ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012
FOSFATASA ALCALINA Es una fosfatasa, el código del comité de enzimas es 3.1.3.1, hidroliza esteres de fosfato, se hidroliza y forma el alcohol que dio forma a ese ester de fosfato. No se conoce su función metabólica se sabe que se localiza en ciertos tejidos con mayor implicancia, tejido óseo mayormente, tejido hepático, variaciones en sus niveles medidos en sangre van a indicar patología a esos tejidos que se encuentran grandemente expresados. Es una enzima en donde muchas de las células están en la membrana plasmática, los tejidos más importante donde se encuentra es el tejido óseo y el tejido hepático, sin embargo, también se ha descrito con cierta importancia a nivel de pulmón. También es un indicador de algunas neoplasias.
Determinación experimental La determinación de fosfatasa alcalina, se utiliza para ello un sustrato artificial, sintetizado en laboratorio, el cual es incoloro en presencia de agua y de la fosfatasa alcalina, hidroliza el enlace ester fosfato, se forma p-nitrofelato que es amarillo y se puede determinar espectrofotométricamente en alrededor de 210nm. Como la enzima es fosfatasa alcalina, quiere decir que su actividad ocurre a pH alcalino. También hay una fosfatasa acida que está en otro tejidos, pero es distinta.
La fosfatasa alcalina presenta varias isoenzimas Probablemente en bioquímica general había homología entre isoenzima e isoformas, como sinónimos, en este caso para la FAL, y para otras enzima no es lo mismo isoformas que isoenzimas. En el caso de la FAL se habla de isoenzima ya que ellas son codificadas por diferentes genes, se habla de 4 genes para FAL: 1. Tejido 1. Tejido inespecífica (isoformas: ósea, hepática y renal) 2. Intestinal 2. Intestinal 3. Placenta 3. Placenta 4. Células 4. Células germinales (isoformas: testis, timo y pulmón HMW). Clase de Enzimas II
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Dentro de cada una de estas isoenzimas descrita, que corresponden a 4 genes, existen isoformas, por ejemplo, para el gen denominado tejido inespecífico, existen 3 isoformas distintas, una expresada en tejido óseo, otra en tejido hepático, y otra renal. El mismo concepto para el gen de isoenzimas germinales.
¿Por qué un gen puede presentar 3 productos proteicos distintos (isoformas)? Desde que estamos de ADN a proteína pueden haber cosas que ocurren que generan productos distintos, el primer paso es de ADN a ARN, aquí ocurre transcripción y se forma un RNA inmaduro que sufre división llamada splicing alternativo, tenemos los exones y los intrones que se arreglan y por lo tanto tendrán mensajeros distintos que van a dar proteínas distintas, no muy distintas pero son diferentes al fin y al cabo. En este caso son FAL pero no son las 3 iguales, la que expresa el tejido óseo no es exactamente igual a la hepática, catalizan la misma reacción pero tienen diferencias estructurales y de actividad o maduración. La otra posibilidad es lo que se produce después que el RNA mensajero se traduce a proteína, la diferencia de las proteínas puede ser por la glicosilación, que les confiere características distintas a las proteínas, una misma proteína glicosilada de manera distinta puede tener otra función relativamente distinta, mejor dicho, propiedades. Esta son dos razones para que el mismo gen codifique dos proteínas distintas. Las más importantes son: la FAL ósea y la hepática. Se pueden distinguir por su termoestabilidad, siendo la ósea más termolábil, es decir, la más sensible a la temperatura. -
Ósea: Propia del tejido óseo en crecimiento y de enfermedades o procesos que cursan
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con neoformación ósea, como por ejemplo, fracturas o fisuras. Es una glicoproteína tetramérica que se encuentra en la superficie de los osteoclastos. Hepática: Propia de las células del árbol biliar; se eleva en las colestasis (obstrucciones biliares) asociada a partículas de elevado peso molecular. Problema hepáticos particularmente asociados a la estructura biliar, provocaran aumento de esta FAL.
OTRAS FOSFATASAS ALCALINAS: FAL de pulmón (HMW): Es de alto peso molecular. Ha sido descrita como marcador de patologías asociadas al pulmon. Localizada en la membrana plasmática y cuerpos lamelares (laminares) de células de epitelio alveolar tipo II, su concentración en fluido pulmonar ha sido vinculada a daño a nivel de este órgano, particularmente en pacientes con patologías bronco pulmonares de diferente etiología, usándose para ello muestras de suero o lavados provenientes de fluidos broncoalveolares (BALF). Se mide en sangre o secreciones la presencia o aumento de los niveles de esta enzima. ISOFORMAS DE FAL de ORIGEN NEOPLÁSICO -
Regan: En 3-15% de los tumores, principalmente metástasis osteoblásticas y hepáticas, es termoestable (60ºC, 35 min). Nagao: En cáncer pleural y de páncreas.
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Kasahara: Fosfatasa alcalina fetal intestinal (retro-expresión), se presenta en hepatomas y en menor proporción en otras neoplasias.
También, puede ocurrir producción ectópica de FAL en cánceres de pulmón, mama, páncreas y colon. La isoenzima placentaria se eleva especialmente en los carcinomas ováricos o testiculares, y en fumadores, en los que es 10 veces mayor. Se determina por inmunoensayo. En los hombres después de cierta edad empieza a aumentar la incidencia de cáncer prostático, existen varios tipos de ensayos, uno de los más nuevos y confiables es medir en sangre cierta proteína cuyos niveles están asociados a problemas a nivel de la próstata, entonces se mide este antígeno prostático, cuyos niveles aumentados son indicativos de problemas a la próstata. Estos marcadores tumorales se buscan porque de alguna manera la presencia de los niveles aumentados de ellos dan cuenta que un tejido está expresando esta proteína, y en algunos casos son tan específicos ya que en las personas adultas no deberían estar presentes y por eso es un buen marcador, si está presente a nivel de un tejido o una muestra, quiere decir que está ocurriendo una patología. ¿Como es posible que una proteína que no debería estar presente, si lo esté? Esto se debe a que la mayoría de estos marcadores son proteínas que sufren retroexpresión, es decir, son proteínas que normalmente se expresan a nivel embrionario, y después del nacimiento dejan de expresarse y son reemplazadas por otras proteínas de nivel adulto. Por lo tanto si un adulto está expresando una proteína que solo debería ser expresada a nivel embrionario, algunas de sus células están haciendo cosas que no deben y está particularmente asociado a neoplasia. También puede ocurrir excreción o producción ectópica de esta FAL, quiere decir que las neoplasias expresan cosas en tal desorden que en cualquier neoplasia puede estar expresando FAL que no corresponden, es típico que muchas neoplasias expresan FAL. Las FAL pueden ser medidas por actividad, los métodos de análisis son espectrofotométricos de punto final o cinético, pero también puede ser determinada por su migración electroforética a partir de una muestra, suero o plasma, y una posterior transferencia a una membrana intracelulosa o de nylon, y un uso de anticuerpo para detectarla específicamente a ella, técnica llamada Western blot o inmuno blot. Aquí se muestra un Western Blot donde se cargaron en cada carril de electroforesis en condiciones denaturantes estractos de distintos tejidos, se junto hígado con intestino, hígado, huesos, intestino, y se ve que en hígado hay FAL que migran a un nivel, que son las FAL del hígado de migración Clase de Enzimas II
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 rápida, esta misma muestra se mezclo con intestino y se vio que además de estas había una migración que corresponde a la FAl intestinal, cuando se mezcló además con muestras de hueso se vio que también aparecían otras FAL que correspondían a las de hueso. Es decir, se pueden identificar las FAL a través de Western Blot ya que tienen distinta migración, y por su migración se puede saber cuál es, o simplemente usando anticuerpos monoclonales que permiten distinguir entra cada una de ellas.
Intervalos normales de expresión de FAL de acuerdo a la edad: Como es una enzima presente en tejido óseo, su expresión a nivel de sangre va a variar de acuerdo a la edad del individuo, en el crecimiento se mantiene alrededor de 500 UI/L, en la pubertad aumenta en tanto hombres como mujeres, y después de la pubertad disminuye en los adultos hasta valores que son cercanos a 100 UI/L. es una enzima que varia con la edad. El intervalo normal es entre 44 a 147 UI/L. Los factores que afectan estos valores de referencia son 4 (revisar en clase anterior). Patologías que cursan un aumento de fosfatasa alcalina: •Embarazo (último trimestre) •Fractura de hueso en recuperación •Enfermedades hepáticas •Obstrucción biliar •Hepatitis •Enfermedad ósea •Enfermedad de Paget (ósea): trastorno que involucra destrucción y regeneración anormal del
hueso, lo cual causa deformidad. •Cáncer óseo osteoblástico •Osteomalacia: defecto en la mineralización de la matriz orgánica del esqueleto •Raquitismo •Enfermedades del esqueleto •Anemia •Leucemia •Infección de la glándula tiroides •Hiperparatiroidismo •Consumo crónico de alcohol
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TRANSAMINASAS Son enzimas que catalizan la interconversión reversible de aminoácidos y cetoácidos. Se tiene un aminoácido y un cetoácido y se intercambian el grupo amino, por eso se llama transaminasa, el amino pasa al cetoacido, y esto se convierte en grupo ceto, en este caso el glutamato en presencia de cetoácido, se convierte en alfa-cetoglutarato y el resto se convierte en aminoácido. Transaminasas existen para todos los aminoácidos, excepto para treonina y lisina. Los compuestos más comúnmente asociados a las reacciones de transaminación como par donante/aceptor son el glutamato y el alfa-cetoglutarato, participan en muchas reacciones de conversión de distintos aminoácidos. De importancia química existen dos transaminasas, la aspartato aminotransferasa (AST, GOT) y alanina aminotransferasa (ALT, GPT). Las transaminasas utilizan piridoxal 5´-fosfato (P5´P) como coenzima, es adquirido durante la dieta como vitamina B6. Normalmente el suero contiene cantidades adecuadas por lo que no es necesario coenzima adicional, salvo en pacientes con una deficiencia de vitamina B6 o en aquellos que sufren diálisis renal, los que producirán falsamente valores séricos disminuidos de aminotransferasas. A menos que P5´P sea agregado como un reactivo en la determinación. Cuando uno mide la actividad de esta enzima en la sangre, uno la puede encontrar disminuida no porque esté en bajas cantidad, sino porque la coenzima no está, cuando uno la determina se agrega cantidad suficiente a propósito de la coenzima. ASPARTATO AMINOTRANSFERASA
Cataliza la interconversión de aspartato a oxalacetato, es decir, un aspartato produce glutamato, o viceversa. Esta enzima está presente en tejido hepático y en tejido cardiaco, por lo tanto si en sangre se mide aumento de la AST, uno debiera estar pensando en patologías hepáticas y miocardias, cualquiera de las dos cosas. Cuando se hacen diagnósticos a través de enzimas, no se mide solo una enzima sino que se mide una batería para poder precisar el diagnostico. Determinación de AST La AST viene del tubo, este tubo va a tener aspartato, cetoglutarato, pero también va a tener otra enzima llamada malato dehidrogenasa (MD).
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Entonces la enzima que viene en la muestra va a convertir el aspartato y cetoglutarato a glutamato y oxalacetato, este oxalacetato en presencia de la otra enzima MD que también está en el tubo y en presencia de NADH, se va a convertir en malato y va a haber interconversión entre NADH y NAD+. Se absorbe a 240 nm, por lo tanto lo que se mide es diminución de absorbancia.
ALANINA AMINOTRANSFERASA: A diferencia de la anterior solo está mayoritariamente presente en tejido hepático, por lo tanto aumento en sangre de sus niveles indican patologías a nivel hepáticos. Si hay aumento de AST y ALT hay patologías hepáticas, si solo tengo aumento de la AST hay patologías miocárdicas. Determinación de ALT La enzima viene de la muestra de sangre o suero, el tubo va a tener los reactivos, por lo tanto en presencia de la enzima la alanina se convierte en piruvato, el cetoglutarato a glutamato. El piruvato en presencia de Lactato Deshidrogenasa (LDH) y de NADH hidrogenado se convierte en lactato y NAD+ y se mide a 240 nm. Acoplado a algo que se puede medir que es interconversión entre NAD+ y NADH hidrogenado. La elevación de las transaminasas puede corresponder a una variación de la normalidad o ser la primera evidencia de una enfermedad grave. Existen rangos de valores que pueden orientar sobre la etiología. El problema de las transaminasa es que el intervalo normal y de algunas patologías se sobrepone, son muy parecidos para ambas enzimas. Esto lleva a la dificultad de precisar a qué tipo de patología corresponde, se puede saber el órgano. En cirrosis 30 aun es un valor normal, en hepatitis crónica 50 aun entra en cirrosis. Nivel normal se superpone con cirrosis, cirrosis se superpone bastante con hepatitis. Por eso que hay otra batería de enzimas que permite precisar el diagnostico.
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Causas frecuentes de elevación: Medicamentos como el paracetamol que es hepatotoxico produciría aumento de ambas transaminasas, Hemocromatosis es una enfermedad hereditaria que afecta al metabolismo del hierro, provocando un acumulo excesivo e incorrecto de este metal en los órganos y sistemas del organismo. La razón o cociente de Ritis (AST/ALT) Herramienta que permite afinar los valores, se divide el valor determinado de AST con el valor de ALT y se grafica contra una de ellas, particularmente es AST. Dependiendo de donde caiga el punto se puede suponer la patología. Cuando ambas enzimas aumentan de manera pareja tiene una razón alrededor de 1, cuando aumenta bastante AST y no ALT, se puede pensar en patologías asociadas al musculo esqueléticos. Este análisis permite tener una suposición de cuál puede ser la patología asociada a los aumentos de niveles de transaminasas.
Gama -GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA (GGT) o gama-GLUTAMIL TRANSFERASA Transfiere o cataliza la transferencia de gama glutamico entre un aceptor y un donador. El gamaglutamico la enzima lo obtiene a partir del glutatión, que es un tripeptido el cual contiene gamaglutamico, cisteinglicina (cys-gly) y la enzima le saca el gamaglutamico al glutatión y se lo transfiere a otro aminoácido, por lo tanto se forma gamaglutamil y el aminoácido en particular. Esto tiene una función metabólica que tiene que ver con el estrés oxidativo y cofactores de varias enzimas. Los niveles de esta enzima están asociados a patologías hepáticas, se dice que es una enzima inducible, que dependiendo de algunos factores externos aumenta sus niveles en la sangre, por ejemplo, aumenta con xenobiótico, alcohol y fármacos. Los valores de referencia son en mujeres 8-40 U/L y en hombres 9 a 50 U/L.
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Es muy sensible, en la obstrucción de las vías biliares, por lo tanto es un buen marcador de patologías biliares. Es la enzima más sensible a los problemas hepáticos producidos por el alcohol, es la primera en elevarse y es la más sensible a los daños producidos por él. Suele asociarse a la elevación de la fosfatasa alcalina, excepto en problemas óseos en los que sólo aumenta la fosfatasa alcalina, si tengo aumento de la FAL y tengo aumento de las enzimas hepáticas, se confirma que es patología hepática, porque solo con FAL queda la duda si es hepático u óseo. Determinación experimental
Existen dos formas de hacerlo, sustratos sintéticos artificiales que en presencia de glicilglicina y la presencia de la enzima a pH 8 en ambos casos, convierte el sustrato en nitroanilina el cual sería alrededor de 405 nm. El segundo sustrato es el de elección debido a su alta solubilidad y baja tasa de hidrólisis espontánea. Sin embargo, el primer sustrato es el más utilizado debido a su menor costo. 5’ NUCLEOTIDASA
También es una fosfatasa, pero es más específica que la fosfatasa alcalina. Solo hidroliza esteres 5’ fosfato como por ejemplo, AMP, el cual en presencia de esta enzima lo convierte en adenosin di fosfato (ADP)
Uno podría determinar fosfato con técnicas que son antiguas pero eso es muy engorroso; existen técnicas más modernas. El problema de la determinación de esta actividad es que esta reacción también la cataliza la fosfatasa alcalina, ya que esta, actúa sobre cualquier Èster mono fosfato; entonces lo que se hace es que se mide en dos tubos la reacción con la muestra. En unos de los tubos se agregan sales de níquel que inhiben selectivamente a la 5’ nucleotidasa, por lo tanto, tengo la actividad total y la actividad con níquel, la diferencia entre actividades de estos tubos, es la actividad real de la 5’ nucleotidasa. Se encuentra ampliamente distribuida en los tejidos, sin embargo, incrementos en su actividad reflejan trastornos hepato biliares (igual que la gama glutaril transferasa), especialmente, obstrucción hepato biliar, lo que se conoce como Colestasis, esto es cuando se produce una obstrucción por la existencia de cálculos en el árbol biliar. Clase de Enzimas II
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Intervalos de referencia hasta 15 U/l. Esta enzima no es inducible (como la anterior). No responde a mecanismos de inducción. Permite diferenciar cuando hay un aumento de fosfatasa alcalina si se trata de una patología ósea o hepática.
LACTATO DESHIDROGENASA Cataliza la interconversiòn reversible de lactato a piruvato, con interconversiòn de NAD a NADH, por lo tanto, para la determinación de esta enzima no hay que hacer ensayos acoplados ya que ella misma interconvierte NAD a NADH. Esta es una de las enzimas que les comentaba este concepto de isoenzimas y de isoformas. En este caso, para el lactato deshidrogenasa, existen dos genes. Un gen M y un gen H, cada uno de ellos produce un RNAm y una proteína distinta; pero como esta enzima es un tetrámero, existe la posibilidad de que se formen todas las opciones posibles. Un tetrámero de cuatro subunidades M o, en el otro extremo, un tetrámero de cuatro subunidades H, además de las posibles formas intermedias. Cada uno de estos distintos tetrámeros presentan distinta distribución en los tejidos, por lo tanto si hay un aumento de este tetrámero medido en sangre, podemos suponer que tejidos están involucrados en tejidos que sobre expresan mas esta, esa o al revés. Se encuentra especialmente en corazón, hígado, musculo y cerebro. Por lo que al existir un aumento de lactato deshidrogenasa deberíamos pensar en alguna patología que afecte a uno de estos órganos, mediante la pesquisa de alguna de las isoenzimas que se expresen. La subunidad H predomina en tejidos aeróbicos, como el musculo cardiaco (de ahí proviene la H, del ingles Heart), mientras que la M predomina mas en tejidos anaeróbicos como el musculo esquelético (de ahí proviene la M = músculo).
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 En una electroforesis se separan muestras de distintos orígenes: corazón, musculo, cerebro, hígado, retina uno puede apreciar que hay distintas separaciones de las distintas isoformas. En la imagen podemos ver la M4 o también conocida como lactato deshidrogenasa 5 y en el otro extremo tenemos la H4 o lactato deshidrogenasa 1. Entonces, en órganos como el corazón, las isoformas mas expresadas son las que se acercan más a la H4. Caso extremo, por ejemplo al contrario el hígado expresa particularmente, solo la M4 y no las otras isoformas. Es decir, a partir de este patrón electroforético podemos tener una idea de donde se encuentra la patología o usar anticuerpos monoclonales específicos para cada una de ellas, para saber cuál se está sobre expresando y así tener una idea de donde está el problema. En esta grafica, que es un Western Blot, en donde se cargo en el carril 1 suero humano normal, carril 2-5 extracto de riñón, corazón, musculo e hígado. Entonces por los polos, negativo y positivo, podemos observar que las que migran hacia más arriba serian las que tienen más subunidades H que correspondería a corazón; musculo e hígado poseen más subunidades M. Esta enzima se considera un marcador histórico para patologías cardiacas, cuando individuos llegan a urgencias, lo primero que se hacía era medir lactato deshidrogenasa. Entonces, ¿Cómo serian los niveles de LD? Acá tenemos H4, M4 y las distintas isoformas; ingreso, cuando ocurrió el infarto. A las 12 horas comienzan a aumentar los niveles de aquellas isoformas que son ricas en subunidades H (H4, H3M); a las 24 horas, el aumento es mucho más pronunciado, y a las dos semanas todos estos niveles vuelven a la normalidad. Por lo tanto, es un buen marcador cardiaco, muchas veces para los médicos no es tan evidente la situación de un infarto, tienen que estar seguros para poder aplicar los fármacos correspondientes. El problema de esta enzima, es que recién a las 12 horas del infarto comienza a tener respuesta y, para una persona infartada eso no es bueno, Posteriormente vamos a ver que existen otros marcadores cardiacos que aparecen más tempranamente. Clase de Enzimas II
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MARCADORES CARDIACOS ESPECIFICOS. Entre los marcadores cardiacos uno podría hacer una clasificación, puesto que existen enzimas cardiacas propiamente tales: Creatina quinasa, Aspartato amino transferasa (aumenta en problemas cardiacos y hepáticos), lactato deshidrogenasa. También existen proteínas estructurales, que forman parte de la organización muscular, es decir, de la contracción, por ejemplo las troponinas, de las cuales existe una isoforma T y otra isoforma I, y también, se encuentra la Mioglobina que une oxigeno que está presente en los músculos, la cual, también sirve como marcador cardiaco. Por último, tenemos la albumina modificada por isquemia.
CREATINA QUINASA. Cataliza la interconversiòn entre creatina y creatina fosfato, con gasto de ATP. Es una enzima que cataliza la formación de enlaces ricos en energía, ya que se producen a través del ATP, estas moléculas se conocen como fosfatos. Se pueden hacer diferentes determinaciones, se puede determinar la actividad total de creatina quinasa; se puede determinar las isoenzimas de creatina quinasa utilizando anticuerpos específicos, incluso con anticuerpos más específicos aun se pueden determinar isoformas dentro de las isoenzimas de creatina quinasa. Obviamente, las isoformas y las isoenzimas son de importancia para patologías cardiacas. Esta enzima, en términos generales, aparece a las 4 u 8 horas, con un peak de 12 a 18 horas. Es decir, a las 4 horas de sucedido un infarto, podemos medir un aumento de creatina quinasa, por lo que es un marcador bastante más temprano que la lactato deshidrogenasa. Además su aumento permanece por 3 a 4 días.
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Es un dímero de dos subunidades posible M y B. entonces el dímero MM se encuentra en musculo esquelético; el dímero MB se encuentra en musculo cardiaco, por lo tanto es este el que es interesante para las patologías cardiacas (marcador primario para esta patología); y el dímero BB que se encuentra mayoritariamente en cerebro. Estas distintas isoenzimas, se pueden diferenciar electroforéticamente ya que tienen distintas migraciones, incluso haciendo un western Blot porque existen anticuerpos que las distinguen entre ellas. Otra técnica es el Dot Blot, en donde no se hace una separación electroforética, solamente se pone una gota para ver si está presente o no un antígeno para pegarse con el anticuerpo. En la separación electroforética tenemos que la isoenzima MM migra más hacia el polo positivo, y la isoenzima MB es mas intermedia, por la que también las podemos determinar por sus tipos de migraciones o utilizando anticuerpos específicos para cada una de ellas. Acá ya se ve uno de los problemas asociados a la CK-MB, porque también está presente en musculo esquelético. Por lo tanto un aumento de sus niveles se puede sospechar de problemas cardiacos pero también, existe el ruido de que puede ser por un problema a nivel del musculo. Es decir, un individuo que jugó un partido de futbol y además sufre un ataque de ansiedad, llega a urgencias y le miden los niveles de creatina quinasa 2 y estarán aumentados, pero por el trauma muscular y como llego con ataque de ansiedad, los síntomas son muy similares a los de un ataque cardiaco, por lo que para determinar realmente se necesitan otros marcadores más específicos aun.
Importancia clínica:
Marcador precoz para indicar lesiones en músculo cardíaco y esquelético. Detección en suero/plasma: La concentración de CK se eleva 4-8 h después del inicio del dolor precordial (igual que CK-MB). Alcanza el pico máximo dentro de 12-14 h. Retorna a valor normal en 3-4 días. Especificidad reducida debido a la existencia de otras causas de elevación plasmática (insuficiencia renal, daño muscular).
CK-MB es más específica del miocardio (10-20% de la actividad de CK-Total, siendo solamente 2% de origen muscular esquelética). Determinaciones seriadas aumentan la sensibilidad en el diagnóstico de IAM.
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OTRAS CAUSAS DE ELEVACIÓN DE CK-MB (Debido a que está presente en tejido muscular cardíaco y esquelético) -Ejercicio físico exagerado (ej: maratones pueden elevar CK-MB durante una semana) -Politraumatismos o cirugía mayor -Distrofias musculares (Ej. Distrofia de Duchenne) -Polimiositis
Métodos para determinar CK-MB Puede ser: 1. Por actividad enzimática, técnica cada vez menos utilizada. Supongamos que se toma la muestra en una “Clínica Rural” donde no se determina la actividad sino que se envía la muestra, por ejemplo, a Valdivia; entonces como lo que se está determinando es una actividad enzimática, si la muestra no fue resguardada con cuidado va a disminuir su actividad porque la enzima se va a desnaturar, por lo que cuando llegue el momento de determinar la enzima estará en niveles normales y no será reflejo de la patología. 2. Por lo anterior, ahora se utilizan técnicas inmunológicas, porque el anticuerpo para unirse a la enzima no importa si ésta esta activa o no, ya que se unirá a la cantidad total, es decir, a la masa de enzima que es específica para el anticuerpo. Esta técnica se conoce como CKMB masa, mide todo: activo y no activo. Por lo que esta técnica es la de elección para la determinación de CK-MB. Como son di anticuerpos, se puede reducir el tiempo de determinación, incluso hasta 1 o 2 horas. Es decir, a un paciente que sufrió un infarto agudo al miocardio luego de 1 o 2 horas podemos determinar si esta elevada la CK-MB Una herramienta para sacarles más provecho a estas determinaciones es lo que se conoce como porcentaje IR o Índice Relativo CK-MB masa. Se determina con anticuerpos los niveles de CK-MB masa pero, además se determina la actividad total de creatina
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 quinasa, medido enzimáticamente.
Luego se hace la razón, se multiplica por 100. Un aumento importante en esta razón, predice un problema a nivel cardiaco, es decir, cuando aumenta mucho en función de la actividad total, es decir que se está concentrando la MB-masa en función de todas las CK, o sea que el %IR estará sobre 3 o 6 %, sobre este último valor se asegura que hay un infarto agudo al miocardio. Menos del 6% puede corresponder a problemas del musculo esquelético (no es seguro). ¿Para qué más sirve ésta enzima? primero lo que hay que hacer es identificar que está ocurriendo una patología cardíaca y para eso están estos marcadores, pero, luego viene la terapia y es bueno saber si ésta está funcionando o no. En general, estas terapias se producen como terapias tromboembolíticas porque lo que se hace es administrar fármacos que disuelven el trombo o coágulo que está taponando alguna de las arterias coronarias que provocó el infarto. Un fármaco antitrombolítico, que en realidad no se usa para eso pero tiene propiedades anticoagulantes es la aspirina, hay otros que son específicos y son los que se usan. El problema es, que el médico necesita saber si el fármaco que se esté utilizando está funcionando o no, entonces una de las formas para saber si el fármaco aplicado está funcionando es medir en forma seriada ésta enzima, es decir, se ingresa al paciente, se seleccionó el fármaco, se le administró al antitrombolítico y desde ese momento se fue midiendo los niveles de enzima CK – MB (de esta isoenzima de creatina quinasa) en forma seriada y seguida en el tiempo. En condiciones normales no importa los niveles, uno debería tener (en relación al gráfico) una distribución más o menos achatada, es decir, hay un aumento que se empieza a ver en unas 3 o 4 horas, se llega a un máximo alrededor de las 24 horas (entre las 12 y las 24) y luego empieza a decaer. El valor de los niveles va a depender de la intensidad del daño, y estos valores no importan, lo que importa es la forma en la gráfica, una forma achatada es infarto al miocardio.
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Cuando se administra un anticoagulante en una terapia antitrombolítica se observa que después de administrado el fármaco empiezan a haber aumentos muy precoces, muy pronunciados, y después caídas pronunciadas que es distinto a lo que ocurre normalmente sin terapia, por lo tanto cuando hay aumentos pronunciados y disminución pronunciada se supone que la terapia trombolítica está funcionando. ¿Por qué existen estas diferencias? Porque un individuo que no se le ha administrado terapia
antitrombolítica tiene una forma achatada, los niveles de la enzima en sangre en un individuo que si se le administró tiene un aumento pronunciado y una disminución pronunciada. Lo que hace el anticoagulante es remover el coagulo y por lo tanto nuevamente llega a circulación al tejido dañado y como nuevamente ocurre esto el aumento de todas esas cosas que hubieron en el tejido dañado se refleja en sangre, todo aquello que estaba de las células muertas pasa a la sangre, aumenta y como ahora el tejido se está lavando porque hay circulación y reperfusión disminuye. Entonces, aumenta porque llega a la circulación y disminuye cuando se “lava”.
SUBFORMAS de CK-MB EN EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE IAM También con anticuerpos bastante más específicos es posible diferenciar entre dos subformas de la CK – MB; la que está a nivel tisular se denomina CK MB2 la cual una vez que llega a los tejidos es hidrolizada por una proteasa presente en la sangre y se convierte en una forma más pequeña, la cual por anticuerpos se puede diferenciar de la otra subforma. La que está en la sangre una vez que fue hidrolizada por esta proteasa inespecífica se denomina CK - MB1 la cual se caracteriza por ser un poco más pequeña pues tiene un trozo menos, por lo tanto, si se tiene un anticuerpo dirigido a ese trozo en particular se podrán diferenciar. Cuando se hace la razón CK – MB2 / CK – MB1 (tejido/sangre) la razón siempre es menor que 1 porque apenas llega la creatina quinasa a la sangre es hidrolizada, por lo tanto, siempre habrá una mayor cantidad de MB1 que de MB2. Sin embargo, cuando hay un infarto empieza a llegar tanta cantidad de la tisular que el sistema hidrolítico no alcanza a hidrolizar todo de golpe logrando que empiece a aumentar la MB2 en relación a la MB1, por lo tanto, la razón se hace mayor que 1. Entonces, estadísticamente se sabe que cuando la razón es mayor a 1,7 es sospecha de IAM. Es una buena forma de sacar más provecho de ésta enzima.
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TROPONINAS Proteínas globulares que están presente en el sistema de contracción muscular. Existen tres tipos de troponinas (T, I, C) y hasta el momento la troponina T y la troponina I tienen importancia como marcadores cardíacos, presentan distinta masa molecular y por lo tanto al tener distinto tamaño pueden ser diferenciables por electroforesis.
Aquí se puede ver en una electroforesis un marcador molecular, una muestra en donde la proteína que migro hasta los 29.000 Dalton correspondiente a la Troponina I, una que migró alrededor de 19.700 Dalton correspondiente a la Troponina C y otra que migró alrededor de los 40.000 Dalton que es la Troponina T. De esta manera se pueden diferenciar.
¿Cómo se comportan? La Troponina T aumenta a las 4 – 6 horas y la Troponina I también, ambas tienen un peak de 24 horas, y el retorno a la normalidad para la T es de 10 a 15 días mientras que para la I es de 5 días La Troponina T dura más, por lo tanto, esta entrega una ventana más larga de tiempo donde se podrá observar cómo va variando la Troponina, como debería ir disminuyendo, ha habido reperfusión. Y si hay un aumento de nuevo se podría monitorear reinfarto en una ventana muy grande de tiempo.
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Comparación CK – MB versus cTnT Si uno mide CK-MB donde el resultado puede ser negativo o positivo mientras que en el caso de la cTnT valores menores a 0.03 ng/mL reflejan una sensibilidad normal, si el valor es entre 0.03 – 0.09 ng/mL habría compatibilidad con la angina (taponamientos no totales de las arterias) por lo tanto se manifiestan en el paciente sólo con molestias y valores más elevados sobre 0.1 ng/mL se asocian especificamente a un infarto al miocardio. Estas Troponinas también están presentes en las células musculares, pero, se utilizan anticuerpos específicos para las isoformas cardíacas y por eso que presentan la c adelante (cTnT).
La Troponina T permite monitorear reperfusión, en la gráfica se muestra como varía de acuerdo a los niveles en el tiempo la Creatina total (CK total) que se dijo que tenía que ser como máximo 12 a 24 horas, la Troponina T sin tratamiento posee una curva relativamente achatada como en el caso de la CK – MB. Por otra parte, si resulta la terapia trombolítica; nuevamente aumento pronunciado y caída pronunciada, es decir, terapia trombolítica exitosa. *En reperfusión exitosa se observa una disminución dramática a las 36 – 48 horas.
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MIOGLOBINA Esta es una proteína que se encuentra en el músculo esquelético y el músculo cardíaco, (sirviendo como reservorio de oxígeno) sin embargo, elevados niveles de ésta en sangre están asociados a daño en las células musculares, por lo tanto, significan o daño en el músculo esqueléticos o daño en el músculo cardíaco y esto ya es un problema porque no es específico para sólo el tejido cardíaco.
Se caracteriza por ser un marcador temprano que aparece alrededor de los 90 minutos post infarto miocárdico.
Permite monitorear reperfusión y lo importante es que es un marcador predictivo negativo y eso es para soslayar este problema, es decir, si se sospecha de un Infarto Agudo al Miocardio y la Mioglobina no está elevada, no es infarto. (Ese es el valor predictivo negativo).
¿Por qué aumenta tan rápido? Porque es una proteína de bajo peso molecular por lo que tiene difusión más rápida al torrente sanguíneo y eso se debe a que las proteínas pequeñas como ésta su portal de entrada a la circulación es vía capilar. Las proteínas más grandes lo hacen a través de vía linfática y por lo tanto eso hace que uno mida niveles a tiempos más largos.
La Mioglobina aparece en la sangre periférica 90 a 120 minutos después de la aparición del dolor y alcanza niveles patológicos 3 a 6 horas antes de CK – MB.
Se alcanzan niveles máximos de Mioglobina de 6 a 9 horas mientras que los de las enzimas cardíacas sólo se alcanzan después de 12 a 19 horas.
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Retorna a normalidad dentro de 24 horas: un paciente que llegó después de las 24 horas infartado ya no se le saca nada medir mioglobina porque ya no sirve.
Desventajas:
Se normaliza en 24 horas, por lo tanto, es un test negativo en determinaciones posteriores. Presente en los tejidos musculares cardíaco y esquelético.
Se pueden observar los valores normales en suero tanto para los hombres como para la mujer y lo que ocurre en la orina. Hay diferencia por la edad, sexo y raza
ALBÚMINA MODIFICADA POR ISQUEMIA (IMA) El estrés oxidativo produce especies reactivas del oxígeno dentro de los que se encuentran los radicales libres, los cuales dañan a todas las macromoléculas (proteínas, ácidos nucléicos, lípidos, hidratos de carbono). Cuando una persona sufre un infarto (cardíaco, cerebral) sufre pérdida de irrigación sanguínea, por lo tanto, las células que están sometidas a una cierta irrigación sanguínea dejan de recibir nutrientes y oxígeno por lo que entran a un estrés oxidativo. Posteriormente hay reperfusión, ya sea por fármacos o de forma natural, llega oxígeno de golpe y eso aumenta inclusive mucho más el estrés oxidativo.
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ENZIMAS II 6 de noviembre de 2012 Entonces cuando ocurren estos infartos ocurre eso en los tejidos y entre las muchas macromoléculas que se ven afectadas por los radicales libres que oxidan y modifican las macromoléculas está la albúmina (principal proteína de la sangre) por lo tanto, con anticuerpos específicos se puede medir albúmina que han sido modificadas por los radicales, denominándose albúmina modificada por isquemia y se puede medir minutos después de que se produzca la isquemia, es decir, es un marcador muy rápido pues se puede medir a los minutos de producido el infarto. Los niveles de IMA suben rápidamente hasta las 3 horas y vuelven a la normalidad alrededor de las 6 horas, es decir, después de las 6 horas ya no se puede usar la medición de IMA porque ya se normalizó.
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