Giải trình tự thế hệ mới Phạm Hùng Vân Trưởng Đơn Vị Kỹ Thuật Phân Tích Gene
Hai giai đoạn trong giải trình tự Sanger
Ứ ng dụng giải trình tự Sanger 1. Giải trình tự gene hay bộ gen cho các nghiên cứ u có liên quan; 2. Phát hiện các đột biế n gene (liên quan đế n ung thư , đên kháng thuố c), các SNP (trong cá nhân hóa các liệu pháp đi ều trị), các kiểu gene (genotype của virus gây bệnh)…; 3. Định danh vi khuẩn hay vi nấ m dự a trên giải trình tự DNA của gene qui định RNA của ribosome (16S của vi khuẩn và 28S của vi nấ m) đặc biệt là các tác nhân khó định danh hay thấ t bại nuôi cấ y từ mẫu thử ; 4. Phân tích đoạn xét nghiệm dấ u vân tay DNA (DNA finger printing) để nhận dạng cá nhân và mố i quan hệ cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán ti ền sanh, trong phát hiện đa dạng loài…
Pyrosequencing
Nguyên tắc pyrosequencing 1. A, hay T, hay C, hay G được lập trình cho vào giế ng phản ứ ng; và mỗi khi dung dịch nucleotide cho vào có nucleotide được bắt cặp vào sợi khuôn thì một pyrophosphate (PPi) sẽ được phóng thích ra để được enzyme sulfurylase tạo ra một ATP, ATP này sẽ giúp hệ thố ng phát quang luciferin-luciferase (luciferin thành oxyluciferin phát quang) 2. dATP-S được sử dụng để thay thế dATP vì dATP-S không có hoạt tính của ATP. 3. ATP và các nucleotide tự do còn thừ a sau mỗi l ần bổ sung nucleotide bị huỷ nhờ apyrase được cho vào giế ng sau khi tín hiệu phát quang được ghi nhận
Định lượng được đột biế n
Ứ ng dụng pyrosequencing Nhi ều bộ thuố c thử đã được chấ p nhận IVD (In-Vitro Diagnosis) trong phát hiện các đột biế n gene ung thư liên quan đế n chỉ định và theo dõi đi ều trị đích, Epigenomic: Định lượng các CpG với C bị gắn methyl (Cytosine methylation) để tiên đoán ung thư , Phát hiện đột biế n gene trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di truy ền, Đặc biệt trong vi sinh lâm sàng: định danh các vi khuẩn.
Ba giai đoạn của giải trình tự thế hệ mới
Giải trình tự bằng tổng hợp thế hệ mới vs pyrosequencing
1. Thuố c thử giải trình tự được thổi chảy vào chip nanowell hay vi bản theo chương trình và sau khi ghi nhận được tín hiệu thì thuố c thử củ sẽ được thổi chảy ra để thuố c thử mới lại được bơm vào. 2. Tổng hợp mạch bổ sung dự a trên mạch khuôn có thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung bằng các nucleotide (A, T, C hay G) được ghi nhận, hay có thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung mỗi l ần 2 base nhờ sự kéo dài và nố i probe dự a trên sợi khuôn 3. Tín hiệu tổng hợp có thể là tín hiệu phát quang dự a trên hệ thố ng luciferin-luciferase (454 của Roche), tín hiệu điện do thay đổi pH (Ion-Tolent hay IonProton của ABI), tín hiệu huỳnh quang được đánh dấ u trên các nucleotide A, T, C hay G (Solexa của Illumina), hay cũng có thể là tín hiệu huỳnh quang được gắn lên probe (solid của ABI).
Công nghệ Barcode
cho phép xác định ngu ồn gố c trình tự được giải
Ứ ng dụng giải trình tự thế hệ mới
Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene người Lôi ra ánh sáng bấ t cứ một trình tự nucleic acid của bấ t cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấ y từ vật chủ hay bệnh nhân Công cụ nhạy cảm nhấ t để có thể phát hiện các đột biế n cho dù tỷ lệ đột biế n hiện diện trong mẫu thử là rấ t thấ p Chẩn đoán ti ền sanh phát hiện dị bội của thai nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện trong máu mẹ dự a trên ư u điểm độ nhạy cao của kỹ thuật
Giải trình tự bộ gene (Crag Venter)
Ứ ng dụng giải trình tự thế hệ mới
Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene người Lôi ra ánh sáng bấ t cứ một trình tự nucleic acid của bấ t cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấ y từ vật chủ hay bệnh nhân Công cụ nhạy cảm nhấ t để có thể phát hiện các đột biế n cho dù tỷ lệ đột biế n hiện diện trong mẫu thử là rấ t thấ p Chẩn đoán ti ền sanh phát hiện dị bội của thai nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện trong máu mẹ dự a trên ư u điểm độ nhạy cao của kỹ thuật
ABL1
EGFR
GNAS
MLH1
RET
AKT1
ERBB2
HNF1A
MPL
SMAD4
ALK
ERBB4
HRAS
NOTCH1
SMARCB1
APC
FBXW7
IDH1
NPM1
SMO
ATM
FGFR1
JAK2
NRAS
SRC
BRAF
FGFR2
JAK3
PDGFRA
STK11
CDH1
FGFR3
KDR
PIK3CA
TP53
CDKN2A
FLT3
KIT
PTEN
VHL
CSF1R
GNA11
KRAS
PTPN11
CTNNB1
GNAQ
MET
RB1
FFPE Sample Quality Control
• qPCR‐based sample quality control • Ensure samples will be successful in assay
New!
Prepare Amplicons
Sequence on MiSeq
Automated analysis
• Prepare libraries w/ TruSeq Amplicon assay • Index up to 96 samples • Built‐in sample normalization
• Simple sample sheet creation with Illumina Experiment Manager • Bidirectional amplicon sequencing with 2x150 bp reads (2x250 soon) • >75% bases @ >Q30 (>99.9% accuracy)
• Align reads with MiSeq Reporter • Call low frequency variants (<5%) • Analyze data with Amplicon Viewer
K ế t quả giải trình tự bộ gene virus trên máy MiSeq ‐ Illumina
Các bước tiế n hành:
Bảo quản mẫu và bấ t hoạt chủng virut Rubella bằng dung dịch RNA Shield™ của hãng Zymo Research – Mỹ. Tách chiế t mẫu Virut Rubella bằng Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit. (P/N: R2050) của hãng Zymo Research . Chuẩn bị thư viện với bộ kit TruSeq RNA LT của Illumina. Chạy giải trình tự với bộ kít MiSeq 300 cycle V2 trên MiSeq. Phân tích kế t quả sử dụng ph ần m ềm SeqMan và Blast trên NCBI Tổng thời gian chuẩn bị mẫu và chạy giải trình tự , phân tích kế t quả: 3 ngày.
Kế t quả
Phân tích kế quả bằng ph ần m ềm SeqMan thu được toàn bộ genome của virut Rubella (9.762bp)
So sánh trình tự thu được trên ngân hàng gene NCBI
Trình tự thu được giố ng với: Rubella virus strain RVi/LA.CA.USA/45.08/2B CRS, complete genome Các vùng giàu GC vủa virut đều có thể đọc trình tự được (việc này rấ t khó khi thự c hiện bằng máy giải trình tự thế hệ cũ) Độ chính xác cao: 51782 coverage với Q >30.
