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El ADN como material genético
A comienzos del siglo XX, se había demostrado que los genes se localizan en los cromos cromosoma omas. s. Dada Dada la compos composici ición ón nucleo nucleopro proteic teica a de estas estas estruc estructur turas, as, los ácidos ácidos nucleicos y las proteínas eran las sustancias candidatas a constituir los genes. En 1928 Frederick Griffith trabajando con la bacteria que provoca neumonía en los humanos (Streptococcus pneumoniae) y que resulta letal para los ratones, demostró que la capacidad biológica para producir una cápsula (hecho que determina la virulencia de las bacterias) podía ser adquirida de otra cepa por medio de una sustan sustancia cia,, aún no identif identifica icada, da, a la que denomi denominó nó “factor “factor transf transform ormant ante”. e”. Griffith Griffith había observado que existían dos cepas distintas, unas virulentas, que provocan la muerte, provistas de una cápsula de polisacáridos que da a sus colonias un aspecto liso, por lo que las denomino cepas S, y otras aparecidas por mutaciones de las anteriores, que son inofensivas, y que carecen de esa cápsula de polisacáridos, motivo por el cual sus colonias no tienen aspecto liso sino rugoso, a las que denominó cepa R. La cápsula de polisacáridos forma una capa mucosa que protege a las bacterias de los fagocitos. Al parecer, las mutantes de la cepa R carecen de alguna enzima necesaria para sintetizar dicha cápsula, por lo que son fagocitadas. Griffith inoculó a los ratones bacterias S muertas por ebullición y observó que éstos sobrevivían, con lo que que dem emos ostr tró ó que que las las cápsulas no eran las que provocaban la enferm enfermedad edad.. Al infect infectar ar un ratón con una mezcla de bacterias S (virulentas) (virulentas) muertas y de bacterias R (no virulentas) vivas, el ratón inexplicablemente enfermaba y moría. Además en su organismo podían aislarse bacterias S vivas vivas.. Algo Algo había había en los los ca cadá dáver veres es de las bacterias S que había provocado la transformación de las R en S. Avery, McLeod McLeod y McCarth McCarthy y En 1944, Avery, intentaron aislar y determinar la molécula que había hecho que los neumococos R se tran transf sform ormara aran n en S en los expe experim rimen ento toss de Griffith; Griffith; demostraron demostraron experimentalm experimentalmente ente que sólo los extractos de bacterias S muertas que contenían ADN eran capaces de producir dicha transformación; luego el ADN era la molécula portadora de la información biológica, la que suminis inisttrab raba la inf información de cómo se sint sintet etiza izaba ba la cá cáps psul ula a de polis polisac acár árido idos, s, que que hace a estas bacteria eriass resi esistent entes a los los fagocitos. Cult Cultiv ivar aron on las las bact bacter eria iass en tubo tuboss de ensayo; fueron destruyendo sistemáticamente, uno por uno, todos los componentes bioqu bioquím ímico icoss de las las cé célu lula lass S, para para evit evitar ar la transformación e identificar a su responsable. 1
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Degradaron los polisacáridos y la transformación seguía produciéndose; por tanto, dedu deduje jero ron n que que la cubie ubiert rta a no era era el prin princi cipi pio o tran transf sfor orma mant nte. e. A co cont ntin inua uaci ción ón,, destru destruyer yeron on las proteí proteínas nas de las células células S y vieron vieron que seguía seguía produc producién iéndos dose e la transformación. Lo mismo ocurrió cuando destruyeron el ARN. Por fin, expusieron los extractos de células S a la enzima destructora de ADN (la ADNasa) y no se produjo la transformación: el principio transformante era el ADN. A pesar de la evidencia de este experimento, el mudo científico se resistió a acaptar que el ADN era el portador de la información biológica. Muchos consideraron que que se trat tratab aba a de una una pecu peculia liari rida dad d de las las bact bacteri erias as.. No se ente entend ndía ía có cómo mo una una molécula constituida por sólo cuatro tipos de nucleótidos podía ser la que contenía la información biológica, en vez de las moléculas proteicas que están constituidas por 20 tipos de aminoácidos. Fue necesario el experimento de A. Hershey y de M. Chase en 1952 para confirmar estas conclusiones. Hershey y Chase trabajaron con un virus de ADN que infectaba a las bacterias, el bacteriófago T2. A partir de un cultivo con el isótopo radiactivo S35 como fuente de azufre, azufre, consig consiguie uieron ron virus virus que tenían tenían este este isótop isótopo o en los aminoá aminoácid cidos os (ciste (cisteína ína y metionina) de su cápsida proteica, y a partir de otro cultivo con el isótopo radiactivo P32 consiguieron obtener virus que tenían este isótopo en su ADN. Posteriormente infectaron infectaron con estos virus un cultivo de la bacteria Escherichia Escherichia coli. Tras dejar tiempo suficiente para que los virus infectaran a las bacterias, agitaron el cultivo, mediante una batidora doméstica, para separar las cápsidas vacías de los virus infectantes, y finalmente las retiraron mediante centrifugación. A partir del primer cultivo observaron que la radiactividad debida al S35 quedaba en las cápsidas vacías, mientras que con el segund segundo o cultiv cultivo o consta constatar taron on que el ADN radiacti radiactivo vo aparec aparecía ía en el interio interiorr de las bacterias y, al cabo de tiempo, en el interior de los nuevos virus descendientes. Así se demostró que era el ADN, y no las proteínas, la molécula que pasa de una generación a otra y, por lo tanto, la que debe contener la información de cómo han de ser los organismos.
Material genético en procariotas y eucariotas Mendel utilizó el término “factor hereditario” (actualmente sustituido por el término gen) para referirse a los factores responsables de cada carácter. Demostró que cada carácter está determinado por dos factores hereditarios. Ante Antess de 1940 1940 se co cons nsid ider erab aba a que que el gen era era la unid unidad ad de infor informa maci ción ón hereditaria, o sea, que el gen era la unidad más pequeña capaz de controlar un carácter. En 1941 Beadle y Tatum enunciaron la hipótesis denominada “un gen-una enzima”, según la cual cada gen (fragmento de ADN) lleva información para una enzi enzima ma.. Segú Según n esta esta hipó hipóte tesi sis, s, un gen gen co cont ntie iene ne la info inform rmac ació ión n para para que que los los aminoácidos se unan en un determinado orden y formen una enzima. La forma como un gen controla un carácter es mediante la producción de una enzima que actúa en una una dete determ rmina inada da ruta ruta me meta tabó bólic lica, a, posi posibil bilit itan ando do la sínt síntes esis is de una una dete determ rmina inada da sustancia. Con posterioridad, esta hipótesis fue ampliada, ya que el gen podía codificar una proteína proteína cualquiera, cualquiera, no necesariament necesariamente e enzimática, enzimática, aunque estas últimas, últimas, al permitir permitir las reacciones metabólicas, tienen efectos fisiológicos más notables. Por otra parte, como como alguna algunass proteí proteínas nas están están consti constitui tuidas das por más de una cadena cadena polipe polipeptí ptídic dica, a, resu result ltab aba a má máss apro apropi piad ado o deci decirr que que ca cada da gen gen co codi difi fica ca sola solame ment nte e una una ca cade dena na polipeptídica. El gen es una unidad de transcripción. Qued Quedab aba a claro claro qu que e la expr expres esió ión n del del mens mensaje aje gené genéti tico co,, es deci decir, r, la ejecución de las órdenes contenidas en la molécula de ADN, consiste en la síntesis de proteínas específicas . Sin embargo, dado que la síntesis de proteínas
se realiza en los ribosomas (situados en el citoplasma) y que el ADN se encuentra en el núcleo, del que no sale, se hace necesaria la existencia de alguna molécula que actúe como intermediario entre el ADN y los ribosomas. Este papel de intermediario lo realiza un tipo de ARN, el ARN mensajero mensajero (ARNm). El proceso de formación del ARN se denomina transcripción . 2
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Con la información contenida en la molécula de ARN m se puede sintetizar una cadena cadena polipep polipeptíd tídica ica en un proces proceso o denomi denominad nado o traducción que que oc ocur urre re en los los ribosomas. ribosomas. En este proceso proceso intervienen intervienen otros tipos de ARN, el ARN ribosómico ribosómico (ARNr), componente fundamental de los ribosomas, y el ARN de transferencia (ARN t), que transporta los aminoácidos hasta los ribosomas. En 1970 1970 Fran Franci cis s Cri Crick enu enunc ncia ia el dogm dogma a centr ntral de la Biolo iologí gía a molecular : El ADN ADN form forma a un una a copi copia a de parte parte de su mens mensaj aje e sint sintet etiz izan ando do un una a molécula de ARN mensajero (proceso denominado transcripción)(se realiza en el núcleo), la cual constituye la información utilizada por los ribosomas para la síntesis de una proteína (proceso de traducción).
Todo este trasvase de información se produce gracias a la naturaleza química de los ácidos nucleicos. Debido a la complementariedad de las bases nitrogenadas , el ADN se puede replicar y transcribir a ARN m, que se va a traducir por medio del ARN t y ARNr, también gracias a la complementariedad de las bases. En la ac actu tua alida lidad d el dogm dogma a ha tenid enido o que ser mo modi difi fica cado do,, debi debido do a los los mecanismos de replicación de algunos virus: 1. Algunos virus que almacenan su información genética en forma de ARN poseen una enzima, la ARN replicasa, capaz de fabricar copias de este ARN. 2. Los retrovirus almacenan su información genética en una molécula de ARN. Emplean una enzima, la transcriptasa inversa, que sinteriza ADN a partir de una molé mo lécu cula la de ARN. ARN. El proc proces eso o reci recibe be el nomb nombre re de retrotranscri retrotranscripción pción o transcripción inversa .
Estructura del genoma El genoma de un organismo es su material genético, es decir, su ADN. La secuencia de bases nitrogenada del ADN constituye la información codificada que las células emplean para sintetizar sus proteínas. Sin embargo la organización de esa secuencia es distinta en las células procariotas y en las eucariotas células procariotas procariotas prác En las células prácti tica came ment nte e todo todo el ADN ADN se em empl plea ea co como mo información para la síntesis de proteínas y el gen codificador da cada proteína se compon compone e de una secuenci secuencia a contin continua ua de nucleót nucleótido idoss (carec (carece e de intron intrones) es).. El ADN contiene una copia de cada gen. No hay apenas ADN silencioso (que no se transcribe). Su geno genoma ma está está form formad ado o por por un solo solo cromo cromoso soma ma circ circula ular. r. Ademá Ademáss de este este ADN ADN cromos cromosómic ómico, o, muchas muchas bacter bacterias ias contie contienen nen plásmido plásmidos, s, que son molécul moléculas as de ADN circ circul ular ares es má máss pequ pequeñ eñas as que que el crom cromos osom oma a y co con n ca capa paci cida dad d para para repl replic icar arse se independientemente de el. 3
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Organismos Organismos eucariontes eucariontes: La mayor parte de su ADN se encuentra en el
núcleo, constituyendo el genoma nuclear. No existe una relación directa entre la complejidad del organismo y la cantidad de ADN, ya que la mayor parte de este no codifica proteínas ni interviene en la regulación de su síntesis. En las células eucariotas parece existir un exceso de ADN, ya que solamente un 10% o menos de esa molécula se emplea para codificar proteínas. El resto tiene funciones poco conocidas. Se estima que en la especie humana menos del 5% del ADN codifica proteínas. Un importa importante nte porcen porcentaj taje e de este este ADN no codifi está formad formado o por codifican cante te está secuencias de nucleótidos altamente repetidas. Casi la mitad del ADN en eucariotas es altamente repetitivo, lo que significa que existen secuencias de nucleótidos repetidas cientos o miles de veces. El ADN altamente repetitivo no lleva información para la síntesis proteica y quizá desempeña un papel importante en la estabilidad de la estructura de los cromosomas. Otra característica distintiva del material genético de las células eucariotas es que las secuencias nucleotídicas que codifican para proteínas no suelen ser continuas, sino sino que existe existen n secuen secuencia ciass no codific codificada adass interc intercala aladas das.. Los fragmen fragmentos tos de ADN codificadores se denominan exones, mientras que los que no llevan información información para la síntesis proteica se llaman intrones. Cuanto más compleja y más reciente es una especie, más abundantes y más largos son los intrones intrones de su genoma. Parece, por tanto, que los intrones constituyen constituyen una ventaja evolutiva, ya que estos fragmentos favorecen la recombinación meiótica al aumentar la distancia entre los exones.
Se distinguen tres tipos de ADN: • ADN altamen altamente te repeti repetitiv tivo o (ADN (ADN satéli satélite) te).. Co Cons nsti titu tuye ye el 10% 10% del del tota total, l,
aunque puede llegar al 50%. Está constituido por secuencias cortas de 5 y 10 pares de bases que se disponen en tándem (una detrás de otra), y que llegan a
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repetirse de 10 a 10 veces. Se sitúa en los extremos (telómeros) y en las constricciones (centrómeros) de los cromosomas, que son zonas genéticamente inactivas, es decir, que no se transcriben nunca. Puede que su única función sea mecán mecánic ica, a, co como mo el empar empareja ejami mient ento o y la segr segrega egaci ción ón de los los crom cromos osoma omass durante la mitosis y la meiosis. ADN moderad moderadamen amente te repeti repetitiv tivo. o. Co • Cons nsttituy ituye e el 20% 20% del del tot total. al. Está Está consti constituid tuido o por divers diversas as secuen secuencia ciass de 150 a 300 nucleót nucleótido idoss que pueden pueden disponerse en tándem o dispersas por todo el ADN. El número de copias varía entre 10 a más de 1.000 veces, pudiendo llegar en algún caso a más de 100.000. Comprende genes que codifican histonas, ARNr, ARNt y secuencias de función desconocida. ADN no repetitivo o simple. Constituye el 70% del total. Contiene la mayor • parte de la información que pasa al ARNm y da lugar a proteínas, y al ADN que está intercalado y que no se transcribe (ADN espaciador). Una Una part parte e del del geno genoma ma euca eucari riot ota a se encu encuen entr tra a en los los clor clorop opla last stos os y en las las mitocondrias, se trata de moléculas circulares de ADN relativamente pequeñas, que carecen de histonas. Su estructura es parecida a la del cromosoma bacteriano. Los crom cromos osoma omass de esto estoss orgá orgánu nulo loss forma forman n un sist sistema ema gené genéti tico co prop propio io co con n plena plena capacidad para realizar la replicación del ADN, transcripción y síntesis proteica. 6
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El proyecto genoma humano A finales de los años 80 se propuso el objetivo internacional de conocer la secuencia de nucleótidos (3 x 10 9 pares de nucleótidos) de los genes del ser humano que están contenidos en los 23 pares de cromosomas. En 1990 se inició el Proyecto Genoma Humano . Los objetivos del proyecto son: Elaborar un “mapa genético” para determinar en qué cromosomas y en qué • lugar de los mismos se encuentran encuentran cada uno de los genes humanos. Determinar la secuencia exacta de nucleótidos de cada gen para conocer la • prot proteí eína na que que co codi difi fica ca y sus sus posi posibl bles es alte altera raci cion ones es.. 3 bill billon ones es de base basess nitrogenadas. Se realiza fundamentalmente mediante la electroforesis en geles de distintos fragmentos de ADN y la l a ayuda de ordenadores. Acumular la información en bases de datos. • Desarrollar de modo rápido y eficiente tecnologías de secuenciación. • Desarrollar herramientas para análisis de datos. • Dirigir las cuestiones éticas, legales y sociales que se deriven del proyecto. • Se ha conseguido secuenciar el ADN en un 99%, del cual un 85% se ha establecido de manera precisa (12 del 2 de 2001), en el 2003 se ha producido el mapeo casi completo del mismo. Obtener la secuencia de un ser humano no sirve aún para conocer cuál es la misión que desempeñan los genes, simplemente identifica los “nucleótidos” que conforman la espiral del ADN. Pero interpretar el genoma llevará tiempo. Ahora se ha logrado la secuencia, falta por saber qué función tiene cada gen y cómo se interrelacionan entre ellos y cuál es su relación y en qué medida con las enfermedades. El genoma humano: aproximadamente 30.000 genes. Esta cifra de genes es sólo dos o tres veces mayor que el encontrado en el genoma de Drosophila, la mosca de la fruta y que tenemos genes comunes con bacterias y que no han sido encontrados en nuestros ancestros. De un 40% de los genes identificados se desconoce su función. Menos del 5% de la secuencia contiene genes portadores de instrucciones para hacer proteínas. Más del 90% de la secuencia es exacta en un 99,99% (entre una persona y otra el ADN difiere sólo en un 0,2%). Los genes humanos son pocos y se encuentran alejados entre sí. Además, se encuentran muy fragmentados. La fragmentación de los genes humanos hace posible que se construyan muchas proteínas distintas a partir de los mismos genes, genes, mediant mediante e la combina combinació ción n de las instru instrucci ccione oness de formas formas divers diversas. as. Según Según parece, como mínimo el 35% de todos los genes humanos pueden leerse de muchas 5
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forma formas. s. De esta esta ma maner nera, a, el geno genoma ma huma humano no podr podría ía co codi dific ficar ar cinc cinco o vece vecess má máss proteínas que los genomas menos flexibles de la mosca del vinagre o del gusano. Grandes tramos del genoma humano parecen haber sido antiguamente virus, puede que hace millones de años. Hay cientos de otros genes, que codifican un mínimo de 223 proteínas, que pueden proceder de las bacterias. Analizado el genoma de unos pocos centenares de personas, los científicos han creado un catálogo bastante completo de la variación genética entre unos individuos y otros otros.. En esta estass varia variaci cion ones es radic radica a la clav clave e de las difer diferenc encias ias here heredi dita tari rias as entr entre e personas, incluyendo sus distintas propensiones a una u otra enfermedad. Casi toda la variabilidad genética humana se basa en las mínimas alteraciones concebibles: las diferencias en una sola letra (nucleótido) en el ADN. Estas alteraciones en un solo nucleótido se denominan snips. Se han detectado 1,42 millones de snips. Las diferencias entre una persona y otra se deben a la combinación particular de snips tomados de ese conjunto básico de 1,4 millones. Como el 95% del genoma es basura, la gran mayoría de esos snips están en el vasto desierto del ADN sin sentido. Pero, aún así, hay 60.000 snips que caen dentro de los genes. Aplicaciones futuras: La información contenida en los genes ha sido descodificada y permite a la ciencia ciencia conocer conocer mediante mediante test genéticos, genéticos, qué enfermedades podrá sufrir una persona en su vida. El ADN encierra las claves para combatir una gran parte de las enfermedades, como el cáncer, la diabetes, la obesidad, los trastornos del sistema inmu inmuno noló lógi gico co y las las dege degene nera raci cion ones es nerv nervio iosa sass y ce cere rebr bral ales es.. Se podr podrán án trat tratar ar enfermedades hasta ahora incurables. Diagnóstic Diagnóstico o precoz: precoz: Permitir Permitirán án predec predecir ir qué person personas as son propen propensas sas a padecer padecer determinadas enfermedades, por lo que se podrá avanzar en su diagnóstico y en su posterior tratamiento. Cáncer: La form forma ación ción de un tumor umor se debe debe a una com ompl plej eja a acumu cumula laci ción ón de mutaciones en una sola célula de una persona, que provocan que la célula escape de control y prolifere indebidamente. Algunas de estas mutaciones ocurren durante la vida del individuo, causadas por agresiones externas como el humo del tabaco o la radiación ultravioleta de la luz solar. Otras mutaciones las lleva puestas cada individuo de naci nacimi mient ento, o, lo que que expl explic ica a que que algu alguna nass perso persona nass sean sean má máss susc suscep epti tible bless de desarrollar uno u otro tipo de cáncer. Conocer la combinación exacta de mutaciones en un tumor tumor concre concreto to de un pacient paciente e concre concreto to (una (una combina combinació ción n que determi determina na estrictamente el comportamiento del tumor y permite predecir si va a responder aun fármaco o a otro) será pronto la herramienta básica para predecir el tratamiento óptimo de ese tumor. Enfermedades simples: De los 30.000 genes humanos, hay 1.100 cuyas variaciones (snips) se asocian a unas 1.500 enfermedades (algunos genes pueden mutar de varias formas para dar lugar a enfermedades clínicamente distintas). propen enssión ión gené genéti tica ca a las las enfe enferm rmed edad ades es má máss Enfermedade Enfermedades s complejas complejas: La prop comunes, sin embargo, no se debe a la alteración de un solo gen, sino a decenas o cientos de genes simultáneamente. Fármacos a medida: Cada persona responde de forma muy distinta a cada fármaco. El análisis del genoma de cada persona permitirá predecir a qué fármacos va a sufrir reacciones peligrosas, o a cuál va a responder de manera óptima. El estudio del genoma, permitirá desarrollar medicamentos que modifiquen las funciones incorrectas de las proteí proteínas nas,, la verdade verdadera ra causa causa de las enferme enfermedad dades. es. También También será será posible posible elaborar medicamentos a la carta, específicos para cada persona. Envejecimiento: la manipul manipulaci ación ón de los genes genes respon responsab sables les del enveje envejecimi cimient ento o aumentará la esperanza media de vida en cien años o más. Mapas individuales: En un plazo aproximado de veinte años, cada persona podrá tener su mapa genético genético individualizado, individualizado, de tal modo que sabrá cuáles son sus puntos débiles constitucionales y su propensión a padecer enfermedades.
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Se podrá informar a una persona, que puede comer alimentos grasos porque carece de predisposición genética a la obesidad y a enfermedades cardíacas, pero que debe huir del alcohol porque es genéticamente propenso al alcoholismo. En identificac identificación ión forense forense , para identificar victimas de catástrofes, paternidad y otras otras relac relacio iones nes famil familiar iares es,, iden identi tific ficar ar y prot proteg eger er espe especi cies es en peli peligr gro, o, dete detect ctar ar bacterias que pueden polucionar agua, aire, alimentos, determinar compatibilidad de órganos donantes en programas de transplante. utiliz iza a para para me mejo jora rarr la En agricul agricultur tura, a, gan ganader adería ía y bioproc bioprocesa esamien mientos tos,, se util resis resiste tenc ncia ia de cult cultivo ivoss ante ante inse insect ctos os,, sequ sequías ías,, para para hace hacerl rlos os más prod produc ucti tivo voss y saludables, para producir animales más saludables y nutritivos, elaborar biopesticidas, vacunas comestibles y nueva limpieza del medio ambiente de plantas como tabaco. Pero el conocimiento del código de un genoma abre las puertas para nuevos conflictos ético-morales , por ejemplo, seleccionar que bebes van a nacer, o clonar seres por su perfección. Esto atentaría contra la diversidad biológica. Quienes tengan desventaja genética quedarían excluidos de los trabajos, compañías de seguro, seguro social, etc. Otro problema ético que se ha generado a partir del PGH, es el patentamiento de genes y secuencias génicas por parte de compañías biotecnológicas, universidades y gobiernos.
La duplicación del ADN La necesidad de la duplicación del ADN El ADN portador de la información genética debe transmitirse fielmente a cada una una de las las cé célul lulas as hijas hijas obte obteni nida dass tras tras la divi divisi sión ón ce celu lular lar.. Po Porr tant tanto, o, ante antess de producirse esta, es imprescindible que el ADN puede formar réplicas exactas de si mismo para disponer de dos copias iguales. Este proceso conocido como replicación o autodu autoduplic plicaci ación, ón, result resulta a fundam fundament ental al para para asegur asegurar ar que todas todas las células células de un organismo pluricelular mantienen la misma identidad. El mecanismo general de la replicación fue intuido por Watson y Crick cuando establecieron la estructura de doble hélice y la complementariedad de las bases. Propusieron que la doble hélice del ADN se abre y las dos cadenas de nucleótidos se separan; a partir de cada una de las dos cadenas se forma una nueva, que es complementaria de la que le ha servido como patrón. La replicación o duplicación del ADN consiste en sintetizar, a partir de una moléc mo lécula ula inic inicial ial (molé (molécu cula la ma madr dre), e), dos dos idént idéntic icas as entr entre e sí (mol (moléc écula ulass hijas hijas). ). La replicación permite a las células hijas contener el mismo ADN que la célula madre. Así, la info inform rmac ació ión n gené genéti tica ca se tran transf sfie iere re desd desde e una una cé célu lula la prog progen enit itor ora a a toda toda su descendencia.
Primeras hipótesis sobre la duplicación del ADN La estructura del ADN en doble hélice permite comprender cómo dicha molécula es idónea para dar lugar a copias. Por un lado su estructura presenta dos cadenas complementari complementarias as entrelazadas, entrelazadas, lo que se da gran estabilidad, estabilidad, y por otro, bastaría con que una enzima específica las separara para que cada una de ellas pudiera servir como molde para sintetizar, a partir de nucleótidos sueltos y bajo la acción de otra enzima, la hebra complementaria. Se prop propus usier ieron on tres tres hipót hipótes esis is:: la hipó hipóte tesi siss semi semico cons nser erva vativ tiva, a, la hipót hipótes esis is conservativa y la hipótesis dispersiva. • La hipótesis semiconservativa sobre la duplicación del ADN se debe a Wats Watson on y Cric Crick k . En ella se sostiene que en las dos nuevas moléc écu ulas las de ADN de doble héli hélice ce prod produc ucid idas as,, una una de las las hebr hebras as sería ería la anti antigu gua, a, que actuaría como molde, y la otra la 7
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modern moderna, a, consti constituid tuida a por la polimer polimerizac ización ión de nucleó nucleótido tidoss libres libres sobre sobre ese molde, por complementariedad de las bases nitrogenadas. • En la hipótesis conservativa se propone que tras la duplicación quedan, por un lado, las dos hebras antiguas juntas y, por otro, las dos hebras nuevas también espiralizadas. hipótesis dispersiva dispersiva se prop • En la hipótesis propon one e que que las las hebr hebras as,, al fina final, l, está están n cons co nsti titu tuid idas as por por frag fragme ment ntos os dist distin into toss de ADN ADN anti antigu guo o y de ADN ADN reci recién én sintetizado. El experimento más definitivo para dilucidar cuál de estas tres hipótesis era la corr co rrec ecta ta fue fue el de Mesels 1957.. La hipó hipóte tesi siss co conf nfirm irmad ada a fue fue la Meselson on y Stahl Stahl en 1957 semiconservativa. Experimento de Meselson y Stahl
Mesels Meselson on y Stah Stahll cult cultiva ivaro ron n bact bacter erias ias (Esc (Escher heric ichi hia a co coli) li) en un medio medio co con n 15 15 14 nitrógeno pesado (N ). El N es un isótopo del nitrógeno normal o N . Tiene el mismo número de electrones (7 e) y de protones (7 p) que el átomo de N 14, y así tiene el mismo comportamiento químico, pero posee un neutrón más (8 n), por lo que pesa más que el N14. Esto conlleva a que las moléculas de ADN sintetizadas con N 15 pesen más que las construidas con N 14, lo que permite separarlas mediante centrifugación utilizando un medio que presente gradiente de densidades. Las moléculas de ADN ligero quedan más arriba y las de ADN pesado más abajo en el tubo de centrífuga. Para realizar el experimento pasaron las bacterias cultivadas con N15 a un medio con nitrógeno nitrógeno normal (N14) durante una media hora, que es tiempo necesario para que se duplique el ADN bacteriano, lo extrajeron y lo centrifugaron. Luego, mediante rayos ultravioleta, que son muy absorbidos cuando atraviesan una disolución que contiene ADN, ADN, se pudo pudo dedu deduci cirr que que el ADN ADN reci recién én sint sintet etiz izad ado o oc ocup upab aba, a, en el tubo tubo de centrifugación, una posición que era intermedia entre la que ocupaba el ADN con N 15 y el ADN con N14. Se trataba, pues, de un AD híbr híbrid ido o y habí había a que descartar la hipótesis conservativa. Si en lugar de deja dejarr las las bact bacter eria iass 14 en N durant durante e una divisió división n las dejaba dejaban n durante dos, aparec aparecían ían dos ADN, ADN, uno uno híbri íbrido do y otro tro ligero. Si se dejaban durante tres, el ADN híbri híbrido do era era,, en propo proporc rcio iones nes,, much mucho o menos importante. Esto descartaba la hipótes hipótesis is disper dispersiv siva a y demost demostrab raba a la hipótesis semiconservativa. Meselson y Stahl completaron el experimento con otro ensayo. Después de aislar el ADN híbrido y someterlo a una temperatura de 80 a 100ºC dura durant nte e 30 minu minuto tos, s, co cons nsig igui uier eron on sepa separa rarr las las dos dos hebr hebras as y, media mediant nte e enfr enfria iami mien ento to súbit úbito, o, el que que no se volvieran a asociar de nuevo. Posteriormente, mediante centrifugación del preparado,
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comprobaron que una hebra era ligera y la otra densa, lo que confirmó definitivamente la hipótesis semiconservativa.
La síntesis del ADN in vitro En 1956 Kornberg aisló a partir de la bacteria Escherichia coli la enzima ADNpolimerasa. Esta enzima es capaz de sintetizar ADN in vitro. Para su actuación, la ADN-polimerasa necesita la presencia de desox desoxir irrib ribon onuc uclei leico coss-5-t 5-trif rifos osfat fatos os de aden adenina ina,, timin timina, a, guan guanina ina y cito citosi sina, na, iones iones 2+ magnesio magnesio Mg , y un ADN en el que una de las hebras actúa como hebra “patrón”, y un extremo de la otra, que se ha retirado en parte, como “cebador”. La ADN-polimerasa es incapaz de iniciar una cadena de novo. Su papel se limita a añadir nucleótidos al extremo de una cadena preexistente, el llamado ADN cebador. Concretamente, actúa añadiendo nucleótidos al extremo que presenta libre el carbono 3´ del nucleótido, siendo incapaz de añadirlos en el otro extremo, que es el que presenta libre el carbono 5´ del nucleótido. Así pues, la cadena del ADN cebador sólo puede crecer en el sentido 5´ → 3´. Por ello, en una cadena de ADN, el nucleótido que tiene su carbono 5´ libre es el primer nucleótido de la cadena y el que tiene libre el carbono 3´ es el último nucleótido añadido y al que se puede añadir otro. La ADN-polimerasa, además, actúa de forma que la nueva hebra sintetizada es antiparalela y complementaria.
Duplicación del ADN in vivo Entre los primeros experimentos encaminados a observar la duplicación del ADN en los seres vivos cabe destacar el realizado por Cairns en 1963. El experimento de Cairns volvió a confirmar la hipótesis semiconservativa y, además, descubrió la existencia de un punto concreto como como origen origen de replic replicaci ación ón del ADN bacteriano. La replicación replicación es bidireccional , es dec ecir ir,, hay hay una
horquilla horquilla a la izquierda del punto de inicio y otra horquilla a la derecha, que van progresando en direcciones opuestas. Se plantearon dos dilemas: El primero, era cómo la ADNpolimerasa podía sintetizar sin necesidad de cebador; y el segundo, cómo las dos nuevas hebras de la horquilla crecían en paralelo: si una de ellas lo estaba haciendo en dirección 5´→ 3´, la otra lo debía hacer en dirección 3´ → 5´, lo cual era imposible de explica explicar, r, ya que ningun ninguna a ADN-po ADN-polime limeras rasa a trabaja trabaja en esa direcc dirección. ión. La ADNADNpolime polimeras rasa a recorr recorre e las hebras hebras molde molde en sentid sentido o 3´ 5´ y va uniendo los nuevos nucleótidos en el extremo 3´ ( dirección 5´ 3´). Sin embargo, como las
dos cadenas del ADN son antiparalelas, cuando se forma la horquilla de replicación la ADN-po ADN-polime limeras rasa a solo solo puede puede sintet sintetiza izarr nucleó nucleótid tidos os en uno de los dos sentid sentidos. os. La síntesis de la nueva hebr hebra a orien orienta tada da en sent sentido ido 3´→ 5´ se realiza sin interru interrupci pción, ón, a esta esta hebra se la denomina conductora o lider . El mecanismo de
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síntesis de la hebra orientada en sentido 5´ → 3´ (hebra retardada) fue descubierto por Okazaki. La solución al dilema la dio el descubrimiento en 1968, por Okazaki, de unos fragm fragmen ento toss co cons nsti titu tuido idoss por por unos unos 50 nucl nucleó eóti tido doss de ARN ARN y unos unos 1.00 1.000 0 o 2.00 2.000 0 nucleótidos nucleótidos de ADN. Estos fragmentos, fragmentos, denominados, denominados, fragmentos de Okazaki , son sintetizados por la ARN-polimerasa, que no precisa cebador para empezar, y luego por la ADN-polimeras ADN-polimerasa, a, en dirección 5´→ 3´ sobre diferentes regiones de la hebra patrón. Luego, sin moverse, tras perder su porción de ARN, pueden ser fusionados entre sí, pudiendo dar la sensación de que la l a nueva hebra de ADN crece en dirección 3´→ 5´. La hebra retardada se sintetiza de forma discontinua, es decir, se sintetizan pequeños fragmentos de forma separada y después se unen. La replicación es semidiscontinua : en una cadena (llamada conductora) se sintetizan fragmentos bastante grandes de forma continua, mientras que en la otra (llam (llamad ada a reta retard rdad ada) a) la sínt síntes esis is es disc discon onti tinu nua, a, es deci decir, r, se sint sintet etiza izan n pequ pequeñ eños os fragmentos de forma separada y después se unen.
En bacterias: Iniciación: desenrrollamiento y apertura de la doble hélice
Exis xiste una sec ecue uenc ncia ia de nucl nucleó eóti tido doss en el ADN ADN llam llamad ada a “o “ori rige gen n de la replicación” (donde abundan las secuencias de bases GATC), que actúa como señal de iniciación . El punto de iniciación es reconocido por una proteínas que se unen a el. proces eso o se inici inicia a co con n una una enzim enzima a deno denomin minad ada a helicasa que rompe los 2. El proc puentes de hidrógeno entre las dos hebras complementarias y las separa para que sirvan de patrones o moldes. Como el desenrollamiento de la doble hélice da lugar a superenrollamientos en el resto de la molécula, capaces de detener el proceso, se hace preciso el concurso de topoisomerasas que eliminen las tensiones tensiones en la fibra. Estas proteínas actúan cortando una (las topo topois isom omer eras asas as I) o las dos fibras (las topois topoisome omeras rasas as II) y, una vez vez elimi limina nada dass las tensiones, empalmándolas nuevamente. La topo topois isom omer eras asa a II de Escheri erichia coli se denomina girasa. continuac uación ión intervi interviene enen n unas unas proteí proteínas nas 3. A contin que se enlazan sobre el ADN de hebra única. Son Son las las proteínas proteínas estabilizado estabilizadoras ras (SSB), que tiene ienen n como func unción ión mantener ener la separación de las dos hebras complem complement entari arias. as. Se inicia inicia así la formaci formación ón de la horquilla de replicación . 4. El proceso es bidireccional , es decir, hay una helicasa trabajando en un sentido y otra trab traba ajand jando o en sent entido ido opues puesto to.. La Lass dos horquillas de replicación forman las llamadas burbujas u ojos de replicación . Elongación: se sintetiza la nueva hebra de ADN sobre cada hebra de la doble hélice original. 1.
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Además de las enzimas que actúan en la iniciación, en la elongación intervienen las ADNpol I, II, III. Durante la elongación elongación se lleva a cabo la corrección corrección de errores que se hayan podido producir. 5. Como ninguna ADN-polimerasa puede actuar sin cebador, interviene primero una ARN-polimerasa que sí lo puede hacer. Esta encima se denomina primasa y sintetiza un corto fragmento de ARN de unos diez nucleótidos, denominado primer, que actúa como cebador, con un extremo hidroxílo 3´libre al que añadir los nuevos nucleótidos; una vez iniciada la síntesis, la propia cadena de ADN ya sintetizada actúa como cebador. 6. Interviene después la ADN-polimerasa III, que, partiendo del primer, comienza a sintetizar en dirección 5´→ 3´, como todas las polimerasas, una hebra de ADN a partir de nucleótidos trifosfato. La energía necesaria para el proceso es aportada por los propios nucleótidos, que pierden dos de sus grupos fosfato. Esta nueva hebra es de crecimiento continuo , ya que la helicasa no se detiene, y se denomina hebra conductora . 7.
Sobre la otra hebra que Sobre la otra hebra que es antiparalela, la ARN-polimerasa sint sinteti etiza za unos unos 40 nucl nucleó eóti tido doss de ARN ARN en un punt punto o que que dist dista a unos unos 1.00 1.000 0 nucleótidos de la señal de iniciación. A partir de ellos, la ADN-polimerasa III sintetiza unos 1.000 nucleótidos de ADN, formándose entonces un fragmento de Okazaki . Este proceso se va repitiendo a medida que se van separando las dos hebras hebras patrón patrón.. Posteri Posteriorme ormente, nte, intervi interviene ene la ADN-polimerasa I (ADNpoli polime mera rasa sa ais aislada lada por por Ko Korn rnbe berg rg), ), que, ue, prim primer ero, o, grac gracia iass a su func unción ión exon exonuc uclea leasa sa,, reti retira ra los los segm segment entos os de ARN, ARN, y lueg luego, o, grac gracia iass a su func funció ión n polimerasa, rellena los huecos con nucleótidos de ADN. Aunque el mecanismo de corrección es muy eficaz, a veces queda alguno sin corregir. Finalmente interviene la ADN-ligasa, que empalma entre sí los diferentes fragmentos (cataliza la formación del enlace fosfodiester entre un extrema 3´OH y uno 5 ´fosfato de un ADN situados adyacentes uno del otro). Esta hebra es, pues, de precisa que se desespiralic desespiralice e un segmento de crecimiento discontinuo . Como precisa varios miles de nucleótidos para que se inicie su síntesis, tarda más en crecer que la otra, y , por ello, se la denomina hebra retardada. Dura Durant nte e la repl replic icac ación ión es frec frecue uent nte e que que se prod produz uzca can n erro errores res y se incorporen nucleótidos que no tengan correctamente apareadas sus bases. La 11
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ADNp ADNpol ol I actúa actúa entonc entonces es como como exonuc exonuclea leasa sa y elimina elimina los nucleó nucleótid tidos os mal
apareados. Aunque el mecanismo de corrección de errores es muy eficiente, a veces queda alguno sin corregir. Esos errores pueden ser importantes en la evolución. 8. El proces proceso o continú continúa a así hasta hasta la dupli duplicac cación ión total total del del ADN. ADN.
En eucariotas: El proceso es similar al que se sigue en las bacterias. Cabe destacar dos diferencias básicas. •
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La pr prim imer era a gr gran an dife difere ren ncia cia es qu que e el ADN ADN de los los euca eucari rion onte tes s está está fuertemente asociado a histonas, formando los nucleosomas . Esto dificulta
la procesividad de las ADN polimerasas y, además, requiere que la replicación esté coordinada con la síntesis de histonas. Se ha observado que, durante la replicación, la hebra que sirve de patrón a la hebra conductora se queda con las histonas y ambas se enrollan sobre los octámeros antiguos. La hebra que sirve de patrón a la retardada y la retardada se arrollan sobre nuevos octámeros de histonas que llegan a los lugares de replicación para formar nuevos nucleosomas. La segunda gran diferencia es que, teniendo en cuenta que la longitud del ADN de un cromosoma eucariótico es mucho mayor que el ADN bacteriano y que, seguramente debido a la presencia de histonas, el proceso es bastante más lento (unas diez veces más lento), en cada ADN de un cromosoma no hay un solo origen de replicación, sino aproximadamente un centenar . Se forman unas cien burbujas de replicación. Su distribución es irregular, pudiendo haber regiones con muchas burbujas y regiones con pocas. Se activan de forma coordinada y constituyen las llamadas unidades de replicación o replicones.
También cabe señalar que los fragmentos de Okazaki son más pequeños , de unos unos cien cien a dosc doscie ient ntos os nucl nucleó eóti tido doss (en (en proc procar ario iota tass de unos unos 1000 1000 a 2000 2000 nucleótidos). • La replicación en los procariotas tiene lugar antes de la división celular en el citosol, y en eucariotas el proceso de replicación se realiza durante el período S de la interfase, que dura unas seis a ocho horas. • El proceso de replicación del ADN se va completando normalmente hasta llegar al extremo del cromosoma, el telómero. Cuando se elimina el último ARN cebador la hebra retardada quedará incompleta, ya que la ADNpol no podrá rellenar el hueco, al ser incapaz de sintetizar en dirección 3´ → 5´. Este hecho hace que el telómero se vaya acortando un poco cada vez que la célula se divide, fenómeno que se asocia a los procesos de envejecimiento y muerte celular. Al cabo de un número determinado de divis division iones es,, se prod produc ucir irá á una una pérd pérdida ida de una una ca cant ntida idad d impor importa tant nte e de ma mate teri rial al genético que provocará la muerte celular. Las cadenas de ADN de los cromosomas eucariotas son lineales, no anulares, lo que plantea un problema añadido. Cuando se elimina el ARN cebador del extremo 5´ de cada una de las hebras recién sintetizadas, el hueco que queda no lo pueden rellenar las enzimas ADNpol III porque porque no encuen encuentra tran n extremo extremoss hidroxil hidroxilos os 3´ libres libres sobre los que adicionar nuevos nucleótidos. Esta imposibilidad de replicar los extremos de cada cromosoma hace que el telómero se vaya acortando en cada etapa de replicación con el envejecimiento y la muerte de las células: al cabo de un número •
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determinado de divisiones, tarde o temprano, se producirá la pérdida de una cantidad importante de material genético que provocará la muerte celular. El ADN telomérico está constituido por secuencias de 6 nucleótidos que se repiten numerosas veces. La hebra del extremo 3´ es rica en guanina (AGGGTT en la espe especi cie e huma humana na)) y, lógic lógicam ament ente e las las del del extr extrem emo o 5´ es rica rica en cito citosi sina na.. Se ha comprobado que, si los telómeros desaparecen, los cromosomas se vuelven inestables y se unen. La consecuencia de esta inestabilidad es la muerte celular.
Existe Existe una enzima enzima,, llamada llamada telomerasa (retrotrans (retrotranscriptas criptasa a o transcripta transcriptada da inversa) y constituida por una parte proteica y un ribonucleótido (ARN), que actúa como molde para alargar la hebra del extremo 3´. Esta prolongación, catalizada por la telomerasa, sirve como cebador, por parte de la polimerasa, del extremo 5´ que quedó incompleto. La telomerasa aporta el molde, debido a que el telómero, está formado por una secuencia que se repite un gran número de veces. Así, la enzima solo necesita contener esta secuencia. En las células que se dividen continuamente (células madres de los gametos, células embrionarias y células cancerígenas) hay una enzima llamada telomerasa que impide el acortamiento del telómero. En las células somáticas la longitud del telómero disminuye a medida que se producen nuevas divisiones celulares. En los procariotas, sin embargo, el ADN es circular, y por lo tanto no hay telómeros, lo que significa que no se producen esos procesos de envejecimiento celular. En los organismos unicelulares la actividad telomerasa evita el acortamiento de los telómeros. Los organismos unicelulares son inmortales, en el sentido de que no mueren inexorablemente, sino que se reproducen por divisiones sucesivas. Los estudios realizados en células humanas han demostrado la existencia de la telomerasa en los tejidos germinales y embrionarios. No se ha detectado el enzima en muchos otros tejidos. Los experimentos han demostrado la presencia de la actividad telomerasa en el 80% de los tumores malignos. Ni en las primeras etapas que dan lugar al tumor no en los tumores benignos se detecta telomerasa. Si se inhibiese la telomerasa, las células mali ma lign gnas as perd perder ería ían n la posi posibi bili lida dad d de divi dividi dirs rse e inde indefi fini nida dame ment nte, e, pues puesto to que que envejecerían.
Reacción en cadena de la polimerasa Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas. Las enzimas ADN polimerasa duplican el ADN copiando las dos cadenas de la doble hélice. Debido a la acción de estas enzimas, a partir de una molécula de ADN bicatenario se obtienen dos moléculas de ADN bicatenario exactamente iguales. Para que estas enzimas lleven a cabo su función correctamente debe existir: 13
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Una cadena molde de ADN, que es una de las dos hebras de la doble hélice. Una mezcla de desoxiribonucleótidos trifosfato. • Un ce ceba bado dor, r, que que es un pequ pequeñ eño o frag fragmen mento to de ADN ADN mo mono noca cate tena nario rio,, cuya cuya • secuencia de bases es complementaria de uno de los extremos de la cadena molde. Una fuente de calor. • En 1985, Kary Mullis desarrolló la técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa, conocida también como PCR, que, a partir de la capacidad de la ADN polimerasa para replicar el ADN, permite obtener en el laboratorio múltiples copias de un fragmento determinado de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo de la siguiente forma. La molécula o fragmento de ADN que se desea replicar se desnaturaliza para separar las dos hebras de la doble hélice. Para ello se somete el ADN a temperaturas elevadas. Cada Ca da una de las las dos dos hebr hebras as sirve irve com omo o mo mold lde e para para sinte inteti tizzar otra otra caden adena a complementaria. A fin de que la ADN polimerasa pueda actuar copiando cada una de las dos cadenas complementarias, son necesarios unos cebadores adecuados. En la mezc me zcla la de reac reacci ción ón debe debe exis existi tir, r, así así mism mismo, o, una una co conc ncen entr trac ació ión n sufi sufici cien ente te de nucleótidos trifosfato, que componen las piezas de construcción de las cadenas que se van a sintetizar. El proceso que se acaba de describir constituye un ciclo de síntesis. Si se repitiera el proceso íntegramente, íntegramente, se partiría de cuatro cuatro hebras molde y se obtendrían obtendrían cuatro moléculas bicatenarias. Si se realiza un nuevo ciclo, se partiría de ocho hebras molde que, a su vez, darían ocho moléculas bicatenarias. En el siguiente ciclo, los moldes serían 16. Se trata, por tanto, de un proceso exponencial, en el que se llevan a cabo tantos ciclos como sea necesario para obtener el número de copias deseado. Tras 20 ciclos de síntesis se puede obtener del orden de un millón de copias de una molécula de ADN. Se utiliza la ADN polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales (Thermus aquáticus), así la enzima puede trabajar a altas temperaturas. Aplicaciones de la PCR: La finalidad de la PCR consiste en la amplificación del ADN , es decir, en la obtención de múltiples copias de un fragmento específico de ADN a partir de un número muy pequeño de moléculas. • Clonación de genes. La PCR ha resultado útil en la clonación de genes, ya que permi permite te obte obtene nerr un gran gran núme número ro de co copia piass del del gen gen ante antess de la clon clonac ació ión n propiamente dicha. Gracias a esta técnica también es posible amplificar genes mutados artificialmente para su posterior clonación. • Media ante nte la PCR PCR se pued pueden en ampli mplifi ficcar genes enes de Estudios Estudios evolutivos evolutivos.. Medi orga organi nism smos os ya exti exting nguid uidos os a part partir ir de ca cant ntid idad ades es muy pequ pequeñ eñas as de ADN ADN present presentes es en alguno algunoss fósiles fósiles,, para para compar compararlo arloss poster posteriorm iorment ente e con genes genes semejantes de organismos actuales y estudiar la conservación de ciertos genes a lo largo de la evolución y reconstruir árboles filogenéticos. • han podi podido do conoc onocer er datos atos Estud Estudios ios históri históricos cos y arqueoló arqueológic gicos. os. Se han referentes a enfermedades de origen genético amplificando ADN de muestras de individuos momificados, pertenecientes a civilizaciones antiguas. • Huellas dactilares del ADN. Es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entr entre e ella ellas. s. Esta Esta técn técnic ica a se apli aplica ca ac actu tual alme ment nte e en me medi dici cina na fore forens nse e e inves investi tiga gaci cion ones es polic policia iales les,, co con n el fin de iden identi tific ficar ar indi individ viduo uoss a part partir ir de muestras biológicas, como sangre, semen, piel o cabellos. También se utiliza en pruebas de paternidad. • Secuenciación: Mediante la PCR se pueden formar la suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciación. Es mucho más sencillo y rápido que la clonación en células. •
Transcripción 14
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La transcripción es el paso de una secuencia de ADN a una secuencia de ARN, ya sea ARNm, ARNr o ARNt. Ocurre en el interior del núcleo. Para ello interviene una cadena de ADN que actúe como molde (de las dos cadenas de nucleótidos que forman el gen, solo una, la denominada molde, se transcribe realmente, mientras que la otra, llamada informativa, no lo hace), ribonucleótidos trifosfato de A, C, G y U, las ARN-polimerasas (ARNpol) y los cofactores ( σ) y rho (ρ). Las ARNpol reco recorr rren en la cadena de ADN en sentido 3 ´→ 5´ y añaden los nucleótidos nucleótidos complementar complementarios ios a los de la cadena de ADN que que se tran transc scri ribe be (cad (caden ena a codific codificado adora) ra),, la molécula de ARN crece en sentido 5 ´ 3´.
La transcripción es asimétrica: solamente se transcribe para cada gen una de las dos cadenas del ADN. La cadena transcrita se llama codificadora, y la cadena de ADN que no se transcribe se denomina estabilizadora . En los organismos eucariotas, para cada gen, solame lamen nte se transcribe ibe una cadena de ADN (la codificadora), de forma que genes distintos del mismo cromosoma pueden util utiliz izar ar co como mo co codi difi fica cado dora ra una una cade ca dena na dife difere rent nte e a la de otro otross genes.
En bacterias En bacterias existe solamente
una ARN polimerasa polimerasa que sintetiza todos los tipos de ARN. En el caso de la síntesis de ARNm se distinguen las siguientes etapas: 1. Iniciación. En primer lugar, la ARN-polimerasa se asocia con el cofactor sigma ( σ), que permite a esta enzima reconocer y asociarse a una región concreta del ADN denominada promotor , que a veces es común a varios genes. En esta región se han han dist disting ingui uido do dos dos secu secuen enci cias as de co cons nsen enso so (secuencias cortas de bases nitrogenadas a las que se une la ARN-po -polim limera erasa), iguales les o parecidas a TTGACA y a TATAAT, que se encuentran a distintas distancias ante antess del del punt punto o de inic inicio io.. Se han han desc descub ubie iert rto o tamb tambié ién n secu secuen enci cias as inte intens nsifi ifica cado dora ras, s, que que favor favorec ecen en la transcripción. A continuación, la ARNpolimerasa pasa de una configuración cerrada a una config configura uració ción n abiert abierta a y desenr desenrolla olla,, apro aproxi xima mada dame ment nte, e, una una vuel vuelta ta de hélice permitiendo la polimerización de ARN a partir de sólo una de las hebras hebras que se utiliza como patrón (la 15
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ARN-polimerasa hace que la doble hélice de ADN se abra para permitir que quede expuesta la secuencia de bases del ADN y se puedan incorporar los ribonucleótidos que se van a unir). Posteriormente se separa el cofactor σ. proces eso o co cont ntin inúa úa a razó razón n de unos unos 40 Elongación o alargamiento. alargamiento. El proc 2. Elongación nucleótidos por segundo. A medida que la ARN-polimerasa recorre la hebra de ADN patrón hacia su extremo 5´, se sintetiza una hebra de ARN en dirección 5´→ 3´. Lee el ADN en sentido 3´ → 5´, mientras que sintetiza en sentido 5´ → 3´. La ARN-po -polim limera erasa 3. Finalización. reco recono nocce en el ADN ADN unas unas seña eñales les de term termin inac ació ión n que que indi indica can n el fina finall de la transcripción. Esto implica el cierre de la burbuja formada por el ADN y la separación de la ARN-polimerasa del ARN transc transcrit rito. o. La finaliz finalizaci ación ón presen presenta ta dos variantes: una en la que se precisa el cofactor ρ (que reconoce una secuencia específica del ARN y se une a ella para tirar del ARN y soltarlo de la ARN polime imerasa asa), y otra en la que no se prec precis isa: a: la fina finali liza zaci ción ón se prod produc uce e al lleg llegar ar a una una secu secuen enci cia a pali palind ndró rómi mica ca (secuencia que tiene la misma lectura de izq izquier uierda da a der derec echa ha y de dere dereccha a izquierda) rica en G y C, que posibilita la auto autoco comp mplem lement entar aried iedad ad de la co cola la del del ARN, lo que da lugar a un bucle final que provoca su separación del ADN. Entonces éste vuelve a formar la doble hélice y la ARN-polimerasa se separa. 4. Maduración. Si lo que se sintetiza es un ARN m, no hay maduración; cuando se tran transc scrib ribe e ADN ADN que que co codi dific fica a los los ARN ARNt y los ARNr se forma forma una una larga larga molécula de ARN que contiene numerosas copias de las secuencias del ARN r o el ARNt. Esta larga molécula, el transcrito primario, es posteriormente cortada en fragmentos más pequeños por enzimas específicas, para dar lugar a los distintos ARNt y ARNr.
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En eucariotas. Hay tres tipos de ARN-polimerasa, según el tipo de ARN que se ha de sintetizar. ARN-pol I = ARN r ARN-pol II = ARN m ARN-pol III = ARNt Los genes están fragmentados de forma que siempre es necesario un proceso de madu ma dura raci ción ón en el que que se elimi elimine nen n las las secu secuen enci cias as sin sin sent sentid ido o o intrones y se empalmen las secuencias con sentido o exones. Excepcionalmente, hay genes, como los de las histonas, que no presentan intrones. Se ha observado que en genes que se transcrib riben cont co ntin inua uamen mente te (com (como o los los de ARNr) el ADN est está siem emp pre exte extendi ndido do,, en otro otross siemp siempre re está, aparentemente, en forma forma de nucl nucleos eosoma omas, s, y en otros hay transición a la forma ext extendid dida sólo duran rante la transcripción. En el caso de la síntesis de ARNm se distinguen las siguientes etapas: Existe 1. Iniciación. una región del ADN denominada región promotora, donde se fija la ARNpolim polimer eras asa a II, II, que que co cons nsta ta de dos dos seña señales les deno denomin minad adas as secu secuen enci cias as de consenso: la CAAT y la TATA, a distintas distancias antes del punto de inicio. 2. Alargamiento o elongación. El proceso de síntesis continúa en sentido 5´ → 3´. Al cabo de 30 nucleótidos transcritos se añade una caperuza constituida por una metil-guanosín-trifosfato invertida al extremo 5´. 3. Finalización. La finalización de la síntesis del ARNm parece ser que está relacionada con la secuencia TTATTT. A continuación interviene la enzima poli-A-polimerasa que añade al extremo final 3´ un segmento de unos 200 ribonucleót ribonucleótidos idos de adenina, adenina, la llamada cola de poli A, al transcrito transcrito primario o pre ARNm, también llamado ARN heterogéneo nuclear. 4. Maduración. En eucariotas la maduración es más compleja, ya que la mayor parte de los genes que codifican las proteínas están fragmentados. Cada gen 17
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consta de varios fragmentos denominados intones (secuencias de bases más o menos largas que se transcriben, pero que no se traducen, es decir, no codi co dific fican an una una secu secuen enci cia a de am amin inoá oáci cido dos) s) y exon exones es (sec (secue uenc ncia iass que que se transcriben y se traducen), intercalados unos con otros. Se produce en el núcleo. La maduración consiste en la eliminación de los intrones y la unión de los exones. La maduración la realiza una enzima denominada ribonucleoproteína pequeña nuclear (RNPpn) que es un complejo proteínaARNpn. El ARNpn contiene unas secuencias que son complementarias de las de los extremos de los intrones. Al asociarse, el intrón se curva y se desprende. A continuación, actúan ARN-ligasas específicas que empalman los exones. El ARNt y el ARNr presentan también procesos de maduración.
El código genético Una vez obtenida una copia del mensaje genético en forma de cadena de ARNm, ésta dirige la síntesis de proteínas en los ribosomas. Para ello, estos orgánulos interpretan la secuencia concreta de nucleótidos existente en la molécula de ARNm como la información necesaria para la unión de los aminoácidos precisos para construir la proteína específica. Se deno denomi mina na códi código go gené genéti tico co a la rela relaci ción ón entre entre la secu secuen enci cia a de nucleótidos (o, más concretamente, de bases nitrogenadas presentes en ello ellos) s) del del ARN ARN m y la secu secuen enci cia a de amino aminoác ácid idos os qu que e cons consti titu tuye ye un una a proteína .
Consiste en una equivalencia entre dos polímeros específicos. Uno de ellos, el ARN, ARN, tiene tiene dispues dispuestas tas sus bases bases nitrog nitrogena enadas das en una secuen secuencia cia concre concreta ta que contiene la información que determina el orden en que han de engancharse los sucesivos aminoácidos que forman la cadena polipeptídica. Por tanto, los ARN m con secuencias de bases nitrogenadas distintas llevan información para la síntesis de proteínas diferentes. 18
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El código genético es la clave que permite la traducción del mensaje genético a su form forma a func funcion ional al,, las las prote proteín ínas as.. Co Como mo sólo sólo hay hay cuat cuatro ro base basess nitro nitroge gena nada dass distintas, las señales codificadoras para los 20 aminoácidos proteicos deben estar constituidas por más de una base. Si la señal estuviera formada por dos bases nitrogenadas, sólo codificarían 42 = 16 aminoácidos, por lo que aún quedarían aminoácidos sin codificar. Por tanto, cada señal que codifica para un aminoácido está constituida por tres bases distintas (un triplete), es decir, 4 3 = 64 tripletes de bases distintas. Los tripletes de bases del ARN m reciben el nombre de codones. Los tripletes del ADN ADN co corr rres espo pond ndie ient ntes es,, que que han han sido sido tran transc scrit ritos os,, se deno denomin minan an codógenos. Existen 61 codones codificadores de aminoácidos y 3 (UAA, UAG y UGA, llamados sin sentido) que señalan el final del mensaje y no especifican ningún aminoácido. Hay Ha y tamb también ién un co codó dón n (AUG (AUG)) que, que, ademá ademáss de co codi dific ficar ar para para el am amin inoá oáci cido do metionina, es la señal de comienzo. En la década de 1950 se emprendió la tarea de descifrar el código genético, es decir, de identificar la señal concreta en el ARN m para la introducción de cada aminoácido en la cadena proteica en formación. Severo Ochoa descubrió en 1955 la enzima polinucleótido fosforilasa, capaz de sintetizar ARN a partir de nucleótidos difosfato sin necesidad de un molde de ADN. Esto permitió sintetizar cadenas conocidas de ARN constituidas por un único tipo de nucleótido o por varios. A raíz de sus trabajos con esa enzima en Escherichia coli, M. Nirenberg y H. Matthaei dedujeron en 1961 que el triplete de sus bases UUU codificaba para el aminoácido fenil-alanina, el CCC para la prolina y el AAA para lisina. Posteriormente se descifró el resto de los tripletes. Colocaron una serie de 20 tubos con los veinte aminoácidos en cada uno de los tubos. En cada tubo había un aminoácido diferente marcado con C 14. En todos y cada uno de los tubos añadió el poli U y todos los elementos necesarios para la síntesis proteica. Observó que solo aparecía un polipéptido radiactivo en el tubo donde había marcado la fenilalanina.
El código genético tiene las siguientes características: • •
Está formado por una secuencia lineal de bases nitrogenadas . Carece de solapamiento . Los tripletes de bases se hallan dispuestos de
manera mane ra line lineal al y conti ontin nua, ua, sin sin que entr entre e ello elloss exis existtan espa espaccios ios ni separaciones de ningún tipo, y sin que compartan ninguna base nitrogenada. Su lectura se hace en un solo sentido (5´ → 3´), desde el codón que indica el comienzo de la proteína hasta el que indica su final. Sin embargo, existe la posibilidad de que un mismo ARNm contenga varios codones de iniciación. Esto significa que se podrían realizar varias fases de lectura y se sintetizaría más de un polipéptido.
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Es universal universal. Es el mismo código para todas las células de todas las
especies (incluso los seres acelulares como los virus emplean el mismo código). Sin embargo, se han detectado excepciones a la universalidad del código en el material genético de mitocondrias, en algunos protistas ciliados y en micoplasmas. Es degenerado . El código está degenerado en el sentido matemático del térm términ ino. o. Est Esto signi ignifi ficca que que no exis existte el mism mismo o númer úmero o de señal eñales es codificadoras en el ARN que aminoácidos van a ser codificados. Salvo el triptófano y la metionina, que están codificados por un único codón, los demás aminoácidos están codificados por más de un triplete. Generalmente, solo se diferencian en la última base. La existencia de codones distintos que codifican el mismo aminoácido, se puede considerar que proporciona cierta vent ventaj aja, a, pues puesto to que que si se prod produc uce e un ca camb mbio io no dese desead ado o en una una base base nitrogenada es posible que el codón alterado siga codificando para el mismo aminoácido. No pr pres esen enta ta impe imperf rfec ecci cion ones es. Ningún codón codifica más de un aminoácido.
Traducción Para Para que que teng tenga a luga lugarr el proc proces eso o de trad traduc ucci ción ón o sínt síntes esis is de prot proteí eína nass se necesitan: Ribosomas, donde se realiza la síntesis proteica. • • ARNm, que lleva la información para sintetizar cada proteína. Aminoácidos, que son los componentes de las proteínas. • pr oteínas. • ARN de transferencia, que aporta los aminoácidos en el orden preciso. • Enzimas y energía, necesarias en toda reacción de biosíntesis. La traducción traducción se realiza en los ribosomas, orgánulos citoplasmátic citoplasmáticos os formados formados por dos dos subu subuni nida dade des, s, una una pequ pequeñ eña a y otra otra gran grande de,, forma formada dass por por ARN ARNr específicos específicos y proteínas. En la subunidad pequeña se une el ARN m, mientras que en la subunidad grande es donde se unen los aminoácidos para formar la cadena polipeptídica. Ambas se unen cuando van a sintetizar proteínas. En el ribo ibosoma se dist isting inguen tres lugares diferentes de unión a los ARN de transferencia: el sitio P (pep (peptid tidil) il),, dond donde e se sitú sitúa a la ca cade dena na polip polipep eptí tídi dica ca en formaci formación; ón; el siti (aminoaci acil), l), donde donde entran entran los sitio o A (amino aminoácidos aminoácidos que se van a unir a la cadena proteica, proteica, y el itúa el ARNt ante antess de sali salirr del del siti sitio o E, donde se sitú ribosoma. En la bios biosín ínte tessis de las las prot proteí eína nass pod podem emos os distinguir las siguientes etapas: 1. Activa Activació ción n de los amin aminoác oácidos idos.. 2. Tra Traduc ducció ción: n: iniciació iniciación n de la síntesi síntesis. s. Elongaci Elongación ón o alargam amiient ento de la cadena polip lipeptídica ica. Finalización de la síntesis. 3. Asoc Asocia iaci ción ón de varia variass ca cade dena nass polip polipep eptí tídic dicas as y, a veces, de grupos prostéticos, para constituir las proteínas. 20
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1. Activación de los aminoácidos. Los aminoácidos, en presencia de la enzima
aminoacil-ARNt-sintetasa y de ATP, son capaces de asociarse a un ARN t específico y dar lugar a un aminoacil-ARN t, liberándose AMP, Ppi y quedando libre la enzima, que vuelve a actuar. La unión del aminoácido a su ARN t específico se realiza entre su grupo carboxilo (-COOH) y el radical –OH del extremo 3´ del ARN t.
2. Prime Primera ra etap etapa a de la tradu traducc cció ión: n: la inic inicia iaci ción ón de la sínt síntes esis is.. La
traducción se inicia en el extremo 5´ del ARNm. En
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bacterias, el ARNm no experimenta maduración. Incluso antes de acabarse su síntesis
ya se empieza a traducir. El ARNm se une a la subunidad pequeña de los ribosomas gracias a una secuencia inicial llamada región lider , que no se traduce, en la que hay unos 10 nucleótidos complementarios con el ARN ribosómico. Se une por su extremo 5 ´. Gracias a un factor proteico de iniciación IF 3. (5´ AUG AUG 3´). 3´). A ésto éstoss se asoc asocia ia el aminoacil-ARNt, gracias a que el ARNt tien tiene, e, en una una de sus sus asas asas,, un tripl triplet ete e de nucleótidos denominado anticodón , que se asocia al primer triplete de codón del ARNm según la complementariedad de las bases (formación de puentes de hidrógeno entre entre las bases bases complem complementa entarias rias del antico anticodón dón-co -codón dón), ), poster posteriorm iorment ente e se une la subunidad grande, formándose el complejo ribosomal o complejo ac tivo que posee dos sitios de unión o centros: el centro peptidil o centro P , donde se sitúa el primer aminoacil-ARNt, y el centro aceptor de nuevos aminoacil-ARN t o centro A . Todos los procesos están catalizados por los llamados factores de iniciación. Todos estos procesos precisan gasto de GTP. El primer triplete que se traduce es el AUG, que corresponde a la formilmetionina. Posteriormente este aminoácido suele ser retirado. En células eucariotas, el ARNm es sintetizado en el núcleo y antes de salir exper experim iment enta a un proc proces eso o de ma madu dura ració ción. n. En el extr extrem emo o 5´ lle lleva va una una ca caper peruz uza a constituida por una metil-guanosín-trifosfato, que permite su identificación por los ribosomas, y a continuación la llamada región líder , que no se traduce. Después está el triplete AUG que se traduce por el aminoácido metionina que, frecuentemente, después es retirado. 3. Segunda etap tapa de la traducción ión: elonga gac ción de la cadena polipeptídica. Al centro A llega el segundo aminoacil-ARNt. El radical carboxilo del
aminoácido iniciador se une con el radical amino del aminoácido siguiente mediante enlace peptídico. Esta unión es catalizada por la enzima peptidil-transferasa. El centro P queda, pues, ocupado por un ARN t sin aminoácido que sale del ribosoma. Se produce entonces la translocación ribosomal (desplazamiento del ribosoma sobre el ARN m es en sentido 5´→ 3´). Como este desplazamiento es exactamente de tres bases, el primer ARNt abandona el ribosoma, y el dipeptidil-ARNt, que todavía se mantiene unido a su codón, pasa a ocupar el centro P. Todo ello precisa de GTP y está catalizado por los factores de elongación. En estas estas condic condicion iones, es, otro otro amin aminoac oacil il -ARNt se puede incorporar al sitio A, de manera que el proceso de alargamiento de la cadena proteica puede continuar, repitiéndose el ciclo. 4. Terc Tercer era a etap etapa a de la tradu traducc cció ión: n: la fina finaliz lizac ación ión de la sínt síntes esis is.. La terminación de la cadena proteica tiene lugar cuando el ribosoma llega a un lugar del ARNm donde se encuentra un codón codón de terminación terminación (UAA, UGA o UAG), que no es rec reconoc onocid ido o por por nin ningún gún ARN ARNt (no exist iste nin ningún ARNt cuyo cuyo anti antico codó dón n sea sea factores proteicos proteicos de liberación liberación (FR) que complementario de ellos) y si por unos factores precisan gasto de GTP para actuar. Se instalan sobre el centro A y provocan que la peptidil-transferasa haga interaccionar el último grupo –COOH con el agua, con lo que queda liberada la cadena polipeptídica. A continuación, se separan el ARN m y las dos subunidades ribosomales.
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Un mismo ARNm, si es lo suficientemente largo, puede ser traducido por varios ribosomas a la vez, uno detrás de otro formando un polirribosoma o polisoma . 5. Asociación de varias cadenas polipeptídicas y, a veces, de grupos prostético prostéticos, s, para constitu constituir ir las proteínas proteínas.. A medida que se va sintetizando la cadena polipeptídica, ésta va adoptando una determinada estructura secundaria y terciaria. Tras finalizar la traducción hay proteínas enzimáticas que ya son activas y otras otras que que prec precis isan an elimi eliminar nar algu alguno noss am amin inoá oáci cido doss para para serlo serlo.. Gener General almen mente te,, se produc produce e la separa separació ción n del aminoá aminoácid cido o metion metionina ina o aminoá aminoácid cido o iniciad iniciador. or. Alguna Algunass enzimas necesitan asociarse a iones o a coenzimas para ser activas.
Regulación de la expresión génica Las células no están constantemente sintetizando todos los tipos de proteínas sobre las cuales tienen información; depende de las necesidades celulares. Si fuera así, se produciría un caos metabólico y alteraciones importantes. Para evitar el despilfarro de moléculas y energía, los genes sólo se expresan cuando es necesario sintetizar las proteínas adecuadas en cada momento de la vida celular. Es evidente que debe existir un sistema de regulación. Como la cantidad de proteínas sintetizadas depende directamente del ARN m presente en el citoplasma y como la vida media de éste es muy corta, es, pues, suficiente con regular la síntesis del ARNm. Ésta depende, en los procariontes, del sustrato disponible, y en las células eucariotas de los organismos pluricelulares, del ambiente hormonal del medio interno.
Regulación de la expresión génica en los procariontes Uno de los modelos de regulación de la expresión génica mejor conocidos en procariontes es el modelo del operón , descrito en los años cincuenta por F. Jacob y J. Mono Monod d en Esch Escheri erich chia ia co coli. li. De ac acue uerd rdo o co con n este este mo mode delo lo exis existe ten n unas unas prot proteín eínas as reguladoras que controlan la transcripción de los genes que codifican para las enzimas implicadas en una ruta metabólica determinada. Se distinguen cuatro tipos de genes:
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• •
•
•
Gen promotor. Es una secuencia de nucleótidos del ADN a la que se une la
ARN-polimerasa para iniciar la transcripción de un gen o un conjunto de genes. Genes estructurales. Son los que codifican (contienen la información) para la sínt síntes esis is de las prot proteín eínas as implic implicad adas as en un mismo mismo proce proceso so me meta tabó bólic lico. o. Se tran transc scri ribe ben n sin sin inte interr rrup upci ción ón,, de mo modo do que que el ARN ARNm resu result ltan ante te lleva lleva la información para varias proteínas y recibe el nombre de ARNm policistrónico . Gen operador. Secuencia de nucleótidos situada entre el promotor y los genes estructurales. Es el lugar del ADN donde puede unirse una proteína reguladora e impedir la transcripción de los genes estructurales. Sintet etiza iza la prot proteín eína a regu regula lado dora ra (represor). Pued Puede e esta estarr Gen regulador. regulador. Sint situ situad ado o en cual cualqu quie ierr luga lugarr del del crom cromos osoma oma bact bacter erian iano. o. Cuan Cuando do la prot proteín eína a represora se asocia al operador impide físicamente que la ARN-polimerasa se pueda unir al ADN y con ello imposibilita la transcripción. Cuando el represor se separa, la transcripción ya es posible.
Según se trate de una ruta catabólica o anabólica se diferencian dos tipos de sistemas de regulación de la expresión génica: inducible y represible . Sistema inducible:
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Es característico característico de los procesos catabólicos. catabólicos. La proteína proteína sintetizada sintetizada por el gen regulador es un represor activo que, al unirse al gen operador, impide la acción de la ARN polimerasa sobre los genes estructurales. Por tanto, no se formarán las enzimas de la ruta metabólica y ésta no se podrá realizar. Cuando aparece el sust sustrat rato o inic inicial ial de esta esta ruta ruta,, la prot proteín eína a repre represo sora ra ca cambi mbia a su co conf nform ormac ación ión volviéndose inactiva, y deja de actuar sobre el gen operador. La inactivación del represor se consigue por la unión a una molécula inductora, que puede ser el mismo sustrato o un derivado de éste, de modo que se favorece la acción de la ARN polimerasa sobre los genes estructurales, los cuales se transcriben y sintetizan las enzimas correspondientes. Este mecanismo permite la síntesis de proteínas enzimáticas solamente cuando son necesarias. Hasta que no hay sustrato que catabolizar no existen las enzimas para hacerlo, pues el gen represor, unido al gen operador, operador, impide la transcripción. transcripción. Sin embargo, la presencia del sustrato inactiva al represor e induce la síntesis de las enzimas que llevan a cabo la ruta catabólica. El operón (de lactos lactosa) a) consti constituy tuye e un sistema sistema induci inducible ble que permit permite e la operón lac (de regulación de la síntesis de las enzimas que intervienen en el catabolismo de la lactosa por Escherichia coli. Existen tres genes estructurales que codifican para las tres enzimas que participan en la ruta catabólica. La alolactosa, derivada de la lactosa, es el inductor que modifica la estructura del represor inactivándolo. Sistema represible
Se da en procesos anabólicos. A diferencia del sistema inducible, el represor sintetizado por el gen regulador es inactivo y, por tanto, la ARN polimerasa actúa y los genes estructurales se transcriben. La molécula represora se activa únicamente al cambiar su conformación por la unión a un correpresor, el cual constituye el producto final de la ruta anabólica. La activación del represor permite su unión al gen operador impidiendo la transcripción de los genes estructurales. De esta forma se producen las enzimas que participan en la ruta anabólica hasta que existe suficiente cantidad de producto final. En este caso, el represor se hace activo y se inhibe la transcripción, con lo cual se evita una síntesis excesiva del producto.
Control de la biosíntesis proteica por el AMP cíclico
El AMP cíclico se forma a partir del ATP por la enzima adenilato-ciclasa, que está situada en la cara interna de la membrana citoplasmática: Adenilato ciclasa ATP ------------------→ AMPc + Ppi El AMPc para actuar necesita el concurso de la proteína denominada proteína activador activador del catabolito (CAP) . El complejo CAP-AMPc tiene una gran afinidad por una zona que hay en el promotor, anterior al lugar donde se sitúa la ARN-polimerasa. Parece ser que, sin su presencia, la ARN-polimerasa tiene grandes dificultades para asociarse a su lugar en la zona promotor. Se ha co comp mpro roba bado do que que cuan cuando do aumen aumenta ta el nivel nivel de gluc glucos osa a en la cé célu lula, la, disminuye el nivel de AMPc (por un mecanismo todavía desconocido). No se forma el 25
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complejo CAP-AMPc, la ARN-polimerasa no se puede fijar, y, por tanto, no se producen las enzimas para el metabolismo de la lactosa. As pues, sólo cuando se agota la glucosa, y además hay presencia de lactosa, la bacteria produce las enzimas para metabolizar dicha lactosa.
El control de la expresión génica en eucariontes En los los orga organis nismo moss plur pluric icelu elula lares res las las cé célu lula lass de difer diferen ente tess tejid tejidos os tiene tienen n distin distintas tas funcio funciones nes y sintet sintetizan izan distint distintas as proteí proteínas nas,, aunque aunque conten contengan gan los mismos mismos genes. Aunque todas las células tienen el mismo ADN, no en todas se manifiesta la misma información. Por ejemplo, los genes de la hemoglobina solo se manifiestan en los eritrocitos, los genes de la melanina en las células epiteliales, etc. Los segmentos de ADN que se encuentran fuertemente condensados no se expresan, mientras que los que están extendidos, incluso sin formar nucleosomas y facilitando la acción de la ARNARN-po poli lime mera rasa sa,, será serán n los los que que se tran transc scri ribi birá rán. n. Segú Según n las las zona zonass que que qued quedan an condensadas aparece, durante el desarrollo embrionario, la diferenciación celular y con ella la organogénesis o formación de órganos en el embrión. Según el tipo de célula, habrá unos receptores de membrana u otros y, por tanto, sólo unas serán células diana respecto a unas hormonas determinadas. En el ADN de las células eucariotas, además de los genes estructurales que se tran transscrib criben en,, hay hay una una serie erie de sec ecu uenc encias ias rela relaci cion onad ada as co con n el co cont ntro roll de la transcripción: • El promotor , al que se une la ARN polimerasa después de que se haya unido un factor de la transcripción (proteína activadora). • Las secuencias intensificadoras , donde se unen factores de la transcripción que la activan. • Las secuencias silenciadoras , donde se unen factores de la transcripción que la inhiben. Los factores factores de la transcripci transcripción ón son proteínas reguladoras que controlan específicamente la expresión de cada gen, según la situación fisiológica de la célula. El funcionamiento de algunos factores de la transcripción está condicionado por la pres presenc encia ia de hormo hormonas nas,, de difer diferen ente te mo modo do segú según n sean sean horm hormon onas as lipíd lipídic icas as o proteicas. Las hormonas lipídicas (esteroideas), debido a su bajo peso molecular y su liposolubilidad, atraviesan la membrana plasmática y se difunden en el citoplasma, donde se unen a sus receptores específicos formando complejos “hormona-receptor”, que las introducen en el núcleo. Allí se fijan sobre secuencias determinadas del ADN e indu induce cen n la tran transc scri ripc pció ión n de determinados genes, segu segura rame ment nte e faci facili lita tand ndo o la desco descond nden ensa saci ción ón de cier cierta tass zonas de ADN. hormonas Las proteicas no penetran en el medio medio inte intern rno o de las cé célu lulas las del órgano blanco, debido a su eleva elevado do peso peso mo molec lecul ular. ar. La Lass hormonas proteicas al unirse a su rec ece eptor de me mem mbrana inducen la activación de una enzi enzima ma,, la aden adenil ilat atoc ocic icla lasa sa asociada al receptor y situada en la cara interna de la membrana. La adenilatociclasa cataliza la transformación del ATP en AMP cíclico (AMPc) que actúa como segundo mensajero, el cual activa a su vez a una proteína reguladora de la transcripción.
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Genética 1.- ¿De qué tipo de moléculas está constituido el virus T 2? ¿Por ¿Por qué A. Hershey Hershey y M. Chase
eligieron isótopos radiactivos de S y de P, y no de C, N, O o H, para realizar su experiencia?. ¿Qué función función realiza la cápsida cápsida y cuál el ADN en el bacteriófago T2? ¿Por qué el experimento realizado por A. Hershey y M. Chase demuestra que las proteínas no aporta aportan n inform informació ación n genétic genética a a los descendientes? Obser Observa va la figu figura ra y come coment nta a por por qué qué una de las hipótesis esis se deno enomina ina conser servati vativ va y otra se deno enomina ina semiconservativa. En la figura , se observa la posición posición que ocupa un ADN sintetizado con N 14, un ADN ADN sinte inteti tizzado ado con con N15 y el ADN obtenido en la primera experiencia de Meselson y Stahl. Explica qué posición habría ocupado el nuevo ADN si la hipótesis conservativa fuera correcta y por qué se descartó dicha hipótesis.
2.- En la figur figura a ante anterio riorr tamb tambien ien se obse observa rvan n los los resu result ltad ados os tras tras la segu segund nda a y terc tercer era a replica replicación ción.. Explica Explica qué qué result resultado adoss se habrían habrían obteni obtenido do si la hipótes hipótesis is correc correcta ta fuera fuera la dispersiva y por qué se rechazó dicha hipótesis. 3.- ¿En ¿En qué qué cons consis iste, te, básic básicam ament ente, e, la dupl duplica icaci ción ón o replic replicac ación ión del del ADN ADN y cuál cuál es su importancia biológica? Describe el mecanismo de replicación del ADN, indicando qué quiere decir que es un proceso bidireccional.
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4.-Explica brevemente brevemente cómo se produce produce el flujo de información genética genética en un organismo. organismo. Di
en qué consiste cada uno de los procesos biológicos implicados en este flujo. 5.- La ADN-polimerasa precisa nucleótidos trifosfato a pesar de que, una vez incorporados, quedan nucleótidos monofosfato. Sabiendo que los enlaces entre dos grupos fosfato son muy ricos en energía, ¿qué explicación puedes dar a este hecho? 6.- La nueva hebra siempre crece en dirección 5 ’→ 3’. ¿Qué quiere decir esto? 7.- ¿Cuál es la secuencia de ADN complementario de: 5 ’ ... ACTCAGGTA ... 3’? 8.- Si en un ADN de una célula eucariota hay un 18% de timina, ¿qué porcentaje hay de las otras bases nitrogenadas?. ¿Qué son los fragmentos de Okazaki? 9.- Completa el siguiente cuadro, especificando la función de las siguientes enzimas, que intervienen en la duplicación del ADN bacteriano. Enzima
Función Procesos en los que interviene
ADN-polimerasa I
Topoisomerasa Topoisomerasa I y II
Primasa (ARN- pol)
ADN-ligasa ADN-polimerasa III Helicasa 10.- ¿Por ¿Por qué qué la hebr hebra a reta retard rdad ada a se sint sintet etiz iza a de form forma a disc discon onti tinu nua? a? ¿Por ¿Por qué qué la hebr hebra a
retardada tarda más en sintetizarse si cuenta con más puntos de iniciación?
11.- Después de extraer y desnaturalizar el ADN de bacterias (Escherichia coli) que estaban
iniciando la replicación, Okazaki observó que había fragmentos de cadena sencilla y largos, de unos unos 1000 1000 nucle nucleót ótido idos; s; si dejab dejaba a que que la replic replicac ación ión prog progres resar ara a dura durant nte e má máss tiem tiempo po,, encontraba encontraba fragmentos fragmentos largos de cadena cadena sencilla sencilla y fragmentos fragmentos cortos. ¿Qué relación relación pueden tener estos resultados con el hecho de que las ADN-polimerasas sólo actúan en sentido 5 ’ → 3’? 12.- Diferencia entre procariotas y eucariotas en la duplicación del ADN. 13.- Sin consulta consultarr el libro, libro, rotula rotula las enzimas enzimas que que intervi interviene enen n en la duplic duplicaci ación ón del ADN bacteriano.
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14.- Explica lo que significa la sentencia: “un gen, una enzima”. 15.- Comenta la siguiente frase: El ARN m de los procariotas procariotas suele ser policistrónico policistrónico mientras mientras
que el de los eucariotas es monocistrónico 16.-Un fragmento de una cadena de ADN tiene la siguiente secuencia de nucleótidos: 5´... TCTGCATCCTT ... 3´ a) Escribe Escribe la cadena cadena complemen complementaria taria tras tras la replicac replicación ión del mismo. mismo. b) Supón que que en la replicación replicación anterior anterior el punto punto de iniciación iniciación (origen (origen de la replicación replicación)) es el nucleótido adenina, que aparece subrayado en la cadena. - Desde dicho punto hacia la derecha indica si la síntesis es continua o discontinua. Razona la respuesta - Desde dicho punto hacia la izquierda indica si la síntesis es continua o discontinua. Razona la respuesta. c) En el caso caso del fragme fragmento nto cuya síntesi síntesiss es discont discontinu inua a indica indicar: r: cuál es el fragmen fragmento to de Okazaki que primero primero se forma, si el más próximo al punto de iniciación o el más alejado. Cuál es la dirección de síntesis de cada fragmento de Okazaki. 17.- Escribe la secuencia de ARNm que se transcribiría de la siguiente cadena de ADN. ADN: 3’ ... TACAAGTACTTGTTTCTT ... 5’ 18.- Escribe la secuencia de ARNm que se transcribiría de la siguiente cadena de ADN. ADN: 5’ ... TACAAGTACTTGTTTCTT ... 3’ 19.- Realiza el dibujo de dos instantes sucesivos de una translocación ribosomal sobre un ARNm inventado. Consultar la clave genética. 20.- Escr Escrib ibe e la secu secuen encia cia de ARNm ARNm que que se tran transc scrib ribirí iría a de la sigu siguien iente te cade cadena na de ADN ADN bacteriano y la secuencia de aminoácidos que resultaría de su traducción. 5’ ... TACAAGTACTTGTTTCTT ...3’ Supó Supón n que que las las dos dos guan guanina inass se camb cambian ian por por cito citosi sina nas. s. ¿Cóm ¿Cómo o afec afecta taría rían n esta estass mutaciones a la secuencia de aminoácidos? Supó Supón, n, ahor ahora, a, que que las las dos dos guan guanina inass se elimi elimina nan n de la secu secuen encia cia del del ADN. ADN. ¿Cóm ¿Cómo o afectarían estas otras mutaciones a la secuencia de aminoácidos de la proteína? 21.-
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a) El esqu esquem ema a repr repres esen enta ta dos dos proc proces esos os biol biológ ógic icos os muy muy impo import rtan ante tes. s. ¿Có Cómo mo se denomi denominan nan?? Indic Indicar ar los distin distintos tos ele elemen mentos tos de la figura figura repres represent entado adoss con los números. b) Identificar Identificar los extremos extremos del elemento elemento 2 (a,b) (a,b) y los extremos extremos del elemento elemento 5 (c,d). c) A part partir ir de los dato datoss del del esqu esquem ema a podr podría ía conc conclu luirs irse e que que esto estoss proc proces esos os está están n ocurriendo en una célula procariota. ¿Por qué? 22.- Definir: codón, anticodón, gen, locus, alelo, telómero. 23.- ¿Qué secuencias nucleotídicas de ADN pueden codificar el siguiente tripéptido? H2N - lys – Met – Glu – COOH 24.- Supongamos la hebra de ADN: 3’ ... AATACAAAT ...5’ Duran Durante te la tran transc scrip ripció ción n de la mism misma a hay hay un erro errorr de tal tal ma mane nera ra que que fren frente te al nucleótido de “C” se sitúa otro de citosina, en lugar de uno de guanina. ¿Se modificará la secuencia peptídica codificada por esa hebra de ADN? 25.- ¿Cuál es la secuencia de un segmento de ADN de doble hélice que ha servido de molde para sintetizar el siguiente ARNm: 5’ ... AUCCUCAUG ... 3’? 26.- Contestar SÍ o NO?. Proc Procar ario iota tas s
Euc ucar ario iota tas s
¿El ARN transcrito primario es ya el ARNm? ¿Se ¿Se real realiz iza a la tran transc scri ripc pció ión n y la trad traduc ucci ción ón en compartimentos distintos? ¿La transcripción y la traducción son simultáneas? 27.- ¿Cómo se encuentra codificada la información genética? ¿Qué son los fragmentos de
Okazaki, a que proceso biológico los asocias, y qué enzimas intervienen en su formación?
28.-
En el esqu esquema ema adju adjunt nto o se repr repres esen enta tan n los los pasos para la introducción introducción y expresión expresión de un gen (gen A) de un organismo en otro. El producto del gen human umano o (prote roteín ína a A) se exp expresa resa en el organismo receptor (bacteria) después de que le sea introducida la molécula transformada. a) ¿Cóm ¿Cómo o se denom denomina ina el proc proceso eso por por el que se forman las proteínas codificadas por el gen A? b) ¿Qué ¿Qué moléc molécul ula a se form formar aría ía a part partir ir del gen A antes de que su información se conv convie iert rta a en prot proteí eína nas? s? ¿Cóm ¿Cómo o se denomina este proceso? Sin entrar en detalles moleculares, descríbelo.
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c) ¿Qué caract característic erísticas as tiene el código código genético genético que que permite permite expresar expresar un gen de origen origen humano en un organismo tan distinto como una bacteria? ¿Qué otras características tiene el código genético? d) ¿Cuál ¿Cuál fue la aportación aportación de Severo Severo Ochoa al descub descubrimiento rimiento del código código genético? genético? 29.- ¿Qué diferencia ves entre inducción y represión? ¿Qué semejanza existe entre ambos procesos de regulación génica? 30.- ¿Qué diferencia hay entre operón y operador? 31.- Indica la relación existente entre los distintos tipos de genes y su función:
1) Gen regulador. a) A él se une la ARN-polimerasa. 2) Gen promotor. b) Codifica la síntesis de proteínas enzimáticas o no. 3) Gen operador. c) Codifica la síntesis del represor. 4) Gen estructural. d) A él se une el represor o complejo activo. 32.- El operón está formado por: a) Una secuencia de genes reguladores unidas al gen promotor. b) Una secuencia de genes operadores unidos al gen regulador. c) Una secuencia de genes estructurales unidos a un gen promotor y un gen operador. d) Una secuencia de genes estructurales unidos al represor activo y al gen operador. 33.- Indica cual de estas características corresponde a una inducción enzimática según la teoría del operón: a) La presencia de un compuesto hace que éste se una al represor activo y forme un complejo inactivo que no se une al gen operador. b) La presencia de un compuesto hace que éste se una al represor inactivo y forme un complejo activo que se une al gen operador. c) La presencia de un compuesto hace que éste actúe sobre el ATP formando el AMPcíclico que actúa sobre el represor. 34.- Además de la inducción y represión, en los eucariotas pueden existir estos dos tipos de regulación génica: a) …………………………………… …………………………………………..… ……..… b) …………………………………………..… 35.- ¿Qué hormonas son las que actúan formando un segundo mensajero y cuál es éste? 36.- Expli Explica ca las razo razone ness por por las las cual cuales es una una muta mutació ción n punt puntua uall en un dete determ rmina inado do gen gen (sustitución de un nucleótido de la secuencia del ADN por otro) puede conducir a la producción de una enzima no funcional como producto de la traducción de dicho gen. ¿Por qué razón muchas mutaciones puntuales tienen efecto nulo? 37.- Indica la relación existente entre los tipos de mutación y su causa:
1) Mutación cromosómica. a) Cambios en la secuencia de nucleótidos de un gen. 2) Mutación génica. b) Cambio en la estructura de uno o varios cromosomas. 3) Mutación genómica. c) Cambio en el número de cromosomas. 38.- Las mutaciones genómicas pueden ser: a) Euploidías d) Aneuploidías b) Delecciones e) Inversiones c) Puntuales 39.- Indica la relación existente entre el tipo de mutación y su definición: 1) Duplicac Duplicación. ión. a) Cambio Cambio de sentido sentido de un un segmento segmento cromosó cromosómico mico dentro dentro del cromosoma. 2) Transposición. b) Pérdida de parte de un cromosoma. 3) Delección. c) Paso de un segmento de un cromosoma a otro cromosoma. 4) Inversión. d) Repetición de un segmento cromosómico. 40.- Indica qué conceptos relativos a las mutaciones están relacionados: 1) Aneuploidía. a) Transversión. 2) Puntual. b) Paracéntrica. 3) Delección. c) Poliploidía. 4) Euploidía. d) Transposición. 5) Translocación. e) Trisomía. 6) Inversión. f) Deficiencia. 7) Puntual. g) Sustitución. 41.- El origen y la evolución de las especies biológicas se deben a ……………………
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42.- ¿Conoces ¿Conoces algún otro tipo de regulación regulación génica en células células eucariotas eucariotas además del sistema sistema
inducción-represión? Razona la respuesta. 43.- ¿Es lo mismo represor que correpresor? Razona la respuesta. 44.- a) ¿Las mutaciones son alteraciones al azar o dirigidas hacia un cambio concreto?; b) ¿Las mutaciones, generalmente, mejoran o empeoran la información inicial?; c) ¿Por qué son la base de la evolución de las especies?; d) ¿Por qué en algunos casos la aparición de una mutación puntual puede ser causa de una enfermedad grave y otras veces no se expresa?, e) ¿Qué diferencia hay entre mutación a nivel molecular y a nivel cromosómico? 45.- En una determinada hebra de ADN se han producido las siguientes alteraciones: a) En lug lugar ar de de una una A hay hay una una G, G, b) En lug lugar ar de de una una T hay hay una una C c) En vez vez de una una G hay hay una una C d) Además Además,, falta falta el nucleót nucleótido ido de de C ¿Qué tipo de mutación es cada una de ellas? ¿Cuál es la más importante? 46.- ¿En ¿En qué qué trip triplet lete e de ARN ARNm de los los que que codi codific fican an la argi arginin nina a es má máss prob probab able le que que la sustitución de una sola base codifique el triptófano? 47.- ¿Qué crees que sucedería si en una secuencia de nucleótidos de un gen, se
suprime una base? ¿Cómo quedarían los tripletes o codones? ¿Qué pasaría con la proteína codificada por ese gen? Supón que esta proteína es responsable de la visión de un organismo. ¿Es lo mismo que el cambio se dé en una célula cualquiera del cuerpo, o que se dé en los óvulos de ese organismo, suponiendo que fuese un animal hembra? ¿Qué ocurriría con la descendencia? 48.- Indica qué diferencias existen entre un individuo trisómico y uno triploide. ¿Qué tipo de mutación aparece asociada al síndrome de Down? 49.- ¿En qué consiste el proyecto Genoma Humano? ¿Qué ventajas nos aportará? 50.- ¿Qué genes no codifican proteínas? ¿Qué son genes solapados? 51.- ¿Cuál es la posible razón por la que los genes que codifican el ARNt, ARNr y las histonas se encuentran replicados hasta más de 100 veces, dispuestos unos detrás de otros? 52.- ¿Cuál es la posible función de las secuencias cortas que se encuentran repetidas miles de veces, sobre todo en los centrómeros y en los telómeros? 53.- ¿Cuál es la posible explicación evolutiva de que en las células eucariotas, el ADN que codifica proteínas no supere el 1% del total, es decir, que haya una enorme cantidad de ADN extra (ADN repetitivo, intrones, pseudogenes, etc)? 54.- ¿Qué ventajas tiene que no todas las réplicas de los genes duplicados sean iguales, sino que formen familias de genes algo diferentes? 55.- ¿Qué tipo de vectores de clonación se utilizan para transferir genes a células procariotas y eucariotas? ¿Qué son los organismos organismo s transgénicos? ingeniería genética es una ventaja ventaja utilizar como vector vector de genes un 56.- ¿Por qué en ingeniería plásmido que posee información sobre resistencia a ciertos antibióticos? 57.- ¿Por qué se utiliza la transcriptasa inversa vírica para introducir genes de células eucariotas en bacterias? 58.- ¿Por qué es más fácil aplicar la ingeniería genética a los peces que a los mamíferos? ¿Qué es un organismo transgénico? 59.- ¿Qué peligros respecto al equilibrio ecológico y respecto a la salud humana se pueden derivar de la ingeniería genética? 60.- ¿Cómo se pueden obtener sustancias beneficiosas para el hombre (por ejemplo, insulina) mediante ingeniería genética? 61.- ¿Conoces la función que desempeñan los enzimas de restricción? ¿Cómo se puede clonar un gen? 62.- ¿Qué es la técnica de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa)?. Indica alguna aplicación concreta de esta técnica y explícala brevemente. 63.- Indica si son verdaderas o falsas: 1. El código código genético genético es degenerad degenerado o porque porque un mismo mismo triplet triplete e codific codifica a a varios varios aminoácidos. 2. La transcr transcripc ipción ión del ADN es el proceso proceso mediant mediante e el cual cual el ADN forma forma copias copias exactas de si mismo. 3. La replic replicaci ación ón del ADN ADN es conse conserva rvativ tiva. a. 32
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Los promotores son secuencias de ARN a las que se unen las ARN pol. 5. Las encim encimas as de restric restricció ción n cortan cortan el ADN. ADN. 6. La traducción del ARNm tiene lugar en el núcleo. 7. En los los ribososmas ribososmas se produce produce la transcripc transcripción. ión. 8. El intrón es la parte del del gen eucariota eucariota que que se transcribe transcribe y se traduc traduce. e. 9. Los tripletes de bases del ARNm se llaman codones. 10.El proceso de la conjugación implica el paso de ADN de una bacteria a otra. 11.Según el código genético, cada aminoácido se especifica por un codón que consta de tres nucleótidos. 12.Los plásmidos son moléculas de ADN circular de doble cadena. 13.Las mutaciones son una fuente de variabilidad genética. 14.Sólo una cadena de ADN actúa como molde en la síntesis del ARN durante la transcripción. 15.Locus es el lugar que ocupa un gen en el cromosoma. 16.La síntesis de la cadena polipeptídica finaliza cuando el ribosoma reconoce el codon teminador 17.Los plásmidos son vectores que se emplean en ingeniería genética. 18.La rea reacci cción ón de polimer polimeriza izació ción n en cadena cadena (PCR) (PCR) permite permite la amplifi amplificac cación ión de moléculas de ARN. 19.En 19.En las cé célu lulas las euca eucari riot otas as y proc procar ariot iotas as el ADN ADN tien tiene e siemp siempre re estr estruc uctu tura ra bicatenaria. 20.El sentido de crecimiento de la cadena de ADN durante la replicación es siempre en sentido 3´ a 5´. 21. El proceso de transcripción del ARNm se realiza en el citoplasma. 22.Una cadena de de ARN mensajero mensajero puede puede ser leída simultánea simultáneamente mente por varios ribosomas. 23. En el proceso de la traducción la información genética de una cadena de ARN m se transforma en una cadena polipeptídica. madu dura raci ción ón del del ARN ARNm se eli elimin minan an los los troz trozos os co corre rresp spon ondie dient ntes es a los los 24. En la ma intrones. 25.El genotipo es consecuencia de la interacción entre el fenotipo y el ambiente. 26.La insulina se puede obtener a partir de bacterias modificadas genéticamente. 27. La maduración del ARNm tiene lugar en el núcleo. 28.En los ribosomas se produce la transcripción. 64.- Relaciona los siguientes científicos con sus descubrimientos: Darwin, Pasteur, Krebs, Severo Ochoa, Watson y Crick, Miller, Avery, Meselson y Stahl, Mendel, Calvin. 65.- Agrupa de tres en tres, mediante una frase, los términos relacionados: Replica Replicació ción, n, código código,, antico anticodon dones, es, riboso ribosomas mas,, cadena cadena,, locus, locus, Okazak Okazaki, i, ARNm, ADN, gen, semiconservativa, retardada, genético, tripletes, cromosoma, traducción, ARNt, degenerado. 4.
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