PRACTICA #9
FOSFATASA FOSFATASA ALCALINA ALCALIN A (PARTE (PARTE I)
DAYANA PAOLA PARODY PEREZ DINA LUZ GUEVARA CANOLE KESMY ISABEL LIDUEÑA PEREZ
PRESENTA PRESEN TADO DO A: RAMON LOZADA DEVIA
UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGIA SINCELEJO-SUCRE 0!MAYO!"0$
OBJETIVOS
•
Obtener una curva de calibración del para-nitrofenol (PNP). Que representa las variaciones de absorbancia de una solución que contenga esta susutancia a diferentes valores de concentración, esto es absorbancia vs [PNP]
MARCO TEORICO as reacciones qu!"icas en los siste"as biológicos sólo ocurren en presencia de catali#adores, que son prote!nas espec!ficas deno"inadas en#i"as. a presencia de una en#i"a se detecta por las reacciones espec!ficas que catali#a. $oda reacción en#i"%tica puede esque"ati#arse co"o sigue&
's!, la en#i"a se co"bina con un sustrato () que se transfor"a en un producto (P). l tie"po que tarda una deter"inada cantidad de en transfor"arse en P es lo que caracteri#a a la en#i"a, * se deno"ina velocidad o actividad en#i"%tica (v) que se define co"o cantidad de sustrato transfor"ado o de producto for"ado en la unidad de tie"po. a cat%lisis en#i"%tica es de gran i"portancia en los seres vivos, pues acelera reacciones qeue en su ausencia tardar!an "uc+o en ocurrir. a "a*or!a de las en#i"as son de origen proteico. as fosfatasas on prote!nas de "e"brana cu*a estructura es la de una glicoprote!na. a parte gluc!dica est% for"ada por cadenas de oligosac%ridos que llevan general"ente en el etre"o "%s aleado de la prote!na %cido si%lico a fosfatasa alcalina es una en#i"a +idrolasa responsable de eli"inar los grupos de fosfato de varios tipos de "olculas co"o nucleótidos, prote!nas * alcaloides. l proceso de eli"inar el grupo se deno"ina desfosforilacion. /o"o sugiere su no"bre, las fosfatasas alcalinas son "%s efectivas en un entorno alcalino.
a fosfatasa alcalina (Ortofosfórico "onoster fosfo+idrolasa, (/ 0.1.0.1) es una en#i"a a"plia"ente distribuida que +idroli#a el enlace ster fosfórico entre un grupo fosfato * un radical org%nico a p2 b%sico (p2 ópti"o entre 3 * 14) liberando fosfato inorg%nico. st% presente en ri5ón, +!gado, intestino * +ueso. p-nitrofenilfosfato ( pNPP ) es un sustrato cro"ognico para la fosfatasa %cida * alcalina en ensa*os espectrofoto"tricos convencionales.
stas en#i"as catali#an la +idrólisis de pNPP a a"arillo para- nitrofenol . ste producto
absorbe
fuerte"ente
a
647
n"
*
se
puede
"edir
con
un
espectrofotó"etro de lu# visible .
sta en#i"a +idroli#a el
p-nitrofenilfosfato
para for"ar el cro"ógeno a"arillo p-
nitrofenol de acuerdo a la siguiente reacción&
I%&' & reacción en#i"%tica a actividad de una en#i"a se deter"ina conociendo la velocidad de la reacción que catali#a. a velocidad de reacción se define co"o la cantidad de sustrato consu"ido o de producto for"ado por unidad de tie"po. a deter"inación de la actividad de la fosfatasa se reali#a "idiendo la cantidad de p-nitrofenol liberado por acción del en#i"a contenido en las clulas durante un per!odo de tie"po deter"inado. a reacción se detiene a5adiendo carbonato sódico (Na8/O0) que provoca un ca"bio brusco de p2 alcalini#ando el "edio. a actividad de la en#i"a se puede estudiar gracias a que el producto de la reacción (p-nitrofenol) en solución alcalina posee un color a"arillo caracter!stico que posee su "%i"o de absorbancia a 644 n" ("ientras que el sustrato de la reacción, pnitrofenil-fosfato, no absorbe a esta longitud de onda).
PORCEDIMIENTO*
Tubo
Dilución de
PNP
Na2HP
Bufer
PNP (con Bufer de glicina ) -----1:2 1:4 1:8 1:1!
Blanco 1 2 3 4
diluid o (ml) ---3 3 3 3 3
O4 (ml)
de Glicina
1 1 1 1 1 1
3 -----------
$abla 1& /antidades necesarias para la preparación de las distintas "uestras
DATOS*
Tubo
"b#orbancia#
1 2 3 4
4$28! 3$823 3$%&' 3$43& 1$&'
$abla 8& 'bsorbancias obtenidas con distintas concentraciones de PNP
RESULTADOS
1. /oncentración de PNP para cada tubo& $ubo 1&
$ubo 8&
[ PNP ]
=
−
5
3∗10 M
C 1∗V 1 =C 2∗V 2
C 2=
C 1∗V 1 V 2
−
C 2=
•
5
3∗10 M ∗3 ml 6 ml
−
5
1,5∗10 M
$ubo 0& −
C 2=
•
=
5
1,5∗10 M ∗3 ml 6 ml
=
−
5
0,75 ∗10 M
$ubo 6& −
5
0,75 ∗10 M ∗3 ml 5 C 2= M =0,375 ∗10 6 ml −
•
$ubo 7& −
C 2=
5
0,375 ∗10 M ∗3 ml 5 M =0,1875 ∗10 6 ml −
8. 'bsorbancia 9s [PNP]
PNP 3*10
"b#orbancia 4$28!
-5
1,5*10
-5
0,75*10
-5
3$823 3$%&'
-
3$43&
0,1875*1
1$&'
0,375*10 5
0
-5
"b#orbancia # PNP 4* +(,) 438%*'%, . 3*'8 /0 '*&
4 3* 3 2*
"b#orbancia*
inear ()
2 1* 1 '* ' '
'
'
'
'
'
'
'
PNP :r%fica 1& /urva est%ndar de la ;osfatasa alcalina.
CUESTIONARIO * +D,./& 1 234/56 4 7/38 1 ,67/38 &4 6&4 3.7 4& 8,&7&,& &4&4/& a fosfatasa alcalina (Ortofosfórico "onoster fosfo+idrolasa, (/ 0.1.0.1) es una en#i"a a"plia"ente distribuida que +idroli#a (0) el enlace ster (1) fosfórico entre un grupo fosfato * un radical org%nico a p2 b%sico (p2
ópti"o entre 3 * 14) liberando fosfato inorg%nico. Por lo tanto es de tipo +idrolasa * de subtipo fosfatasa.
"* +;6< 6/= 6%34 4& N&">PO 4& %?4& @ 4& .&/= a función que cu"ple la Na 82PO6 es que detiene la reacción porque el eceso de p-nitrofenol in+ibe la actividad en#i"%tica pero la presencia del fosfato i"pide esta in+ibición. Otra función que cu"ple es q al "o"ento de interaccionar con las prote!nas estas dis"inu*en la perdida de agua.
L8, 8,&78, , %34& 8%8 &@/7/8, &4/%7&./8, * +;6< ,/'//&@8 7/ 4 56 4& .&/= , 44 & &8 8 6 6. 3>0* Porque a este p2 la fosfatasa +idroli#a el enlace ester fosf%tico entre el grupo fosfato * un radical org%nico * libera fosfato inorg%nico
* +P8. 56< 4& &,8.&/& %2/%& @4 PNP , %/@ & 0 % a absorbancia se "ide a 614 n" porque a velocidad de incre"ento de absorbancia debido a la producción de p-nitrofenol (pNP) es directa"ente proporcional a la actividad de fosfatasa alcalina en la "uestra.
$* E234/56 +38. 56< 4 /8 Z" &7& 8%8 6 &7/&@8. @ 4& 8,&7&,& &4&4/&
