BỘ Y T Ế TRƯ Ờ N G ĐẠI HỌC
Dược
H À NỘ I
***********
LÊ THỊ NGA
TỔNG QUAN VỂ CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN cứu TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA THUỐC (KHÓA LUẬN
T Ố T N G H IỆ P DU Ọc S Ỹ K H Ó A 2 0 0 3 -2 0 0 8 )
Người hướng dãn : T S . Đ ào Thị Vui Nơi ihực hiện
: B ộ m ôn D ược lý
Trường đ ạ i h ọ c D ược H à N ội Thời gian thực hiện: 02Ỉ2008 - 05/2008
V í— I A V ^íL.
HÀ NỘI, THÁNG 5-2008
hòi cám 0R Bể cỏ kết' quả báo cáo như ngày hôm nay, tôi xin bày íỏ lòng biết ƠĨ1 sâu s ắ c tới T I. S ào Thi Vui - Rgườĩ thầy đã ỉận tình dìu dắt và hướng dản tôi hoàn thành Khóa luận này. Tôi xin chân íhành cảm ơn cá c thầy cô giáo trong Bộ mủn Bưục lý đã tạo mọi điều hiện và nhiệt tinh giúp đỡ lôi trong suốt thời gian học tập và làm Khóa luận.
Tôí xin chân thành cảm ơn tập thể Thư viện trường Đại T)ỌC Dược ĩịà Hội đã giúp dỡ tôĩ rất nhiều trong quá Irình làm hháa luận này. Tôi xỉn chân thành cảm ơn Ban flt*m hiệu trường Dụi ĩịọc Được Tịà Hội đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợt cho tồi hoàn thành tốt Khóa luận Và cuối cùng, tôi xỉn bày tô lòng biết ơn vô hạn tới gin đình, người Hìan Tà bạn bỀ là những người luôn cổ vũ, động viên, ỉà chồ dựa tinh thần cho lôi những lúc hhó hhăn trong học tập và cuộc sống.
Tịà Hội. ngày 2 1 /0 5 /2 0 0 8 Sinh viên: liê Thị ĩìga
MỤC LỤC Đ Ặ T VẤN Đ Ể ......................................................................................................................... 1 1. V IÊ M VÀ T H U Ố C C H Ố N G V I Ê M ........................................................................ 2 1.1. ĐẠT CƯƠNG V Ề V I Ê M .............................................................................................2 1.1.1. Khái n i ệ m .............................................................................................................. 2 1.1.2. Nguycn nhân gây v ic m .....................................................................................2 1.1.3. Phân l o ạ i .................................................................................................................2 1. ỉ .4. Diễn biến phản ứng viêin ................................................................................. 3 1.1.5. Các yếu tố tham gia vào phản ứng v ic m ....................................................5 1.2. T H U Ố C C H Ố N G V I Ê M ....................................................................................... 1 ] 1.2.1. Hóa dược chống v ic m ................................................................................... ỉ ỉ 1.2.2. Đông dược chống viêm ................................................................................ 14
2. MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN c ứ u TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM C Ủ A T H U Ố C ...................................................................................................................... 16 2 . 1 M ô hình gây viêm cấp và bán c ấ p ...................................................................... 16 2.1 .1 . M ô hình gảy phù hàn chân c h u ộ t .......................................................... 16 2. ỉ .2. M ô hình gây phù tai ch uộl........................................................................ 18 2. ] .3. M ô hình gây tăng tính thấm thành m ạ c h ................................................21 2.1 .4 . M ô hình gây viêm màng phổi................................................................... 23 2 . 1.5. Mô hình gây ban đ ỏ ...................................................................................... 2 4 2.1 .6 . Mô hình tạo túi u h ạ t .................................................................................... 25
2.2. Mô hình gây
viêm mạn t í n h ...............................................................................2 6
2.2 .1 . M ô hình gây u hạt thực nghiệm ............................................................... 2 6
2.2.2. M ô hình gây viêm đa khớp thực n g h iệ m ..............................................28 2.3. M ô hình nghiên cứu c ơ ch ế chống v i ê m ..........................................................3 0 2.3 .1 . Gây kết tập bạch cẩu đa n h ân ..................................................................... 3 0 2.3 .2 . Gây hóa ứng động đại thực b à o ................................................................. 30
2.3.3. Thí nghiệm về các chất chuyển hóa của acid a ra ch id o n ic........... 31 2 .3 .4 . Gây giải phóng các cytokin từ t ế bào bạch c ầ u .................................... 34 3 . B À N L U Ậ N ........................................................................................................................3 6 3.1. Bàn luận vé mô hình nghicn cứu tác dụng chống viêm của th u ố c ...... 3 6 3.1.1. M ô hình gây vicm cấp và bán c ấ p ............................................................36 3.1.2. Mô hình gây viêm mạn t í n h ....................................................................... 39 3.1 .3 . M ô hình nghiên cứu cư c h ế chống viêm ................................................4 0 3.2. Hướng lựa chọn mô hình nghiên cứu thuốc chống viêm ở Việt N a m . 42
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT.......................................................................... 45 4.1. Kết l u ậ n .......................................................................................................................... 4 5 4.2. Đề xuất.............................................................................................................................4 6 T À I L IỆ U TH A M KH ẢO PH U LƯ C
CHÚ THÍCH CÁC TỪ VIÊT TẮT
C O X -1
C y c lo o x y g c n a sc -1
C O X -2
C yclooxygenase-2
DM SO
Dimethyl Sulfoxid
FM LP
Form yl-L-m ethionyI-L-leucyl-Lphcnylam in
IL -]
Inícrlcukin-1
IL -6
Interleukin-6
IL -8
Inlerleukin-8
LOX
Lipooxygcnasc
LPS LTB4 N SA ID s
Lipopolysaccharid Lcucotrien B4 Non-Stcroidal Anti-Inriammalory Drugs Thuỏc chống viêm không steroid
PAF
Platclct Acĩivating Faclor- yếu lố hoại hóa tiểu cầu
PG
Prostaglandin
P G Ej
Prostaglandin E|
PCi E 2
Prostaglandin E 2
PGE3
Prostagiandin E,
P G I2
Prostacyclin
TNF
Tumor Nccrosis Factor- yếu tố hoại tử u
TXA2
Thromboxan A ,
Đ Ặ T VÂN Đ Ể Viêm là một hiộn tượng bệnh lý phổ hiến, theo thống ké có 1/3 bệnh nhân đến khám hay nhập viộn là có tình trạng viêm. Ngày nay, nhờ sự phát triển của y dược học, con người đã có những hiểu biết sâu hơn về cơ chế phân tử của phản ứng viêm. Từ đó giúp tìm ra các cơ chế tác dụng của thuốc chống viêm, đồng thời gợi ra những hướng mới trong nghiên cứu phát triển ihuốc chống viêm mới. Hiện nay có nhiều thuốc chống viêm được sử dụng như NSAIDs. glucocorticoid, enzym chống viêm, dược liệu chống viêm, trong đó NSAIDs và glucocorticoid là hai nhóm thuốc chống viêm kinh điển, có tác dụng tốt trên nhiều loại vicm và được sử dụng phổ biến. Nhưng các thuốc này cũng có nhiều lác dụng không mong muốn: gây viêm loét đường tiêu hóa, ảnh hưởng quá trình đông máu, tạo máu, xốp xương...gây nguy hiểm cho các bệnh nhân đạc biệt là với các bệnh nhân viôm mạn tính. Vì vậy, việc tìm kiếm, nghiên cứu các thuốc chống viêm mới có hiệu quả tốt. ít tác dụng không mong muốn là yêu cổu cấp thiết đôi với các nhà khoa học. Từ lúc phát hiện ra ti ém năng của một dược liệu cũng như hóa dược chống viêm đến lúc biến nó trở thành một chế phẩm thuốc hoàn chỉnh là cả một chặng đường dài, trong đó giai đoạn tiền lâm sàng-thử tác dụng dược lý là kháu rất quan trọng. Và để thực hiện việc đó thì không thể thiếu các mồ hình thực nghiệm phù hợp giúp chứng minh thuốc đó thực sự có tác dụng hay không? liều lượng trong khoảng nào? cơ chế tác dụng ra sao? Hiện nay tại Việt Nam các mô hình nghiên cứu tác (lụng chống viêm của thuốc còn ít và hạn chế cũng như chưa được thống kc một cách đầy đủ. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc" với mục tiêu: + Tổng quan về cấc mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc. + Đánh giá các mô hình nghiên cứu tác dụng chống vicm của thuốc. + Bước đầu lựa chọn một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống vi ôm của thuốc phù hợp với điều kiện thực tế Việt Nam.
1. VIÊM VÀ THUỐC CHỐNG VIÊM 1.1. ĐẠI CƯƠNG V Ể V IÊM 1.1.1. Khái niệm Theo từ điển Bách khoa Dược học: “Viêm là phản ứng lại chỗ của cơ thổ do các mô bị kích thích hoặc tổn thương. Đó là một phán ứng phức tạp cua các mô liên kết và của tuần hoàn mao mạch ở nơi hị tác động, được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn chức phận” [23]. Theo Vũ Triệu An: “Viêm là tập hợp các phản ứng tế bào. phân tử, mô và dịch thể mà cơ thể phát động để phản ứng với mọi khả nãng gày tổn thương đến tính toàn vẹn cùa nó hay đổ chế ngự. hạn chế, bâì hoạt, tiêu hủy nhân tô tấn công rồi dọn sạch mô đã bị tổn thương” [9]. 1.1.2. Nguyên nhân gây viêm [21] ★ Nguyên nhân ngoại sinh - Do vi sinh vật: vi khuẩn, virus, một số loại nấm, các vi sinh vật đơn bào, ký sinh trùng và côn trùng. - Do các chất hỏa học: do hóa chất (acid. bazơ..
đo thuốc...
-D o yêu tô vật lý: chấn thương, dị vật, nhiệt (hỏng nóng, hỏng lạnh), tia phóng xạ. bức xạ... ★ Nguyên nhân nội sinh - Sản phẩm chuyển hóa: như urê máu tăng gây viêm màng phổi, màng lim; aicd uric tăng gây viêm khớp trong bệnh Gút. - H oại tử kín gáy viêm vô trùng: như hoại tử chỏm xương đùi. - Phản ứng tự miễn-, như bệnh thấp khớp, viêm cầu thận. - Viêm xung quanh tổ chức ung thư ... 1.1.3. Phân loại - Theo nguyên nhản: viêm nhiễm trùng và viêm vô trùng. - Theo vị trí: viêm nông, viêm sâu hoặc viêm bên ngoài, viêm bên trong. - Theo dịch rì viém: viêm Ihanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mu...tùy theo dịch rỉ viêm giống huyết thanh, huyết tương hay chứa nhiều bạch cầu thoái hóa.
2
- Theo tiến triển của viêm gồm có: viêm cấp và viêm mạn. Viêm cấp có 4 triệu chứng điển hình là sưng, nóng, đỏ, đau và có đặc điểm là tăng mạnh số lượng hạch cầu đa nhân tại mô bị tổn thương. Viêm mạn có đặc điểm làtăng
số
lượng các đại thực bào. lympho bào, tương bào và bạch cầu ái toan. 1.1.4. Diẻn biến phản ứng vicm Quá trình điền biến của viêm có thể chia thành năm giai đoạn, các giai đoạn ít nhiều đan xen lẫn nhau hơn là xảy ra liên tiếp. / . 1.4.1. Giai đoạn cảm ứng Khi yếu tố gây viêm xâm nhập vào cơ thể tại một điểm nào đó thì những tế bào hảo vệ lại chỗ và hệ thống dịch thê tiếp xúc (đông máu, bổ thổ) sẽ gây mộl phản ứng tức
khắc. Những phản ứng ban đầu phóng ra các tín hiệu hóa học khuyếch tán tới
mọi tế bào có khả năng phản ứng lại nhằm khoanh vùng tổn thương lại.[9] / . 1.4.2. Giai đoạn phản ứng m ạch máu Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thương và phái triển ở mức độ khác nhau phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô. Đầu tiên là sự co mạch chớp nhoáng xuất hiện ở các tiểu động mạch do hưng phấn thần kinh co mạch. Sau đó ià hiện tượng giãn các mạch máu theo thứ tự từ các tiểu động mạch, mao mạch rồi đến tiểu tĩnh mạch. Sự giãn mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ gây nên các triệu chứng nóng và đỏ. Phản ứng tuần hoàn quá mạnh tlản tới các rối loạn nghiêm trọng như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chạm lại. gây tăng tính Ihấm thành mạch làm thoát dịch ri viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản. Do sự chcn ép của dịch rỉ viêm và do một số yếu tô mạch máu (liột thần kinh vận mạch, tế hào nội mạc sưng to, tăng độ nhớt của m áu...) gây ứ mấu làm mất tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu oxy, gây rối loạn chuyển hóa. làm tổn thương tổ chức và vicm phát tri ổn loàn diện (biếu hiện lâm sàng là phù và đau). [6. 15].
1.1.4.3. Giai đoạn phản ứng tê bào Phản ứng tế hào là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả nãng bảo vệ của cơ thổ chống vicm. trong đó bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất. Hoạt động của bạch cầu tại ổ viêm gồm hai hiện tượng xảy ra kế tiếp nhau:
3
★ Bạch cảu thoát mạch Bình thường bạch cầu chỉ dính với nội mô ớ mức thấp. Khi có viêm, dưới tác động của các chất trung gian hóa học (yếu tố hoại tử u (TNF), intcrlcukin-1 (IL-1), prostacyclin (P G I,)...) thì bạch cầu tăng khả năng bám dính với tế bào nội mô. Sau khi dính vào các tế bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề mặt nội mô, luồn những chân giả vào kẽ hở giữa các tế bào nội mô rồi xuyên qua vào khoảng gian bào ngoài mao mạch. Tiếp theo, bạch cầu di chuyển Irong mô kẽ về phía mô viêm do kích thích hóa ứng động. Các chất gây hóa ứng động bạch cầu là: các sản phẩm cua vi khuẩn (các peptid có các acid amin lận cùng là N-formyl-methionin); các sản phẩm của hệ Ihống bổ thể bị hoạt hóa (C3a, C5a); prostaglandin, leucotrien: các cytokin; fibrin và các sản phẩm phân hủy của fibrin— [5. 6. 15]. ★ Hiện tượng thực bào và thoát hạt Khi tới ổ viêm, bạch cầu nhận biết và dính với đôi tượng bị thực bào. Sau đó. bào tương của thực bào kéo dài ra tạo thành giả túc tiến đến bao quanh lấy đối tượng (nuốt), sập giả túc lại tạo thành hốc thực bào. Màng của hốc thực bào sát nhập với màng bào tưưng của hạt lysosom. rồi các thành phần của lysosom đổ vào hô thực bào để phần hủy đỏi tượng thực hào (bạch cầu mất hạt).[7].
1.1.4.4. Giai đoạn toàn thân Khi ổ viêm chiếm một thổ tích mô lớn thì nó phát tán các yếu tồ hoạt hóa đi xa qua tuần hoàn máu với số lượng đủ đê làm các trung tàm thần kinh chuyên biệt tham gia. Các trung tâm ấy gửi đi xung động thần kinh làm íhav đổi bộ máy ổn nhiệt của cơ thể và kích thích vùng liền yên là bộ phận điều hòa cơ chế đáp ứng đối với các tấn công. Kết quả là có các phản ứng toàn thân như: sốt. tăng hạch cầu. tăng tốc độ máu láng, rối loạn chuvển hóa (glucid. lipid, protcin)....[9J.
ỉ . 1.4.5. Giai đoạn thành sẹo hay chuyển sang mạn tính Sau một thời gian những hoạt động thoái hóa ngừng, thay vào đó là phản ứng tổng hợp. Khi ấy nguyên bào xơ giữ một vai trò chủ yếu. Chúng hình thành sợi collagen và những phân lử proteoglycan cần cho việc sửa chữa mô bị viêm. Khi viêm kco dài nhiều ngày thì viêm chuyển sang mạn tính, Irong đó quá trình phá hủy và hàn gán tổn thương mô xảy ra đổng thời. Viêm u hạt là một hình thái đặc hiệt của
4
viêm mạn tính, trong đó đại thực bào chiếm ưu thế và chuyển thành các tế bào dạng biểu mô (epitheloid cell)- là các tê bào không có khả năng thực bào nhưng có Ihổ bát giữ các mảnh nhỏ. Các đại thực bào cũng có thổ hợp lại thành các tế hào khổng lổ giúp chúng có khả nãng thực bào những đối tượng lớn. u hạt được bao bọc bởi vỏ bọc xơ gồm collagen, proteoglycan làm cho khối u hạt không đủ máu tưới, thuốc không thâm nhập được vào trong nèn viêm khó chữa và kéo dài.[5. 9] 1.1.5. Các yếu tô tham gia vào phản ứng viêm Viêm là một phản ứng phức tạp, có sự tham gia của nhiều yếu tố tế bào và Ihô dịch.
ỉ . 1.5.1. Các tê bào tham gia vào phan ứng viêm ★ Bạch cầu đa nhân trung tính Bạch cầu đa nhân trung tính chiếm khoảng 60-70% tổng số bạch cầu, có chức năng chính là tìm kiếm phá hủy vi khuẩn, là hàng rào bảo vệ đầu ticn của cơ thể với nhiễm trùng. Các bạch cầu này chứa nhiều hạt bên trong tế bào. Thành phần chính của các hạt này là các cnzym có khả năng ticu hóa các thành phần cấu trúc của vi khuẩn cũng như phân hủy mô của vật chủ.[7,21 ] ★ Bạch cảu ái kiém và dưỡng bào Là những tế bào quan trọng trong phản ứng viôm. Bạch cầu ái kiềm tuần hoàn trong máu và được huy động khi có dị ứng. Dưỡng bào cư trú và thuần thục tại mô. Các hạt ưa kiềm chứa các chất trung gian như histamin, serin protease, sulíatase, glycosidasc và carboxypeptidase A.[ 13] ★ Bạch cáu ái toan Bào tương chứa các hạt đạc hiệu ưa acid. trong chứa nhiều protcin có hoạt tính sinh học, đặc biệt là protein EBP (eosinophilic basic protein) rất độc với ký sinh trùng. Bạch cầu ái toan còn có tác động điều hòa và kiểm soát quá trình viêm.[5] ★ Bạch cầu đơn nhân và đại thực bào Bạch cầu đơn nhân lưu hành trong các mao mạch và có thổ thoát khỏi vòng tuần hoàn đi vào mô. Tại mô chúng được biệt hóa thành các đại thực bào. Bạch cầu đơn nhân và đại thực hào là những tế hào đầu tiên bị thu hút lới ổ viêm bởi nhiều chất hóa ứng động như sán phẩm thoái hóa của mô và màng vi khuẩn, các thành
5
phần bổ thế đã bị hoại hóa. phức hợp kháng nguyên-kháng thể, mảnh sợi collagcn. Tại vị trí viêm, đại thực bào sản xuất các chất trung gian hóa học gây viêm như [ L - l . IL-6, TNF-a, PG...làm khuyốch đại phản ứng ra xa.[9,13] ★ Lvmpho bào B, T và tê bào NK [7]
Lympho bào B: tham gia vào miền dịch dịch thổ. Khi kháng nguyên vào cơ thể sẽ gắn với tế bào B có kháng thd bổ mặt tương ứng rồi kích thích biệt hóa tế bào B thành tương bào có khả năng sản xuất kháng thể (IgE, IgG, IgA, IgD, IgM).
Lympho bào T. là tế bào chịu trách nhiệm đáp ứng miền dịch qua irung gian tế bào. Có 2 dòng tế bào T : - Một dòng chứa kháng nguyên CD4: sinh ra các lymphokin tiêu diộl thể lạ bẳng cách tuyển mộ. hoạt hóa các tế bào lympho khác, đổng thời kích thích tổng hợp globulin miễn dịch và kích thích phản ứng viêm quá mẫn chậm. - Một dòng chứa kháng nguyên CD8: nhận biết kháng nguyên, tấn cồng trực tiếp các tế bào có kháng nguyên lạ trên bề mặt (tế bào đích), điều hòa miỗn dịch, ức chế hoạt động của các lympho khác.
Té bào NK: là những lympho bào không biệt hóa thành lympho B hay ỉympho T và tham gia vào đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào do gây độc tế bào. ★ Tiểu cầu Tiểu cầu có thể tham gia vào mọi giai đoạn của quấ trình viêm. Chúng chứa nhiều cnzym và các thành phần hạt có hoạt tính viêm mạnh. ★ C ác thành phần của mó đệm Gồm các lố bào nội mô, nguyên hào xơ và các tế bào cơ trơn. Chúng giữ vai trò tích cực trong viêm do không chỉ đáp ứng với các tín hiệu phiìn từ của bạch cẩu mà còn điều hòa cả chức năng của bạch cầu. Các tố bào nội mô phủ mặt trong tất cả các huyết quản và tạo thành hàng rào đầu tiên giữa các thành phần máu và mô đệm. đóng vai trò là các tế bào viêm quan trọng.[13]
ỉ . 1.5.2. Các chất trung gian hóa học trong phản ứng viêm ★ C ác chất có nguồn gốc lê bào
6
• Prostaglandin Khi tế bào bị tổn thương, màng pho.spholipid của lế bào sẽ bị hoạt hóa bởi phospholipase A2 tạo ihành acid araehidonic. Prostaglandin là sản phẩm chuyên hóa của acid arachidonic theo con đường cyclooxygenase (C O X ). Có hai loại cnzym c o x đổng phân là COX-1 và COX-2. C O X -1 là en/ym có mạt ở hầu hết các mô, chịu trách nhiệm tổng hợp prostaglandin sinh ỉý tham gia vào các chức năng bình thường của một số cơ quan trong cư Ihc (đặc biệt ở đường tiôu hóa, tiểu cầu và thận), ổn định nội mô và bảo vệ tô' bào. C O X -2 được xcm là enzym tiền vicm, chí xuất hiện tại các tổ chức bị tổn thương và cổ vai trò tạo ra các prostaglandin gây viêm. Bình Ihường nồng độ COX-2 trong tế bào rất thấp. Trong các mô viêm, kích thích viêm gây cảm ứng các tế bào tham gia vào phán ứng viêm (bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào nội m ạc...) tìĩ đó hoạt hóa mạnh COX-2 và nồng độ COX-2 có thể tâng cao gấp 80 lần bình thường.[ 13,20] Trong viêm cấp, các mò và mạch máu tại chỗ sản xuất PGE, và PGI2. Trong vicm mạn, các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phóng PGE, và T X A 2.
Prostaglandin có nhiều tác dụng khác nhau Ị9Ị P (ÌE ị', có receptor trên tế bào nội mổ, tế hào cơ trơn thành mạch, tố hào trung tâm điều nhiệt vùng dưới đồi. Nó gây tăng tính thấm mạch, gây sốt. P G E , : có receptor trôn các tế hào cơ trơn. Nó có tác dụng giãn mạch gây han đỏ và đau. P G E V có rcceptor trcn tố bào nội mô mạch mà nó làm tăng tính thấm, trcn các tế bào niêm mạc dạ dày và trong một số nơron. P G I ị : có rcccptor trcn màng tô' bào nội mô mạch và tế bào CƯ trơn. Nó có tác dụng giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch gây phù. ban đỏ, tăng đau. sốt. TXA-t: được giải phóng sau khi tiểu cầu kết dính với nội mạch bị tổn thương. TXA? kích thích sự kết tập tiểu cầu và có tác dụng co mạch. • Leucotrien Ngoài con đường c o x . acid arachidonic có thc được chuyển hóa theo con đường lipooxvgenase (L O X ) để tạo ra các leucotrien. Các lcucotrien được tổng hợp chủ yếu hởi các tế bào viêm như bạch cầu đa nhân, đại thực hào và đưững bào.
7
Leucotrien B 4 có tính hóa ứng động với hạch cẩu đa nhân irung tính, bạch cẩu đưn nhân và một số tế bào lympho; kích thích bám dính bạch cầu đa nhân trung tính vào tế hào nội mô. kích thích đại thực hào và lympho bào tăng sinh và sản xuất cytokin
[9J. • Các acid amin hoạt mạch
Histamin Nguồn gốc: histamin có nguổn gốc chủ yếu từ dưỡng bào, ngoài ra còn có trong bạch cầu ái kiềm và tiểu cầu. Nó được tạo thành và dự trữ Irong các hạt của các tế bào này. Histamin được giải phổng do quá trình mất hạl của các tế hào khi đáp ứng với các kích thích.[9, 13] Vai trò trong viêm: histamin gây giãn tiểu động mạch và được coi là chất trung gian chính trong giai đoạn khởi đầu tăng tính thấm thành mạch. Nó gàv co các tế bào nội mạc của tiểu tĩnh mạch, giãn rộng vùng nối giữa các tế bào này và cho huyết tương thấm qua đê vào nội mô.[5. 13]
Serototiin Nguồn gốc: serotonìn có nguồn gốc từ tiểu cầu và các tế hào ưa crom ở ruột. Sự kết dính tiểu cầu sẽ giải phóng serotonin.Ị 13) Vai trò Irong viêm: lương tự histamin. • Yếu tô hoạt hóa tiểu cầu (PA F) PAF được hình thành trong màng các tiểu cầu. tế bào nội mô. hạch cẩu đa nhân trung tính (sau khi bị kích thích), bạch cẩu ái toan, tế bào đcín nhân, tố bào lõi và cầu thận từ một loại phospholipid nhờ phospholipase A2. Tác dụng của PAF là hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung lính nhằm kích thích chúng bám dính vào tế hào nội mồ. PAF cũng gâv vỡ hạt, mở đầu cho việc tiết các enzym Iv giải và giải phóng superoxyd. Một tác dụng khác là làm tàng tính thâm thành mạch, gây phù. Ngoài ra nó cổ tác dụng co thắt phc' quản làm cho cơn hen nặng hơn và cũng tác dụng lên các tê bào máu (giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu) [9J.
8
• Các thành phần của lysosom Các hạt lysosom chứa trong các bạch cẩu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn nhân. Trong phán ứng vicm các hạt này được giải phóng. Thành phần chính của các hạt này là các enzym có khả năng ticu hủy các thành phần cấu trúc của vi khuẩn và mô của vật chủ [21 ]. • Các cytokin Cvtokin bản chất là những glycoprotein. do nhiều loại tế bào sản xuất nhưng chủ yếu từ lvmpho bào và đại thực bào đã bị hoạt hóa. Cytokin do tế hào lympho tạo ra gọi là các lymphokin, do tế bào đơn nhân tạo ra gọi là monokin và đưực gọi dưới một tên chung là các interleukin (IL). Chúng điều hòa hoại động trên mọi hộ thống cư quan và tham gia điều khiển mọi giai đoạn của đáp ứng vicm lừ khởi đầu đến sứa chữa [9]. Tại vị trí tổn thương: IL-1. IL-6. TNF-a tác động lên các nguyên bào xơ, tố bào nội mô. gây tổn thương tế bào, giải phóng nhiều chất có hoạt tính sinh lý gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, tập trung bạch cầu tại ổ vicm. ỈL-8 có tác dụng hóa ứng động đặc biệt mạnh với hạch cầu đa nhân trung tính. Toàn thân: IL -I, IL-6, TNF-a tác động lên vùng dưới đồi làm tăng thân nhiệt (gây sốt), tàng tổng hợp ACTH. hvdrocortison. Các cytokin còn kích thích tố bào gan sản xuất protein phản ứng c (CRP). Các CRP này nhanh chóng gắn vào vi khuẩn kco thêm hổ Ihế vào tạo Ihành một phức hợp hấp dẫn cho các thực bào vây bắt. xử lý [13]. • C ác góc oxv tự do Gốc oxy tự do hình thành trong li thể đại thực bào đã hoạt hóa. Chúng tiêu húy đối tượng thực bào. Trong viêm khi đại thực bào bị ly giải sẽ gâv tràn gốc tự do ra ngoài, tạo điều kiện cho quá trình pcroxyd hóa lipid màng tế bào gây tăng lính (hấm mạch, lạo điéu kiện thuận lợi cho việc giải phóng acid arachidonic từ phospholipid màng tế bào để tổng hợp các chất trung gian hóa học Ị 15]. • Oxyd nitơ (NO) NO gắn với nửa Hem trên guaniyl cyclase và hoạt hóa enzym này. Dưới tác động của các kinase. guanosin phosphat vòng được tăng sinh, gây giãn cơ trưn của
9
huyết quản và gây giãn mạch, lãng tính (hâm Ihành mạch, tăng sản xuấl các PG vicm. Ngoài ra NO còn làm giảm tụ lập và kếl dính tiểu cầu. NO do đại thực bào sản xuất sẽ tác động như các gốc tự do là yếu tố độc với tế bào vi khuẩn, nấm, virus, tế bào u. Tuv nhiên, nếu các đại thực bào bị hoạt hóa sản xuất quá nhiều NO sẽ gây hại cho cơ thể như giãn mạch nặng và choáng trong sốc nhiễm khuẩn [13]. ★ C ác chát trung gian có nguồn gốc huyết tương /5 , 7] Bao gồm: hệ thống bổ thể, hệ thống đông máu, hệ thống tiêu tư huyết, hệ thống kinin và các globulin miễn dịch. Trong đó 4 hệ thống đầu licn được tạo thành theo kiểu “dòng thác” và có mối tương quan lẫn nhau. • Hệ thòng bổ thẻ Vai trò: diệt khuẩn nhờ các thành phán cuối của hệ thống bổ thổ; gia tăng phản ứng vicm nhờ các sản phẩm phụ như C3a, C5a khi hoạt hóa từ C1 đến C5 bao gồm sự opsonin hóa. hóa hướng động bạch cầu, thoát hạt tê bào mast. • Hệ thông đông máu Vai trò: ngăn sự phát tán của vi khuẩn; giữ vi khuẩn và vật lạ ở nơi mà hoạt động thực bào mạnh nhất; lạo thành bộ khung tạo điều kiện cho sự sửa chữa và lành vết thương. • Hệ thống kinin Kinin căn bản là bradykinin, có vai trò: gây giãn mạch: cùng tác động với PCi gây đau; gáy co Ihắt cơ trơn ngoài mạch máu; gây tãng tính thấm thành mạch do cùng tác động với PG nhóm E trong giai đoạn sau của quá trình viêm: tăng hóa ứng động bạch cầu. •
Hệ thống tiêu
tơ huyết
Enzym gâv ticu tơ huyết điển hình là plasmin, nó được tạo thành do sự phân tách plasminogen. Plasmin có vai trò quan trọng Irong tiêu cặn tơ huyết. Trong phản ứng viêm, nó khởi động sự hoạt hóa của hệ thống bổ the do phân lách C3 thành các đoạn, phân hủy íibrin và làm tăng tính thấm thành mạch. • C ác globulin miễn dịch (kháng thể) Bao gồm: IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.
10
i i chiếm ưu thế trong huyết thanh, vai trò [à opsonin hóa, hoạt hóa bổ thể, gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể, trung hòa ngoại độc tố, gây ngưng kết tế bào vi khuẩn, trung hòa virus. IgA: chiếm ưu thế trong các dịch tiết phủ lên bề mặt niêm mạc đường hô hấp trên và dưới, đường tiêu hóa. đường tiết niệu, sữa. Vai trò là trung hòa các tác nhân gây bệnh, hoạt hóa bổ thê theo đường nhánh. IgM : lìm thấy chủ yêu trong huyết thanh. Nó có khả năng hoại hóa bổ thổ mạnh hơn IgG. IgE : nồng độ trong huyết thanh thấp, tăng lên khi dị ứng, nhiễm ký sinh trùng. IgE gán với các thụ thể trên bề mặt dưỡng hào và hạch cầu ái kiềm, kích thích các tế bào này giai phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, leucolrien... IgD: có rất ít trong huyết thanh. Vị trí khu trú là trôn bé mặt tế bào B. Nó cùng với IgM là những globuiin miễn dịch xuvên màng. IgD bề mặt có vai trò trong thuần thục lê bào B.
1.2.
THUỐC CHỐNG VIÊM
1.2.1. Hóa dược chòng viêm 1.2.1.1. Thuốc chòng viêm khỏng steroỉd (NSAIDs) [4, 8] Bao gồm một số thuốc: aspirin, phcnỵlbuta/.on. indomethacin, piroxicarru ibuproícn, celecobxid...
C ơ ché chóng viêm NSAIDs gắn vào vị trí hoạt động dành cho acid arachidonic trên c o x gây ức chè cnzym c o x làm cho aciđ arachidonic khổng chuyển thành prostagỉandin- chất trung gian hóa học gây viêm nên NSAỈDs ức chê phản ứng viêm (hình I ). Ngoài ra NSAIDs ức chế hệ enzym phân hủy proiein trong lysosom, làm vững bổn màng lysosom và đối kháng tác dụng của các chất trung gian hóa học như bradykinin. histamin, serotonin. ức chế hóa hirứng động bạch cầu, ức chế sự di chuyển của bạch cầu tới ổ viêm.
Hình 1: Sơ đổ cơ chê chống viêm của NSAIDs và glucocorticoid
Tác dụng không mong muốn NSAIDs gây loét dạ dày-tá tràng, kéo dài thời gian chảy máu, gây viêm thận, gây cơn hen giả, gây dị tật ở thai nhi nếu dùng thuốc trong 3 tháng đầu của Ihai kỳ...
C hỉ định chung Chông viêm: cả viêm cấp và mạn (viêm khớp dạng ihấp, thấp khớp, viêm cột sống dính khớp, hệnh gút...) Ngoài ra thuốc còn dùng giảm đau và hạ sốt. 1.2.1.2. Thuốc chỏng viêm steroid [4, 8] Thuốc chống viêm steroid còn gọi là các glucocorticoid, bao gồm một số thuốc: hydrocortison, prednisolon, methylprcdnisolon, triamcinolon. dcxamcthason, betamethason...
12
C ơ chê chông viêm Glucocorticoid ức chế phospholipase A2 thông qua kích thích tổng hợp lipocortin làm giảm tổng hợp acid arachidonic. do đó làm giảm tổng hợp leucotrien và prostaglandin, vì vậy ức chế phản ứng viêm. Ngoài ra nó còn có tác dụng ức chế dòng bạch cầu đơn nhân, trung tính, lympho bào đi vào mô để gây khưi phái phản ứng viêm.
Tác dụng khóng mong muốn Glucocorticoid gây nhiều tác dụng không mong muốn như phù, loét dạ dàv tá tràng, loãng xương-xốp xương, teo cơ, rối loạn phân bố mỡ. suy Ihượng thận cấp khi ngừng thuốc đột ngột, ...
C hỉ định Điều trị vicm khớp, viêm da. viêm cơ... Ngoài ra còn dùng điều trị Ihay thê hormon trong suy thưựng thận, điểu trị các bệnh tự miễn, đị ứng, sốc phản vệ... 1.2.1.3. Enzvm chống viêm Bao gồm một sổ cnzym: a-chymotrypsin. trypsin, serratiopeptidase. amylase. papain, bromelain.
C ơ chê chỏng viêm Thủy phân protein huyết tương, tiêu hủy mảnh vụn sợi tạo keo, các mảnh tế bào và các fibrin kết tụ tại vùng bị tổn thương đổng thời kích thích hiện tượng thực bào. Vì vậy chúng làm giám phù viêm, cải thiện khá năng lưu Ihông của máu. phục hổi luẩn hoàn mao mạch đổ đảm hảo cung cấp đủ oxv VÌ1 dinh dưỡng cho các vùng bị tổn thương. Điều hòa các chất trung gian hóa học của viêm như các protein của pha cấp, các cytokin. các thụ thể gây kết dính trên màng bạch cầu. Úc chế các protcase. các protcin thu dọn gốc tự do. Giảm khả nãng hoạt hóa hệ thống bổ (hể của phức hợp miỗn dịch màng tê hào, làm giảm sự nguy hiếm của các phán ứng quá mẫn [13].
Tác dụng không mong muốn Một số enzym có íhể gây dị ứng, rối loạn tiêu hóa (tiêu cháv, chán ăn,...)
13
C h ỉ định Chống viêm, chống phù nề sau phẫu thuật, chấn thương, trong tiết niệu, sản phụ khoa, tai mũi họng. 1.2.2. Đòng dưực chống viêm Theo quan điểm của đông y, viêm là triệu chứng của cơ thể khi bị nhiễm độc. Nguvên nhân nhiềm độc có the do bên trong (phủ tạng hoạt động yếu, không đủ sức thanh thải chất độc) hoặc do bôn ngoài (côn trùng cắn. hơi hóa chất, ngộ độc thức ăn...)* Vì thế. trong đông y các vị thuốc chống viêm thường là các Ihuốc thanh, tiêu và hoạt như thuốc ihanh nhiệt giài độc, thuốc trừ thấp, thuốc hoạt huvết tiêu ứ... Có rất nhiều dược liệu và bài thuốc cổ truyền có tác dụng chống viêm đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian và hiện nay đang được nghiên cứu đổ tìm ra các hoạt chất có khả năng chống viêm cũng như cơ chế chống viêm của các hoạt chất đó. ★ Một sớ dược liệu chông viêm [2, 3]
Kim ngán Tên khoa học: U m icera ịaponica Thunb. Capritbliaccae Bộ phận dùng: hoa, phần trên mặl đấl phơi hay sấy khô Công dụng: Kim ngân hoa được dùng chú yếu đổ chữa mụn nhọl, mẩn ngứa, sốt nóng, sốt rét, tả lỵ và viêm nhiễm trùng đường hô hấp trôn, viêm da, viêm màng kết do sicu vi...
H òe hoa Tên khoa học: Sophora ịaponica L. Fabaceac. Bộ phận dùng: nụ hoa hòc Công dụng: chủ yếu đổ phòng những biến cố của bệnh xơ vữa động mạch, điều trị các trường hợp suy yếu tĩnh mạch, các Irường hợp xuất huyết như chảy máu cam, ho ra máu, tử cung xuất huyết, các trường hợp tổn thương ngoài ra do bức xạ, chòng dị ứng. thấp khớp, làm vết thương chóng lành sẹo.
Núc nác Tên khoa học: Oroxyỉum imỉicum Bignoniaceae. Bộ phạn dùng: vỏ thân và hạt phơi hay sấy khô.
14
Công dụng: chữa ho, vicm phế quản, đau gan, đau dạ dày. Ngoài ra còn có các vị dược liôu có tác dụng chông viêm khác như: Hoàng cầm, Ngưu tất, Cam thảo. Tam thất. Khương hoạt, Cốt toái bổ. Dây đau xương. Bạch hoa xà, Lão quan thảo di thực... ★ Một số bài thuốc chống vỉêm [13]
Ngân kiều tán Thành phần:
Kim ngân hoa
Trúc diệp
Liên kiều
Kinh giới
Đạm đậu xị
Thăng ma
Ngưu bàng tử
Cát cánh
Bạc hà
Cam thảo
Chủ trị: cảm cúm, viêm nhiễm và các chứng mụn nhọt.
Cao tiêu viêm Thành phần:
Tô mộc
Ngải cứu
Lá móng tay
Nghệ vàng
Huyết giác Chủ trị: cảm cúm, mụn nhọl
Độc hoạt tang kí sinh thang Thành phần:
Độc hoạt
Tố tân
Thục địa
Phục linh
Tang kí sinh
Đương quy
Đỗ trọng
Cam thảo
Tần giao
Thược dược
Ngưu tất
Ọuố tâm
Phòng phong
Xuvên khung
Nhân sâm
Chủ trị: đau đầu gối, đau lưng, tc lạnh, thấp khớp lâu ngày co duỗi khó khăn.
15
2.
MỘT SỐ MÔ HÌNH NGHIÊN c ứ u TÁC DỤNG CH ốNG VIÊM CỦA THUỐC Dựa trên những hiểu biết về nguyên nhân gây viêm, liến triển của phản ứng
viêm, triệu chứng lâm sàng của viêm, người ta tạo ra các mô hình vicm thực nghiệm dùng để nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc. Các mô hình này có the chia thành 3 loại: - Mô hình gây viêm cấp và bán cấp - Mô hình gây vicm mạn tính - Mô hình nghiên cứu cơ chế chông vicm 2.1.
MỔ HÌNH G Â Y V IÊM C Ấ P VÀ BÁN CẤ P Viêm có thổ do nhiồu nguyên nhân gây ra như nhiễm khuẩn, thiếu máu cục bộ,
tương tác kháng nguyên-kháng thể, tổn thương do hóa chất, nhiệt độ, cư học. Tuy nhiên, dù do nguyên nhân nào thì ở pha cấp tính của phan ứng viêm cũng xuất hiện 4 triệu chứng điển hình là sưng, nóng, đỏ, đau. Trong Ihực nghiệm, người ta dùng các chất hóa học tạo ra các triệu chứng viêm lương tự Irên lâm sàng để nghiên cứu tác dụng cua thuốc. Thuốc làm giảm được các triệu chứng này được coi là có lác dụng chống viòm cấp. Trong các phương pháp thì gây phù (sưng) là phương pháp hay được sử dụng nhất. 2.1.1. Mô hình gây phù bàn chân chuột
Nguyên tắc Mô hình này cổ thể dùng nhiều chất gâv viêm khác nhau như carrageenin, dextran. kaolin. formaldehyđ. men bia, albumin trứng...Khi tiêm các chất này vào bàn chân chuột sẽ kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin. prostaglandin, serotonin...và kết quả là gây phù. Thuốc có khá năng ức chế phù bàn chân chuột được coi là có tác dụng chông vicm. 2.1.1.1. (ỉây phù chân chuột bằng carrageenin [29]
Tiến hành Sử dụng chuột cống cả 2 giống, trọng lượng khoảng 100-150 g. chia ngẫu nhiên thành các lô:
16
Lô chứng: dùng dung môi pha thuốc Lô đôi chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết Lô ihử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống vicm Chuột được để đói qua đêm. Cho chuột uống thuốc hoặc dung môi. Sau 30 phúl. ticm 0.05ml dung dịch carrageenin 1% vào gan bàn chân trái sau của chuột. Đo thể tích chân chuột tại các thời điểm: trước khi gây viêm; 1. 2. 3. 4, 5. 6. 7 và 24 giờ sau khi gây viêm.
Đánh giá Tỉ lệ % tăng thé tích bàn chân của mỏi chuột biểu thị mức độ viêm cấp được tính theo công thức (1):
V -V X % = ~ L ------— X 100 y o
tu
Trong đó:
x%: tỉ lệ % tăng thể tích chân chuột V0: thể tích chân chuộl trước khi gây viêm V,: thổ tích chân chuột sau khi gây viêm t giờ Sau đó tính trung bình tỉ lẹ % độ tăng thổ tích chăn của các chuột trong mỗi lô. Tỉ lệ % ức chế phù của lô thử so với lô chứng được tính Ihco công thức (2):
Y % - Vt% Ị % = Ấ C 1 Xt 0/
X 100(2) v 7
Trong đó:
ỉ%: tỉ lệ % giám mức độ phù bàn chân chuột ỵ
%: trung hình tỉ lệ % độ tâng thể tích chân chuột ở lô chứng
ỵ % : trung hình tỉ lộ % độ tãng thể tích chân chuột ở lố thử. Các mô hình tương tự Tương tự với cách tiến hành VÌ1 cách đánh giá nhu mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenin, nhiều nhà nghiên cứu đã cải sử dụng các chất gây viêm
khác như: hồn dịch kaolin 5%; dung dịch lòng trắng trứng 1%; formalin 1% (Turner 1965); dextran 1% đến 3% (Turner 1965); dextran 6% (Winter, 1963); dung dịch
carrageenin ỉ% thêm ì 00 riỊỊ PGE2 hoặc PGỈỵ, hỗn dịch bột men bia 2,5% : 0,1 ml dung dịch trvpsin 0,1% : dung dịch coỉìagenase ; dung dịch serotonin 0,02%;
bradxkiniỉĩ 0,005% ; prostaglandin E2 0,1 mg/ml; gcl bentoniv, 0,1 ml Nxstatin 15000 đơn vị: adriamycin 0,5% (gây phù chân chuôi nhắt). 2.1.1.2. Gây phù chân chuột do chán thương [12, 25, 37]
Nguyên tắc Khi tác động lực cơ học mạnh lên bàn chân chuột sẽ gây tổn thirơng mô và tê bào chân chuột, làm hoạt hóa phospholipase A7 gây giải phóng acid arachidonic lừ phospholipid màng. Acid arachidonic sẽ chuyển hỏa thành prostaglandin nhờen/ym c o x và kết quả là gây phù. Mô hình này đã mô phỏng tình trạng tương tự trên lâm sàng khi cơ thổ bị chấn thương như bong gân, ngã, va đập...
Tiến hành Sử dụng chuột cống trắng, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô: Lô chứng: uống dung dịch nước muối sinh lý Lô đối chiếu: uống thuốc chống viêm đã biết Lô thử: uống thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm Cho chuột uống thuốc hoặc nước muối sinh lý vào mỗi buổi sáng trong 4 ngày liên tục. Đến ngày thứ 5. sau khi cho chuột uống thuốc hoặc nước muôi lần cuối 1 giờ thì gây viêm bằng cách thả 1 quả nặng 100 g từ độ cao 50 cm xuống bàn chân chuột. Đo thc lích bàn chân chuột tại các thời điểm: trước khi gây viêm, sau khi gày viêm 1, 3, 5 giờ [18].
Đánh giá Tính tỉ lệ % độ tăng thể tích chân chuột, rồi tính tí lệ % ức chế phù của lô thừ so với ló chứng theo công thức (1) và (2) tương tự như mục 2.1.1.1. 2.1.2. Mô hình gâv phù tai chuộỉ 2.1.2.1. Gáy phù tai chuột bằng oxazolon [29]
18
Nguyên tắc Mó hình gây phù tai chuột hằng oxazolon do Evans giới thiệu lần đẩu tiên năm 1971. Đây là mô hình dựa trôn phản ứng quá mẫn chậm của cơ thổ với oxazo1on. kết quả là kích thích làm vỡ hạt tế bào mast, giải phóng các chất trung gian gây phù.
Tiến hành Sử dụng chuột nhắt cả 2 giống, trọng lượng Irung bình khoáng 25 g, chia ngẫu nhiên thành các lô: Lô chứng: bôi 0,01 ml oxa?,olon 2% trong accton Lô đôi chiếu: bói 0 . 0 1 ml oxazolon 2% trong aceton dã hòa tan thuốc chống viêm đã biết ( hydrocortison 0.03% hoặc indomethacin 1%) Lô thử: hôi 0,01 ml oxazolon 2% trong aceton đã hòa tan thuốc đang nghiên cứu. Gây mê chuột hằng halothan. Bôi 0 J ml oxazolon lên vùng da bụng đã cạo lông hoặc bôi 0,01 ml oxazolon lên phần trong của cả 2 tai chuột để làm chuột nhạy cảm với chất kích thích oxazolon. Sau đó 8 ngày, gây mê chuột rồi kích thích gây viêmbằng cách bôi lên phía trong
tai phải chuột dung dịch tương ứng của các lô
(chứng, đối chiếu, thử). Tất cả các tai trái đều được giữ nguyên. Sau 24 giờ, giết chuột rồi bấm 1 vòng tròn đường kính 8cm ở vùng bôi thuốc của cà 2 tai, cân ngay lập tức, Irọng lượng khác nhau thể hiện mức độ phù trong viêm. Bailey và cộng sự (1995) cũng mồ la mỏ hình gây quá mẫn do tiếp xúc ở chuột nhắt. Bôi 20 |il oxazolon 2% vào mật trong và mật ngoài của mỗi tai (mỗi mặt 10 ụl) để chuột nhạy cảm với oxazolon. Sau đó 7 ngày, kích thích chuột bằng cách bôi dung dịch oxazolon 2% trong aceton và dầu ôliu (aceton:dầu ôliu = 4:1) vào cả 2 mặt cua tai phải. Ngay sau đó, lô đối chiếu và lô thử được bôi thuốc. Tai trái giữ nguyên. Sau 24 giờ, giết chuột, bấm I vòng tròn đường kính 6mm ở mỗi tai rổi đcm đi cân ngay.
Đánh giá Tính tỉ lệ % lăng khôi lưựng của tai phải so với tai trái rồi tính giá trị trung bình tỉ lệ % tăng khôi lượng tai chuột trong mỏi lô. Sau đó tính tỉ lộ % ức chế phù của lô thử so với lô chứng. Công thức tính tương tự mục 2 .1 .1 .1.
19
2 .I.2.2. (ìây phù tai chuộỉ bằng dầu ba đậu [29]
Nguyên tắc Mô hình gây phù tai chuột hàng dầu ba đậu do Tonelli và cộng sự đồ xuấl (1965) dùng để đánh giá đồng thời tác dụng chống viêm và tác dụng tco tuyến
ức
của các stcroid. Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại, dầu ba đậu dùng lạichồ gây giải phóng histamin là chất gâv giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch và kết quả là gây phù.
Tiến hành Thí nghiệm có thổ thực hiện trên chuột nhắt đực trọng lượng 22 g hoặc chuột cống đực trọng lượng 70g. chuột được chia ngầu nhiên thành các lô: Lô chứng: dùng dung môi pha thuốc Lô đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết. Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm. Chuẩn bị hỗn hợp dung môi gồm có dầu ba đậu: ethanol: pyridine: ethyl ether (tỉ lệ 1:10:20:69 ở chuột nhắt và 4 :10 :20 :6 6 ở chuột cống). Thuốc dối chiếu và thuốc thử dược hòa tan trong dung môi này với nồng độ 0,03 đến 1 mg/ml nếu thí nghiệm trên chuột nhắt và nồng độ cao hơn từ 3 đến 10 lần nếu thí nghiệm trcn chuột cống. Gây mê chuột rổi bôi lên cả 2 mặt của tai phải các dung dịch tương ứng cho mỗi lô (0,01 ml với chuột nhất và 0,02 ml với chuột cống). Tất cả các tai trái được giữ nguyên. Sau đó 4 giờ, giết chuột hằng thuốc mê, cắt 2 tai và bấm 1 vòng tròn dưừng kính 8mm ở mỏi tai rói đem cân ngay, trọng lượng khác nhau thổ hiện mức độ phù trong viêm. Để đánh giá ảnh hưởng trcn tuyến ức thì 48 giờ sau khi bôi thuốc sẽ giết chuột rồi cắt luyến ức và đcm cân, tính ra số mg tuyến ức/100 g thô trọng chuột.
Đánh giá Tính tỉ lộ % tăng khối lượng của tai phải so với tai trái và tỉ lệ % ức chế phù của lô thử so với lô chứng theo công thức tương tự như mục 2 .1 .1 .1. Tính tỉ lộ % giảm trọng lượng tuyến ức của lô thử so với lô chứng đc đánh giá tác dụng làm teo tuyến ức của thuốc.
20
Tương tự với cách tiến hành trôn ta cũng có thể dùng các mồ hình gâv phù tai chuột bàng acid arachidonic, phorbol myristate acelat. telradccanoyl phorbol acctat, capsaicin, xylene. 2.1.3. Mô hình gâv tăng tính tháni thành mạch
Nguyên tắc Các chất gây vicm kích thích giải phóng các chất trung gian như histamin, prostaglandin. leucotricn sẽ làm giãn các tiểu động mạch và tiểu tĩnh mạch, tăng tính thấm thành mạch. Kết quả là dịch và protein huyết tương bị thoát ra gây phù. Các thuốc có khả năng ức chế tăng tính thấm thành mạch sẽ có tác dụng giảm phù, chống viêm. 2.1.3.1.G ây tăng tính thấm bằng phenethvlainỉn [29]
Tiến hành Sử dụng chuột cống đực, trọng lượng 160-200 g, chuột được chia ngầu nhiên thành các lô: Lô chứng: dùng dung môi pha thuốc Lồ đồi chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biốt Lỏ Ihử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm Cạo lông vùng bụng chuột, tiêm tĩnh mạch dung dịch xanh Evan ]% với liều 5 mg/kg. Sau đó 1 giờ, cho chuột uống thuốc hoặc dung môi. Sau 30 phút, gây mô chuột bằng clhcr rồi tiêm trong da 0,05 ml dung dịch phenethylamin 0,01% ở cả 3 vị trí phải, trái và Ircn bụng. Sau 90 phút, giết chuột bàng ether rồi tiến hành đo đường kính vùng da bị nhuộm xanh hoặc cắt vùng da bị nhuộm xanh đem ngâm vào dung dịch natri clorid 0.9% . sau khoảng 24 giờ lọc lấy dịch rồi đem đo quang.
Đánh giá Đo đường kính đổ tính diện tích vùng da bị nhuộm màu xanh hoặc tính nồng độ dung dịch xanh Evan đã thoát mạch. Tính giá trị trung hình cho từng lô. Sau đó tính ti lệ % ức chế sự thoát mạch xanh Evan của lô thử so với ló chứng theo công thức tương tự công thức (2) mục 2.1.1.1.
21
2.1.3.2. Gây tăng tính thấm thành mạch hằng acid acetic [17]
Tiến hành Sử dụng chuột nhắt trắng, trọng lượng ỉ 8-22 g, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô: Lỏ chứng: dùng nước muối sinh lý Lô đối chiếu: dùng thuốc chống viêm cíã biết Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm Cho chuột uống thuốc hoặc nước muối sinh lý. Sau đó 30 phút, liêm tĩnh mạch đuôi chuột 0,2 ml dung dịch xanh methylen 0.5% pha trong nước muối sinh lý. Sau 3 phúl. tiêm màng bụng 4 ml dung dịch acid acctic 0.3%. Sau 1 giờ, giếl chuột, dịch ổ bụng được hút riêng vào từng ống nghiệm, lỵ tâm, khử đục và đo mật độ quang trên máy đo quang dể định lượng chất màu thoát ra khỏi lòng mạch [24].
Đánh giá Tính nổng độ xanh mcthylen thoát mạch trên mỏi chuột. Tính giá trị trung bình cho từng lô. Tính tỉ lộ % ức chế thoát mạch của lô thử so với lô chứng theo công thức tương tự công thức (2) mục 2 . I .I .I . 2.1.3.3. Gâv tăng tính thâm thành mạch bằng oxazolon [29] Zentel và Topert (1994) dùng oxazolon gây ihoát mạch xanh Evan đổ đánh giá tác dụng chống viêm tại chỗ của glucocorlicoid.
Tiến hành Sử dụng chuột nhát đực, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô: Lô chứng: dùng dung môi pha thuốc Lô đối chiếu: dùng thuốc chống vicm đã biết Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu lác dụng chống vicm Cạo lóng sườn trái chuột rồi bôi vào đó 50 nl dung dịch oxazolon 40% trong ethanol (diện tích bôi khoảng 4 cm2) để chuột nhạy cảm với chất kích thích. Sau đỏ 13 ngày, tiêm tĩnh mạch chuột 0,2 ml dung dịch xanh Evan 0,5%. Ngay sau đó, bôi 20 p.1 oxazolon 4% trong ethanol vào sườn phải chuột đã cạo lông (diện tích bôi khoảng 6 cm2). Sau 3 giờ, bôi thuốc hoặc dung môi vào vùng da bị kích thích. Sau
22
24 giờ. giết chuột và cắt vùng da bị kích thích, ngâm trong dung dịch NaCI 0,9% khoảng 24 giờ, lọc lấy dịch đem đi đo quang ở bước sóng 623 nm.
Đánh giá Tính nồng độ dung dịch xanh Evan thoái mạch. Tính tỉ lệ % ức chế sự thoát mạch xanh Evan của lô thử so với lô chứng theo công chức tương tự công thức (2) mục 2.1.1.1. 2.1.4. Mò hình gâv viêm màng phổi [29]
Nguyên tắc Viêm màng phổi là một hiện tượng vé viêm rỉ dịch phổ biến ở người. Trong các thí nghiệm trên động vậl. có Ihc gây viêm màng phổi bằng các chất kích Ihích như histamin, bradykinin. prostaglandiru yếu tố gây mất hạt tế hào mast, dextran, kháng nguyên, vi khuẩn và các chất kích thích không đặc hiệu như turpentin hay carrageenin. Viêm màng phổi gây ra bởi carragcenin ở chuột được xcm là một mô hình gâv viêm cấp rất tốt mà trong đổ sự thoát dịch, sự di chuyến của hạch cầu và các chỉ số sinh hóa khác licn quan tới phán ứng viêm có thể được đo dỗ dàng trong dịch rỉ.
Tiến hành Sử dụng chuột cống đực. trọng lượng 220-260 g, chia ngẫu nhiên thành các lô: Lô chứng: dùng dung môi pha thuốc Lô đôi chiếu: dùng thuốc chông viêm đã biết Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm. Gây mê chuột bằng ether. cạo lỏng bên sườn phái rồi lau cồn, rạch một vết nhó vào trong da ở dưới chân phải trước giữa xương sườn 7 và 8. mở rộng vêl rạch, bộc lộ CƯ liên sườn rồi rạch m ột vết nông hơn trên đó, thông qua vết rạch tiêm vào
khoang màng phổi 0.1 ml dung dịch carragecnin 2%, việc tiêm phải được thực hiện nhanh đổ tránh gây tổn Ihưưng phổi, vết thương được đóng kín lại bảng một kẹp. Sau đó cho chuột dùng thuốc hoặc dung môi vào các thời điểm 1, 24, 48 giờ sau khi liêm carragccnin. 72 giờ sau khi tiêm carragcenin tiến hành giết chuột bằng cthcr, hút hcì dịch rỉ màng phổi vào trong một ống có chia vạch để xác định thể tích dịch rỉ.
23
Ngoài mõ hình trên, có thể gây vicm màng phổi chuột cống bàng tinh dầu thông với cách tiến hành và đánh giá kết quả tương tự [ 19|.
Đánh giá Tính giá Irị trung bình của thể tích dịch rỉ viêm ở mỗi lô và so sánh lô thử với lô chứng. Dùng các liều khác nhau có ihê xác định được ED50. Một số thông số có thể xác định: Xác định sô lượng hạch cẩutrong dịch rỉ bằng một máy dếm Xác định hoạt lính của các enzym trong lysosom •
Xác định íìbronectin
•
X ác định PGE2
2.1.5. Mô hình gây ban đỏ [29]
Nguyên tắc Mô hình gây ban đỏ bằng tia u v được Wilhelmi mô tả lần đầu tiên (1949), ông đã nhận thây khá nãng làm chậm sự phát triến ban đỏ do tia u v của phenylbutazon và các thuốc chống viêm không steroid. Sau đó các nhà khoa học khác đã mở rộng và cải tiến phưưiig pháp này bằng các cách kích thích khác.
Tiến hành Sử dụng chuột lang trắng cả 2 giống, trọng lượng khoảng 350 g, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô: Lô chứng: dùng dung môi pha thuốc Lô đôi chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết (indomethacin liều 1,5 mg/kg: phenylbutazon liều 4 mg/kg: acid acetylsalicylal liều 60 mg/kg). Lô thử: dùng ihuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm. Trưức khi tiến hành thí nghiệm 18 giờ, chuột dược cạo lông 2 bên sườn và Irèn lưng. Cho chuột uống 1/2 lưựng thuốc nghiên cứu hoặc dung môi. Sau đó chuột được đặt vào trong ] lúi da đã được đục 16 (kích thước 1.5 X 2.5 cm) cho phép tia u v chỉ chiếu vào vùng này. Sử dụng đèn tử ngoại nguyôn bán Hanau 600W, làm nóng đèn 30 phút trước khi dùng và đặt đèn cố định, cách các con vật 20cm. Chiếu tia u v trong 2 phút rồi cho chuột uống nốt 1/2 lượng thuốc hoặc dung môi còn lại. Ban đỏ được ghi lại tại thời điểm 2 giờ và 4 giờ sau khi chiếu tia u v .
24
Ngoài tia u v , tia X cũng được sử dụng là vếu tố kích thích gâyban đỏ (mô hình do Ilirabayashi và Graham đề xuất, 1969) [39].
Đánh giá Dựa vào phương pháp tính điểm để đánh giá mức độ ban đỏ trên mồi chuột : 0 = không ban đỏ 1 = ban đỏ yếu 2 = ban đỏ mạnh 4 = ban đỏ rất mạnh. Tính điểm trung bình của mỗi lô. Sau đó tính tí lệ % ức chế ban đócủa lô thử so với lô chứng theo cống thức tương tự công thức (2) mục 2 .1 .1 .1. Những chuột với kết quả là 0 và 1 được xem là đã được bảo vộ. Các kốl quả thu được sau 2 và 4 giờ có thể sơ bộ cho biết khoảng thời gian tác dụng và có thể tính được EDS(). 2.1.6. Mô hình tạo túi II hạt [29, 39]
Nguyên tắc Mô hình tạo túi 11 hạt do Selye phát minh (1953) và được Roberl và Nezamis cải tiến (1957). Mô hình sử dụng dầu ba đậu [à chất kích thích gây ra một viêm bán cấp tương tự tình trạng viêm vô khuẩn do tăng một thể tích lứn dịch Ihoál mạch.
Tiến hành Sử dụng chuột cống cả 2 giống, trọng lượng 150-200 g, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô: Lô chứng: dùng dung môi pha thuốc Lô đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết (indomethiicin) Lồ thử: dùng Ihuôc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm Lưng chuột dược cạo lông và sát trùng. Gây mê chuột, dùng một kim rất mỏng tiêm 20 ml không khí vào vùng da giữa lưng. Sau đó, tiêm 0.5 ml dung dịch dẩu ba đậu 1% trong dầu vírng vào trong túi không khí. tránh để lọt khí. Sau 48 giờ. rút không khí trong túi. Sau đó, hàng ngày cho chuột dùng thuốc hoặc dung môi. Để đánh giá tác dụng tại chỗ, thuốc được tiêm trực tiếp vào túi không khí cùng thời
25
điếm kích Ihích. Vào ngày Ihứ 4 hoặc thứ 5. giết chuột, mở túi và thu dịch vào trong xilanh thủy tinh. Mỏ hình trên có thể dùng các chất kích thích khác như carrageenin (Boris và Stevenson.1965), D-a-tocopherol (Glcnn và cộng sự. 1963).
Đánh giá Tính thể tích trung hình dịch thu được của các lô. Tính ti ]ệ % ức chế viôm của lô thử so với lô chứng theo công thức tương tự công thức (2) mục 2.1.1.1. 2.2. MỎ HÌNH C.ÂY V IÊM MẠN TỈNH 2.2.1. Mó hình gây u hạt (hực nghiệm
Nguyên tắc Khi đưa vào cơ thc một vạt lạ khổng có khả nãng hấp thu được như amian. bông...thì cơ the sẽ phán ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế hào lạo ra mô bào lưới và nguyên bào sợi bao quanh vật lạ, tạo Ihành một khối u gọi là u hạt thực nghiệm. Quá trình tiến triển tạo u hạt thực nghiệm tương tự với tiến triển của một viêm mạn tính. Một thuốc có khá năng ức chế sự hình thành u hạt sẽ góp phẩn điều trị các bệnh vicm mạn lính. Với các chất kích thích khác nhau ta có các mô hình gây u hạt thực nghiệm khác nhau. 2.2.1.1. (ỉây u hạt thực nghiệm bàng amian [1 8 ,1 1 ] Mô hình tiến hành theo phương pháp của Ducrol. Julou và cộng sự (1963).
Tiến hành Sử dụng chuột cống tráng cả 2 giống, trọng lượng 100-140 g. chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô Lô chứng: dùng nước muối sinh lý Lô đối chứng: dùng Ihuôc chống viêm đã biết Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu lác dụng chống viêm. Dùng I mẩu sợi amian đường kính khoảng 2 mm. trọng lượng 30 ± I mg được vê tròn và sấy tiệt khuẩn trong 2 giờ ở 160"C. Chuột được gây mê, cạo sạch lông vùng lưng phía trên. Dùng mũi kéo bấm mội lỗ nhỏ ở da rồi ịuồn mũi kéo vào để tách da lưng ra khỏi cơ. cấy sợi amian vào
26
nơi đã bóc lách. Đặt kẹp hoặc khâu nối liền chỗ mổ trôn lưng. Phẫu thuật liến hành trong điều kiện vô khuẩn. Cho chuột uống hoặc tiêm dưới da thuốc hoặc nước muối sinh lý vào mồi buổi sáng trong 5 ngày liên lục, lẩn dầu cho thuốc ngay sau khi cấy sợi amian. Chiều ngày thứ 5 kổ từ ngày cấy amian. giết chuột hằng cloroform. bóc tách khối u và cân tươi ngay.
Đánh giá Tính trọng lượng thực của u hạt bằng Irọng lượng cân được trừ đi trọng lượng của sợi amian cấy vào. Tính trọng lượng trung bình của u hạt ớ các lô. Tính tỉ lệ % ức chế u hạt của lô thử so với lô chứng. 2.2.1.2. (jrâv u hạt íhực nghiệm bằng bông [29] Đày là mô hình gây u hạt thực nghiệm đầu tiên do Mcicr và cộng sự (1950) tiến hành.
Tiến hành Sử dụng chuột cống đực, trọng lượng Irung bình khoảng 200g, chia ngẫu nhiên thành các lô Lô chứng: dùng nước muối sinh lý Lô đối chiếu: dùng thuốc chống vicm đã biết Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống vicm Gây mê chuột, cạo lông ở lưng và sát trùng bằng ethanol 70". Rạch 1 vết ở thắt lưng, dùng một kìm tạo những đường dưới da và đặt lĩiột viên gạc bông đã được tiệt Irùng vào cả 2 bên xương bá vai. Cho chuộl uống thuốc hoặc dung môi liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8, giết chuột, bóc tách u hạt và sấy khỏ đến khối lượng khống đổi rồi cân. Theo kinh nghiệm của các nhà nghicn cứu thì sự tạo thành u hạt sẽ mạnh hơn khi gạc bông được tẩm carrageenin.
Đánh giá Tính trọng lượng khô thực của u hạt rồi tính giá trị trung hình của mỗi lô. Tính tỉ lệ % ức chế u hạt của lô thử so với lô chứng. 2.2.1.3. Một sỏ mô hình gây 11 hạt thực nghiệm khác [29, 39]
27
Với cách tiến hành và đánh giá tương tự các mô hình trên, các nhà nghiên cứu đã đề xuất, cải tiến thêm nhiều mô hình gây u hạt thực nghiệm khác như gây áp xc bằng tinh dầu thông (Levy, 1968); gây u hạt bàng mảnh kính (Vogcl, 1970): gây u hạt bằng bọt biển (Saxena. 1960); gây u hạt hằng carraggecnin trên chuột lang (Robcrtson và Schwartz,1953), trôn thỏ (McCandless, 1960), chuột cống (Prodi và Romeo, 1967); gây u hạt hằng polyvinylclorid (Rudas, 1960).... 2.2.2. Mô hình gâv viêm đa khớp thực nghiệm 2.2.2.2. Gây viêm đa khớp thực nghiệm bằng chất bổ trợ Freund [19, 39] Mô hình tiến hành theo phương pháp của Ncvvbould B. B. (1963). Chất hổ trợ Freund là hỗn hợp của các vi khuẩn Mxcohacterium ịM. bntyricum, M. tubercưìosis,
M.phlei) đã chết được pha trong paraíìn lỏng hoặc dầu khoáng hoặc dầu thực vậi. Khi tiêm chất này vào trong cơ thế chuột cống sẽ gây hội chứng giống viêm khớp.
Tiến hành Sử dụng chuột cống đực tráng, trọng lượng trung hình khoáng 200 g, chuột được chia ngẫu nhicn Ihành các lô: Lô chứng: dùng nước muối sinh lý Lô đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm. Cho chuột uống thuốc hoặc nước muối sinh lý. Sau 1 ngày, đo độ dày bàn chân phải sau của chuột. Tiêm vào gan bàn chân phải sau 0.05 mi chất bổ trợ. Cho chuột uống thuốc 13 ngày liên tục kể từ khi tiêm chất bổ trợ. Đến ngày thứ 13, đo độ dày bàn chân phải sau của chuột. VVard và cộng sự (1962) đã tiến hành gây viêm đa khớp bàng chất sáp D phân lập từ trực khuẩn lao với cách làm tương lự trcn.
Đánh giá Tính li lệ % tăng độ dày chân chuộl trước khi tiêm và 13 ngày sau khi licm chất bổ trợ. Sau đó tính trung bình tỉ lệ % tăng độ dày chân của các chuột trong mỗi lô. Từ đó tính tí lệ % ức chế tăng độ dày của lô thử so với lô chứng. Các công thức tính tương tự mục 2.1.1.1.
28
Ngoài ra có thổ đánh giá các tổn thương thứ phát (như sưng bàn chán trái sau, sưng các bàn chân trước, sưng các lai và sưng đuôi) dựa vào mức độ nghiêm trọng của tổn thương: bình thường, nhẹ. nặng vừa và nặng.
2.2.2.X Gây viêm da khớp thực nghiệm bằng Mycoplasma arthritis [19] Mô hình tiến hành theo phương pháp của Ward và Russel (1962), Wiesinger (1964).
Tiến hành Sử dụng chuột cống trắng, trọng lượng 120-150 g, chuột được chia ngầu nhiên thành các lô Lô chứng: dùng dung mòi pha thuốc Lô đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết Lô thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm. Chuẩn bị Mycopỉasmơ arthritis: nghiền một mảnh sarcom lympho Murphy có chứa Mycopiasma arthrùis. Sau đó pha thành hỗn dịch trong NaCl 0,9% và cho thêm 400.000 đơn vị penicillin và 1.000.000 đơn vị colislin mclhansulíonat. Hỗn dịch được ly tâm trong 30 phút, giữ lại dịch nổi phía trên. Tạo dịch rỉ gây viêm khớp: Tiêm 30 ml không khí vô khuẩn vào dưới da lưng chuột đe tạo 1 túi khí, rồi tiêm 2 ml dịch chứa Mxcopìưsma arthritis thu được ử trên vào túi khí. Sau 6-10 ngày, hút dịch từ trong túi, dịch này có chứa nhiều vi khuẩn
Mvcopỉasma ưrthritis, thí nghiệm liến hành trong điều kiện vô khuẩn. Gây viêm khớp: tiêm màng bụng chuột iml hỗn hợp đồng the tích thuốc hoặc dung môi và dung dịch deXtran 6%. Sau đó cho chuột uống hoặc ticm dưới da thuốc hoặc dung môi hàng ngày trong 8 ngày ỉicn tục. Hàng ngày quan sál và ghi lại các chỉ số viêm.
Đánh giá Quan sát hàng ngày các nhóm khớp: khớp chày-eổ chân trước và sau; khớp xương cổ chân trước và sau; khớp giữa các đốt ngón chân trước và sau. Từ đó xác định chỉ số viêm khớp dựa vào phưưng pháp tính điểm: 0: bình thường 1: ban đò nhẹ
29
2: vừa ban dỏ vừa sưng 3: sưng tấy. Cộng số điểm của các ngày ta được một chỉ số viêm khớp. Tính tỉ lệ % ức chê viêm khớp của lô thử so với lô chứng theo công Ihức tương tự công thức (2) mục 2.1.1.1. 2.3. MỔ HÌNH NGHIÊN CÚXi c ơ C H Ế CHỒNG VIÊM 2.3.1. Gây kết tập bạch cầu đa nhân [29]
Nguyên tắc Khi có lác nhân gây viêm tấn công vào cơ thể. chúng sẽ tạo ra các chất hóa ứng động thu hút và tập trung bạch cầu lới nưi có các chất hóa ứng động đó. Sự có mạt quá nhiều bạch cẩu sẽ làm khuếch đại phán ứng viêm gây ra những tổn thương trầm trọng cho mô và cơ thổ. Vì vậv. một trong những cơ chế chống vicm là ức chế hóa ứng động bạch cầu. Trong mô hình ihí nghiệm này sử dụng chất gây hóa ứng động bạch cầu là fo)Tnyl-L-mcthionyl’ L"lcucyl-L-phcnylamin (FMLP).
Tiến hành Chuẩn bị tố bào bạch cầu đa nhân: Tiêm vào màng bụng chuột cống 10 ml dung dịch casein natri 6%. Sau đó 17 giờ. Ihu dịch rỉ màng bụng để tạo hỗn dịch các tế bào bạch cầu đa nhân. Các tế bào được rửa 2 lần trong dung dịch nước muối đảng trương rổi pha thành hỗn dịch với nồng độ 15 X 106 tế bào/ml. Gây kết tập bạch cầu đa nhân: Thuốc thử và thuốc đối chiếu (pcntoxiphvllin) được hòa tan trong dung dịch nước muối đẳng trương. Hỗn dịch tế hào được li với thuốc trong 10 phút rồi thêm FMLP pha trong dimethvl sulfoxid (DMSO) để gâv kết íập bạch cầu. Sự kếl tập bạch cầu đa nhân được thực hiện irong máy tập trung Born.
Đánh giá So sánh sự kết tập bạch cẩu da nhân giữa nhóm thử và nhóm chứng dựa Irên kết quả đo từ máy. 2.3.2. Gây hóa ứng động đại thực bào [30]
Nguyên tắc Mô hình sử dụng một chất gâv hóa ứng động đại thực hào và qua đó đánh giá khả nâng ức chế hóa ứng động đại thực bào của thuốc.
30
Tiến hành Sử dụng chuột cống đực. trọng lượng 200-220 g. Dùng Ihioglycolkư là chất gây hóa ứng động đại thực bào. Chuẩn bị các tế bào đại thực hào: tiêm màng bụng chuột 5 ml canh thi og lyco Hat 3%. 3 ngày liên tiếp sau khi tiêm thioglycollat cho chuột uống thuốc hoặc nước muối, Vào ngày Ihír 4, ihu lấy các tế bào trong dịch rỉ màng bụng bằng cách rửa khoang màng bụng với dung dịch nước muối đẳng trương. Các tế bào được rửa 2 Iđn với nước muối rồi pha thành hỏn dịch nổng độ 1X 10fi tế bào/ml trong môi trường lạnh RPM I-1640 không có phcnol đỏ và được bổ sung huyết thanh bê 10%. pcnicillin 100 Ul/ml và streptomỵcin 100 ịig/ml. Gây hóa ứng động đại thực bào: các tế hào được ủ ở 3 7 °c và 5% C 0 2 trong 2 giờ để cho cấc đại ihực bào bám vào bể mặt đĩa nuôi cấy. Các tế bào không bấm sc bị loại bỏ hầng cách rửa mạnh vứi nước muối dẳng trương ấm. 90% các tế bào bám vào đĩa là các đại thực hào.
Đánh giá Số lượng đại thực bào được đếm bằng máy huyết tốc kế. So sánh kết quả giữa mẫu thử và mẫu chứng. 2.3.3. Thí nghiệm về các chát chuyên hóa của acid arachidonic [29] 2.3.3.I. Thí nghiệm oxv hóa acid arachidonic bởi CO X-1
Tiến hành Lấy 50 Jil cnzym COX-1 tái tổ hợp tinh khiết nồng độ 1 ng/ml pha vào trong Tris-HCl 100 mM, EDTA 0,5 mM pH 8,0. phcnol 1 mM, hcmatin ỉ 1-iM rồi ủ với 2 dung dịch chất ức chế hoặc DMSO (mẫu chứng) trong 15 phút. Sau đó phản ứng được bát đầu bằng cách thêm 5 |j1 [ MC1- acid iìrachidonic 1 f.iM (0.005 jiQ) đổ thu được nồng độ cuối cùng là 0.1 ịjM. ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 7 phút, phản ứng được dừng lại hằng cách thêm 5 [li MCI ] M và 50 jLil acetonitril. Lấy 50 nl mẫu phản ứng cho lên cột sắc ký HPLC để tách các chất. Các chất chuyển hóa của acid Ltraehidonie và acid arachidonic được tách ra và được định lượng bằng máv phát hiện sắc phổ phóng xạ.
31
Đánh giá Tính tỉ lệ % acid arachidonic chuyến hóa thành prostaglandin. So sánh ti lệ đó giữa mẫu thử có chất ức chế và mầu chứng không có chất ức chế. 2.3.3.2. Tạo các eicosanoid từ l4C-acid arachidonic ở tẻ bào ỉiểu cầu Eicosanoid là tên gọi chung cho các sán phẩm chuyển hóa của acid arachidonic, bao gồm prostaglandin. leucotrien, thromboxan. Prostaglandin gây tăng tính thấm thành mạch, gây phù. han đỏ. gây đau. Lcucotrien có tính hóa ứng động bạch cẳu. kích thích hám dính tế hào bạch cầu vào lế bào nội mô...Thromboxan kích thích sự kết tập tiểu cầu. Do đó, ức chế sự hình thành các chất này là một cơ chế chống viêm quan trọng.
Tiến hành Chuẩn bị các tế bào tiểu cầu: lấy máu tĩnh mạch cánh tay của người tình nguyện khỏe mạnh và tập trung trong các ống nghiệm chất dẻo có sẩn nalri citrat (nồng độ cuối cùng là 0,38% ). Không quá 1 giờ trước khi làm thí nghiệm, ly tám máu Ư 100 g trong 15 phút thu được huyết tương giàu tiểu cầu (khoảng 2,5 X 10" tiổu Cầu/I),
bảo q u ả n ử
20°c.
Tạo các eicosanoid: huyết tương giàu tiểu cầu được trộn đồng thể tích với dung dịch citrat trong glucose (27,35 g ỉrinatri citrat.2HiO, 1,47 g acicl citric và 27,74 g g!ucose.2H20 và 1 lít nước) và được ly tâm ở 1000 g trong 20 phút (4°C). Cặn được pha thành hồn dịch trong dung dịch nước muôi bằng thể tích ban đầu. Lấy 0,495 ml hỗn dịch tiểu cầu này ủ với thuốc thử ở 37”C trong 15 phút.. Sau đó hát đầu lạo các eicosanoid bằng cách thêm 5 nl dung dịch l - l4C-acid arachidonic (5 0 Ci/mol, 9 X
10 4 Ci/1). Sau 5 phúl. dừng phản ứng hằng cách thêm 0.5 ml aceton đã làm lạnh/o.l ml HC1 IN, làm lạnh tới 0"C và chiết 2 lần với 3 ml ethylacetat/lần. Dịch chiết được làm bav hơi dung môi. sau đó hòa tan cặn trong 0,2 ml mcthanol rồi đưa lên cột sác ký HPLC đổ tách các chất. Xác định các l4C-eicosanoid tạo thành bằng máy plìát hiẹn nhấp nháy.
Đánh giá So sánh sự tạo thành T X B : và PGE ị giữa mẫu thử và mẩu chứng.
32
2.3.3.3. Tạo prostaglandin ở bạch cầu đa nhân trung tính
Nguyên tắc Mô hình sử dụng lipopolysaccharide (LPS) để kích thích sinh PGE2. Cách tiến hành do Herrmann và cộng sự đề xuất lần đầu (1990). sau đó Weithmann và cộng sự cãi tiến (1994).
Tiến hành Nuôi cấy các tế bào hạch cầu đa nhân trung tính vúi mậl độ 2.5 X 109 tế bào/1 trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung natri pyruvat 1 mmol/l. huyết Ihanh bồ 5%, glutamin 2 mmol/1 và 100 Ul/ml pcnicillin/slreptomycin. Tiến hành ủ bạch cầu đa nhân trung tính trong môi trường RPMI 1640 với acid acctyl salicylic 100 |amol/l trong 60 phút (37°c, 5% C 0 2). và sau đó rửa 4 lần với mồi trường. Lấv 0,25 ml mẫu (2,5 X 10ụ bạch cầu đa nhân/1 môi trường) ủ với LPS 0,1 mg/ml cùng với thuốc Ihử trong 18 giờ (cĩĩa 96-well, 37°c. 5% c o ? )- Tạo các eicosanoid bằng cách thcm 7 X 10'5 mol/1 chất mang ion calci A 23 187. ủ 30 phút ở 37"C. Sau đó các đĩa được ly tâm ở 400 g trong 15 phút. PCiE, tạo thành nằm trong phần địch nổi phía trôn, được xác định bằng kií ELISA.
Đánh giá So sánh nồng độ PGE2 tạo thành giữa mẫu có thuốc ihử và mẫu chứng không có thuốc. 2.3.3.4. Tạo leucotrien B4 ở tê bào bạch cầu
Tiến hành Chuẩn bị các tế hào hạch cầu: lấy 40 ml máu tươi đã citral hóa được trộn lẫn vói 8 ml đệm PM16 gồm có dcxtran 6% (trọng lượng phân tử là 480 000) và được ú ỏf nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Dịch nổi phía trôn gổm có các tế hào hạch cầu, lấy dịch ra và pha loãng 1:1 với PM16 rồi ly tâm ở 300 g trong 15 phút. Phần cắn được hòa trong P M 16 và điều chỉnh để cỏ 10'° tế bào/1. Tạo leucotrien: lấy 0,3 ml hỗn dịch tế bào ở trên để tiến hành thí nghiệm chuyển hóa acid arachidonic nội sinh thành LTB4 (ở 37"C). Ông nghiệm phản ứng gồm có 2 mrnol/1 CaCI2, 0,5 mmol/l MgCU và thuốc nghiôn cứu. Sau khi ủ 15 phút, phản ứng được hắt đầu bằng cách thcm 12,5 ụg chất mang ion calci 23 187 và 2 ụg
33
glutathionc. Sau 5 phúl, phán ứng được dừng lại bằng cách thêm 30 ịil HCI 0.1 M ở 0l,c . Sau đó ly lâm 2 phút ở Ơ’C. phần dịch nổi phía trên được đcm đi sác ký HPLC để tách lcucotrien B4. Dùng các thuốc chuẩn đã biết đê xác định các đồng phân cis-, trans-, và Cpi-LTB4. Việc phân hiệt 3 đổng phân có thổ theo dõi hằng phcp đo quang ở hước sóng 278 nm.
Đánh giá So sánh kết quả giữa mẫu có thuốc thử với mẫu chứng không có thuốc và mẫu có thuốc đã biếl Các dụng. 2.3.4. Gây giải phóng các cyíokin từ tế bào bạch cầu [29]
Nguyên tắc Các cvtokin đại diện cho một nhóm các peptid có hoạt tính sinh học cao. Chúng liên quan tới nhicu quá trình tế bào như phản ứng vicm. miễn dịch và nhiều đáp ứng khác. Việc khóa các 1L-1 và TNF-tt đã giúp điều trị thành công bước đẩu trên các bệnh nhân viêm khớp dạng thấp, viêm ruột hoặc các bệnh thải manh ghép. Mô hình gây giải phóng cytokin được dùng để phát hiện các thuốc mà tác dộng với lipopolysaccharid trong quá trình giải phóng cytokin từ tê bào bạch cầu đom nhân,
Tiến hành Chuấn bị tế hào hạch cầu: lấy 10 ml máu tươi đã cilrat hóa pha loãng 1:1 với đệm PM 16 và đưực lót với 15 ml dung dịch Lymphoprcp*. sau đó ly tâm ở 400 g trong 30 phút ở 20 "C. Phần tế bào là một vòng trắng xuất hiện ở giữa 2 pha và được lấy ra cẩn thận bằng 1 ống tiêm, pha loãng 1:1 với PM 16 rồi ly tâm lại trong 15 phút. Cắn được rửa sạch với 10 môi trường RPMI 1640 có thêm L-glutamin 300 mg/1. Phần tế bào đã rửa được cho vào trong 1 ml môi trường RPMI 1640 có Ihêm L-glutamin
300
mg/1.
HEPES
25
mmol/l.
huyết
thanh
bê
5%
và
penicillin/streptomycin 100 IU/mi. Điều chính hỗn dịch tế hào tới khoảng 5 X lo** lê bào/ml. Tạo các cytokin: tiến hành trong các đĩa 96-vvell rất nhỏ. Lấy 0,23 ml hỗn dịch tố bào, 500 ng LPS, thuốc nghicn cứu hòa vào Irong 0,01 ml DMSO/nuớc (1:10). Hỏn dịch tế bào được ủ trong tủ thường ở 37°C/5% C 0 2. thời gian ủ thường 20 giờ (xác định IL-6 thì ủ 4 giờ, IL-8 thì ủ 1 giờ). Phản ứng dừng lại bàng cách đặt đĩa vào
34
trong bát nước đá. Sau đó lỵ tâm đìa tại 2000 rpm trong 2 phút. Dùng kit ELI SA thích hợp để xác định nồng độ cytokin.
Đánh giá Xác định nồng độ cytokin và so sánh giữa mẫu dùng thuốc với mầu chứng không dùng thuốc.
35
3. BÀN LUẬN 3 .1 .Bàn luận về mô hình nghicn cứu tác dụng chống viêm của thuốc
3.1.Ị. Mô hình gày viém cấp và bán cấp 3.1.L I . Mô hình gày phù bàn chán chuột ★ Mò hình gây phù bàn chân chuột bàng carrageenin Sau khi liêm carragccnin, đáp ứng viêm tiến triển theo 2 pha (Vinegar và cộng sự. 1969). Pha đầu tiên được đặc trưng bằng sự giải phóng histamin. serotonin và các kinin. Pha thứ hai đặc trưng bởi sự giải phổng prostaglanđin. Các chất irung gian này đã gây nên phù chân chuột. Vì vậy, các thuốc có tác dụng làm giảm phù trên mô hình này có thê có tác dụng ức chế riêng lc hoặc đổng Ihời các chất trung gian hỏa học trên.[39] Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin là một mô hình đơn gian, dc làm, thời gian tiến hành nhanh. Carragccnin là chấl tan trong nước lạo ihành dung dịch, do đó sẽ tiêm được liều chính xác, tạo độ phù ổn định. Tuv nhiên, khi đo thổ tích bàn chân chuột phụ thuộc vào yếu tố chủ quan là người tiến hành thí nghiệm nên kết quả có độ chính xác chưa cao. Mò hình thường được đùng đc sàng lọc thuốc mới. Carrageenin là chất rẻ tiền, sẩn có ở nhiều nơi trên thê" giới, ử Việt Nam carrageenin có nhiều trong một loại tảo đỏ ở bờ biển. Vì vậy, mõ hình này có thổ áp dụng rộng rãi ở Việt Nam. [10] ★ Mô hình gâv phù chân chuột khác
Gáy phù bằng kaolin: Cơ chế gâv vicm của kaolin cũng tương tự như carrageenin. Mô hình này hiện nay ít được sử dụng do một số han chế: kaolin gây phù rất mạnh vì vậy đê đánh giá khả nàng ức chế phù của thuốc sẽ gặp khó khăn, nhất là với các thuốc có nguồn gốc dược liệu; hơn nữa. kaolin không tan trong nước và tạo thành hồn dịch nôn lượng tiêm khó chính xác. phù tạo thành không đều và ổn định.
Gày phù bằn g/orm alin : đây cũng là một mô hình dùng để đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc. Trên thực nghiệm người ta thu được kết quả: phenylbutazon không có tác dụng ức chế phù tạo thành do íormalin; indomcthacin và acid íluícnamic không ức chế phù ử liều đã có lác dụng trên các
36
IT 1 Ô
hình khác;
methdilazin và cyproheptadin có khả nãng ức chế phù trên mồ hình này. Do vậy cư chế gây phù trong mỏ hình này có thổ là do íormalin kích thích làm vỡ tế hào mast. giải phóng histiimin và serotonin, khống có sự tham gia của prostaglandin.
Gày phù bằng dextran: cơ chế gây phù chân chuột bằng dextran thông qua việc giải phóng histamin và scrolonin (Parratt và Wcsl. 1957). Theo nghiên cứu của Wintcr, phcnvlbutazonc không có tác dụng giám phù trên mô hình nàv. ngoại trừ điều đó thì mỏ hình gây phù bằng dcxtran giống mỏ hình gây phù bàng carrageenin hơn các mổ hình khác. Đây cũng là mô hình đã được sử dụng nhiều ở Việt Nam.
Mô hình gãy phù bằng các chất trung gian hóa học (histamin. prostaglandin. bradvkinin..): mỏ hình gây phù chân chuột hằng các chấl trung gian hóa học là đưa trực tiếp các yếu tố của phán ứng viêm vào cơ thé. phát dộng và khuếch đại phản ứng viêm. Từ đó đánh giá được thuỏc nghiên cứu lác dụng theo cơ chế nào? Mò hình này hiện nay còn sử dụng rất hạn chc ớ Việt Nam. ★ Mó hình gảy phù du chán tliưưng Mô hình đã mô phỏng tình trạng chấn thương tương tự trong làm sàng khi cư thổ bị ngã. va đập...Khi đó. màng tế bào bị kích thích giải phổng aciđ arachidonic, acid arachidonic chuyển hóa thành prostaglandin gây sưng, phù nồ, Các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy mô hình gây phù chân chuột do chấn thưưng tạo độ phù ổn định, mức độ phù vừa phải (thường 25%). tránh được phù quá mạnh đôi khi khống hồi phục của carrageenin. Đâv là mô hình tốt để đánh giá tác dụng chống viêm tại chỗ của các thuốc (thuốc dán ngoài tla. cồn xoa bóp. cao xoa bóp.. . Mò hình này đơn giản, dẻ thực hiện, rất phù hợp trong nghiên cứu ử Việt Nam-nơi có nhiổu vị thuốc, hài thuốc cổ tru vén có tác dụng điều trị chấn thưtmg (bong gân, ngã gâv bầm tím. tụ m áu ...).[25]
3.1.1.2. Mó hình gày phù tai chuột Tương tự với mô hình gây phù chân chuột, các mổ hình gây phù tai chuột cũng dựa trôn nguyên tắc là các chất gây viêm kích thích giai phóng các chất trung gian hóa học như hisliimin, prostaglandin...làm giãn mạch, tăng tính thấm, thoát dịch và gây phù. Do đó có thể sơ bộ biết được các thuốc có tác dụng trên mỏ hình này là theo cơ chế nào? Phương pháp tiến hành và đánh giá các mổ hình gây phù tai
37
chuộl đơn giản, dỗ Ihực hiện. Mó hình thường dùng để đánh giá tác dụng tại chỗ của các thuốc. Tuy nhiên hiện nay mô hình này ít được sử dụng tại Việt Nam. Trong các mô hình gây phù tai chuột, mô hình gây phù bàng oxazolon dựa trên phản ứng quá mẫn muộn của cơ thổ với oxazolon ncn thường thích hợp trong nghiên cứu các Ihuốc chông viêm slcroid và mô hình này đòi hỏi thời gian tiến hành dài hơn các mô hình khác. Mô hình gây phù tai chuột bằng dầu ba đậu là mô hình rất lốt đổ đánh giá tác dụng của các Ihuốc chống viêm steroid khi có thổ xác định đồng thời tác dụng ức chế phù và tác (lụng làm teo tuyến ức của thuốc.
3.1.ỉ . 3. Mô hình gáy tăng tính thấm thành m ạch Cư chế gây tăng lính thấm thành mạch cũng iưưng tự như cư chế gây phù chân chuột và tai chuột. Do vậy các thuốc có lác dụng trên mô hình này có cơ chế chống viêm là ức chế giải phóng các chất trung gian hóa học hoặc đối kháng trực tiếp với các chất ấy trên reccptor. Mô hình này thường dùng trong sàng lọc thuốc mới.
3.1.1.4.
Mô hình gáy ban đỏ
Trong đáp ứng viêm do tia u v gây ra xuất hiện cả ban đỏ và sự thay đổi tính thấm thành mạch. Tuy nhiên, thời gian tiến triển của hai triệu chứng này khác nhau. Thông thường ban đỏ xuất hiện sau 1 giờ và mạnh nhấl sau khoảng 2-4 giờ. Còn tính thấm thành mạch đạt lớn nhất sau 12-20 giờ. Hơn nữa sự tăng tính thấm thành mạch trong mô hình này yếu hưn nhiều so với các mô hình tiêm chất kích thích vào trong da. Vì vậy, mức độ tăng tính thấm không phải là Ihông số thích hợp đánh giá mức độ ban đỏ do tia uv gày ra. Qua nghicn cứu. người ta nhận thấy các glucocorticoid không có tác dụng ức chế ban đỏ trong mô hình này. Như vậy các yếu tố gây stress đã không tham gia vào đáp ứng viêm trong mô hình này. Các NSAIDs được thấy là có tác dụng ức chế ban đỏ, tuy nhiên NSAIDs chỉ có tác dụng trong thời gian đầu và hiệu lực giảm dần dù Ihuốc được dùng nhác lại. Điều này đưa ra giả thiết rằng trong giai đoạn đầu của đáp ứng viêm proslaglandin là châì chịu trách nhiệm chủ yếu và khi đó NSAIDs thể hiện được tác dụng. Sau đó. các yếu tố khác tham gia vào đáp ứng mà NSATDs khi đó không còn tác dụng. Các yếu tô này hiện nay vẫn dang được nghiên cứu và sẽ mơ ra những hướng mới trong việc nghiên cứu thuốc chống viêm.
Trong đánh giá kết quả, mức độ ban đỏ được tính hằng phương pháp lính điểm, phương pháp này mang tính chủ quan và không chính xác. Vì vậy cán nghiên cứu phương pháp tính chính xác hơn. Hiện nay có một số nhà nghicn cứu đã đề xuất phương pháp xác định mức độ han đỏ dựa vào các yếu lô liên quan như nhiệt độ. màu sắc ban đò.
3.1.1.5.
Mỏ hình tạo túi u hạt
Đây là mô hình tạo một viêm bán cấp dùng đổ đánh giá đổng thời lác dụng chông rỉ dịch và chống lăng sinh của thuốc qua sự phát triển cúa túi u hạt. Sự tãng sinh tế bào thể hiện qua độ dày thành túi. Sự rí (lịch đặc Irưng bởi sự thâm nhiễm các hạch cầu vào trong ổ viêm. Theo kết quả nghiên cứu, các thuốc chông viêm steroid có tác dụng mạnh hơn hẳn các thuốc chống viêm khổng steroid trôn cá sự tăng sinh tê bào và sự rỉ dịch. Do đó mô hình này thích hợp cho nghiên cứu các thuốc chông viêm stcroid cả toàn thân và tại chỗ.
3.1.2. Mô hình gày viêm mạn tính 3.1.2.1. Mớ hình gày u hạt thực nghiệm Khi đưa vào cơ thổ tác nhân gàv vicm trơ như amian, hòng...thì cơ thể phản ímg bằng cách tập trung nhiều loại tế hào xung quanh dị vật và tạo thành u hạt. u hạt [à một trường hưp đặc biệt cua viêm mạn lính, tổ chức này bị bao bọc bới một lớp xơ gồm collagen, proteoglycan...nên không đủ máu tưới đến. thuốc khỏ thâm nhập vào, việc điều trị thường khó khãn và lâu dài. Một thuốc có khả năng ức chế u hạt đồng nghĩa thuốc đó có tác dụng chống vicm mạn. Các mô hình gây u hạt thực nghiệm tiến hành đơn giản, cho kết quả tương đôi tin cậy nôn hay được áp dụng trong nghiên cứu thuốc chông viêm mạn tính. Mô hình gây u hạt bằng amian: amian là vật liệu trơ khi đưa vào cơ thổ. dễ tạo hình dáng, kích thước đồng đều, dẽ hóc tách và sẩn có, rc tién ncn đây là nguyên liệu gây u hạt thực nghiệm hay đưực sử dụng. Mô hình này hiện nay được sử dụng phổ biến ớ Việt Nam. Mô hình gây u hạt bàng bông: đây là mô hình gây u hạt thực nghiệm đầu tiên và đến nay vẫn dược sử dụng nhiều trên Ihế giới. Các nhà nghiên cứu đã thấy ràng quá trình tăng sinh tế bào tạo u hạt hằng mỏ hình này gồm 3 giai đoạn: giai đoạn 1
39
là giai đoạn thấm dịch, xuất hiện irong 3 giờ đầu tiên, viên bông sẽ ngấm dịch và đạt bão hòa; giai đoạn 2 là giai đoạn rỉ dịch, xuất hiện sau 3-72 giờ cấy bông, pha 3 là pha tăng sinh với sự xuất hiện của collagen trong u hạt. Do đó có thổ nghiỏn cứu cơ chế lác dụng của các Ihuốc thông qua các giai đoạn này. Mó hình này rất nhạy với các thuốc chống vièm slcroid.
3.1.2.2. Mô hình gây viêm đa khớp thực nghiệm Viêm đa khớp là một bệnh viêm mạn tính phổ biến trôn thế giới và Việt Nam. Mặc dù đã tìm được nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh của bệnh nhưng quá trình điều trị vãn gặp nhiều khó khăn. Mỏ hình gây viêm đa khớp (hực nghiệm đã mõ phòng tình trạng bệnh giống như trong thực tế và cách sử dụng thuốc ở đâv cũng tương tự với cách sử dụng thuốc của bác sĩ lâm sàng. Đặc hiệt mô hình gây viêm khớp bằng chất bổ trợ Freund hiện nay được coi là mò hình lốt nhất để nghiên cứu viêm khớp dạng thấp. Các thuốc chống viêm sleroid và chông viêm không steroid đều thấy có tác dụng làm giảm các triệu chứng cúa bệnh trên mô hình này, tuy không chữa khỏi hoàn toàn. Như vậy, các mô hình gây viêm đa khớp thực nghiệm đã góp phẩn quan trọng trong việc tìm ra thuốc điểu trị bệnh. Tuy nhiên, để có thổ chữa được bệnh hoàn toàn cần tìm ra những mô hình hiệu quả hưn nữa để giúp cho công tác nghiên cứu phát triển thuốc mới đạt kết quả lốt nhất.
3.1.3. Mô hình nghiên cứu c ơ chẻ chống viêm 3.1.3.1. Kết tập bạch cáu da nhân bởi F M L P Trong phản ứng viêm, các bạch cầu đa nhân bị thu hút hởi nhiều chất hóa ứng động Irong đó có FMLP - một chất có gốc N-formyl-methionyl- là cấu trúc đạc thù
ở các pepticỉ của vi khuẩn mà ở người không có. FMLP làm thay đổi mạng lưới vi sợi aclin của bạch cầu đa nhân và làm thay đổi hình Ihể, sự di chuvển của bạch cầu tới khu vực viêm, để rồi bám dính vào thành mạch và thoát mạch. Khi bạch cầu tập trung tại nơi có nồng độ chất hóa ứng động cao. bạch cáu có thể dính vào nhau làm nghẽn mạch gây cản trở tuần hoàn mao mạch và tĩnh mạch, cuối cùng gây phá hủy nội mô do các bạch cầu giải phóng các prolease và các gốc tự do chứa oxy gây độc cho mô. Do đó ức chế sự kết tập bạch cầu là cơ chế cần thiết để bảo vệ cơ thể. Các
40
thuốc có tác dụng ức chế hóa ứng động trong mô hình này có thè có cơ chế là gắn cạnh tranh với FM LP trcn các rcccptor màng tế bào bạch cầu.[9] 3.1.3.2. Hóa ứng động đại thực bào Đại thực bào là những lế bào đáu tiên bị thu hút và hoạt hóa bởi các chất gây hóa ứng động. Tại ổ viêm chúng tiết ra các yếu tố gây viêm như IL-1. IL-6 gây khuyốch đại phản ứng viêm ra xa; chúng tiết các cnzym tiêu protcin, glucid như gelalinase, collagenase, elastinasc...tiốt NO và các gốc tự do có oxy. Theo nghiên cứu của Dy M. và cộng sự, thioglycollat làm tăng số lượng đại thực bào do tác dụng hóa ứng động, dẫn đến làm tăng nồng độ các enzym tại ổ viêm. Thuốc có tác dụng trên mô hình này sẽ có cơ chế là ức chê' sự hóa ứng động đại thực bào hoặc làm bền vững màng lysosom để ngăn giải phóng các cnzym phân giải.[28] 3.1.3.3. Thí nghiệm vể các chất chuvên hóa của acid arachidonic Các chất chuyển hóa của acid arachidonic là những chất có vai trò lớn trong các đáp ứng viêm và là những mục tiêu mà thuốc chống viêm hướng tới. Vì vậy những mô hình liên quan tới các chất này là ihực sự cần thiết để làm sáng cỏ thêm cơ chế chống viêm của thuốc. Prostaglandin 1Ì1 chất được nhắc lới đầu liên vì vai trò của nó trong phản ứng viêm rất quan trọng. Prostaglandin Iham gia vào mọi phán ứng của viêm, tạo nên các triệu chứng điển hình cho viêm như sưng, nóng, đỏ, đau. Mô hình oxy hóa acid arachidonic bởi COX-1 hoặc mô hình tạo prostaglandin ở tế bào bạch cầu cho phcp tìm hiểu cơ chế chống viêm của một thuốc thông qua tác dụng ức chế tạo prostaglandin. Tuy nhiên như chúng ta đã biết vổ vai trò của COX-I trong hoạt động sinh lý của cơ thổ, các thuốc ức chế COX-1 mạnh sẽ gâv ra nhiều tác dụng không mong muốn như loét dạ dày tá tràng, viêm thận...Xu hướng hiện nay là tìm các thuốc ức chế chọn lọc trên COX-2 để lầm giảm tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa. trên máu. trên thận...nhưng liệu các thuốc tác dụng ưu ticn trôn COX-2 có ít tác dụng không mong muốn hơn các thuốc NSAIDs kinh điển vẫn còn là vấn đề cần nghiên cứu kỹ. Do đó các ITIÔ hình nghiên cứu về COX-1 và COX-2 là những mô hình cần thiết trong nghiên cứu vé các thuốc chống viêm.
41
Leucotrien B4 là một lcucolricn điền hình cho Iihóin lcucotrien với hoạt tính hóa ứng động bạch cầu đa nhân khá mạnh, do đó thúc đẩy phản ứng viêm liến triển. Vì vậy ức chế sự tạo thành leucotrien cũng là 1 cơ chế chống viêm cần được quan tâm nghiên cứu. Và mô hình tạo leucotrien B4 thích hợp để đánh giá khả nâng ức chế đó. 3.1.3.4.
Gây giải phóng cytokin từ tế bào bạch cẩu người
Cylokin là nhóm các chất có hoạt tính sinh học mạnh và ảnh hưưng tới rất nhiều giai đoạn của phán ứng viêm. TNF-a là một cytokin vicm mạnh. Nó Iham gia trong các bệnh mạn tính như viêm khớp dạng thấp, xơ cứng bì hệ thống. Đó là yếu tố khuyếch đại phản ứng viêm do hóa ứng động bạch cầu đơn nhân và đa nhân trung tính, làm vỡ hạt và phóng thích các supcroxyd. thoái hóa mô. tác động lên trung tâm điều nhiệt gây sốt... IL-1. IL-6. IL-8 tăng cường phản ứng viêm tại chỗ và toàn thân hóa phản ứng. Vì vậy việc giải phóng nhiều các cytokin sẽ gây hại cho mô, cho cơ thể. Do đó cẩn phải ức chế sự tăng sinh các cytokin này đổ bảo vệ cơ thể. Mô hình cho phép đánh giá khả năng ức chế các cytokin của thuốc, nhưng ức chế vào cytokin nào, theo cơ chế phân tử ra sao thì còn là vấn đề cần phái nghicn cứu ihêm. 3 .2 .Hướng lựa chọn mò hình nghiên cứu thuốc chỏng viêm ở Việt Nam Trong giai đoạn thử tác dụng liền lâm sàng của thuốc, ngoài việc chứng minh thuốc mới có tác dụng dược lý. còn phải tìm ra cơ chê' lác dụng của thuốc. Vì vậy, việc lựa chọn mô hình nghiôn cứu phù hợp là thực sự cần thiết, đặc biệt trong điều kiện công nghệ, kĩ thuật ở Việt Nam. Sau đây là đé xuất của chúng lôi về cách tiến hành nghiên cứu một thuốc chống vicm
★
Mó hình gây viêm cấp và bán cấp Theo chúng tôi, muốn chứng minh một thuốc (thuốc y học cổ truyền hay hoạt
chất mới) có tác dụng điểu trị viêm, Irướe ticn nên tiên hành chứng minh tác dụng chống viôm trên các mô hình gây viêm cấp và bán cấp. Các kết quả thu được trên các mô hình này sẽ cho phép đánh giá một cách sơ bộ thuốc có lác dựng chống vicm hay không và mức độ tác dụng của chúng. Chỉ tiêu đánh giá ở các ihí nghiệm này chủ yếu thông qua khả năng ức chế độ phù (chân chuột hoặc tai chuột) hoặc thông
42
qua làm giảm các dấu hiệu ban đỏ hoặc thông qua ức chế sự thoát mạch của huyết tương hoặc thông qua ức chế sự tăng liết dịch rỉ viêm... ★
Mó hình gày viêm mạn tính Sau khi đã có các kết quả về tác dụng của thuốc trên mỏ hình gây viêm cấp và
bán cấp, tiếp tục đánh giá trcn các mô hình gây viêm mạn như tạo u hạl thực nghiệm, gây viêm đa khớp thực nghiệm...Chỉ tiêu đánh giá trong các mồ hình này thông qua khả năng ức chế lạo u hạt hoặc ức chế các triệu chứng viêm khớp. Các chỉ tiêu đánh giá trong các mô hình gây viêm cấp. bán cấp và mô hình gây viêm mạn thực chất [à các triệu chứng của vicm thường gập trôn lâm sàng. Vì vậy. các kết quả thu được sẽ cho biết thuốc nghiên cứu có làm giảm các triệu chứng viêm hay không và từ đó khảng định thuốc có tác dụng chống vicm hav không. ★
Mó hình nghién cứu cơ chẻ chông viêm Tuy nhiên, nếu việc nghiên cứu chỉ dừng lại ở các mô hình gây viêm cấp, bán
cấp và mỏ hình gây viêm mạn thì vấn đề đậl ra là không biết thuốc tác động vào khâu nào của quá trình viêm đổ việc sử dụng thuốc được hiệu quả hơn, đúng bệnh hơn và tránh được tác dụng không mong muốn của thuốc. Vì vậy cần thiết phải nghiên cứu thêm về cơ chế tác dụng của thuốc. Để tìm biết thuốc có tác dụng chống vicm theo cơ chế nào trước tiên phải hiểu rõ cơ chế gây viêm cũng như các yếu tố liên quan đến phản ứng viêm. Hiện nay có rất nhiểu mô hình nghiên cứu cơ chế chống viêm, mỗi mô hình chỉ đề cập đến một cơ chế nào đó vì vậy luỳ iheo điều kiện và yêu cầu cũng như kết quả nghicn cứu sơ bộ có chế chọn một số mô hình đổ đánh giá cho phù hợp. Theo chúng tôi các yếu tố được đánh giá có liên quan nhiều tới cơ chế gây viêm và chống viêm là: prostagỉandin, enzym c o x , leucotricn B.ị, đại thực bào. bạch cầu đa nhân... Vì vậy các mô hình nghiên cứu vc cơ chế chống viêm của thuốc quan trọng là: nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đối với việc tạo ra prostaglandin. leucotrien B4, khả năng ức chế enzym c o x đặc hiệt là ức chế COX- 2, khả năng ức chế sự tập trung của bạch cáu đa nhân, đại thực bào hoặc ức chế giải phóng cytokin. Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi phương tiện và kỹ thuật cao ncn khả năng áp dụng ở Việt Nam còn hạn chế. Thực tế. qua thu thập tài liệu chúng tôi nhận
43
thấy ở Việt nam chưa có công Irình nào đi sâu nghiên cứu cơ chế chống viêm của thuốc. Vì vậy đây cũng là phần nghiên cứu cần nhanh chóng triển khai dể các nghiên cứu về thuốc chông vicm nói riêng và các nghiên cứu khác ở Việt Nam có độ chính xác cao hơn.
44
4. K ẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 4.1. Kết luận —
Đề tài đã tổng kết được mộl số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm
của thuốc đang được áp dụng tại Việt Nam và trên Thê giới, chia thành 3 nhóm: + Mô hình gây viêm cấp và hán cấp gồm: Mô hình gây phù bàn chân chuột Mô hình gây phù tai chuột Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch Mô hình gây vicm màng phổi Mô hình gây ban đỏ Mô hình tạo lúi u hạl + Mô hình gây viêm mạn tính gồm: Mô hình gây u hạt thực nghiệm Mô hình gày viêm đa khớp thực nghiệm + Mô Kình nghiên cứu cơ chế chống viêm gồm: Gây kết tập bạch cầu đa nhân Gây hóa ứng động đại thực bào Thí nghiệm về các chất chuyển hóa của acid arachidonic Gây giải phóng cytokin từ tê bào bạch cầu. — Đề tài đã đánh giá từng mô hình, khả năng áp (lụng mô hình trong nghiên cứu tác dụng chống vicm của thuốc. — Đề tài đã đề xuất hướng lựa chọn các mô hình nghiên cứu áp dụng vào điều kiện thực tế của Việt nam 4.2. Đề xuất Từ kết quả thu được và dựa vào đicu kiện cụ Ihc, chúng lôi nhận thấy đổ hoàn thiện hệ thống các mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm để phục vụ cho nghiên cứu thì cần tiếp tục: — Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử của các mô hình để từ đó đưa ra được cơ chế tác dụng của Ihuốc.
45
1
— Cập nhật, thống kê, phân lích đấy đủ hưn về các mô hình nghiên cứu tác dụng chống vicm của ihuốc hiện nay trên thố giới — Xây dựng quy trình các mô hình áp dụng trong nghiên cứu lác dụng chống viêm của thuốc để đạl hiệu quả tốt và phù hợp với điều kiện Việt Nam.
46
T À I L IỆ Ư T H A M K H Ả O Tài liêu tiếng Viêt
1.
Vũ Hổng Anh (1999), “ Góp phần nghiên cứu tác dụng chống viêm của chê' phẩm chứa papain”. Luân văn Thạc SỸ Dược học
2.
Bộ môn Dược học cổ truyền- trường Đại học Dược Hà Nội (2005). Dược học r ổ
truyền, tr. 201-202. 3.
Bộ môn Dược liệu- trường Đại học Dược Hà Nội (2004). Bài ỊịiàììỊị Dược liệu, tập 1. tr.292-293.
4.
Bộ môn Dược lý- trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Dược lý học, tập 2. Ir. 231244. 255-260.
5.
Bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh-1rường đại học Y Dược Thành Phô' Hổ Chí Minh (1999). Miền dịch sinh lý bệnh . tập 1. NXB Thành Phô Hồ Chí Minh. tr. 120-133.
6.
Bộ môn Miễn dịch và sinh lý bệnh- trường đại học Y Hà Nội (1991). Sinh lý bệnh, NXB Y học, tr. 68-76.
7.
Bộ môn sinh lý học- trường đại học Y Hà Nội (2006). Sinh lý học, tập 1, NXB Y học, ư. 118-126.
8.
Bộ y tế (2006). Dược làm sàng. NXB Y học, tr.205-234.
9.
Borel J. B., F-X Maquart. Ph. Gillcry. M.Exposito (2006), Hóa sinh cho thầv
thuốc tâm sàng, NXB Y học, tr.21-61. 10. Đỗ Trung Đàm (1996), “ Đánh giá mô hình gây phù thực nghiệm hàng kaolin và caragenin để nghiên cứu tác dụng chống vicm cấp của thuốc”. Tạp chí Dược liệu. sỏ 2, tr.49-51. 11. Đỗ Trung Đàm (1996), “ Tác dụng chông viêm mạn tính của bài thuốc chữa thấp khớp SASP-5221”, Tạp chí Dược học . sô 10, tr.23. 12. Trần Mạnh Dũng (2005), “Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học và tác dụng chông viêm, giảm đau của huyết giác (Dracưena camboiìiưna Pierre ex Gapnep..
Draciienaceae)”, Khóa luận tô! níịhiệp dược .vỹ dại học. 13. Nguyễn Thị Mai Hương (20Ơ6), ‘Tổng quan về hóa sinh viêm và thuốc đieu trị viem”, Khỏa luận tốt nghiệp Dược sỹ dại học 14. Nguyễn Hoàng Hải (2001), “Nghiên cứu tác dụng chống viêm cũa Núc nác kết hợp với a-chymotrypsin”, Luận ván Thạc sỹ Dược học 15. Lê Thị Diẻm Hổng (2002), “Góp phần tìm hìcu tác dụng chống viêm của hoa cây kim
ngùn
{Lonicera japonica
Thunb..
Capriíoliaceae)
kết
hợp
với
a-
chymotrvpsin”. Luận văn Thạc sỹ Dược học 16. Lê Thị Diỗm Hổng, Nguyễn Thị Hổng Nhiên, Nguvỗn Thị Hổng Vân. Nguvẽn Viết Thân, Nguyền Xuân Thắng (2007), “Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của saponin và ílavonoid cây kim ngàn”, Tạp chí Dược học , số 10. tr.24-25. 17. Vũ Mạnh Hùng (1996), “ Nghiên cứu lác dụng kháng khu án chống viêm của Hạch hoa xà và tác dụng cua nó đối với mội số chỉ tiêu chống viêm trên dộng vậi thực nghiệm nhiem Dichlor diethylsulííđ”, Luận (hỉ Phó Tiến sĩ Y Dược. 18. Mai Lc Hoa, Nguyên Gia Chấn, Nguvễn Thượng Dong. Nguyễn Thị Dung (] 998). “Nghiên cứii tác dụng chống viêm của cây lão quan di thực ở Viội Nam (Genuùum
ihunbenỊÌi Sieb. Et 7.UCC., Geraniaceae)", Tọp chí Dược liệu, sỏ 3, ir. 78-81 19. Đoàn Thị Nhu. Đỗ Trung Đàm. Phạm Duy Mai (2006). Phương pháp nghiên cứu
tác dụng dược lý của thuốc lừ dược thảo , NXB Khoa học và Kv thuật. ír. 139-149. 20. Đào Vãn Phan (2004), Các thuốc iịiâỉìĩ đau chong viêm, NXB Y học, tr. 49-51. 21. Lê Đình Roanh. Nguyẽn Đình Mão (1997), Bệnh học viêm và nhiễm khuẩn, NXB Y học, tr. I -132. 22. Vũ Thị Minh Thục, Đái Hằng Ngii, Đái Duy Ban (2000), Hỏa sinh phân tử của
miễn dịch di ứng, NXB Y học. 23. Từ điển bách khoa dược học (1999). NXB Từ điển Bách Khua, tr.630, 24. Phạm Vãn Ty (2001), Miễn dịch học . NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. tr. 21-22. 25.
Đào Thị Vui, Nguyễn Hoàng Anh, Phạm Ngọc Bùng (2003). “Đánh giá tác dụng
chống viêm và giảm đau trôn thực nghiệm của các dạng bào chê khác nhau từ cồn xoa bóp”, Tạp chí Dược liệu , lập 8, số 6, trang 180-183. Tài tiêu tiếng Anh
26. Ana Maria Diaz ct al. (2000), ‘i n vitro anti-inflammatory activity of iridoids and triterpenoid compounds isolated from Phiiiyrea latifolia L.’\ ỉìiol. Pharm. BulL Vol.23. No. 11, pp. 1307-1313. 27. Antonio Navarro, Bcatriz Dc Las Hcras and Angcl Villar (2001), “AntiinAammatory and immunomođulating ppropcrlics of a stcrol ừaction from
Sideritis foetens Clem.”, Biol. Pharm. Bu ìì. Vol. 24, No. 5, pp. 470-473. 28. Dy M.. Debray-Sachs M.. Kamoun p., Hamburgcr J. (1978), “Effcct of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes.”. Biomediãnc . 29(5), pp. 167170. 29. Gcrhard H. Vogcl (Ed.) (2002). DruỊỊ discovery and cvơluaiion- pharm acoloỳcaì
assay, Sprínger, 72-771. 30. Gurpreet Kaur. Sarvvar Alam M. and Athar M. (2004), “Nimhidin suppresses function of macrophagcs and ncutrophils: revalance to its antiintlammalory mechanism”, Phytothcr. Res., 18. pp. 419-424 31. Halis Sulevman and Mehmet Emin Buyukokuroglu (2001), “The effects of newly synlhcsizcd pyrazolc derivatives on formaldehyde-, carrugccnan-, and dextraninduccd acuic paw edema in rats”. Biol. Pharm. Bull, Vol.24, No. 10. pp. 11331136. 32. Ilenricks p. A. et al. (1984), “Aggrcgation of human polymorphonuclear leucocytes during phagocytosis of bacieria.", ỉmmunoiơỊỊy, 52(4), pp. 671-678 33. Hidco Inouc, Nobuyuki Nagata and Yasuko Koshihara (1995). “Participation of scrotonin in capsaicin-induced mousc car cdcma”. The .ỉapanese .ỉournaỉ <)f
PhannacoloịỊY, Voi.69, No. I ,pp.61-68
34. Jing Ming J1A. Chun Fu w u , * Wen LỈU. Hai Y U Yue HAO. Jian Hua ZHENG, and Yu Rong JI (2 0 0 5 ), “AiUiinf]ammatory and analgesic actìvitics ol' thc tissuc
cuiture of Saussitrca invoìucrata”, Bioi. Pharm. BnlL 28(9). pp. 1612— 1614 35. John M.Young. Doreen A Spires. Charles J. Bedord. Bonnie Wagncr. Stcphcn J. Ballaron and Lawrcncc M. de Young (1984), “The mouse car inflammatory response to topical arachidonic acid”, .ỉoitrnơỉ o f ỉnvestìqative Dennatology&2, pp. 367-371 36. Juhlin.L , Shroot. B (1992). “Effect of drugs on the early and hite phase ư v erythema”, Acta-Derm-VenereoìJ2Q ). pp. 222-3 37. Maria Alejanđra HOSSEN et al.(2006), “CalTeic acid inhibits compound 48/80-
induced allergic symptoms in micí'”, tìioỉ. Phann. Bid. 29(1), pp. 64— 66 38. Riesterer L. and iacques R. (1970). ‘The iníluence oí’ anti-inflammatory drugs on the
development
of
an
expcrimcntal
tramatic
paw edema
in thc
rai".
Phannacơlogy, Vol.3. pp.243-251. 39.
Robert A. Scherrcr, Mìchael w . NVhitehouse (1 9 7 4 ). Antiinỷỉammatory agenis-
chenùstn' andpharmacoĩogy, ACADEMIC PRESS, voíume II. pp. 33-122 40. Takashi Nosc and Kaito Tsurumi (1993). “Pharmacologicaí siudics on culaneous inflammation incluccđ bv Liltraviolct irradiation: quantification of erythema hy rcílcctancc colorimctry and corrclalion with culancous blood Dow”, ./. Pharm acoỊ.
62. pp. 245-256. 41. Winter c . A., Risley E. A. and Nuss G. w. (1962). “Carragecnin-induccd edema in high paw of ihc rats as an íissay for antiinlìmnmatory drugs”. Proc. Soc. Exp.
lìio. Meà., 111, pp. 544-547.
PHỤ LỤC 1.
M ỏi trư ờ n g R P M I 1640
Ca(NO,)2
L-Isoleucine
Polic acid
M g S 0 4 (anhyd)
L-Leucine
Glutathionc
KCI
L-Lvsinc • HC1
mvo-Inositol
NaHCO,
L-Methionine
Niacinamide
NaCI
L-Phenylalanine
D-Pantothenic acid
Na2H P 0 4 (anhyd)
L-Proline
Pvridoxinc
L-Argininc
L-Serine
Riboílavin
L-Asparagine
L-Thrconine
Thiaminc • HCI
L-Aspartic acid
L-Tryptophan
Vitamin B12
Cystinc • 2HCI
L-Tyrosine • 2Na
D-Glucosc
L-Glulamic acid
dihydrate
HEPES
L-Glutaminc
L-Valine
Phcnol rcd
Glycine
p-Aminobcnzoic acid
L-Glulaminc
L-Histidine
D-Biolin
NalỉCO,
Hydroxy-L-proline
Choi ine chloridc
2.
L y m p h o p rep "
Sodium Diatrizoate
9,1% (w/v)
Polysaccharide
5.7% (vv/v)
