólico primario de crecimiento y desarrollo. Estas sustancias fueron tradicionalmente llamadas metabolitos o compuestos secundarios y, en la actualidad, se las conoce también como productos naturales vegetales. Por mucho tiempo se las consideró como simples productos de desecho; actualmente, aunque muchas de sus funciones permanecen aún desconocidas, se sabe que cumplen funciones ecológicas, es decir, participan en las interacciones químicas entre las plantas y el ambiente. Las técnicas analíticas modernas, como cromatografía de gases, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y espectrometría de masa, constituyen herramientas muy útiles para la separación e identificación de la gran variedad de estos compuestos secundarios presentes en el reino vegetal. Los productos naturales vegetales constituyen una fuente importante de principios activos de medicamentos y de otros valiosos productos químicos como esencias, colorantes, insecticidas, funguicidas, etc. En esta unidad sólo se mencionarán algunos de los grupos principales: los alcaloides, los glicósidos cianogenéticos, los fenoles y los terpenos. ALCALOIDES Se caracterizan por tener nitrógeno en su molécula generalmente formando parte de un anillo heterocíclico y casi siempre, como su nombre lo indica, son básicos (alcaloide = parecido a álcali). La mayoría de ellos tiene importancia farmacológica. Hasta el momento, más de 12.000 alcaloides se han aislado de las plantas y determinado su estructura química; si se considera que se ha examinado menos del 15% de las 250.000 a 500.000 especies de plantas superiores, es evidente que queda aún un amplio campo para la investigación de los alcaloides. De acuerdo con la estructura molecular y ruta biosintética, los alcaloides se dividen en tres grupos: 1) alcaloides propiamente dichos o verdaderos: constituye el grupo principal. Se caracterizan por tener el nitrógeno fijado heterocíclicamente y se biosintetizan a partir de aminoácidos. 2) protoalcaloides: poseen el nitrógeno en una cadena lateral de la molécula; pueden ser considerados también aminas aromáticas. 3) pseudoalcaloides: poseen normalmente todas las características de los alcaloides verdaderos pero no se forman a partir de aminoácidos. En la mayoría de los casos conocidos se trata de isoprenoides, de allí que se los nombre como alcaloides terpénicos; por ejemplo los alcaloides monoterpénicos, diterpénicos, triterpenoides, sesquiterpénicos. Un ejemplo de pseudoalcaloide es la solanina presente en la papa. Los alcaloides verdaderos se clasifican según la estructura del ciclo nitrogenado.

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Ejemplos de núcleos nitrogenados de alcaloides verdaderos:

N Piridina (en nicotina)

N H

N H Piperidina (en cicutina)

N H

Pirrolidina (en nicotina)

Indol (en alcaloides del cornezuelo del centeno)

N N Quinoleína (en quinina)

Isoquinoleína (en papaverina del opio) N

NH

NH N Tropano (en cocaína)

N

Purina (en caf eína)

Están presentes especialmente en dicotiledóneas herbáceas y son escasos en monocotiledóneas y gimnospermas. Es raro encontrar un solo alcaloide en un vegetal, siendo frecuente que se encuentren varios estrechamente vinculados químicamente (nicotina, nornicotina, anabasina y otros en tabaco; morfina, codeína, papaverina y más de otros 30 en opio). Los alcaloides se sintetizan en distintos órganos de las plantas, por ejemplo, la nicotina en raíz, cocaína en hojas, morfina en látex. Algunos, como la nicotina, se forman en la raíz y se trasladan a los órganos aéreos. Cuanto más simple es la molécula del alcaloide y, por lo tanto su biosíntesis, más extensiva es su distribución; así por ejemplo, la nicotina (estructura molecular sencilla) está ampliamente distribuida, mientras que la morfina (estructura molecular complicada), se encuentra sólo en especies de Papaver. Se conoce poco de la función que los alcaloides cumplen en la planta que los produce. Algunos sirven para proteger a la planta de depredadores o microorganismos (sustancias tóxicas o repelentes), otros para competir con otras especies vegetales en determinado hábitat (sustancias alelopáticas). En algunos casos pueden actuar como reserva de nitrógeno, el cual puede ser metabolizado de acuerdo con las necesidades. De un modo general, los alcaloides parecen ser productos de excreción; luego, estas excreciones, pueden ser utilizadas secundariamente para ciertas funciones particulares.

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GLICÓSIDOS CIANOGÉNICOS Cianogénesis y sustancias cianogénicas. Cianogénesis es la capacidad que poseen ciertas plantas para sintetizar compuestos que, por hidrólisis, liberan ácido cianhídrico o prúsico (HCN), sustancia altamente venenosa. Casi todas las sustancias cianógenas son glicósidos de 2-hidroxinitrilos, y son llamados glicósidos o heterósidos cianogénicos. La estructura general de estos compuestos puede representarse de la siguiente manera:

R1

O-Azúcar C

R2

C

N

El azúcar puede ser un mono o disacárido, aunque generalmente es la glucosa y los grupos R y R’ pueden ser alifáticos o aromáticos. Mecanismo de liberación del ácido cianhídrico.

R1

O-Glucosa

hidrolisis

C R2

C

N

R1

OH

R1

C R2

C C

N

O

+ HCN

R2

(R1 y R2 pueden ser grupos alquilos, aromáticos u otros sustituyentes)

El primer paso de esta reacción es enzimático y las plantas cianógenas contienen la enzima hidrolasa específica que la cataliza. El segundo paso, es decir la liberación de HCN y producción de un compuesto ternario (cetona o aldehído) a partir del intermediario inestable (cianhidrina) ocurre espontáneamente. En la actualidad se conocen más de 2600 especies, distribuidas en unas 110 familias diferentes.

Ejemplos de glicósidos cianogénicos: Glucósido Amigdalina Durrina Prunasina Linamarina

Fuente Prunus amygdalus Sorghum vulgare Prunus seratina Linum usitatissimum

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COMPUESTOS FENÓLICOS Los compuestos fenólicos constituyen uno de los grupos de productos naturales más importantes y más ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Los fenoles poseen, al menos, un anillo bencénico, con uno o más grupos hidroxilos, libres o sustituidos. Son generalmente hidrosolubles. La solubilidad en agua es mayor al aumentar el número de hidroxilos. Se extraen generalmente de las plantas con alcohol en ebullición; de esta forma se previene la oxidación de los fenoles por acción de enzimas específicas (fenolasas) presentes en todas las plantas. El ennegrecimiento que se produce al cortarse el fruto de la manzana o tubérculo de papa se debe a la oxidación de compuestos fenólicos presentes en los mismos. Por otro lado, los fenoles pueden actuar como agentes antioxidantes. Función: la lignina, que es el compuesto fenólico más difundido en las plantas superiores, cumple un rol fundamental en la estructura de la pared celular. En cambio, otros compuestos fenólicos cumplen variadas funciones ecológicas: sustancias de defensa de las plantas en el caso de los taninos, flavonoides y fenoles simples, y como pigmentos (algunos flavonoides) de las flores y frutos favoreciendo la polinización y la dispersión de las semillas respectivamente. Biosíntesis: el compuesto precursor de las sustancias fenólicas es el ácido siquímico que se forma a partir de la eritrosa-P (ruta de fosfatos pentosas y del ciclo fotosintético de Calvin) y del fosfoenolpirúvico (glucólisis). Ácidos fenólicos: Aunque existen en las planta los ácidos fenólicos simples (ejemplo: el ácido gálico en los taninos hidrolizables), los más difundidos son los derivados del ácido cinámico (ejemplos: ácidos cumárico, cafeico, ferúlico, clorogénico, etc) que poseen la estructura de un fenilpropanoide:

C

C

C

Algunas funciones ecológicas de los derivados cinámicos: repelen herbívoros actuando como disuasorios alimentarios. Al ser componentes de algunas esencias, confieren a las plantas aromas que atraen insectos favoreciendo la polinización. Cumarinas: Son compuestos muy relacionados con los derivados cinámicos. R1

8

O 1 2

7 6 R2

O 3

5

4

Cumarina El grupo OH generalmente está en posición 7

135

Se conocen más de 1.500 estructuras de cumarinas distribuidas en más de 800 especies. Pueden encontrarse en las cubiertas de las semillas, frutos, flores, hojas, tallos y raíces aunque las mayores concentraciones se dan en general en frutos y flores. Sus funciones en las plantas están principalmente relacionadas con la defensa de las mismas: actúan como antimicrobianos y repelentes de insectos. También son inhibidores de la germinación de ciertas semillas.

Flavonoides: Constituyen uno de los grupos más característicos y extensos de metabolitos secundarios de las plantas superiores (más de 4.500 compuestos), siendo muchos de ellos reconocibles como pigmentos de las flores en la mayoría de las angiospermas. Su estructura química se basa en el anillo de 15 carbonos llamado flavona: 3´

2´ 8

O1

1´

7

A 6

4

3

4´

B

2 6´

5´

5 O

Las distintas clases de flavonoides se diferencian en el anillo central. El anillo A es generalmente trihidroxilado, y el anillo B, puede presentar varias modificaciones (distinto grado de hidroxilación, metilación, etc.). Los hidroxilos del anillo A y de la posición 3 del anillo central sirven de punto de unión para moléculas de azúcares formando glicósidos de flavonoides incrementándose de esta forma la solubilidad en agua. La mayoría de los flavonoides se acumulan en las vacuolas de las células aunque se sintetizan fuera de ellas. Los grupos de flavonoides más difundidos son: las antocianinas, las flavonas y flavonoles. Las antocianinas constituyen el grupo de pigmentos vegetales hidrosolubles más difundido. Generalmente se encuentran en flores rojas, azules y violetas. También se presentan en muchas otras partes de las plantas, como en ciertos frutos, tallos, hojas e incluso raíces. La mayoría de los frutos y muchas flores deben sus colores a las antocianinas, aunque algunos, como muchas flores amarillas y los frutos del tomate, son coloreados por carotenoides. En las plantas superiores existen varios tipos de antocianinas (se diferencian entre si en el grado de hidroxilación y en la presencia de grupos metilos del anillo B) y, con frecuencia, hay más de uno en una misma flor (u otro órgano). El color de las antocianinas depende de varios factores: grado de hidroxilación, presencia de grupos metilos, presencia de copigmentos como flavonas y flavonoles (las vuelven en general más azules), asociaciones entre sí, pH de las vacuolas donde se acumulan, etc. Las flavonas y flavonoles son pigmentos amarillentos o blancos y también contribuyen a la coloración de las flores; muchas veces son incoloros pero, aún en este caso, influyen en el color ya que actúan como copigmentos de las antocianinas. Son muy frecuentes en hojas, en donde sirven como factores atrayentes o repelentes de insectos y, además, como absorben radiación ultravioleta, protegen a las plantas contra los rayos UV de onda larga.

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Lignina: Es un componente de la pared celular de varios tipos de células vegetales como fibras, vasos y traqueidas. Después de la celulosa es el compuesto orgánico natural más abundante, constituyendo el 20-30 % de los tejidos de las plantas vasculares. Es un gran polímero que se encuentran en forma de masa amorfa incrustada entre las microfibrillas de celulosa confiriendo rigidez a la pared, a la vez que protege a las células frente al ataque de patógenos. Se encuentra presente en todas las plantas terrestres, excepto en los musgos, que poseen la pared celular impregnada de otros fenoles. Los evolucionistas consideran que la formación de lignina ha sido crucial en la adaptación de las plantas a un ambiente terrestre, ya que suponen que gracias a ella se pudieron construir las paredes celulares rígidas del xilema. En general la lignina contiene tres alcoholes aromáticos: alcohol cumarílico, coniferílico y sinapílico.

Monómeros de lignina: (1) alcohol p-cumarílico, (2)- alcohol coniferílico, (3) alcohol sinapílico. En la polimerización de estos monómeros intervienen los tres grupos reactivos de la molécula: dobles ligaduras, alcohol primario y alcohol fenólico. En general, los organismos más primitivos son ricos en alcohol coniferílico y con la evolución aumenta la proporción de cumarílico y sinapílico (las angiospermas contienen los alcoholes coniferílico y sinapílico en proporciones más o menos iguales). La lignina es difícil de estudiar debido a que es un compuesto muy poco soluble. Esta insolubilidad se debe en gran parte a su peso molecular muy elevado, y a que en su estado natural se encuentra químicamente unida a la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular mediante enlaces éter fundamentalmente y también mediante puentes de hidrógeno. Taninos: También son polímeros fenólicos. De acuerdo con su estructura se dividen en dos grupos: 1) taninos hidrolizables: son polímeros que contienen moléculas de ácido gálico esterificadas con moléculas de azúcares, es decir, tienen la estructura de un glucósido. Se encuentran en hojas, frutos, agallas de algunos árboles y aún no han sido identificados en monocotiledóneas.

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2) taninos condensados: son polímeros relacionados con los flavonoides ya que sus unidades monoméricas son fundamentalmente las proantocianidinas (leucoantocianidinas) y catequinas que son clases de flavonoides. Son más abundantes que los taninos hidrolizables y se encuentran prácticamente en todos los árboles y arbustos.

O OH

OH OH

Ácido gálico

Flavan 3,4 diol proantocianidina (leucoantocianidina)

Los taninos tienen la propiedad de formar enlaces con las proteínas y, por ese motivo, se los utiliza comercialmente para curtir pieles. Aunque están muy difundidos en las plantas sólo un número pequeño de ellas los poseen en suficiente cantidad para la producción comercial. Los taninos cumplen la función de sustancias de defensa en las plantas frente a microorganismos. Actúan como disuasorios nutritivos de animales herbívoros ya que reaccionan con las proteínas salivares y las glucoproteínas de la boca ejerciendo un efecto astringente. Algunos taninos actúan como agentes alelopáticos inhibiendo el crecimiento de otras especies alrededor de las plantas que los producen y los liberan.

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ACTIVIDADES PRÁCTICAS A REALIZAR Reacciones de identificación de compuestos fenólicos:

Antocianinas: Para extraerlas colocar en un erlenmeyer pétalos de flores rojas, violetas o azules. Agregar alcohol etílico y llevar a ebullición. Filtrar y evaporar a sequedad el extracto alcohólico. Disolver el residuo con 5 ml de agua destilada y efectuar el siguiente ensayo de variación del color según el pH (las antocianinas son rojas en solución ácida y en soluciones neutras o alcalinas son violetas o azules, color que desaparece lentamente). a) agregar 2 ó 3 gotas de HCl al 10% b) agregar 2 ó 3 gotas de NaHO al 10%. Flavonas y flavonoles: Para extraerlos colocar pétalos de flores blancas en un vaso de precipitación con agua hirviendo. Filtrar, enfriar y efectuar las siguientes reacciones de fenoles: 1) 5ml de solución más 3 gotas de cloruro férrico. 2) 5ml de solución más 1 ml de acetato de plomo. Lignina: Ensayo de Wiesner: el material vegetal, (virutas de pino) se trata con floroglucina ácida (0,25g de floroglucina en 100ml de HCl al 25%), si aparece un color rojo indica presencia de lignina en el tejido vegetal. Esta coloración se atribuye al aldehído coniferílico presente en la lignina.

Taninos: Precipitar una solución de gelatina (proteína) al 2% con una solución acuosa de taninos al 3‰ (se pueden agregar gotas de solución de cloruro de sodio).

TERPENOIDES Un gran número de sustancias vegetales están incluidas en este grupo de metabolitos secundarios llamados terpenoides. Todas tienen el mismo precursor biosintético (isopentenil PP), y tienen como unidad estructural básica a la molécula de isopreno, y sus esqueletos carbonados se forman con la unión de dos o mas de estas unidades de 5 C.

CH3 CH2

C H2C

CH

isopreno

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Así se los clasifica según la cantidad de estas unidades que contengan en su estructura. Cada una de estas clases de terpenoides tiene importancia en diversos aspectos, algunas en el crecimiento, otras en el metabolismo, o en funciones ecológicas de las plantas. Principales clases de terpenoides en las plantas: Nº de unidades de isopreno

N° C

Nombre o clase

1

5

Hemiterpenos

Isovaleraldehído en esencia de Eucaliptus sp.

2

10

Monoterpenos

Componentes de aceites esenciales mirceno, limoneno, pineno, etc.)

3

15

Sesquiterpenos

Componentes de aceites abscícico (hormona).

4

20

Diterpenos

5

25

Sesterpenos

6

30

Triterpenos

8

40

Tetraterpenos

Carotenoides (carotenos y xantófilas)

n

n

Politerpenos

Caucho (Hevea brasiliensis)

Ejemplos

(mentol,

esenciales.

Ácido

Ac. Diterpénicos en resinas (ácido abiético); Fitol; componentes de algunas esencias; Giberelinas; Steviósido; diterpenos tóxicos Pequeño grupo de compuestos naturales presentes principalmente en organismos marinos (ej. esponjas) Esteroles (colesterol); Triterpenos verdaderos: amirina, limonina, cucurbitacina Saponinas; Glicósidos cardiotónicos

Casi todos los terpenoides naturales tienen estructuras cíclicas con uno o más grupos funcionales (hidroxilos, carbonilos, etc.). Químicamente, los terpenoides son generalmente solubles en lípidos y están localizados en el citoplasma. En el caso de los aceites esenciales, éstos se ubican generalmente en glándulas especiales en la superficie de las hojas, mientras que los carotenoides están asociados con cloroplastos en las hojas y con cromoplastos en los pétalos. Son extraídos de los tejidos de las plantas con éter o cloroformo y pueden ser separados por cromatografía en placas de sílico-gel usando los mismos solventes. Sin embargo ofrecen dificultad para detectarlos en pequeña escala, puesto que todos (salvo carotenoides), son levemente coloreados y no hay un reactivo cromogénico para ellos. El isomerismo es común en los terpenoides, y pares de formas isoméricas pueden ser aislados de las plantas. Se le atribuyen gran número de funciones.

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La producción, acumulación, emisión y secreción de terpenoides está generalmente asociada con la presencia de estructuras anatómicas altamente especializadas: tricomas glandulares, cavidades secretoras, glándulas epidérmicas, conductos y cavidades resiníferas, canales laticíferos.

Biosíntesis de terpenoides. Aunque los terpenoides derivan estructuralmente de la molécula de isopreno, esta sustancia no es el precursor “in vivo”. En lugar de ella el compuesto encontrado es el isopentenilpirofosfato (IPP): CH2=C(CH3) –CH2–CH2–O–PP La biosíntesis de los terpenoides está compartimentalizada. Los sesquiterpenos (C15), triterpenos (C30) y politerpenos son producidos en compartimentos citosólicos y retículo endoplasmático, mientras que el isopreno (C5), monoterpenos (C10), diterpenos (C20) y tetraterpenos (C40) se sintetizan en los plástidos. Las evidencias indican que las vías biosintéticas para la síntesis del IPP difiere mucho en esos compartimentos: la clásica vía del ácido mevalónico en el citosol y retículo endoplasmático, y la vía del gliceraldehído fosfato y piruvato en los plástidos. En la vía del ácido mevalónico, reaccionan 3 moléculas de acetil-CoA para formar el compuesto intermedio hidroximetil glutaril CoA, que se reduce para formar ácido mevalónico (C6). Dos fosforilaciones posteriores y una descarboxilación originan el IPP. En los plástidos, el IPP se sintetiza a partir del gliceraldehído 3-fosfato (GAP) y el piruvato. En esta vía, el piruvato reacciona con la tiamina pirofosfato (TPP) para dar un esqueleto de 2 C: hidroxietil-TPP, que se condensa con el GAP. La TPP es liberada para formar un intermediario de 5 C: 1-deoxy-D-xylulosa-5 fosfato, que sufre un reacomodamiento y reducción para formar 2-C-metil-D-erytritol 4- fosfato y luego se transforma para dar el IPP. Dos IPP se unen para dar geranil-pirofosfato (C10), la llave intermedia en la formación de monoterpenos. La unión con otro IPP forma el farnesil-pirofosfato, precursor de los sesquiterpenos (C15). BIBLIOGRAFÍA: - Azcon, Bieto y Talon. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Ed. Interamericana. Madrid. - Buchanam , B., Gruissem, R., Jones, R. 2000. Biochemistry & Molecular Biology of Plants. American Society of Plants Physiologists. USA. - Valencia Ortiz, Ciria. 1995. Fundamentos de Fitoquímica. Editorial Trillas. Méjico. - Ringuelet, Jorge Abel, Viña, Sonia Zulma. 2013. Libro Cátedra Productos naturales vegetales. SEDICI. Repositorio institucional de la UNLP. Ed. EDULP http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/27885

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UNIDAD 12. INTEGRACIÓN DEL METABOLISMO La bioquímica trata la química de la célula viva y tiene como objetivo describir los procesos de la vida a nivel molecular. Para ello debe conocer la estructura química de las biomoléculas y entender su función biológica. Para comprender el significado del metabolismo en los seres vivos, es preciso estudiar las distintas rutas metabólicas en el contexto del organismo entero. Los organismos multicelulares tienen como característica esencial la diferenciación celular y la distribución de funciones. Los organismos eucariotas, que incluyen a las plantas y animales, poseen la característica de tener separados sus componentes celulares en compartimentos y, en consecuencia, sus funciones biológicas también estás separadas. El núcleo posee una compleja estructura interna y está envuelto por una membrana doble y los compartimientos internos, llamados orgánulos, están limitados por membranas. Los orgánulos son paquetes de macromoléculas organizadas que realizan funciones especializadas para la célula. Cada uno de ellos está formado por diferentes biomoléculas y realizan distintas funciones biológicas. A continuación vamos a hacer un breve repaso de los distintos orgánulos de los eucariotas mencionando sus componentes biomoleculares y su función biológica, a fin de integrar las distintas rutas metabólicas y ubicarlas a nivel celular. La membrana plasmática está formada por una bicapa de proteínas y lípidos (también esteroles) y algunos hidratos de carbono y constituye una barrera de permeabilidad selectiva resistente y flexible que regula la entrada y salida de nutrientes y desechos. Posee además actividad enzimática, transportadora y receptora de señales extracelulares. La mayoría de las células de plantas superiores poseen pared celular que rodea la membrana plasmática y actúa como una cubierta protectora y rígida. Está compuesta principalmente por celulosa y otros polisacáridos y permite el paso del agua y moléculas pequeñas. Existe en las células un sistema endomembranoso formado por la envoltura nuclear, el retículo endoplasmático liso y rugoso, el complejo de Golgi y diversos tipos de vesículas de transporte. Este sistema dinámico forma un compartimento distinto del citosol llamado luz, donde su contenido se desplaza de una región a otra del sistema endomembranoso mediante la formación de vesículas de transporte que brotan de un componente y se fusionan con otro. Así las proteínas sintetizadas en los ribosomas unidos al retículo endoplasmático rugoso penetran en el sistema endomembranoso y viajan vía complejo de Golgi hasta los orgánulos de destino o la superficie celular donde son excretadas por exocitosis. Retículo endoplasmático: formado por vesículas aplanadas (cisternas) de una sola membrana de lípidos y proteínas. Éste forma una malla tridimensional y altamente plegada de espacios limitados por membranas que se extiende por el citoplasma, conectándose con la doble membrana que envuelve al núcleo. La unión de miles de ribosomas, a su superficie externa, le confiere una apariencia granular dando lugar al llamado retículo endoplasmático rugoso. Éste transporta las proteínas sintetizadas en los ribosomas destinadas a la exportación y secreción. En cambio las proteínas que deben permanecer y actuar en el interior del citosol se sintetizan en ribosomas citoplasmáticos no asociados con el retículo endoplasmático. El retículo endoplasmático liso es el que se encuentra sin ribosomas, y está formando un continuo con el rugoso. En él se lleva a cabo la síntesis de lípidos, que forman parte de la membrana celular y otras membranas que rodean las distintas

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estructuras celulares, y compuestos importantes entre los que se encuentra el metabolismo de ciertos fármacos y sustancias tóxicas. Aparato de Golgi: Formado por agrupaciones de vesículas membranosas de lípidos, proteínas y polisacáridos. La principal función del aparato de Golgi es la secreción de las proteínas producidas en los ribosomas del RE rugoso, las cuales entran en el sistema endomembranoso (desplazándose del RE rugoso al RE liso) y viajan a través del aparato de Golgi vía vesículas de transporte hacia sus orgánulos de destino o la superficie celular, donde serán excretadas por exocitosis. En el aparato de Golgi se añaden instrucciones moleculares específicas a ciertas proteínas para dirigirlas hacia la superficie de la célula, los lisosomas o vesículas de secreción. Algunos de los productos que se secretan intervienen también en la formación de la pared celular de las células vegetales. Lisosomas: Estos orgánulos están presentes sólo en animales. Su función es la de reciclar moléculas complejas que penetran en la célula por endocitosis, o fragmentos de células extrañas que penetren por fagocitosis o bien orgánulos deteriorados. Para este fin poseen enzimas capaces de digerir proteínas, polisacáridos y lípidos hasta sus componentes básicos, los cuales son liberados al citosol para ser reciclados y formar nuevos componentes celulares o continuar su catabolismo. Vacuolas: Las vacuolas presentes en células vegetales cumplen funciones degradativas similares a las que se llevan a cabo en los lisosomas de células animales. Es por ello que contienen enzimas digestivas que degradan y reciclan componentes macromoleculares que no resultan de utilidad para la célula. Otra de las funciones de estos orgánulos es la de mantener la presión de turgencia dentro de la célula y evitar el marchitamiento. Esto lo logran ya que en las células maduras las vacuolas pueden representar hasta el 90% del volumen celular empujando el citoplasma contra la pared celular. También actúan como reserva prolongada de polisacáridos, proteínas, pigmentos y compuestos secundarios en general. Estos orgánulos están rodeados por una membrana simple llamada tonoplasto. En algunas células la vacuola contiene elevadas concentraciones de pigmentos (antocianinas) que dan su color rojo o púrpura a flores y frutos. Al igual que los lisosomas el medio acuoso es más ácido que el citosol. La vacuola también proporciona un soporte físico a la célula. El agua entra en la vacuola por ósmosis debido a la elevada concentración de solutos, aumentando el volumen celular. La presión resultante empuja el citoplasma contra la pared celular, originando una presión interior que da rigidez al tejido vegetal. A su vez la rigidez de la pared celular evita la expansión y rotura de la membrana plasmática. Peroxisomas y glioxisomas: Algunas de las reacciones oxidativas de degradación de aminoácidos y grasas dan lugar a la aparición de radicales libres y peróxido de hidrógeno, especies reactivas que podrían dañar la maquinaria celular. Con el fin de proteger a la célula de estos productos secundarios peligrosos, estas reacciones están confinadas al interior de pequeñas vesículas rodeadas por membranas denominadas peroxisomas. Poseen catalasa y otras enzimas oxidativas. Los glioxisomas son peroxisomas especializados que se encuentran en ciertas células vegetales. Contienen elevadas concentraciones de enzimas del ciclo del glioxilato, ruta metabólica que permite la conversión de los lípidos almacenados en glúcidos, durante la germinación de las semillas.

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Mitocondrias: Estos orgánulos varían en tamaño, forma y localización dependiendo del tipo celular o de la función tisular. La mayoría de las células animales y vegetales poseen de centenares a un millar de mitocondrias. Las células de tejidos metabólicamente más activos presentan una gran cantidad de mitocondrias. Poseen una doble membrana. La externa sin repliegues, rodea todo el orgánulo. La membrana interna presenta invaginaciones denominadas crestas, que le proporcionan una gran área superficial. El compartimento interno se denomina matriz, y contiene una disolución acuosa concentrada de un gran número de enzimas o intermediarios químicos implicados en el metabolismo energético. Las enzimas allí presentes catalizan la oxidación de nutrientes orgánicos por el oxígeno molecular. Las enzimas ubicadas en la matriz intervienen en el ciclo de Krebs y la beta oxidación de los ácidos grasos. Otras que se hallan embebidas en la membrana interna forman parte de la fosforilación oxidativa. Como producto de la energía liberada en las oxidaciones se genera ATP, principal molécula portadora de energía de las células, el que se difunde hacia todas las partes de la célula proporcionando energía para la realización de distintos trabajos. Cada mitocondria se produce por división de las ya existentes, es por ello que posee sus propias moléculas de ADN y de ARN y sus propios ribosomas. El ADN mitocondrial codifica ciertas proteínas específicas de la membrana interna mitocondrial, y otras proteínas mitocondriales están codificadas por el ADN nuclear. Cloroplastos: Estos plástidos se encuentran en las células de las plantas verdes y algas eucarióticas. (Plástidos: orgánulos especializados del citoplasma de células vegetales rodeados de dos membranas). Al igual que las mitocondrias se los considera como las centrales energéticas de la célula, pero en este caso, éstos utilizan la energía solar para transformarla en energía química. Los cloroplastos contienen una elevada concentración de clorofila localizada en las membranas internas, que forman sacos membranosos aplanados llamados tilacoides. Este pigmento absorbe la energía de la luz para fabricar ATP y reducir el dióxido de carbono para producir glúcidos como el almidón y la sacarosa. Al igual que las mitocondrias, los cloroplastos contienen ADN, ARN y ribosomas. Citoesqueleto: Es una malla intracelular de filamentos de actina, microtúbulos y filamentos intermedios de varios tipos en el citoplasma. Este citoesqueleto actúa proporcionando estructura y organización a la célula como así también colaborando en el movimiento de los orgánulos o de la célula entera. Adquiere relevancia en especial en células animales, ya que al carecer de pared celular rígida, el citoesqueleto mantiene la estructura y forma de la célula. En el citoplasma se hallan distinto tipo de enzimas implicadas en muchas reacciones metabólicas como la glucólisis, vía de las pentosa fosfato, síntesis de ácidos grasos. Núcleo: En él se encuentra casi la totalidad del ADN de la célula. Está rodeado por una envoltura nuclear, compuesta por dos membranas que se comunica con el retículo endoplasmático. El material genético está organizado en cromosomas, complejos de ADN y proteínas histonas altamente ordenadas.

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Relación entre las distintas rutas metabólicas Las diferentes rutas metabólicas que llevan a las transformaciones de los glúcidos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, como así también de los compuestos secundarios están vinculadas entre sí. Las relaciones existentes entre las vías metabólicas de los distintos metabolitos forman una red interconectada que asegura el comportamiento funcional unitario de los organismos vivientes. Compuestos de distinto origen y naturaleza pueden llegar a formar metabolitos comunes y alcanzar el mismo punto final. Por otra parte, a partir de un mismo compuesto pueden generarse sustancias muy diferentes. Las rutas degradativas de los principales compuestos convergen hacia productos finales idénticos. Los polisacáridos, grasas y proteínas se hidrolizan a monosacáridos, glicerol, ácidos grasos o aminoácidos pudiendo degradarse hasta llegar a formar productos finales iguales. A través de la glucólisis, las hexosas dan lugar a piruvato, el cual se transforma luego en acetil-CoA, producto de una descarboxilación oxidativa. El glicerol ingresa en la vía glucolítica y se convierte en piruvato y luego en acetil-CoA. Los ácidos grasos mediante la beta oxidación generan acetil-CoA. Los esqueletos carbonados de muchos aminoácidos producen también acetilCoA. El acetil-CoA (específicamente los dos carbonos del acetato) es un metabolito común a un gran número de rutas diferentes. La oxidación final de los distintos compuestos se realiza en el ciclo de Krebs. Los aminoácidos cuya degradación no termina en acetil-CoA dan productos intermedios del ciclo de Krebs y por lo tanto pueden ingresar al mismo. Los compuestos que convergen en el ciclo de Krebs son oxidados a dióxido de carbono cualquiera sea su procedencia. La fosforilación oxidativa acoplada al transporte de electrones en la cadena respiratoria es otro ejemplo de convergencia metabólica. En esta vía común se canalizan los electrones cedidos por la oxidación de los distintos sustratos. - Interconversión de hidratos de carbono-lípidos Glucosa -------------- piruvato--------------acetil-CoA ------------- Ácidos grasos Dihidroxiacetona fosfato (intermediario de la glucólisis) ----------- glicerol - Interconversión de hidratos de carbono-aminoácidos Hidratos de carbono ------------ alfa cetoácidos ---------------------- aminoácidos transaminación La transaminación constituye la principal conexión entre el metabolismo de aminoácidos y azúcares. Piruvato -----------------------------------alanina, valina, leucina 3-fosfoglicerato --------------------------serina, glicina, cisteína Fosfoenolpirúvico – eritrosa-P -------- triptofano, fenil alanina, tirosina

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Alfa cetoglutarato ------------------------glutamato --- glutamina, prolina, arginina Oxalaceato ------------------------------asparato ---- asparagina, metionina, treonina, lisina, isoleucina Los llamados aminoácidos glucogénicos, previa desaminación, pueden convertirse en hidratos de carbono. El glicerol, en animales, es el único integrante de los lípidos que origina glucosa. En vegetales el acetil CoA también es glucogénico, se convierte en glucosa mediante el ciclo del glioxilato. Alternativas metabólicas de ciertos metabolitos claves del organismo Glucosa 6 P * hidrólisis a glucosa libre * síntesis de polisacáridos y sacarosa * ingreso a la ruta de las pentosas fosfato * degradación vía glucolítica En algunas etapas de las vías antes mencionadas surgen nuevas alternativas que ofrecen otras posibilidades de transformación. Piruvato * descarboxilación oxidativa a acetil CoA * síntesis de glucosa y polisacáridos, previa conversión a malato u oxalacetato. * formación de aminoácidos * reducción a lactato, etanol, etc (fermentaciones) Acetil CoA * oxidación en el ciclo de Krebs para generar energía * síntesis de ácidos grasos * síntesis de terpenoides * oxidación en el ciclo del glioxilato para generar glúcidos

BIBLIOGRAFÍA: - Azcon, Bieto y Talon. 1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal. Ed. Interamericana. Madrid. - Lehninger,A.; Nelson,D. y M. Cox. “Principios de Bioquímica”. 2ª. Edición.Ediciones Omega. Barcelona, 1995. - Boyer, Rodney. “Conceptos de Bioquímica”. International Thomson Editores. México, 1999. - Stryer, L. 1990. Bioquímica. Tercera Edición. Tomos I y II. Editorial Reverté S. A. Barcelona, España. - Ringuelet, Jorge Abel, Viña, Sonia Zulma. 2013. Libro Cátedra Productos naturales vegetales. SEDICI. Repositorio institucional de la UNLP. Ed. EDULP. Disponible en http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/27885.

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