Tehnologija Rekombinantne DNK

EVROPSKI UNIVERZITET BRČKO DISTRIKT I TUZLA UNIVERZITET U BRČKOM SEMINARSKI RAD

Tema: Tehnologija rekombinantne DNK Predmet: Biohemija

Student: Sumeja Fejzić

Mentor:

Broj indexa:

Tuzla, Maj 2018. godine.

Sadržaj

1. UVOD …………………………………………………………………………………....... 3 2. Rekombinantna DNK ............................................ .................................................................. ............................................ .......................................... .................... 4 2.1. Tehnologija rekombinantne DNK ............................................... ..................................................................... ................................... ............. 4-5 2.2. Kreiranje rekombinantne DNK .............................................. .................................................................... ......................................... ................... 5-6 2.3. Karakteristike organizama or ganizama sa rekombinantnom r ekombinantnom DNK .................................................... ....................................................... ... 7 2.4. Primjena tehnologije rekombinantne DNK .............................................................. .................................................................... ...... 7-8 2.4.1. Rekombinantni himozin ........................................ .............................................................. ............................................ ................................. ........... 8 2.4.2. Rekombinantni ljudski insulin ........................................ .............................................................. ............................................ ........................ 9 2.4.3. Rekombinantni ljudski hormon rasta (HGH, somatotropin) ........................................ ........................................ 9 .................................................. ... 10 2.4.4. Rekombinantni faktor zgrušavanja krvi, factor VIII ............................................... ................................................................. ............................................ ............................................ ........................... ..... 10 2.4.5. Zlatna riža ........................................... 2.4.6. Usjevi otporni na herbicide .............................................................. .................................................................................... .......................... .... 10 2.5. Restrikcijski enzimi ........................................... ................................................................. ............................................ ................................... ............. 10-12 2.6. Vektori za kloniranje .......................................... ................................................................ ............................................ ........................................ .................. 12 2.6.1. Plazmidi ...................................... ............................................................ ............................................ ............................................ .............................. ........ 12-13 .................................................................... ............................................ .......................................... .................... 14 2.6.2. Bakteriofag λ .............................................. 2.6.3. Kozmidi ........................................ .............................................................. ............................................ ............................................ .................................. ............ 15 2.6.4. Eukariotski plazmidi ........................................ .............................................................. ............................................ .............................. ........ 15-16

3. ZAKLJUČAK .............................................. .................................................................... ............................................ ............................................ ...................... ..... 17 4. LITERATURA ............................................ .................................................................. ............................................ ............................................ ............................ ...... 18

2

1. UVOD

Tehnike rekombinantne DNA ili po pularnijeg

naziva genetičko inžinjerstvo su jedno od

najrevolucionarnijih dostignuća u području prirodnih znanosti postignuto u

u zadnjih 30 -tak

godina. Taj skup razlićitih tehnika uzrokov ao je i izazvao pravu revoluciju u biologiji i to naročito u onom dijelu koji se odnosi na proučavanje naslijednih osnova (gena) i funkcioniranja živih bića. Zbog mogućnosti široke primjene u gotovo svim područjima prirodnih znanosti kao što su biologija, medicina, agronomija, biotehnologija i druge, te tehnologije postale su naša svakodnevnica. Naročito se za to ukazuje potreba u današnje vrijeme, kada je p utem

javnih glasila stvorena uglavnom negativna slika o dostignućima u

području prirodnih znanosti dobivenih putem tehnologije rDNA odnosno genetičkog inžinjerstva. S druge pak strane, razvijeni svijet koristeći spoznaje dobivene tehnologijom rDNA kroči krupnim koracima naprijed zahvaljujući upravo dostignućima temeljenim na tim tehnologijama.

Genetičko inženjerstvo (ili tehnologija rekombinantna DNA) je dobivanje

novih hibridnih nasljednih materijala izvan stanice i njihovo spajanje s prenositeljem (virusom,

plazmidom ili drugim ), čime se omogućava njegovo un ošenje u organizam

domaćina u kojem one prirodno ne postoje, ali u kojem se mogu umnožavati. Prenositelji ili vectori,

a umnožavanje kombinirane (hibridne) molekule DNA unesene u domaćina često se

naziva i kloniranje. Kako se ovim tehnikama dobiva rekombinirana (rekombinantna)

molekula DNA kao i u klasičnim rekombinacijama DNA, tehnologija se naziva i tehnologija rekombinantne DNA ili skraćeno tehnologija rDNA. Transgena biljka ili životinja je organizam koji u svom genomu ima ugrađenu rekombinantnu molekulu DNA, a koja se nasljeđuje u tom organizmu prema Mendelovim zakonitostima kao dominantna. Transgeneza je metoda i postupak kojom se postiže transgena jedinka. Organizam s ugrađenim stranim genom u svom genomu naziva se genetski modificirani organizam (GMO), termin koji se

često pogrešno pripisuje hrani koja se dobiva iz genetski modificiranih biljaka ili životinja. 1

1

https://www.slideshare.net/MelisaKadric/rekombinantna-dna-92342822

3

2. Rekombinantna DNK Rekombinantna DNK je vrsta DNK koja nastaje umjetnim putem. Ne postoji u prirodi, nego

se laboratorijskom genskom rekombinacijom (primjerice molekulsko kloniranje) različitih vrsta. Ovim se prenosi gen jedne vrste u genom sasvim druge vrste, biljne i životinjske i stvara se sekvencija nukleinske kiseline koja ne postoji u prirodi. Rekombinantnu DNK

moguće je napraviti jer su sve molekule DNK svih organizama iste hemijske strukture, a razlikuju se samo u nukleotidnom nizu unutar te strukture. Genska rekombinacija se primjenjuje radi proizvodnje vakcina, inzuli na

i dr. Rekombinantna DNK često se koristi u

kontekstu plazmida – kratkih, – kratkih, kružnih dijelova DNK s nekoliko gena na njima. Ubacivanjem plazmida u bakterije i uzgajanjem tih bakterija na tanjiru s agarom (kako bi se izolirali klonovi stanica bakterija), naučnici

mogu molekularno klonirati ubačeni fragment DNK. Za

reakciju spajanja vektorske i strane DNK upotrebljava se naziv rekombinacija in vitro, dok se produkt reakcije naziva rekombinantnom DNK. Da bi se molekule rekombinantne DNK autonomno replicirale, treba ih unijeti u bakterijske ili kakve druge prikladne stanice. 2

2.1. Tehnologija rekombinantne DNK

Tehnologija rekombinantne DNK predstavlja niz molekularno- genetičkih

metoda uz pomoć

kojih je moguće mijenjati nasljednu tvar stanice. Razdoblje rekombinantne DNK tehnologije je započeto otkrićem restrikcijskih enzima, 70-tih godina prošlog stoljeća. 1978. godine dodijeljena je Nobelova nagrada za fiziologiju i medicinu W. Arberu, H. Smithu i D. Nathasu

za njihov rad na otkriću restrikcijskih enzim a (endonukleaza). Tehnologija rekombinantne DNK naziva se i genetičko inženjerstvo; predstavlja novu biotehnologiju koja se razvila u posljednje dvije decenije. Primjena ove tehnologije u fundamentalnim istraživanjima je omogućila ogroman napredak biohemije, ćelijske biologije, genetike i drugih bioloških nauka. Tehnike genetičkog inženjerstva pružaju mogućnost da se pristupi detaljnom upoznavanju i razumjevanju složenih bioloških pojava kao što su mehanizmi kojim eukariotske ćelije kontrolipku ekspresiju

svojih genoma u toku razvića, imunološki odgovor, ćelijska dioba,

onkogeneza itd. Ali pored toga što obezbjeđuju preduslov za ogroman napredak u upoznavanju života, one pružaju čovjeku mogućnost da ga mijenja. Ove tehnike su našle 2


4

široku primjenu ne samo u naučnim istraživanjima, već u mnogim drugim oblastima ljudske djelatnosti kao što medicina, veterina, farmacija, agronomija, šumarstvo, zaštita životne sredine, tako da u velikoj mjeri utiču na poboljšanje kvaliteta života čovječanstva. Tehnologija DNK ob uhvata

niz tehnika uz pomoć kojih se može manipulirati malim

fragmentima hromozomske DNK ili pojedinačnim genima, u cilju ispitivanja i i mijenjanja njihove strukture, proučavanja mehanizama putem kojih se reguliše njihova ekspresija, upoznavanje strukture i uloge njihovih proteinskih produkata itd. Tehnike koje se koriste za

izolovanje pojedinh gena iz hromozoma i njihovo ugrađivanje u molekule DNK, koje se mogu unijeti u ćeliju u kojoj će se autonomno replicirati ispitivani gen, poznate su kao kloniranje DNK. 3

2.2. Kreiranje rekombinantne DNK

U kreiranju rekombinantne DNK primjenjuju se posebne metode odgovarajućeg laboratorijskog procesa. Formiranje rekombinantne DNK zahtijeva vektor za kloniranje

3

–


5

DNK molekula koja se replicira unutar žive ćelije. V ektori su uglavnom izvedeni iz plazmida ili virusa, a predstavljaju relativno male segmente DNK koji sadrže potrebne genetičke signale za replikaciju, kao i dodatne elemente radi lakšeg umetanja u stranu DNK, identifikaciju ćelije koje sadrže rekombinantne DNK, i gdje je to moguće, ispoljavanje strane DNK. Izbor vektora za kloniranja molekula ovisi o izboru organizma domaćina, veličine DNK koji se klonira, o tome i da li i na koji način način ispoljava strana DNK. DNK. Segmenti DNK se mogu kombinirati koristeći razne metode, kao što su kloniranje pomoću restrikcijskih enzima/ligaza ili

Gibsonovim sklopom. U standardnom standardnom protokolu protokolu kloniranja, kloniranja, kloniranje kloniranje

DNK fragmenata u osnovi uključuje sedam koraka: 

Izbor domaćina organizma i vektora za kloniranje;



Priprema vektora DNK;



Priprema DNK za kloniranje;



Kreiranje rekombinantne DNK;



Uvođenje rekombinantne DNK u organizam domaćina;



Izbor organizama koji sadrže rekombinantnu DNK i



Pregled i izbor (skrining) klonova sa željenim DNK umecima i biološkim svojstvom.4

4


6

2.3. Karakteristike organizama sa rekombinantnom DNK

U većini slučajeva, organizmi koji sadrže rekombinantnu DNK imaju normalne fenotipove. To se odnosi na njihov izgled, ponašanje i metabolizam, koji su obično nepromijenjeni, a jedini način da se pokaže prisu stvo rekombinantne DNK sekvence je da se ispita sama DNK, obično koristeći polimeraznu lančanu reakciju (PCR test). Ako je u rDNK sekvenci kodirajući gen koji se izražava, onda se prisustvo RNK i / ili proteinskog proizvoda rekombinantnog gena mogu otkriti ,

obično pomoću RTPCR ili Western blot metodom hibridizacije hibridizacije zapadne

hibridizacije. Ukupne fenotipske promjene nisu norma, osim ako su izabrani i modificirani

rekombinantni gen unesen da se generira biološka aktivnost u organizmu domaćina. Dodatni fenotipovi

koji se pojave, uključuju toksičnost na organizam domaćina uzrokovanu

proizvodom rekombinantnog gena, posebno ako je proteinska ekspresija prekomjerno

izražena u neodgovarajućim ćelijama ili tkivima. U nekim slučajevima rekombinantna DNK može imati pogubne efekte čak i ako nije izražena. Jedan mehanizam koji dovodi do te pojave da se to dogodi je insercijska inaktivacija, u kojoj je rDNK umetnuta u gen ćelije domaćina. U nekim slučajevima, istraživači koriste ovaj fenomen za „nokaut“ gena da odrede njih ovu biološku funkciju i značaj. Drugi mehanizam kojim umetnuta rDNK hromosomsku DNK može uticati na ekspresije gena je za neprikladna aktivacija prethodno neispoljenih gena ćelije domaćina. To se može dogodit, na primjer, kada se fragment rekombinantne DNK koji sadrži aktivni promotor nalazi pored prethodno „tihog“ gena ćelije domaćina ili kada gen ćelije domaćina svojom funkcijom obuzda ekspresiju gena putem insercijske inaktivacije rekombinantne DNK. 5

2.4. Primjena tehnologije rekombinantne DNK

Rekombinantna

DNK se široko koristi u biotehnologiji, medicini i istraživanjima. Danas,

rekombinantni proteini i drugi proizvodi koji su rezultat upotrebe tehnologije rDNK se nalaze

u suštini, u svakoj zapadnoj apoteci, ljekarskom ili veterinarskom uredu, medici nskim laboratorijama za ispitivanje i biološka istraživanja. Osim toga, organizmi koji su izmanipulisani korištenjem tehnologije rekombinantne DNK, kao i proizvodi dobijeni iz tih 5


7

organizama, pronašli su svoj put u mnogim farmama, supermarketima, medicinsk im ormarima pa čak i prodavnicama životinja, kao što su one koje se bave prodajom GloFish i drugim genetički modificiranim sortama i varijeteta. Najčešća primjena rekombinantne DNK je u osnovnim istraživanjima, u kojima kojima je ta tehnologija važna za većinu dosadšnjih aktivnosti u biološkim i biomedicinskim naukama. naukama. Rekombinantna Rekombinantna DNK se se koristi i za identifikaciju, mapiranje i sekvenciranje gena, kao

i utvrđivanje njihovih funkcija. Sonde rDNK se

upotrebljavaju u analizi ekspresije gena unutar pojedinih ćelija i širom tkiva cijelog organizma. Rekombinantni proteini se široko koriste kao reagensi u laboratorijskim eksperimentima i za generiranje sonde antitijela za ispitivanje sinteze proteina u ćeliji i organizmu. Mnoge dodatne praktične primjene rekombinantne DNK mogu se naći u industriji, proizvodnji hrane, humanoj i veterinarskoj medicini, poljoprivredi i bioinžinjerstvu. U nastavku su identificirani neki specifični primjeri. 6

2.4.1. Rekombinantni himozin

Pronađen u sirilu, himozin je enzim potreban za proizvodnju sira. To je bio prvi genetički modificirani prehrambeni aditiv koji se koristi u komercijalne svrhe. Tradicionalno, hymozin

je dobijan iz sirila, koje je vađeno iz četvrtog želuca mlijekom hranjenih teladi. Nučnici su kreirali nepatogeni soj (K-12) za bakterije Escherichia coli, za laboratorijsku proizvodnju

velikih količina enzima. Ovaj mikrobiološki proizvod rekombinantnog enzima, strukturno je identičan sa telećim, troškovi su neuporedivo manji, pa se proizvodi u ogromnim količinama. Danas je oko 60% tvrdog sira u USA napravljeno upotrebom rekombinantnog himozina. Od

1990. godine, godine, nadležna nadležna agencija za hranu i lijekove (FDA) je odobrila ovakav ovakav himozin deklaracijom „općenito priznato kao sigurno“ (GRAS), na osnovu podataka koji pokazuju da je enzim bio siguran.7

6 7

https://www.slideshare.net/MelisaKadric/rekombinantna-dna-92342822 https://www.slideshare.net/MelisaKadric/rekombinantna-dna-92342822

8

2.4.2. Rekombinantni ljudski inzulin

Gotovo u potpunosti zamijenio inzulin dobijen iz životinjskih izvora (svinja i goveda), za liječenje insulinski zavisni dijabetes. Rekombinantni insulin je sintetiziran umetanjem ljudskog inzulinskog gena u Escherichia coli ili kvasac ( Saccharomyces cerevisiae) koji onda proizvode inzulin za ljudsku upotrebu. upotrebu. 8

2.4.3. Rekombinantni ljudski hormon rasta (HGH, somatotropin)

Potreban je pacijentima čija žlijezda hipofiza stvara nedovoljne količine hormona za podršku normalnog rasta i razvoja. Prije nego je postao dostupan rekombinantni HGH, za terapeutsku

upotrebu je dobijan iz hipofize žlijezda žlijezda leševa. Ova nesigurna nesigurna praksa, je kod pacijenata pacijenata u razvoju, dovela do pojave Creutzfeldt-Jakobove bolesti. Rekombinantni Rekombinantni HGH eliminira ovaj

problem, a danas danas se masovno koristi u terapeutske terapeutske svrhe. Također Također je zloupotrebljen i kao kao stimulirajuća droga za poboljšanje spremnosti sportista i drugih osoba. 9

8 9

https://www.slideshare.net/MelisaKadric/rekombinantna-dna-92342822 https://www.slideshare.net/MelisaKadric/rekombinantna-dna-92342822

9

2.4.4. Rekombinantni faktor zgrušavanja zgrušavanja krvi, faktor

VIII

Faktor VIII zgrušavanja krvi koji se daje pacijentima s oblicima pomećaja krvarenja, kao što je hemofilija. Oni nisu u stanju da proizvedu proizvedu faktor VIII u količinama količinama koje omogućavaju omogućavaju normalno zgrušavanje krvi. Prije razvoja rekombinantnog faktora VIII, protein je dobijen obradom velike količine ljudske krvi iz više donatora , koja je imala vrlo visok rizik od prenosa krvno prenosivih zaraznih bolesti, na primjer HIV-a i hepatitisa B.10

2.4.5. Zlatna riža

Razne rekombinantne riže su konstruirana tako da imaju ekspresiju enzima, odgovornih za biosintezu β- karotena. Obećavaju značajno smanjenje učestalosti nedostatka vitamina A u svjetskoj populaciji. Zlatna riža trenutno nije u upotrebi, dok se ne riješe regulatorna pitanja njenih svojstava.

2.4.6. Usjevi otporni na herbicide

Oficijelne sorte važnih poljoprivrednih kultura (uključujući i soju, kukuruza sirak, uljanu repicu, lucerku i pamuk) su razvijene u pravcima koji podrazumjevaju rekombinantni gen koji

rezultira otpornošću na herbicid glifosat a poj ednostavljuje suzbijanje korova. Ovi usjevi se zajednički komercijalno koriste u nekoliko zemalja.

2.5. Restrikcijski enzimi

Restrikcijski enzimi ili endonukleaze su oni enzimi koji su sposobni razdvajati (sjeći) sekvence baznih parova na bazno specifič nim mjestima u molekuli DNK. Restrikcijski enzimi 10


10

režu (sijeku) molekulu DNK na određene bazne sekvence tako da svaki do sada izolirani enzim ima „svoju“ prepoznatljivu sekvencu koju izdvaja. To omogućava usmjereno „parčanje“ DNK pri čemu nastaju nastaju definirani dijelovi određene dužine i poznatih poznatih krajnjih sekvenci. Zato su ovi enzimi među najdjelotvornijim i najšire p rimjenivanim sredstvima u ciljanim istraživanjima u oblasti genetičkog inžinjerstva i biotehnologije. Pomoću ovih biološki aktivnih supstanci moguće je izdijeliti duge makromolekule DNK u fragmente koji su pogodni za dalje manipuliranje. Specifičnost mjesta rezanja omogućava bolje upoznavanje specifične strukture pojedinih sekvenci DNK. Poznato je nekoliko stotina restrikcijskih enzima za različite pozicije specifičnih rezova. Rezovi molekula DNK tvore sekvence koje mogu imati dvije vrste krajeva: 

oni koji su na krajevi koji strše i označavaju se kao ljepljivi krajevi. Ovi enzimi su veoma praktični za primjenu u genetičkom inžinjerstvu jer se dva različita fragmenta DNK lako spoje hibridizacijom između jednolančanih krajeva, pod uslovom da su oba fragmenta dobijena uz pomoć istog enzima (tada (tada su njihovi krajevi komplementarni); komplementarni);



glatki rezovi bez stršećih DNK krajeva, a zovu se tupi krajevi. Jedan od primjera u prvoj kategoriji je restrikcijski enzim EcoRI, a u drugoj restrikcijski enzim HaeIII, npr.11

1. po svojoj strukturu i da li režu svoj DNK supstrat na mjestu prepoznavanja prepoznavanja ili je 2. njihovo mjesto prepoznavanja i reza odvojeno od drugih. Da bi se rezala molekula DNK,

treba imati na umu da svi restrikcijski enzimi čine dva reza, jednom kroz svaku okosnicu -fosfat), tj. oba lanca nukleotida u dvojnoj spirali DNK. lancu (šećer -fosfat), 11


11

Unutar prokariota, restrikcijski enzimi selektivno sijeku stranu DNK u procesu koji se zove

restrikcija, dok se sopstvena DNK zaštićen modificiranim enzimom (metiltransferaza), koja blokira rezanje prokariotske DNK. Zajedno, ova dva procesa formiraju restrikcijski sistem

modifikacije. Detaljno je istraživano preko 3000 restrikcijskih enzima, a više od njih 600 su pripremljeni za komercijalni promet. Ovi enzimi se rutinski upotrebljavaju za DNK modifikacije u molekulskom kloniranju. Ovi enzimi nose troslovne nazive koji predstavljaju

skraćenice od imena bakterije iz koje su iz olovane. Npr. enzim izolovan iz bakterije E.coli nosi naziv Eco, enzim iz bakterije Bacillus am yloliqucfacicns je Bam.12

2.6. Vektori za kloniranje

Vektor (u genetici) je generalni naziv za molekule aminokiselina koje pri eksperimentima

kloniranja služe kao nosioci stranih DNK. U popularnom jeziku genetičara vektor se često naziva genferi. Poznajemo različite, ali isto tako i različite forme prenošenj a strane DNK u jedan drugi živi organizam. Vektor može biti samo jedna noseća molekula strane DNK, ali isto tako može dodatno samostalno realizirati transfer gena u ciljanu stanicu. Zajedno sa kloniranom DNK

on čini rekombinantnu DNK molekulu. Najpoznatiji vektorski sistemi u

genetici su plazmidi, bakteriofagi, virusi, kosmidi i bakterije. Fragment DNK bilo kojeg

porijekla može se ugraditi u plazmidnu ili virusnu DNK koja služi kao vektor za kloniranje. Vektor se potom unosi u ćeliju domaćina (bakterijsku i li eukariotsku) u kojoj se replikovati uz učešće enzima domaćinove replikativne mašinerije, tako da se zajedno sa vektorskom DNK umnožava i ispitivani fragment.

2.6.1. Plazmidi

Plazmidi su mali kružni molekuli dvolančane DNK koji se prirodno nalaze u ba kterijama i ćelijama kvasca, a repliciraju se nezavisno od genoma. Oni često sadrže neke za bakteriju veoma važne gene, kao što su geni koji obezbjeđuju otpornost na antibiotike. Plazmidi koji se

12


12

koriste kao vektori za kloniranje najčešće su modifikovani t ako da najbolje zadovolje potrebe eksperimentatora. eksperimentatora. Tipičan plazmidni vektor sadrži: 

replikativni početak koji omogućuje replikaciju plazmidne DNK u ćeliji domaćinu;



bar jedan gen koji obezbjeđuje otpornost ćelije domaćina na određeni antibiotik, tako da se ćelije u koje je

unesen plazmid mogu razlikovati po osjetljivosti na dati

antibiotik; 

restrikciona mjesta čije prisustvo omogućuje da se ispitivani fragment DNK dobijen uz pomoć jedne restrikcione endonukleaze može lako ugraditi u plazmidnu DNK koja se za te potrebe presjeca istim enzimom.

Plazmidi se obično konstruišu tako da sadrže nekoliko različitih restrikcionih mjesta koncentrisanih u jednom dijelu plazmidne DNK koji se naziva POLILINKER. Na taj način se jedan tip plazmida može koristiti za kloniranje fragmenata DNK dobijenih različitim restrikcionim enzimima.13

13


13

2.6.2. Bakteriofag λ

Za kloniranje nešto dužih segmenata DNK kao vektor se najčešće koristi bakteriofag λ. Ovaj virus može poslužiti kao pogodan vektor zbog toga što se trećina njegovog genoma može zamjeniti stranom DNK, a da to ne utiče na virulentnost, tj. sposobnost virusa da inficira bakterijsku stanicu. Genom ovog virusa je linearna DNK molekula u kome su strukturni geni

za protein virusnog omotača smješteni u desnom i lijevom kraju, a sredina virusne DNK se može za potrebe kloniranja, zamjeniti restrikcionim mjestima za različite enzime. Krajevi virusnog genoma su jednolančani i bitni za pakovanje virusne DNK u proteinski omotač. Kada se u genom virusa ugradi ispitivani segment strane DNK, dobijeni hibridni molekul se

može in vitro, pod određenim uslovima spakovati u virusni omotač tako da se dobiju virulentni virusi koji će prilikom inficiranja bakterije ubaciti svoj genom a time i ispitivani fragmenti DNK u bakterijsku ćeliju. U ćeliji domaćina replikuje se virusni genom, sintetišu protein omotača i pakuju nove virusne virusne partikule koje će će lizirati bakterijsku ćeliju. ćeliju. 14

14


14

2.6.3. Kozmidi

Za potrebe kloniranja velikih fragmenata DNK konstruisani su kozmidi, kao vektori koji predstavljaju kombinaciju korisnih osobina plazmida i bakteriofaga. Plazmidi sa tzv. cos

mjestima su kozmidi (cos mjesto čini jednočlana DNK od 12 baza, to su kohezivni ili ljepljivi krajevi, takva mjesta ima u svom genomu fag lambda). To su mali krućni molekuli DNK koji sadrže replikativni početak plazmida, jedan ili nekoliko markera za selekciju, više različitih restrikcionih mjesta u koje se može graditi ispitivani fra gment DNK i dijelove genoma bakteriofaga koji su neophodni za in vitro pakovanje u virusni omotač. Kozmidi se u bakterijama replikuju na sličan način način kao plazmidi.15

2.6.4. Eukariotski plazmidi

Stanica kvasca S. cerevisiae ima prirodni plazmid oko

2 mm dužine, pa se takav plazmid

koristi za unos gena. To se radi na sljedeći način: konstruira se bakterijski plazmid sa CEN (centromer) regijom i izvorom replikacije kvasca i tjelomjernom sekvencom hromozoma

15


15

kvasca. Tako konstruirani plazmid je YAC (Yea st Artificial Chromosome). YAC može nositi veliki dio strane DNK (250- 2000

kb i više, to je vrlo pogodno upravo za eukariotske gene)

koja se prenosi iz generacije u generaciju u stanici kvasca. 16

16


16

3. ZAKLJUČAK

Tehnike rekombinantne DNA ili

popularnijeg naziva genetičko inžinjerstvo su jedno od

najrevolucionarnijih dostignuća u području području prirodnih znanosti postignuto postignuto u u zadnjih 30 -tak godina. Taj skup razlićitih tehnika uzrokovao je i izazvao pravu revoluciju u biologiji i to naročito u onom dijelu koji se odnosi na proučavanje naslijednih osnova (gena) i funkcioniranja živih bića. Zbog mogućnosti široke primjene u gotovo svim područjima prirodnih znanosti kao što su biologija, medicina, agronomija, biotehnologija i druge, te tehnologije postale

su naša svakodnevnica. Naročito se za to ukazuje potreba u današnje

vrijeme, kada je putem javnih glasila stvorena uglavnom negativna slika o dostignućima u području prirodnih znanosti dobivenih putem tehnologije rDNA odnosno genetičkog inžinjerstva. S druge pak strane, razvijeni svijet koristeći spoznaje dobivene tehnologijom rDNA kroči krupnim koracima naprijed zahvaljujući upravo dostignućima temeljenim na tim tehnologijama.

Genetičko inženjerstvo (ili tehnologija rekombinantna DNA) je dobivanje

novih hibridnih nasljednih materijala izvan stanice i njihovo spajanje s prenositeljem

(virusom, plazmidom ili drugim ), čime se omogućava njegovo un ošenje u organizam domaćina u kojem one prirodno ne postoje, ali u kojem se mogu umnožavati. Prenositelji ili vectori,

a umnožavanje kombinirane (hibridne) molekule DNA unesene u domaćina često se

naziva i kloniranje. Kako se ovim tehnikama dobiva rekombinirana (rekombinantna)

molekula DNA kao i u klasičnim rekombinacijama DNA, tehnologija se naziva i tehnologija rekombinantne DNA ili skraćeno tehnologija rDNA. Transgena biljka ili životinja je organizam koji u svom genomu ima ugrađenu rekombinantnu molekulu DNA, a koja se nasljeđuje u tom organizmu prema Mendelovim zakonitostima kao dominantna. Transgeneza je

metoda i postupak kojom se postiže transgena jedinka. Organizam s ugrađenim stranim

genom u svom genomu naziva se genetski modificirani organizam (GMO), termin koji se

često pogrešno pripisuje hrani koja se dobiva iz genetski modificiranih biljaka ili živo tinja.

17

4. LITERATURA 1. https://www.slideshare.net/MelisaKadric/rekombinantna-dna-92342822

18

Tehnologija Rekombinantne DNK

Recommend Documents