CAPITULO
3 3.1
MÉTODOS BIOLÓGICOS EN LA EVALUACIÓN NUTRICIONAL DE ALIMENTOS Vícto Ví cto r A. Higinio Rubio 1
EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE LA CALIDAD NUTRITIVA DE ALIMENTOS.
La composición química de un alimento puede ser sólo el contenido teórico o bruto de energía y nutrientes del mismo, más no su disponibilidad biológica para el humano, por lo que es necesario contar con un ajuste biológico respectivo. Actualmente existen muchas revisiones sobre evaluaciones biológicas aplicables a la evaluación nutritiva de un alimento, generando posibilidades y limitaciones desde diferentes puntos de vista. La evaluación de la calidad de las proteínas constituye un factor esencial para determinar su valor nutricional y comercial. come rcial. Las proteínas no son iguales, ellos varían de acuerdo a su origen (animal, vegetal), su composición de aminoácidos (contenido de aminoácidos esenciales), su digestibilidad, textura, etc. Una buena calidad de proteína es cuando éstos son fácilmente disponibles y contiene aminoácidos esenciales en cantidades que correspondan a los requerimientos humanos.
1
Ingeniero de Alim ento s. Profesor Asociado Asociado de la Facultad Facultad de Ingeniería Ingeniería Pesquera Pesquera y de Alim ent os de la Universidad Nacional del Callao.
Estudios clínicos con humanos que miden crecimiento y otros indicadores metabólicos proveen la valoración más exacta de calidad de proteína. Por razones éticas y de costos tales técnicas no pueden ser utilizadas. Consecuentemente se han utilizado las técnicas de los ensayos diseñados para medir eficacia de una proteína utilizando animales de experimentación. Los principios de un ensayo biológico en general son aplicados a casi todas las especies animales, pero se trabaja principalmente con roedores por la facilidad de manejo de sus bajos costos de mantenimiento. 3.2
MÉTODOS BIOLÓGICOS DE EVALUACIÓN 2
Para el desarrollo de estos métodos es imprescindible que los animales presenten condiciones homogéneas. El animal más utilizado es la reta albina, preferiblemente macho, recién destetado con un peso inicial de 64-68 g. Las cepas más utilizadas son Wistar, Sprague Dawley y Long Evans. Los animales deben de estar en jaulas individuales, anticoprofágica, que permiten cuantificar el alimento ingerido y colectar las heces y la orina. La habitación debe de tener una temperatura de 22-24°C y una humedad relativa de 50-65%. Las dietas utilizadas deben de contener todos los nutrientes en las cantidades que cubran el requerimiento. Por lo general se utilizan tres tipos de dieta control positivo cuya fuente proteica es caseína suplementada con metionina, dieta libre con nitrógeno o con 4% de proteína de huevo extraída con éter y liofilizada y dieta cuya dieta proteica es la que se desea evaluar.
2
Universidad Agraria La M olina. “Evaluación Nutr icional de Alim ent os para Hum anos”, 1995.
3.3
LIMITACIONES DE LOS PROCEDIMIENTOS BIOLÓGICOS
La evaluación de la proteína de un alimento va desde procedimientos simples a más complejos. La evaluación empieza con el análisis de nitrógeno y termina con pruebas biológicas. Los animales de ensayo han sido ampliamente usados para evaluar la calidad de la proteína, y los resultados obtenidos son considerados como que ofrecen toda la información requerida. Sin embargo, existen limitaciones en la cantidad y tipo de información requerida, y es como sigue: a) Los resultados obtenidos dependen de los aminoácidos limitantes, disponibilidad, balance y de la presencia y ausencia de otros materiales inherentes y no provee información acerca de la cantidad de otros aminoácidos esenciales y no esenciales. Por ejemplo: Si dañamos la proteína de la leche destruyendo o reduciendo la disponibilidad de lisina, pero como éste no es aminoácido limitante de leche, tal daño no se revelará en las pruebas con ratas hasta que este sea lo suficientemente severo para hacer de lisina limitante. Sin embargo, cuando la leche es consumida en combinación con un cereal frecuentemente puede haber daño de importancia. b) Un simple índice es obtenido y aplicado a variedad de funciones de la proteína. La proteína dietaria es usado para diferentes propósitos, algunos de los cuales son mantenimiento de tejidos o la formación de nuevos tejidos y pueden requerir diferentes proporciones de aminoácidos. Una proteína que es de alta calidad para un propósito puede no ser para otro, sin embargo, la evidencia para esto todavía no es definitiva. La necesidad de aminoácidos por unidad de proteína requerida son más altas para infantes que
para adultos, sin embargo, no hay evidencia que el patrón de aminoácidos esenciales difieren entre infantes y adultos. c) El ensayo experimental de laboratorio es llevado bajo condiciones controladas y estandarizadas que varían de situaciones no experimentales. Esto ha establecido que la utilización de una proteína varía con la cantidad de proteína y previa historia dietaria. d) Los resultados obtenidos con ratas son extrapoladas a humanos y ambas especies tienen necesidades de aminoácidos esenciales diferentes. La extrapolación no es necesariamente válida. e) Los diferentes tipos de ensayos pueden tener diferentes valores absolutos. Sin embargo ya se han encontrado órdenes de rankings similares para las diferentes proteínas cuando se usaron los diferentes ensayos propuestos. f) Hay evidencia en estudios con ratas que el exceso de un aminoácido puede afectar la utilización de la proteína. Por lo tanto, puede haber diferencia entre los valores hallados en un laboratorio y en la práctica usual de alimentación en humanos. Por lo tanto, la selección del método biológico dependerá de la precisión y reproducibilidad requerida, como también de la simplicidad y sus costos.
3.4
MÉTODOS DE EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE PROTEINAS
Se han desarrollado muchos métodos para estimar el valor nutritivo de la proteína de los alimentos, pero básicamente podemos agruparlos en: (1) Métodos basados en el crecimiento y (2) Métodos basados en el balance de nitrógeno. 3.4.1 Métodos Basados en el Crecimiento 3.4.1.1 Relación de eficiencia proteica (PER) Obsorne y Mendel (1919)3 establecieron el concepto razón de eficiencia proteica al darle una base cuantitiva al crecimiento de las ratas como una medida del valor nutritivo de la proteína dietética. Esta relación está definida como la ganancia en peso por proteína consumida. Originalmente la relación era determinada a distintos niveles de ingestión de nitrógeno, calculándose entonces la PER máxima de manera que se determinaba la ingestión óptima de nitrógeno para el máximo de ganancia en peso. Actualmente es más frecuente fijar un 10% de proteína en la dieta: aunque generalmente la ganancia en peso de la rata se correlaciona bastante bien con la ganancia en proteína corporal, esta relación no siempre es buena. Además, el índice no puede utilizarse con proteína de baja calidad. Se ha recomendado la utilización de la REP relativa. Es el método más simple y el más frecuentemente utilizado tanto en animales de laboratorio (ratas) como en humanos (niños). Sólo requiere la medición del peso ganado y la proteína consumida, bajo condiciones estandarizadas.
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Peso ganado (g) PER = -----------------------------Proteína ingerida (g)
La prueba tiene duración de 4 semanas y los resultados varían de cero (proteínas que no permiten el crecimiento) y 4,4 como máximo. Los valores obtenidos varían con el nivel de proteína de la dieta y por convención internacional la prueba se realiza a una concentraron proteica en la dieta del 10%. Ventajas
Método sencillo y práctico.
Prueba fácil de replicarse.
Permite aplicar los cálculos estadísticos.
Hay amplia difusión en evaluación de alimentos.
Limitaciones
Supone que la ganancia de peso se debe exclusivamente al aporte proteico del alimento, aunque hay dietas que pueden provocar retención de agua y/o grasa.
El resultado depende de la cantidad de alimento ingerido, por lo tanto estaría relacionado a la “palatabilidad”.
Las proteínas que no permiten crecimiento, pero sin embargo son de algún valor, no pueden estimarse inclusive pueden dar valores de cero a negativo.
3.4.1.2 Relación de proteína neta (NPR) La relación entre el peso corporal y la ingestión de nitrógeno no puede extenderse hasta la región de peso cuando la ingestión de nitrógeno es cero. Bender y Doell (1957) diseñaron este índice que elimina la crítica fundamental que se le ha hecho al PER y es que este último no tiene en cuenta el mantenimiento y asume que la ingestión de
nitrógeno está solo disponible para el crecimiento. Esta relación es la suma de la pérdida de peso de un control negativo con la variación de peso de un grupo que está ingiriendo la dieta experimental, contra el nitrógeno ingerido. La mayoría de las limitaciones del PER se pueden superar si es que en el ensayo anterior se introduce un grupo del todo comparable que se alimente con una dieta proteica. Este método a diferencia del PER incluye una tolerancia para el mantenimiento, lo cual se consigue agregando la pérdida de peso de un grupo de ratas alimentadas con una dieta libre de proteínas, a la ganancia de peso del grupo problema.
Ganancia de peso (g) Grupo problema NPR
+
Perdida de peso (g) Grupo proteico
= Proteína ingerida (g) del grupo problema
3.4.2 Métodos Basados en el Balance de Nitrógeno 3.4.2.1
Utilización proteica neta (NPU)
Uno de los métodos más frecuentemente usados es la determinación de la utilización proteica neta. Cuantitativamente el NPU está representado por una fórmula simple:
NPU
N ingerido – (N fecal – N urinario) = ---------------------------------------------- x Digestibilidad N ingerido – N fecal
El NPU representa la proporción del nitrógeno del alimento ingerido que es retenido. El nitrógeno retenido puede ser medido por estudios de balance de nitrógeno (humanos) o por análisis directos del cuerpo del animal. Este último es el más común y de manera práctica se plantea la diferencia entre el nitrógeno corporal de ratas alimentadas con la dieta en ensayo, menos el nitrógeno corporal de ratas alimentadas con una dieta aproteica en el mismo tiempo de ensayo, es decir: Nx – Nk NPU = --------------- x 100 Ni
Donde: Nx = N corporal de ratas alimentadas con proteína evaluada. Nk = N corporal de ratas alimentadas con dieta aproteica. Ni = N consumido por grupo evaluado. A manera de ilustración se presenta en el Cuadro 1 la valoración nutritiva de la calidad biológica de proteínas de algunos alimentos comunes. Cuadro 1. CALIDAD BIOLOGICA DE PROTEINAS DE ALGUNOS ALIMENTOS COMUNES PER
NPU
VB
D
%
%
%
%
Huevo
3,92
93,5
93,7
97,0
Leche de vaca
3,10
81,6
84,5
96,9
Pescado cocido
3,55
76,0
79,5
85,0
Trigo integral
1,53
40,3
64,7
90,9
Arroz pulido
2,18
57,2
64,0
97,9
ALIMENTO
Maíz
1,12
51,0
59,4
90,3
Frijol
1,48
38,4
58,0
72,8
Fuente: Cárdenas, H. 1995. Limitaciones
Algunas proteínas dietarias carentes de uno o más aminoácidos esenciales muestran mediciones adecuadas de NPU en ratas.
Estas mediciones son costosas para estimarlas en experimentos con humanos, por lo cual la mayoría se determina en ratas cuyas necesidades de aminoácidos son diferentes al del ser humano. Esto conlleva a subestimar la calidad de algunas proteínas para el humano.
Es difícil lograr una buena homogenización de los animales de experimentación.
3.4.2.2
Digestibilidad (D)
Mide la desaparición del nitrógeno en su paso a través del tracto gastrointestinal debido a su absorción. Una prueba de digestibilidad implica cuantificar el nitrógeno consumido y las cantidades y las condiciones que se eliminan en las heces.
N ingerido - N fecal D = ------------------------------ x 100 N ingerido
Pero los valores de digestibilidad se clasifican como “aparentes” cuando no se hacen mediciones y correcciones del nitrógeno que no proviene de la dieta sino de la
descamación del tubo digestivo, de los jugos y secreciones y la flora intestinal que constituyen una pérdida inevitable del nitrógeno. Por lo tanto, es necesario estimar esa pérdida, para ello se someten a los animales a una dieta aproteica y se valora la excepción del nitrógeno fecal endógeno y se utiliza para corregir el nitrógeno fecal, por lo que la digestibilidad verdadera será:
N ingerido – (N fecal – N fecal endógeno) Dv = --------------------------------------------------------- x 100 N ingerido
Factores que influyen en la digestibilidad
La interacción de la fisiología digestiva de la especie y la composición química del alimento. Así mismo la digestión de este nutriente puede estar influenciado por la naturaleza que presentan los otros nutrientes de la dieta.
La composición química del vegetal y particularmente el estado de madurez, ya que, a medida que la planta madura se vuelve menos digestible.
La velocidad de pasaje del alimento a través del tubo digestivo que por falta de tiempo la digestión se puede encontrar limitada o por el contrario un tránsito lento produce fermentación excesiva que implica desperdicio de nutrientes.
Naturaleza física del alimento.
Medida de la digestibilidad 4 En principio, la medida de la digestibilidad es simple: un alimento se convierte, en el intestino delgado, en nutrientes que atraviesan la membrana intestinal, con la excepción 4
Adri án, J. 2000.
de un pequeño porcentaje. Como la medida directa de la fracción absorbida resulta difícil, habitualmente la digestibilidad se establece de manera indirecta determinando la cantidad no absorbida presente en la excreta fecal. Por lo tanto, se valora una eliminación de origen alimentario, es decir, ajena al funcionamiento intimo del organismo y dependiente de la naturaleza de la alimentación. Por esta razón, la excreta se califica como exógena. De hecho, la excreta fecal tiene un origen y una composición mucho más compleja. La mayor parte está formada por agregados que empiezan a desarrollarse en el intestino delgado alcanzando su pleno crecimiento en el intestino grueso. Estas partículas están constituidas, esencialmente, por proteínas microbianas y vitaminas B. Otros componentes presentes en la excreta intestinal proceden del funcionamiento hepático. En el hígado se lleva a cabo la eliminación de numerosos elementos minerales como el fósforo, el calcio, el magnesio, el hierro, etc. Por lo tanto, no toda la excreta fecal puede equipararse a la fracción no digestible de la alimentación, una parte importante es una excreta de naturaleza endógena, ligada a los mecanismos vitales del organismo. Con relación a la excreta de origen alimentario, la endógena se puede considerar, en una primera aproximación, como constante. La situación se complica todavía más por el hecho de que una fracción apreciable de la fracción no digestible alimentaria es utilizada por la flora intestinal como medio nutritivo para su desarrollo. Principalmente, se utilizan muchos carbohidratos cuyos componentes elementales no son absorbibles por la pared intestinal, pero que son ampliamente digeridos por la flora y no aparecen en la excreta fecal (lactosa, galactósidos). En este caso, la medida de la digestibilidad peca por exceso. Los balances de digestibilidad se realizan con lotes de animales, de 6 a 10 sujetos, alojados en recintos especialmente adaptados para permitir la recogida cuantitativa tanto de las heces como de la orina. El período de balance tiene una duración mínima de cinco días, durante los cuales se recogen diariamente las excretas fecales individuales. Al
finalizar el período se reúnen las de cada animal, se homogenizan y se analiza fisicoquímicamente el nutriente investigado. Las fórmulas de la digestibilidad aparente (Dap) y de la digestibilidad verdadera (Dv) son las siguientes: ingesta - fecal Dap = ------------------------ x 100 ingesta
Ingesta - (fecal total – fecal endógeno) Dv = ------------------------------------------------------------ x 100 Ingesta
3.4.2.3
Valor biológico (VB)
El valor biológico es una medida más específica del valor nutritivo, puesto que determina el porcentaje de proteína absorbida que es retenido o que permanece en el organismo. De esta forma se determina la utilidad de la proteína tanto para el crecimiento como para el mantenimiento corporal. El valor biológico varía desde cero (proteínas que no pueden utilizarse para la síntesis tisular) a 100 para las que, como las proteínas del huevo son totalmente utilizables. Su expresión es como sigue:
N ingerido – (N fecal + N urinaria) VB = ------------------------------------------------- x 100 N ingerido – N fecal
Para ajustar el dato al valor biológico verdadero debe introducirse las correcciones por el N metabólico fecal y el N urinario endógeno, los cuales se determinan en otro grupo de animales alimentados con dietas libres de nitrógeno. El valor biológico de una proteína dietética fue definido por Thomas (1909)5. Se expresa como la fracción de nitrógeno absorbida que es retenida en el cuerpo, para el crecimiento y mantenimiento. Se realiza por tanto la determinación de nitrógeno eliminado por heces fecales y orina, corrigiéndose los valores mediante la determinación de estos en animales que ingieren una dieta libre de nitrógeno.
3.5
CONCLUSIONES SOBRE LA RELEVANCIA DE LOS ENSAYOS CON ANIMALES EN LA NUTRICION HUMANA
La relevancia de los datos obtenidos con ensayos de animales puede ser considerado desde dos puntos de vista: El primero, relacionado a la metodología, los ensayos en humanos estandarizados están sujetos a las mismas limitaciones y proveen el mismo tipo de información que los ensayos con animales estandarizados. El segundo punto se refiere a la aplicabilidad de los valores obtenidos en ensayos con animales para la estimación de la utilización de la proteína en las dietas consumidas por humanos. Los valores obtenidos de ensayos con animales no son necesariamente índices definitivos cuantitativamente de la utilización de la proteína en humanos. La aplicación de los ensayos en animales para la nutrición de proteínas en humanos son tal vez más del tipo cualitativo que cuantitativo. La ausencia de relación entre los valores obtenidos de animales y humanos se debe al hecho que los estudios en humanos no han alcanzado la estandarización lograda en animales. Asimismo, las diferencias de 5
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requerimientos de aminoácidos esenciales por las ratas puede explicar en parte la ausencia de estos acuerdos. Finalmente la aplicabilidad de los resultados de ensayos con animales es limitado por los factores dietarios por el hecho que los animales consumen dietas de composición constante y “ad libitum”, mientras el hombre consume dietas que varían en cantidad en composición y en períodos de tiempo. Por todas estas razones la significancia para la nutrición humana a partir de datos obtenidos en animales debe ser interpretada con cuidado.
FIGURA 2: DISEÑO EXPERIMENTAL DE LAS EVALUACIONES BIOLÓGICAS 6 Ratas macho Sprague Dawley 21 +/- 1 días de edad (recién destetadas) (08-10 ratas) / (Grupo Dietario) CONDICIONES AMBIENTALES - 23 +/- 1°C - H.R. 55-65% - Circulación de Aire - Luz artificial 12h/día DIETAS
INVESTIGACION 10% de proteína
CONTROL 1 10% Prote. Caseína
CONTROL 2 Libre de Nitrógeno
PERIODO DE ADAPTACION 3 días (50% Dieta Crianza/50% Mezcla de Dietas) DURACION ENSAYOS PER = 4 sem. NPR, DA, DV = 2 sem . INICIO DE PERIODO EXPERIMENTAL - 5 horas de ayuno - Aleatorización por Grupos Dietarios - Peso inicial de alimento y animales - Distribución de jaulas individuales PERIODO EXPERIMENTAL
CONTROL SEMANAL - Peso de alimentos - Peso de animales (previo ayuno) - proteína consumida
CONTROL 2DA. SEMANA - Distribución en jaulas metabólicas (8vo día) - Recolección y peso de heces (14vo día) - Nitrógeno en heces
CALCULOS (Hasta 2da. Semana)
CALCULOS (2da. semana)
NPR= Incremento de peso (g) + Pérdida de peso x g)grupo libre de nitrog proteína consumida (g)
I = Ingesta de Nitrógeno F = Nitrógeno fecal FK = Nitrógeno endógeno de Grupo libre de Nitrógeno
CALCULOS (Hasta 4ª. Semana)
DA = I - F x 100
PER = Incremento de Peso (g) proteína consumida (g)
I
PER CORREGIDO = PER x 2.5 PER CASEINA
DV = I - (F – FK) x 100 I
NPR = Razón Proteica Neta PER = Relación de Eficiencia Proteica
DA = Digestibilidad Aparente DV = Digestibilidad Verdadera
6
M INSA – CENAN 2000.
3.6
REFERENCIAS
ADRIÁN, J. et al 2000. “Análisis nutricional de alimentos”. Editorial Acribia S. A., Zaragoza –España. CARDENAS, H. 1995. Evaluación nutricional de alimentos para humanos. Programa de investigación y proyección social en alimentos. Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima – Perú. MINSA 2000. Pruebas biológicas para la evaluación nutricional. Departamento de Investigación en Fisiopatología Experimental – Centro Nacional de Alimentación y Nutrición, Lima – Perú. UNALM, 1985. “Evaluación Nutricional de Alimentos para Humanos”, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima – Perú. http://www.scielo.cl/
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