INTRODUCCIÒN Una sonda es un reactivo biológico constituido por un fragmento de ADN que posee una secuencia de bases complementaria a la del genoma de un microorganismo. Las sondas génicas son moléculas de ADN señaladas con un marcador que tienen el poder de reconocer genes en los cromosomas y establecer si dichos genes son normales o portadores de alteraciones.
Las ventaas de las técnicas moleculares han sido ampliamente publicitadas en los !ltimos " años# lo que sin duda ha aumentado la presión en los laboratorios cl$nicos para comen%ar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades infecciosas# genéticas# oncológicas y neurológicas. neurológicas. Usando las nuevas técnicas de la ingenier$a genética# es posible locali%ar y anali%ar un gen entre miles# utili%ando el &'( o construyendo y usando sondas genéticas. )stos hechos han convertido a las técnicas de genética molecular y biotecnolog$a en herramientas fundamentales para la detección y tratamiento de estas enfermedades no sólo en la especie humana# sino en el mundo de la veterinaria. *asta hace algunos años# sólo se pod$a saber que un individuo hab$a heredado tal o cu+l enfermedad genética# cuando los s$ntomas se hac$an evidentes y sólo pod$a darse una estimación de la probabilidad de que sus hios heredaran un desorden en particular. Usando las nuevas técnicas de la ingenier$a genética# es posible locali%ar y anali%ar un gen entre miles# utili%ando la (eacción en 'ade 'a dena na de la &ol olim imera erasa sa ,& ,&'( '(## de dell in ingl glés és &ol olim imera erase se 'h 'hai ain n (ea eact ctio ionn- o construyendo y usando sondas genéticas. Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de una muestra cl$nica ,secreciones bronquiales# orina# etcétera- o para conrmar la iden identi tic cac ació ión n de un cult cultiv ivo o que que por por otro otross méto método doss tard tarda a vari varios os d$as d$as ,Legi ,Legione onella lla pneum pneumoph ophila ila## 'hlamy 'hlamydia dia tracho trachomat matis# is# etcéte etcéterara-.. Adem+ Adem+s# s# las sondas pueden ser usadas para hibridación in situ para evaluar la respuesta del huésped a un agente infeccioso en particular y también para determinar la e/tensión de la infección mediante el estudio de muestras de teidos de varios órganos. 0uchos de ellos han sido desarrollados por varios fabricantes y sólo se diferencian en la secuencia a la cual est+ dirigida la sonda. )l diagnóstico mediante el empleo de sondas génicas puede utili%arse también después del nacimiento# por eemplo# para precisar la naturale%a y amplitud de una alteración genética1 o para el caso de pareas procedentes de familias 2de riesgo2 en particular para las mueres que deseen saber si son 2portadoras 2 de un determinado precursor de enfermedad.
OBJETIVOS
Conceptualizar de manera clara las sondas génicas. Identificar los tipos de sondas génicas. Describir el desarrollo de la obtención de sondas génicas. Identificar su utilidad.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES
I.- Definición La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unirá eclusi!amente esa secuencia de la "ue es copia. #sto es lo "ue se llama especificidad de la sonda. #s decir$ %onda es una secuencia &fragmento' de ADN monocatenario marcada con alg(n isotopo radiacti!o o mediante métodos no radiacti!os &como fluorescencia') "ue se usa para detectar fragmentos de ADN o ARN con *omolog+a secuencial en la paridad de bases nitrogenadas espec+ficas &,uanina con Citosina y Adenina con -imina'. Las sondas de cDNA se obtienen a partir de la copia de un mRNA y$ por tanto$ corresponden a secuencias codificantes de un gen. Las sondas RNA son copias del RNA y se obtienen in !itro$ mediante la s+ntesis de una cadena complementaria utilizando una RNApolimerasa. #l uso y aplicación de las sondas génicas está basado en la aplicación de la técnica citogenética de /ibridación in situ por fluorescencia &cuyas siglas en inglés la denominan 0I%/'. 1na !ez "ue la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La detección solo es posible si la sonda se *a marcado con un grupo detectable. Dependiendo del n(mero de estos grupos incorporados y de la se2al "ue emitan la sonda puede tener diferente sensibilidad.
II.- TIPOS DE SONDAS A) Según el tamaño: %e escogen en función de la secuencia diana &ADN o ARN' y se tienen en cuenta la longitud y el tipo de secuencia diana as+ como el medio de marca3e y detección. 4. %ondas grandes5 secuencias de ADN bicatenario de una longitud de 46 7b. 8ueden ser genómicas$ secuencias con intrones y eones$ o de ADNc$ sin intrones$ obtenidas a partir de la transcripción in!ersa del ARNm. 9. %ondas pe"ue2as5 son secuencias monocatenarias de 4::; nucleótidos. Reciben el nombre de oligonucleótidos sintéticos. %on de ADN. <. %ondas intermedias5 son de ARN. B) Tipo de onda ! m"todo de #ntei: Distintos tipos de sondas de ácidos nucleicos pueden ser utilizadas para la *ibridación in situ5 4. %ondas de DNA doble cadena. 8ueden ser preparadas utilizando técnicas
como =nic7 translation$ random priming o 8CR>$ en las cuales el nucleótido marcado es incorporado. 8CR y random priming proporcionan una buena acti!idad espec+fica. #stas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA$ estas son menos sensibles debido a "ue la concentración de la sonda marcada es reducida 9. %ondas de DNA de cadena simple &largas'. 8ueden ser preparadas utilizando =primer etensión> en templados de cadena simple o por 8CR con un nucleótido marcado. ?ste (ltimo es el más usado por"ue es más fácil de lle!ar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material. #l 8CR permite una gran fleibilidad en la elección de las secuencias marcadas por el uso de primers. #stas marcas *an sido ampliamente usadas. <. @ligonucleótidos &entre 9; y 6; bases'. %on marcados incorporando oligonucleótidos modificados durante la s+ntesis "u+mica o adicionando una cola marcada. 1na de las des!enta3as es "ue algunos oligonucleótidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye. 6. %ondas de RNA de cadena sencilla. 8ueden ser sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa &%8$ -B o -< RNA polimerasa'. La secuencia de la sonda es clonada en un !ector "ue flan"ueará dos sitios distintos de iniciación. La cadena de RNA antisentido &sonda' es sintetizada en dirección opuesta al gen endógeno. %e recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas "ue de3en el etremo : co*esi!o$ por"ue se *a reportado$ "ue el etremo < romo promue!e la s+ntesis de transcritos anormales.
III.- $A%&A'E DE SONDAS. Sitio de ma(cae o modificación: 8ara detectar *ibridación *ay "ue usar sondas marcadas o modificadas y para ello se marcan los nucleótidos sin "ue se !ea disminuida la capacidad de apareamiento entre bases complementarias. La 9aminoadenina se incorpora en sondas pe"ue2as y forma < puentes de / con su complementaria$ la timina. La caseina sustituye a la guanina en el ARN rico en ,C y solo forma 9 puentes de / con la citosina. %i se a2aden isótopos radiacti!os las propiedades del marca3e no se !en modificadas. 8osibles sitios de marca3e de las bases5 Adenina5 Citosina5 1racilo5 ,uanina5 -imina5 #isten dos alternati!as para "ue el marca3e sea incorporado dentro de la sonda5 el marca3e radioacti!o "ue es detectado por autorradiograf+a$ o por *aptenos &no radioacti!o' el cual es detectado directa o indirectamente por inmunocito"u+mica.
Isotópicos
radioacti!idad
No isotópicos
no radioacti!os
%istemas
directos Indirectos
Los sistemas isotópicos ofrecen una alta sensibilidad$ particularmente con tritio$ as+ como alta resolución. 8or otro lado el empleo de radioisótopos re"uieren licencia especial. #l método de detección &autorradiograf+a' re"uiere un tiempo de eposición de semanas. Con el uso de sondas radioacti!as es posible *acer un método cuantitati!o. #l marca3e de la sonda se puede dar de 9 formas5
$a(cae (adiacti*o %e puede marcar radiacti!amente la sonda utilizado nucleótidos "ue tengan alguno de sus átomos con un isótopo radiacti!o$ normalmente <98$ pero también es frecuente el uso de tritio. #ste tipo de marca3e es apreciable mediante autorradiograf+a. #l uso de este tipo de marca3e !a a asociado con los peligros "ue trae el uso de elementos radiacti!os$ as+ como también por ser un agente mutagénico este podr+a llegar a modificar la ultra estructura del ADN de muestra$ razón por la "ue se desarrolla otro método "ue es el marca3e inmunológico. Algunos isótopos *an sido usados para marca3es radiocati!os en la *ibridación in situ$ "ue difieren en cuanto a la resolución de la se2al$ la !elocidad en obtención de resultados y la estabilidad de la sonda.
a)
+)
c)
d)
< / proporciona una se2al a ni!el subcelular pero re"uiere largas eposiciones autorradiográficas. <:
% proporciona resolución de un diámetro celular$ con tiempos de eposición de una semana. Agentes reductores como el ditiotreitol &D--' <: pueden ser incluidos en la solución "ue contenga % para proteger al azufre de la oidación. La !ida media de este isótopo es de EB d+as y la marca debe ser usada en un mes aproimadamente. <9
<: 8 da una resolución menor "ue el % y además proporciona una ba3a eficiencia en la autorradiograf+a$ ofrece una pe"ue2a !enta3a en cuanto a la !elocidad de obtención de resultados. 8osee una !ida media de 46 d+as.
<< <: 8 da una resolución similar a %$ pero éste tiene una !ida media más corta &9: d+as' y el costo es mayor.
$a(cae no (adioacti*o
Las sondas se marcan utilizando nucleótidos "ue lle!an unida una molécula &digoigenina'$ a la solución se le a2aden anticuerpos espec+ficos "ue se unen a esa molécula) y estos anticuerpos lle!an asociado un compuesto luminiscente o fluorescente &como fluoróforos o fluorocromos5 fluoresce+na$ rodamina' "ue de3a impronta fotográfica. #isten dos tipos de sistemas no isotópicos para la prueba de *ibridación5 directo e indirecto. El m"todo di(ecto, la molécula detectable &reportera' es enlazada directamente al ácido nucleico y este *+brido puede ser !isualizado en el microscopio inmediatamente después de la reacción de *ibridación. #l paso limitante en éste método es "ue el *+brido subsista a las condiciones de la!ado. Lo más importante$ además$ es "ue la molécula reportera no interfiera con la *ibridación. o m"todo indi(ecto, re"uieren una marca "ue contenga la molécula reportera$ introducida "u+mica o enzimáticamente$ "ue pueda ser detectada por afinidad cito"u+mica. #n este método al igual "ue el anterior$ el marca3e no debe interferir con la *ibridación$ ya "ue la molécula reportera debe estar accesible a los anticuerpos "ue la detecten.
I.- ENTA'AS DE AS SONDAS /EN0TI&AS
Las !enta3as de estas técnicas son "ue nos permiten in!estigar directamente al microorganismo$ sin necesidad de "ue se encuentre !iable$ ni de "ue esté en culti!o puro. /oy en d+a se utiliza para identificar microorganismos no culti!ables$ de lento crecimiento o dif+cil y de identificación comple3a. #s posible utilizarlo en cual"uier tiempo de muestra biológica y permite la identificación de genes no epresados fenot+picamente. %on técnicas muy !álidas$ pues el ADN es muy estable.
Los incon!enientes más importantes son "ue se necesitan un n(mero m+nimo de copias del fragmento de ácido nucleico problema "ue se "uiere detectar$ por eso en las muestras con escasos n(mero de unidades infecciosas se obtiene una ba3a sensibilidad. #n ocasiones este problema se resuel!e detectando ARN en !ez de ADN$ pues el primero suele estar en mayor cantidad.
@tra forma de intentar resol!er este problema consiste en aumentar en !itro el n(mero de copias mediante técnicas de amplificación.
Actualmente disponemos de sondas &,en8robeF$ %yngeneF' para identificación de G. tuberculosis$ G. a!ium$ G. intracellulare$ G. 7ansasii y G. gordonae. #ntre las principales !enta3as de las sondas genéticas *ay "ue destacar la sencillez de su manipulación$ "ue permite su adaptación a cual"uier laboratorio. #l principal incon!eniente es su coste. #s una tecnolog+a muy utilizada en la actualidad en laboratorios ni!el II.
SONDAS GÉNICAS COMERCIALES Sonda /"nica %e obtienen y basan su elaboración a partir de la gran cantidad de secuencias de ADN repetiti!o &intergénico5 disperso o yutapuesto =en tándem>' encontradas en y alrededor del centrómero de cromosomas espec+ficos. #n la actualidad son usadas para el diagnóstico rápido.
Tipo de onda 1tili2ada en 3IS4 con*encional: #n la actualidad *ay un gran n(mero de sondas comerciales disponibles$ ofreciendo todas ellas un resultado rápido y fiable en la caracterización de determinadas anomal+as cromosómicas. %e distinguen 6 tipos de sondas$ en función de las estructuras "ue son capaces de detectar en el n(cleo celular o en metafase.
Sonda loc1 epec#fico: #stas sondas *ibridan con una secuencia (nica de ADN$ son espec+ficas para un locus determinado. %e conocen como sondas L%I &locus specific identifier'. #N función de su diana$ tienen un tama2o de 44; 7b &plámidos' o son !ectores más largos E;7b 4Gb &Hacterial artificial c*romosomes HACs$ east artificial c*romosomesACs' Las sondas de secuencia (nica permiten detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas e identificar delecciones y duplicaciones submicroscópicas de *asta < Gb5 No obstante$ su aplicación re"uiere conocer a priori la región "ue se desea estudiar. Sonda cent(om"(ica: Identifican los centrómeros$ los cuales a pesar de ser prácticamente idénticos para todos los cromosomas$ se distinguen en 9
deri!ati!o o en pe"ue2os marcadores supernumerarios. %i bien se pueden utilizar en interfase$ se aconse3a su uso sobre metafase. Los principales incon!enientes de la utilización de estas sondas son la no detección de in!ersiones paracentroméricas y su ba3a resolución$ "ue impide detectar pe"ue2as delecciones$ duplicaciones y traslocaciones & 3 9< Gb' Con el pintado cromosómico m(ltiple se consigue pintar de forma simultánea todos los cromosomas pero en metafases independientes. #sta !ariante de 0I%/ se realiza utilizando el Kit comercial C*romoprobeG Gultiprobe %ystem$ &CytoCell Ltd$ 1K'.
OT%AS SONDAS Sonda B&%5AB: #specificaciones de la sonda5 HCR &99"44.9<' !erde AHL &"<6' ro3o. La presencia del cromosoma 0iladelfia &8*O' tiene una importante repercusión diagnóstica y pronóstica en una serie de enfermedades *ematológicas. #sta anomal+a es caracter+stica de la leucemia mieloide crónica &LGC'$ esta anormalidad afecta a los cromosomas y 99. #l defecto genético del cromosoma 0iladelfia consiste en un fenómeno conocido como translocación. 8artes de dos cromosomas$ el y el 99 &translocación 99'$ intercambian sus posiciones. #l resultado es "ue parte del gen de región de fractura &HCR$ Hrea7point Cluster Region$ en inglés' del cromosoma 99 ®ión "44' se fusiona con parte del gen AHL del cromosoma ®ión "<6'. #l gen AHL toma su nombre de PAbelsonQ$ el nombre de un !irus causante de leucemias precursor de una prote+na similar a la "ue produce este gen. #l resultado de esta translocación es la producción de una prote+na de peso p94; o p4E: &p es una medida de peso para prote+nas celulares en unidades de masa atómica'. 8uesto "ue el código del gen AHL es capaz de a2adir grupos fosfatados a residuos de tirosina &mediante la enzima -irosin"uinasa'$ la fusión de los genes HCRAHL también es una enzima -irosincinasa &Aun"ue la región HCR del gen es también una enzima serinatreonina prote+na7inasa$ la función de la tirosina 7inasa es muy rele!ante para la terapia de esta enfermedad'. La prote+na resultante de la fusión HCRAHL interact(a con la subunidad receptora Interleu"uina
Actualmente se realiza esta técnica en el Laboratorio de ,enética del instituto de #nfermedades Neoplásicas para 9 tipos de leucemias5 Leucemia Gieloide Crónica para la detección de la fusión génica HCRAHL Leucemia Gieloide Aguda tipo G9 para la detección de la fusión génica AGL#-@ y para el cáncer de mama para la detección de la amplificación del gen /er9 neu #-@ AGL #-@ AGL AGL #-@ %onda AGL #-@ #-@ GL Citogenética Golecular
Sonda 6niloc1: %on espec+ficas para un locus particular. %e utilizan con éito en la identificación de min(sculas delecciones y duplicaciones submicroscópicas. Pinta( c(omooma: Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en particular. Cuando esta mezcla de sondas se usa en una *ibridación$ el cromosoma entero fluorece$ por lo "ue decimos "ue está =pintado>. 8intar cromosomas es muy (til para caracterizar reordenamientos comple3os$ tales como translocaciones sutiles$ y para identificar el origen de material adicional de un cromosoma$ como pe"ue2os marcadores de supernumerarios o anillos. Pinta( a la in*e(a: #n este procedimiento una porción de material cromosómico no identificado$ pe"ue2os marcadores supernumerarios o anillos$ se usa para pintar por *ibridación una metafase normal. #l cromosoma no identificado se obtiene por separación de células acti!adas por fluorescencia$ el cual es amplificado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa &8CR' para preparar dic*a pintura. #l origen del segmento no identificado se obtiene mediante la identificación del cromosoma sobre el cual se *ibrida. &a(iotipo de epect(o m1lticolo(: #l (ltimo logro de la tecnolog+a 0I%/ es utilizar todas las sondas cromosómicas para obtener un cariotipo *umano multicolor$ en el cual cada par de *omólogos cromosómicos puede ser identificado en base a su color. 8ara un cromosoma completo cada sonda se prepara de tal forma "ue$ cuando se une a un marcador fluorescente$ da una se2al espectral diferente$ "ue se analiza con un programa de ordenador. #ste aborda3e es etremadamente (til para detectar sutiles reordenamientos cromosómicos o constitucionales en pacientes con anomal+as ad"uiridas$ como el cáncer$ o del desarrollo.
4IB%IDA&I7N /EN7$I&A &O$PA%ATIA 8&/4) La C,/ &del inglés comparati!e genomic *ybridization' es una !enta3osa modificación del método de pintar a la in!ersa$ de gran utilidad en genética del cáncer para detectar regiones de pérdidas alélicas y amplificación génica. #l ADN eperimental o tumoral se pinta de color !erde y ro3o el ADN control. Las dos muestras se mezclan e *ibridan sobre metafase normal. %i la muestra eperimental contiene más ADN de una región cromosómica en particular "ue la muestra control$ la región se identificará por el
incremento de fluorescencia !erde sobre la ro3a. De forma análoga$ una delección en la muestra eperimental mostrará una reducción en la proporción !erde sobre ro3o. Sonda P$5%A%A Las sondas satélites consisten en secuencias espec+ficas generadas de satélites DNA altamente repetiti!o$ localizados en regiones centroméricas$ pericentroméricas o *eterocromáticas de cada cromosoma. #stas sondas permiten una rápida identificación y enumeración de cada uno de los cromosomas$ tanto en interfase como en metafase. -ambién se ofrecen sondas satélite doblemente marcadas para S e $ cada una de ellas marcada con ro3o o !erde respecti!amente.
A96A%I6S 4E$ATOO/ P%OBES Referencia5 L8/ 0I%/ L+"uida desórdenes /ematológicos. 0I%/ espec+ficas para anomal+as relacionadas con problemas *ematológicos5 4<"46$< Delection 8robe &D4<%<$ D4<%9:' G/44 &4p4<$4' Hreac7point 8robe. 8GLRARa -ranslocation 8robe • • •
A96A%I6S PAINTIN/ P%OBES Referencia5 L88 0I%/ marca3e cromosomas completos. Garca3e mediante sondas "ue *ibridan a lo largo de cada cromosoma completo para identificación de cada uno de ellos y detección de traslocaciones. Cada una de las sondas está disponible marcada en !erde y en ro3o para la me3or combinación y estudio.
A96A%I6S S6BTEO$E%I& P%OBES Referencia5 L80I%/ Li"uida Regiones %ubteloméricas Reestructuraciones cromosómicas relacionadas con los etremos de los cromosomas son causa importante de enfermedades genéticas. La región cercana a los telómeros es enormemente rica en genes. #stas anomal+as de las regiones subteloméricas están +ntimamente ligadas a retrasos mentales y anomal+as congénitas.
A96A%I6S $I&%ODEE&TION P%OBES
0I%/ Li"uida Gicrodelecciones Los s+ndromes de microdelecciones son un grupo *eterogéneo de desórdenes genéticos causados por la delección de regiones espec+ficas de DNA cromosómico$ causando *aploinsuficiencias de genes importantes. #stas delecciones son dif+ciles de detectar utilizando técnicas tradicionales de citogenética. La 0luorescencia In %itu &0I%/' puede resol!er la detección de estas delecciones submicroscópicas a un l+mite aproimado de < Gb de resolución y por lo "ue se *a con!ertido en el método de elección para el diagnóstico de estas enfermedades. Las diferentes sondas de microdelecciones son las siguientes5 • • • • • • •
Di,eorgeTC0%-18L#4 Di,eorgeTC0%N9: 8raderilliAngelman Angelman&1H#
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA 4. Uorde L$ Carey U$ Hams*ad G. ,enética Gedica. 6ta ed. #dit #lse!ier #spa2a. Harcelona#spa2a) 9;44. 9. /ernando C$ Caracterización de anomal+as cromosómicas en diagnóstico prenatal y postnatal mediante técnicas de citogenética molecular. -esis doctoral) 9;;: <. Hlanca Ramos Cerrillo. =/ibridación in situ>1ni!ersidad Nacional Autónoma de Géico.
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