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INFORME 1 BIOQUIMICA
Importancia de Las Propiedades
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“Efecto del pH sobre sobre la l a actividad actividad de la β -amilasa”
David Cabrera Laboratori o de Ingeniería de la s Enzimas, Facul tad de Cienci a e Ingeniería en Alimentos, Alimentos, Univers ida d Té de Ambato Resumen
En el presente ensayo se empleó dete rminar la influencia inf luencia que tiene el pH sobre empl eó β-amilasa, para determinar actividad enzimática de la β - amilasa de soya, condición que afecta en su gran mayoría a
estructura terciaria desestabilizando la enzima lo cual provoca que su velocidad enzimátic
disminuya de forma muy notoria; además mediante la exposición de la enzima a pH que s
encontraban dentro de un rango de 3 a 6,5 se logró determinar el pH óptimo al cual la enzim
puede trabajar trabajar sin ningún problema problema y con con una alta e ficiencia el mismo que resultó tener un val
de 5,313 5,313 resultado resul tado que se pudo determinar mediante la derivación derivación de la ecuación con la velocida vel ocida promedio de formación formación de maltosa que en este caso se utili zó como estándar estándar.. actividad, pH. Palabras Clave: β-amilasa, almidón, maltosa, actividad,
Introducción
Las enzimas enzi mas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones reacciones químicas, siempre si empre
sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que e
energéticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamen
En esta favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la up presencia la title enzima. Sign to vote onde this Useful sustratos, Not useful las cuales reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas
convierten convie rten en moléculas diferentes denominadas denominadas productos. Casi todos los proceso s en las cél
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quelantes pueden producir esta pérdida de función distorsionando la configuración apropiada d sitio activo (Espitia, 2009).
Las enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidaz
etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos puede
tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depend
en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuad
para la actividad catalítica. Este es el llamado pH óptimo . La mayoría de las enzimas son m
sensibles a los cambios de pH. Desvi aciones de pocas décimas por encima o por debajo del p
óptimo pueden afectar drásticamente su activi dad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo d
2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH puede
provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más
menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológico
(González, 2012).
El objetivo de este trabajo es determinar la influencia del PH en la
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-amilasa a divers
concentraciones y e stimar el PH óptimo.
Unlock full access with a free trial.
Materiales y Métodos:
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Reactivos
-
cido acético 0,05 M Acetato de sodio 0,05 M Ácido cítrico 0,05 M Fosfato dibásico de sodio 0,1 M
Materiales
up to vote title para medir - Sign Medidor deon pHthis o papel - Useful Pipetas de1 Not ml yuseful 5ml - Plancha de calentamiento con agi - Agitador magnético
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Método
Preparación del tampón acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml):
Preparar las soluciones de ácido acético y acetato de sodio 0,02M y mezclarlas hasta consegu que el pH de la mezcla sea de 4,5 (relación de mezcla aproximada de 1:1).
Soluciones tampón citrato-fosfato de pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0 (50 ml
Mezclar las soluciones de ácido cítrico (0,05 M) y fosfato dibásico de sodio (0,1 M) de modo que pH final de cada una de el las alcance los valores antes indicados.
Soluciones de almidón al 1% (20 ml) en cada uno de los tampones citrato-fosfato
Pesar la cantidad de almidón soluble correspondiente y suspender en 20 ml de tampón citr fosfato, calentar la suspensión bajo agitación y hervir durante 3 min. Enfriar y restituir el evaporada. Medir el valor de pH de cada sustrato (valor real que será usado para la gráfica y cálculo del pH óptimo).
You're Reading a Preview
full access with(10 a free Solución de enzima 1/40 enUnlock tampón acetato ml)trial.
Download With sucesivas Free Trial(1ª dil 1/10; 3,0 mL) y (2ª ¼; 10 m Preparar la dilución final de la enzima por diluciones
Determinación de la actividad inicial a 20 ℃
Sign up to voteyon this title con el valor d Colocar en una gradill a 36 tubos bacteriológi cos perfectamente lavados marcados
Useful
Not useful
pH, 3 tubos por cada valor de pH más un blanco. Añadir a cada tubo 0,4 ml de la solución
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Resultados
Presente una tabla que rec opile los valores de Absorbancia, conc entración de maltosa, velocidad de formación de maltosa, velocidad relativa en porcentaje y la desviación estándar a los distintos valores de Obtenga el perfil de pH (Gráfico de % veloc idad relativa vs pH) e incluya la ecuación de regresión que mej se ajuste al gráfico.
Generalm ente, la ecuac ión obtenida es de segundo orden. En este c aso, derive la expresión, iguale a cero y obtenga el valor máximo, este pH constituye el óptimo.
Gráfica #1: Estándar de maltosa
0.900 y = 0.3885x - 0.0071 R² = 0.9983
0.800 0.700 0.600 a i c n a b r o s b A
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Useful [maltosa] (mg/ml)
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Calcule las concentraciones de maltosa a partir de la curva estándar utilizando las lecturas d absorbancia correspondientes y determine con ellas las vel ocidades inciales de hidrólisis.
Con cada valor de velocidad cuantifique la actividad relativa divi diendo la ve locidad de formació
de maltosa a cada uno de los valores de pH para la velocidad máxima alcanzada y exprese e porcentaje. Determine e l valor medio y calcule la desvi ación estándar.
A relativa (%)
V pH Vmáx
*100
Elabore el gráfico de A rel ativa media vs pH (NOTA: incluya en el gráfico las barras de error determine el valor de pH óptimo por regresión a partir de la curva. Discusión
Reporte el valor de pH óptimo. Compare con valores reportados en bibliografía para esta enzima. RECUERDE utilizar bibliografía existente en la biblioteca de la FCIAL tanto física como virtual.
En el desarrollo de la práctica se determinó la influencia del pH sobre la actividad enzimática de
el pHReading óptimo para el cual dicha enzima actúe de maner β - amilasa de soya, estimando asíYou're a Preview eficie nte al emplear como sustrato al almidón. El efecto del pH en la actividad enzimática es Unlock full access with a free trial.
factor muy importante que debe ser tenido en cuenta puesto que la intensi dad máxima de
actividad de la enzima, ocurre en el pH óptimo, con rápida disminución de la actividad a cada lad Download With Free Trial de este valor de pH. La actividad óptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9.
El pH óptimo de una enzima puede guardar relación con cierta carga eléctrica de la superficie, con condicione s óptimas para la fijación de la enzima a su sustrato. Cuando hay un exceso de i Sign up to vote on this title hidrogeno, las enzimas los unen a sus moléculas y ante un déficit los ceden.
Useful
Not useful
Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la molécula. Como todas las proteínas, la
enzimas desempeñan su función por los residuos de aminoácidos; algunos confieren a s
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Además en el desarrollo de la práctica se descartó los trabajos experimentales a pH 4,5 y 5.5 y
que al graficar la actividad enzimática vs. pH estos dos valores mostraban picos con errores
simple vista ya que estaban lejos de la curva generada, además con lo realizado se logró bajar margen de error de la experimentación. La relación entre el pH y la actividad depende d
comportamiento ácido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro act pueden contener grupos funcionales ácidos y básicos, si endo su grado de disociación depe ndien
del pH, lo que determinará, entre otros aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad d unión del sustrato al centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformación del sustra Los estudios cinéticos a diferentes valores de pH nos proporcionan información sobre
mecanismo catalítico de los enzimas y la naturaleza de los aminoácidos más directamen implicados en la catálisi s (Vásquez, 2007).
Conclusiones
El pH afecta directamente a la actividad enzimática de la β - amilasa de soya ya que es factor influye sobre la estructura terciaria de la enzima lo cual se ve reflejado en
disminución de la velocidad enzimática, por lo cual se necesita encontrar e l pH óptimo cual esta e nzima trabaja de manera eficiente y para esto se l a sometió a pruebas dent
Reading a Preview de un rango de pH entre 3 yYou're 6,5. Para este análisis se preparó una solución con la enzima
el sustrato que en este caso fuefull el access almidón, la cual Unlock with aa free trial. se le sometió a los pH dentro rango antes mencionado hasta encontrar el pH óptimo el mismo que resultó ser de 5,3
es decir en este punto la Download enzima alcanza mayor With su Free Trialactividad catalítica por lo que s velocidad de reacción aumenta conforme l os valores se acercan a este pH, este valor
pudo determinar mediante la derivación de la ecuación con la velocidad promedio d formación de maltosa.
Se determinó de manera experimental la actividad divers -amilasa Signde uplato vote on this mediante title
Notverificar useful la diferenc Useful concentraciones de enzima, que de la misma manera sirvieron para
entre las velocidades de reacción, empleando como sustrato almidón sol uble, median
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a).- Señale que precaución se ha tomado en el trabajo experimental de determinación del pH óptimo para no mezclar el efecto de la estabilidad de la enzima a los diferentes valores de pH con la estimación de la influencia del pH en la velocidad de reacción. -Se debe emple ar un buffer a un pH indicado para diluir la enzima antes de realizar la esti mac de la actividad, puesto que se puede alterar la estabilidad enzimática.
-Se debe colocar con la mayor exactitud posible las cantidades de e nzima como de buffer pa obtener una medición de actividad lógica. -Se debe aplicar la variación de pH sobre el sustrato de la enzimas permitirá distinguir disminución de la actividad a determinado pH, evitando desestabilizar a la enzima
(Sánchez, 2008).
b).-Cite al menos un ejemplo de enzima que actúe sobre un sustrato que se ioniza. Mencione e nombre del sustrato. La Seretonina N-acetiltransferasa cataliza la conversión de la seretonina (SUSTRATO) en
acetilseretonina, generando un proceso deReading ionización al emplear al acetil -CoA como donador d You're a Preview los grupos acetilo (Fernández, 2009). Unlock full access with a free trial.
c).- ¿Cuántos residuos ionizables tiene una enzima cuyo gráfico de Velocidad relativa vs pH tien Download With Free Trial forma de campana?
Una enzima tiene 2 residuos ionizables para tener una variación en forma de campana, los mism que tienen la capacidad de ionizarse o protonarse dependiendo de las condiciones del medio en que se hallan (Sánchez, 2008).
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d).- ¿Cuáles son los residuos de aminoácido presentes en el sitio act ivo de la β-amilasa?
En el si tio activo de la β-amilasa exi sten dos residuos localizados en el centro activo del enzima, e
la mayor parte de l os casos aspártico o glutámico. Uno de ellos actúa como donador de un protó y el otro como nucleófi lo/base, para estabilizar la estructura. (Navarro, 2009)
e).- ¿Por qué se utilizó en este estudio tampón citrato-fosfato en lugar de tampón acetato de sodio para preparar los sustratos? Se utilizó tampón citrato fosfato porque el acetato de sodio tiene un rango de pH pequeño que
de 3,6 a 5,8; mientras que el tampón citrato fosfato tiene un rango de pH más amplio que va d 2,8 a 7,0, y nos permite trabajar en un rango acido- neutro, puesto que su pH óptimo de trabajo de 5,2, lo cual es el indicado para trabajar con la beta amilasa de soya (Batista, 2009).
BIBLIOGRAFÍA
Batista, A. 2009. “Producción de enzi ma amilasa microbiana mediante fermentación en sustra líquido”. Disponibleen:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/ hmidth02/parte08/09.html
Espitia, C. 2009. “Determinación de la concentración de alfa y beta amilasas comerciales en You're Reading a Preview producción de etanol a partir de almi dón de cebada”. Pontificia Universidad Javeriana. Colomb Unlock full access with a free trial.
Fernández, P. 2009. “Actividad Enzimática”. Disponible en: http://www.rincondelasciencias.com/actividad%20enzimatica.pdf Download With Free Trial González, J. 2012. “Regulación de la actividad enzimática”. Disponible en: http://www.ehu.es/bi omoleculas/enzimas/enz22.htm
Sign up to vote on this title Navarro, Diana. 2009 “Modificación funcional de la glucoamilasa de Sacharomyc Useful Not useful cerevisiae”30/Diciembre2009 Disponible en:
http://theindustrialenzymologist.blogspot.com/2009/12/modificacion-funcional-de-la.html
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