SEKVENCIRANJE DNK FRAGMENATA DNK sekvenciranje je process utvrdjivanja redosleda baza unutar lanca DNK i predstavlja predstavlja jednu od osnovnih metoda na kojima pociva geneticko inzenjerstvo. Metode sekvenciranja:
Maxam – Maxam – Gilbertova Gilbertova
Sangerova
Automatsko sekvenciranje. Maxam - Gilbertova ili metoda hemijskogcijepanja Ova metoda se bazira na upotrebi različitih hemijskih reagenasa koji diferecijalno boje nitrogenske baze molekule DNK. Ovaj tip bojenja može se okarakterisati kao baznospecifičan, jer baznospecifičan, jer se svaka baza boji različito.Danas je upotrebna vrijednost ove metode relativno smanjena usljed primjene enzimatske “dideoxy” analize DNK fragmenata i metoda automatskog sekvenciranja. Da bi bio sekvenciran, DNK lanac mora biti obilježen na jednom od k rajeva radioaktivnim 32Pfosfatnom izotopom. Bazno specifičnobojenje zasniva se na sljedećoj proceduri: Tretmanu hemijskim reagensom koji “potencira”različitosti DNK baza, tako da ih alternirajuće boji. Reagens stupa u bazno-specifične bazno-specifične reakcije,npr.formir anje anje dimetilsulfat-metilata guanina,koji nastaju na N7 poziciji ove baze-dislociranje baze-dislociranje alternirajućih baza sa fosfo šećernog skeleta DNK molecule.Bojenje lanca piperidinom na sećernoj komponenti kostura, gdje nedostaje odgovarajućabaza. Uspješnost ovoga bojenja bojenja ovisi o efikasnosti prethodnih koraka. Upotrebom bazno-specifičnih bazno-specifičnih reagenasa dobije se set fragmenata različite dužine markiranih na jednom od svojih krajeva. Sekvencioni gel je dizajniran tako da frakcionira jednolančane DNK fragmente, na osnovu njihovih njihovih dužina. Uglavnom sadrži 6-20% 6-20% poliakrilamida i 7M ureu. Urea onemogućava formiranje sekundarnih struktura DNK molekule koje bi bitno smanjile mobilnost fragmenata. Povišena temperatura, pri kojojfragmenti putuju, ima istu funkciju. Postoji više načina očitavanja rezultata poliakrilamidne gel elektroforeze.Kod manuelnog sekvenciranja, koje uključuje i Maxam-Gilbertoviu Maxam-Gilbertoviu metodu, neophodno je postavljanje minimalno 4 kolone na gelu, za svako baznospecifično bojenje po jednu. Sangerova dideoxi metoda sekvenciranja Ova metoda se bazira na dobijanju serije fragmenata DNK koristenjem cetiri specificna dideoksinukleotida,kojima nedostaje OH grupa na poziciji 3-dezoksiriboze za terminalno markiranje enzimatski sintetiziranih kopija starne matrice. Da bi se to ostvarilo ciljani DNK fragment se amplificira uz prisustvo malih kolicina sva cetiri ddNTP-a. P CR reakcija se odvija u tri standardne faze denaturacije, vezivanja prajmera I ekstenzije, gde se ova poslednja javlja kao kljucna. Process izduzivanja amplificiranog segmenta prestaje inkorporacijom jednog od ddNTPa. Nedostatak OH grupe na spomenutoj spomenu toj lokaciji onemogucava dalju aktivnost DNK po limeraze. Samo markiranje ovih fragmenata moze se odvijati odv ijati tokom ove faze ili koristeni prajmeri mogu biti ranije oznaceni radioaktivnim ili fluorescentnim markerom. Upotreba Upotreba savremenih DNK sekvencera preferira fluorescentno markiranje. Automatsko sekvenciranje Izazvalo je svojevrsnu revoluciju u molekularnoj genetici. Njegovim otkrićem proces sekvenciranja je postao lakši i brži. Sam proces automatskog sekvenciranja baziran je na
Sangerovoj dideoksi metodi.Amplifikacija se odvija u prisustvu DNK, DNK- polimeraze, prajmera, dNTP-a i male količine 4 različito obojena terminatora -ddNTP-a. Poliakrilamidna gel elektroforeza se odvija u DNK sekvenceru. Ultravioletni laser ugrađen u m ašini skenira gel od jedne do druge strane i run se može pratiti na monitoru. U prvoj generaciji fluorescenti markeri bili su vezani za prajmere. Druga generacija fluorescentne tehnike bazira se na upotrebi fluorescentih markera vezanih za chain terminator nukleotid . Svaka od ova cetiri nukleotida fluorescira u razlicitom spektru. Marker je inkorporiran u DNK molekulu pomocu Taq polimeraze i ima dvije funkcije u jednom koraku: zaustavlja daljnu sintezu DNK lanca i veze fluor na kraj molecule. Osnovna prdnost ove metode je sto se reakcija ne mora separirati u cetiri odvojene tubice. Krajnja detekcija se odvija tokom elektroforeze, prilikom prolaska markiranog fragmenta kroz polje djelovanja detektora. Za sekvenciranje duzih fragmenata koristi se tzv. shotgun sequencing metod . osnovni princip je slucajna fragmentacija ciljanog DNK fragmenta I inkorporacija nastalih fragmenata u univerzalne vektore. U toj reakciji vezu se poznate DNK sekvence koje se preklapaju I koje bi trebale posluziti kao ljepilo prilikom kompletiranja analiziranih fragmenata. Tokom kompletiranja sekvenci u kontigent identificiraju se gapovi-rupe na kojima sekvenca nije dostupna I jednolancani regioni-postoji sekvenca za samo jedan lanac. Gapovi mogu biti popunjeni direktnim sekvenciranjem upotrebom prajmera sintetisanih na osnovu poznate sekvence. Bitno je naglasiti razliku izmedju standardnog sekvenciranja npr.mitohondrijalne DNK i detekcije i profiliranja STR lokusa. Kod mitohondrijalne DNK najcesce se promatraju dva hipervarijabilna regiona da bi se saznao redosled njihovih baza. Koriste se marker koji razlicito boje svaku od baza i prilokom prelaska laserskih zraka svaka baza isijava drugu svetlost. U STR detekcijiosnovni cilj je utvrdjivanje broja ponavljanja pojedinih STR sekvenci unutar analiziranog lokusa. Zbog toga se markiranje ne vrsi diferencijalnim bojenjem svake baze nego se to cini sa cijelim STR lokusom. Prisutna lelna varijanta na datom lokusu pobudjena laserom fluorescira. Dobijeni pikovi ne predstavljaju pojedinacne baze nego alelne varijante koje su pokazatelj koliko se puta poznata repetitivna sekvenca ponavlja. Sekvenciranje DNK se koristi za istraživanje osnovnih bioloških fenomena, i verovatno če sve više nalaziti upotrebu u zaštiti zdravlja (pre- implantaciona dijagnostika, onkologija, infektivne bolesti).
