SONDAS GÉNICAS I. De Defi finic nició ión n Una Una sond sonda a es un frag fragme ment nto o de ADN de ADN (o rara rarame ment nte e ARN ARN)) de pequ pequeñ eño o tama tamaño ño (nor (norma mallment mente e
entre tre
100 y
1000 000 bases bases))
usado
en biología
molecular como como erramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual! "n su uso# la sonda se une a la secu secuen enci cia a dian diana a mono monoca cate tena nari ria a (ADN (ADN$A $ARN RN)) medi median ante te un meca mecani nism smo o de ibridaci%n que que form forma a una una estr estruc uctu tura ra bica bicate tena nari ria# a# una una de las las ebr ebras as pertenece a la sonda# y la otra a la secuencia diana! "sta uni%n se establece porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias# form&ndose pares de bases complementarias bases complementarias 'ioquímicamente una sonda es una molcula de ADN o ARN omologa a una secuencia secuencia de ARN o ADN diana# diana# con la que íbrida íbrida de forma estable estable y especifica (por asociaci%n de bases complementarias)! a sonda es una copia pia fie fiel de un gen gen o de un frag fragme men nto de ARN o ADN y se unir& ir& e*clusi+amente esa secuencia de la que es copia! "sto es lo que se llama especificidad de la sonda! Una +e, que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica! a detecci%n solo es posible si la sonda se a marcado con un grupo detectable! Dependiendo del n-mero de estos grupos incorp incorpora orados dos y de la señal señal que que emitan emitan la sonda sonda puede puede tener difere diferente nte sensibilidad!
II. Tipos Tipos de sondas sondas Distintos tipos de sondas de &cidos nucleicos pueden ser utili,adas para la ibridaci%n in situ. 1! /ond /ondas as de DNA DNA de dobl doble e cade cadena na!! ued ueden en ser ser prep prepar arad adas as util utili, i,an ando do tcnicas como nic2 translation# random priming o 3R4# en las cuales el nucle%tido marcado es incorporado! 3R y random priming proporcionan una
buena
acti+idad
específica!
"stas
sondas
pueden
ser
desna desnatur turali ali,ad ,adas as antes antes de usar! usar! 3uando 3uando se usan usan para para detect detectar ar una cadena simple como mRNA# estas son menos sensibles debido a que la concentraci%n de la sonda marcada es reducida!
5! /ond /ondas as de DNA DNA de cade cadena na simp simple le (lar (larga gas) s)!! ued ueden en ser ser prep prepar arad adas as utili,ando primer e*tension4 en templados de cadena simple o por 3R con un nucle%tido marcado! 6ste -ltimo es el m&s usado porque es m&s f&cil de lle+ar a cabo y las marcas pueden sinteti,arse con poca cantidad de material! 7! "l 3R 3R perm permitite e una una gran gran fle* fle*ib ibili ilida dad d en la elec elecci ci%n %n de las las secu secuen enci cias as marcadas por el uso de primers! "stas marcas an sido ampliamente usadas! 8! 9lig 9ligon onuc ucle le%t %tid idos os (ent (entre re 50 y 80 base bases) s)!! /on /on marc marcad ados os inco incorp rpor oran ando do oligonucle%tidos modificados durante la síntesis química o adicionando una cola marcada! Una de las des+enta:as es que algunos oligonucle%tidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye! ;! /ondas /ondas de RNA de cadena cadena sencilla! sencilla! ueden ueden ser sinteti,a sinteti,adas das por el uso de una RNA polimerasa (/<# => o =7 RNA polimerasa)! a secuencia de la sonda es clonada en un +ector que flanquear& dos sitios distintos de iniciaci%n!
a. a adi diac ac!i !ivvidad idad"" /e puede marcar radiacti+amente la sonda utili,ado nucle%tidos que tengan alguno de sus &tomos con un is%topo radiacti+o!
"l is%topo m&s utili,ado es el 75# con alta acti+idad específica (B500 3i$mmol puro) y emite partículas de alta energía (1C> eE) por lo que sondas marcadas con este elemento tienen un ele+ado rendimiento y sensibilidad! "l marca:e puede ser en diferentes posiciones! "l 75 tiene un periodo de semide semidesin sinteg tegrac raci%n i%n relati+ relati+ame amente nte corto# corto# 18 días# días# lo que obliga obliga a usar usar las sondas marcadas dentro del periodo de una semana despus del marca:e# y adem adem&s &s la emis emisi% i%n n de partí partícu cula lass
dura durant nte e larg largo o tiemp tiempo o pued puede e alte altera rarr la
estructura de la sonda!
#. $arcaj $arcajee no radia radiac!iv c!ivo o "l uso uso de sond sondas as frías frías## marc marcad adas as con con grup grupos os no radi radiac acti+ ti+os os elim elimin inan an el problema de la contaminaci%n! =odos estos mtodos se basan en la adici%n a la sonda de un grupo químico reacti+o que se detecta despus de la ibridaci%n de la sonda con la secuencia diana! "sta detecci%n se basa en la formaci%n de un producto coloreado +isible en soporte donde se produce la ibridaci%n o en el soporte donde se produce la formaci%n de modificaciones en la sonda! "l problema de estos mtodos es el ba:o índice de incorporaci%n de grupos detectables y su menor sensibilidad!
I%. I%. &reparac &reparación ión de la sonda sonda ara ara sond sondas as de cade cadena na senc sencililla la## se debe debe usar usar la secu secuen enci cia a re+e re+ers rsa a compl compleme ementa ntaria! ria! 3uand 3uando o las sonda sondass son sintet sinteti,a i,adas das por transc transcrip ripci% ci%n# n# in+olucra generar mRNA del gen end%geno! 3uando se diseñan los oligos marcados# marcados# es importante importante recordar recordar que la secuenc secuencia ia antisentid antisentido o es la ebra complementaria re+ersa de la cadena líder y debe ser leída de ;? a 7?! "n general es preferible usar sondas específicas# ya que esto garanti,a una buena ibridaci%n! "*isten situaciones en las cuales esto no puede lle+arse a cabo# por e:emplo# si los genes toda+ía no est&n clonados de las especies usadas para la ibridaci%n o si la secuencia gnica es muy similar entre especies! "sto puede fa+orecer una ibridaci%n entrecru,ada! ara e+itar esto# se requiere una alta selecti+idad que redu,ca la presencia de bases mal apareadas# aumentando de esta manera la especificidad! /i los modelos de e*pr e*pres esi% i%n n son son los los mism mismos os## como como se pued pueden en +er +er con con una una sond sonda a
om%loga# es un e*perimento alentador# aunque no prueba la especificidad! a ibridaci%n entrecru,ada pro+ee informaci%n preliminar muy +aliosa!
a. 'l dis dise( e(o o de de la sond sonda" a" 1! a ibr ibrid idac aci% i%n n entr entrec ecru ru,a ,ada da util utili, i,a a sond sondas as larg largas as (F10 (F100 0 pb) pb) usadas ba:o condiciones selecti+as especialmente despus de la digesti%n con nucleasas# ya que una sonda adem&s de om%loga# debe debe ser ser lo sufi sufici cien ente teme ment nte e ampl amplia ia para para lle+ lle+ar ar a cabo cabo la ibridaci%n! 5! ara ara sond sondas as pequ pequeñ eñas as (olig (oligon onuc ucle le%t %tid idos os de 50G7 50G70 0 pb) pb) es muy probable que alg-n gen distinto al de inters tenga una secuencia idntica! Alternati+amente se puede acer un screening y ste puede ser reali,ado por b-squeda de secuencias en bases de datos! 7! os mRNA mRNA posee poseen n las secuenc secuencias ias poli(=) poli(=) y poli(U)# poli(U)# al transcrib transcribirse irse a cDNA se e+ita que la sonda no incluya esta cola# porque secuencias largas# ricas en H3 dan una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se forman entre estas bases! /e necesitan dos elecciones m&s para la preparaci%n de la sonda. el tipo de &cidos nucleicos y la marca que se incorpora en la sonda! Algunos mtodos alternati+os est&n disponibles para la síntesis de la sonda!
#. 'lec 'lecci ción ón de de la son sonda da"" as sondas largas de cadena simple (RNA o DNA) proporcionan una alta sensibilidad en la detecci%n de cadena sencilla! os oligonucle%tidos son muy sensibles y la señal puede ser incrementada por el uso de un coc2tail de sondas que flanquear&n en regiones distintas! ara estudios de mRNAs estrecamente relacionados# las sondas específicas# pueden ser obtenidas por síntesis de oligonucle%tidos! /e diseñan primers que ser&n usados para la amplificaci%n del fragmento deseado de DNA en el 3R! "stos "stos fragme fragmento ntoss puede pueden n ser clonad clonados os y usados usados para para sintet sinteti,a i,arr cadena cadenass dobles o sencillas de DNA o RNA! Alternati+amente# para el caso de sondas de RNA# pueden ser marcadas dire direct ctam amen ente te sin sin clon clonac aci% i%n n incl incluy uyen endo do el prim primer er marc marcad ado o en el siti sitio o de
iniciaci%n de la RNA polimerasa! Iinalmente las sondas de DNA de doble cadena son recomendadas para blancos de doble cadena y esto puede ser suficientemente sensible sensible para detectar detectar abundancia de de cadena sencilla! sencilla!
c. Tama(o ma(o de la son sonda da"" as sondas largas pueden emitir una señal m&s fuerte debido a que incorporan mayor mayor n-mero n-mero de nucle% nucle%tid tidos os marcad marcados os dentro dentro de ella! ella! /in embarg embargo# o# las sondas que son tan largas dan señales dbiles# debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el te:ido! a me:or estrategia es usar una secuencia larga como templado para la síntesis de la sonda pero asegurar que la sonda gene genera rada da es lo sufic suficie ient ntem emen ente te pequ pequeñ eña a para para pode poderr pene penetr trar ar!! uc ucos os procedimientos est&n basados en que la sonda de ;0G1;0 bases porque emiten señales %ptimas para la ibridaci%n en secciones de ciertos te:idos! /e a encontrado que las sondas de RNA que miden por arriba de 1 2b pro+een señales %ptimas para la ibridaci%n in situ# en embriones fi:ados en para formaldeído! a penetraci%n est& influenciada por el tamaño de la sonda aunque tambin depende de la naturale,a del te:ido# de la forma de fi:aci%n y si el pre tratamiento a sido reali,ado para remo+er las proteínas celulares! "l tamaño de la sonda puede ser controlado durante la reacci%n de síntesis. a! /ond /ondas as de DNA# DNA# sint sintet eti, i,ad adas as por por nic nic22 tran transl slat atio ion4 n4## el larg largo o est& est& determinado por la cantidad de DNasa en la reacci%n! b! /ondas /ondas marcadas marcadas por por random random priming4 priming4 el tamaño est& est& determinad determinado o por la concentraci%n del primer! c! rimers rimers que pueda puedan n ser elegido elegidoss para detemi deteminar nar el tamaño tamaño de de la sonda sonda sinteti,ada por 3R! d! /ondas /ondas largas de DNA DNA pueden pueden ser cortada cortadass parcialment parcialmente e por incubaci%n incubaci%n a altas temperaturas! e! /ondas /ondas largas largas de RNA son parcialme parcialmente nte cortadas cortadas por idr%lis idr%lisis is alcalina alcalina limitada! /i el tamaño de la sonda es cortada por idr%lisis ay que re+isar el tamaño de la sonda# porque si sta es muy pequeña# sta no ibridar& ba:o condiciones selecti+as standard# dando una ba:a señal! d. 's!a#ilidad 's!a#ilidad de de la sonda sonda ) la in!eracc in!eracción ión con su #lanco" #lanco" "n e*perimentos de ibridaci%n los puentes entra la sonda y la secuencia blan blanco co :ueg :uega a un rol rol impo import rtan ante te!! "l larg largo o decr decrem emen enta ta la esta estabi bililida dad d en el
siguiente orden RNAGRNA# DNAGRNA# DNAGDNA! a estabilidad de los íbridos est& influenciada por las condiciones de ibridaci%n# por la concentraci%n de formamida# sales y la temperatura!
e. Sondas Sondas de do#le do#le cadena cadena con!ra con!ra cadena cadena sencill sencilla" a" Un n-mero de reacciones competentes ocurren durante la ibridaci%n in situ con sondas de doble cadena! as sondas de cadena sencilla pro+een las siguientes +enta:as. a! a sonda sonda no se agota porque porque no se autoliga autoliga!! b! No son cadenas cadenas largas largas porque porque deben deben penetrar penetrar en la secci%n secci%n de te:ido te:ido o en los cromosomas!
a gentica molecular trata de establecer cu&l es la estructura y secuencia de los genes normales# para poder estudiar y comprender las mutaciones de los mismos y sus efectos en el indi+iduo!
'N*I$AS D' 'STICCION /on endonucleasas capaces de reconocer secuencias específicas de bases en el DNA bicatenario y cortarlo en ese punto! /u papel biol%gico consiste en la degradaci%n de cualquier DNA e*traño! "l DNA propio no es escindido gracias a un sistema de protecci%n conocido como modificaci%n mediante el cual las bases nitrogenadas est&n metiladas en los puntos susceptibles de ser cortados por la en,ima!
'+ $'TODO D' SO,T-'N Una +e, fragmentado el DNA a estudio mediante en,imas de restricci%n# se procede a la separaci%n de estos fragmentos mediante electroforesis! "l DNA es una molcula con carga negati+a debido a los grupos fosfato# por lo que# colocado sobre un gel de agarosa y aplicando un campo elctrico# migrar& acia el polo positi+o! a +elocidad de migraci%n depende del tamaño del fragmento# de forma que los m&s pequeños a+an,an m&s deprisa!
/i# adem&s# se pone en el gel un marcador o con:unto de fragmentos de DNA de tamaños conocidos# podemos determinar el tamaño de cualquier secuencia de DNA! Jncluso# ba:o determinadas condiciones# es posible separar fragmentos del mismo tamaño que difieren en la composici%n de sus bases! Una +e, separados los fragmentos# se desnaturali,a el DNA con una soluci%n alcalina# obtenindose secuencias monocatenarias! "ste DNA desnaturali,ado se transfiere a un filtro y se fi:a a l mediante radiaci%n ultra+ioleta o calentamiento! ost oster erio iorm rmen ente te## se intr introd oduc uce e el filtro filtro en una una solu soluci ci%n %n que que cont contie iene ne un fragme fragmento nto de DNA monocat monocatena enario rio o sonda# sonda# cuya cuya secuen secuencia cia de bases bases es complementaria a la del gen que queremos anali,ar! 'a:o determinadas condiciones ambas secuencias complementarias se unen! /i la sonda introducida est& marcada radiacti+amente podremos detectar a qu fragmento del filtro es complementaria la sonda y si aqul presenta el tamaño y la secuencia normal o a sufrido alguna mutaci%n! Un procedimiento an&logo se utili,a para el estudio del RNA. mtodo Nortern y para el estudio de proteínas. mtodo Kestern!
&O+I$OIS$OS
'N
'+
TA$A $A/ /O
D'
+OS
AG AG$'NTOS
D'
'STICCION "*isten casos en los que no se conoce la secuencia del gen implicado en una enfermedad gentica y# y# por lo tanto# no se dispone de una sonda específica! ediante el estudio de un &rbol familiar se puede relacionar la presencia de una determinada enfermedad con la presencia de un polimorfismo concreto! os polimo polimorfi rfismo smos# s# +aria +ariacio ciones nes al a,ar a,ar en la secuen secuencia cia del DNA# DNA# pueden pueden producir +ariaciones de los sitios de corte para una en,ima de restricci%n# dando lugar a fragmentos de restricci%n de distinta longitud a los obtenidos en otro su:eto!
"stos polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricci%n (RI) se eredan seg-n las leyes de endel! /i el poli polimo morfi rfism smo o se encu encuen entr tra a en el mism mismo o crom cromos osom oma a que que el gen gen en cuesti%n# se dice que est&n ligados y la distancia entre ellos se mide por la frecue frecuenci ncia a con con la que ocurre ocurre recomb recombina inaci% ci%n n durant durante e la meiosi meiosiss gamti gamtica! ca! 3uanto menor sea esta distancia# mayor ser& la probabilidad de que ambos rasgos (enfermedad y polimorfismo) se transmitan unidos a la descendencia! /i ambos genes se encuentran muy separados en el mismo cromosoma se eredan como si se encontraran en cromosomas distintos# debido a la alta probabilidad de que se produ,can entrecru,amientos entre dos loci distantes! R"A33J9N "N 3AD"NA D" A 9J"RA/A "s un mtodo de síntesis en,im&tica in +itro para conseguir grandes cantidades de DNA! "s necesario conocer la secuencia de pares de bases que se desea anali,ar! 3omprende 7 etapas b&sicas. L Desnaturali,aci%n de las cadenas del DNA mediante calentamiento (B0GB;M 3)! L Uni%n de dos oligonucle%tidos iniciadores o cebadores# que flanquean la secuencia concreta de DNA que interesa replicar (8;G<0M 3)! L /íntesis del fragmento entero mediante copiado de la secuencia de DNA molde por una DNA polimerasa (=aq) (>5M 3)! uesto que el producto sinteti,ado en un ciclo sir+e como molde para el siguiente ciclo# el n-mero de copias de DNA diana se duplica en cada ciclo! "ste proceso se lle+a a cabo en un tubo que se introduce en un termociclo capa capa,, de +ari +ariar ar la temp temper erat atur ura a a gran gran +elo +eloci cida dad d para para que que se prod produ, u,ca can n alternati+amente cada uno de los tres pasos!
-i#ridación 0In Si!u0 luorescen!e 1IS-2 "s una tcnica molecular que permite locali,ar un determinado fragmento de la secuencia de los &cidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias gnicas específicas! /e puede aplicar sobre n-cleos interf&sicos
de e*tensiones celulares o cortes de te:ido o directamente en cromosomas! a posibilidad de poder utili,ar las tcnicas de IJ/ sobre clulas que no est&n di+idindose es importante en aquellas neoplasias con ba:a tasa de di+isi%n celular# como en los síndromes linfoproliferati+os cr%nicos! ara ello utili,a sondas marcadas con fluorocromos! Dependiendo del tipo de sonda utili,ada es posible e+aluar la presencia de reordenamientos en los n-cleos! as son sondas das son peque equeña ñass secu secuen enci cias as de cad cadena ena senci encilllla a de ADN# DN# complementarias a la secuencia de inters del &cido nucleico! odemos utili,ar distintos tipos de sondas. •
ADN satlite. estas sondas ibridan con las regiones O o P satlites u otras secuencias repetiti+as de la regi%n centromrica del cromosoma! /on de utilidad para detectar alteraciones cromos%micas numricas! 3omo emos dico anteriormente# esta tcnica puede aplicarse sobre clulas en di+isi%n o n-cleos interf&sicos# por tanto podemos detectar anomalías cromos%micas numricas sin necesidad de tener clulas en
•
metafase! as as sond sondas as de pint pintad ado o crom cromos os%m %mic ico o cont contie iene nen n una una libr librer ería ía de secu secuen enci cias as gen% gen%mi mica cass que que abar abarca can n todo todo un crom cromos osom oma a o una una determinada regi%n! 3on estas sondas podemos detectar alteraciones estructurales o numricas de los cromosomas# pero s%lo en clulas en
•
metafase! "s muy -til cuando tenemos cromosomas de mala calidad! as as sond sondas as de secu secuen enci cia a -nic -nica a (loc (locus us espe especí cífic fico) o)## ibr ibrid idan an con con secuencias cromos%micas muy concretas# correspondiente a una banda crom cromos os%m %mic ica a o a un gen! gen! 3on 3on esta estass sond sondas as pode podemo moss +isu +isual ali, i,ar ar alteraciones estructurales o numricas tanto en n-cleos en interfase como en metafase! odemos detectar la presencia de clulas tumorales residuales con una anomalía característica de estirpe o subtipo# como la t(B@ t(B@55 55)) en la leuc leucem emia ia miel mieloi oide de cr%n cr%nic ica# a# la t(1; t(1;@1 @1>) >) que que afec afecta ta al $RARO en la leucemia mieloide aguda!
os cromosomas que son usualmente anali,ados por IJ/ son los 17# 1Q# 51# e S# que son los m&s propensos a sufrir anomalías! "st&n relacionados a enfermedades como el síndrome de atau (17)# atau (17)# el síndrome de "dTards (1Q)# el sínd síndro rome me de DoTn DoTn (51) (51)## el sínd síndro rome me de =urne urnerr () () y el sínd síndro rome me del del
super superomb ombre re (S)# (S)# entre entre otros! otros! /in embarg embargo# o# como como son posibl posibles es marca marcados dos adicionales del cromosoma# otros cromosomas pueden ser +isuali,ados con esta esta tcn tcnic ica! a! IJ/ IJ/ usa usa segm segmen ento toss de una una -nic -nica a ebr ebra a de ADN de ADN que que son son tintados# o etiquetados# con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico@ estos segmentos de ADN son llamados sondas sondas!! "n un prin princi cipi pio o se empl emplea eaba ban n sond sondas as de car& car&ct cter er radi radiac actiti+o +o## pero pero este este tipo tipo de marca:e fue reempla,ado por los fluor%foros por mayor seguridad# eficacia y facilidad de detecci%n! a tcnica ica IJ/ puede rea reali, li,arse a los cromos mosomas en metafase metafase o o en interfase interfase!!
3.3.4.5&ro!ocolo #6sico "l primer paso de la tcnica consiste en la desnaturali,aci%n del DNA para separar la doble lice! A la muestra desnaturali,ada se le añade entonces la sonda de inters (fragmento de ADN marcado fluorescentemente)! rimero# las sondas ibridan a las regiones específicas para las que an sido diseñadas! Desp Despu us# s# se tiñe tiñen n los los n-cl n-cleo eoss con con un colo colorr de cont contra rast ste e ines inespe pecí cífifico co (generalmente DAJ)! as sondas de DNA pueden marcarse con molculas fluorescentes denominados fluor%foros (mtodo directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (mtodo indirecto)! or -ltimo# se +isuali,a la muestra preparada ba:o un microscopio de fluorescencia!
3.3.7.5 IS- en $e!afase" 3uan 3uando do las las clu clula lass est& est&n n en metaf metafas ase# e# sus sus crom cromos osom omas as se encu encuen entr tran an condensados a modo de preparaci%n para la di+isi%n celular! ara detenerlas en
metafase#
se empl mplea colcicina colcicina##
los microt microt-bu -bulos los encarg encargado ado de separa separarr
un
agente despolim limeri,a i,ante de
las crom&tidas er erman manas de un
cromosoma# impidiendo así el a+ance de la di+isi%n celular! "ste "ste tipo tipo de IJ/ IJ/ se util utili, i,a a para para dete detect ctar ar micro microde dele leci cion ones es espe especí cífifica cas# s# translocaciones o para identificar material e*tra de origen desconocido! os tipos de sondas usadas son.
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os c%smidos son son secu secuen enci cias as -nic -nicas as que que ibr ibrid idan an con con fragm fragmen ento toss
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pequeños! /e emplean en estudios de microdeleciones! as sondas satlites est&n formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centr%meros! "n la mayoría de los casos son son espe especí cífificcas de cada cada crom cromos osom oma! a! /e usan usan para para dete determ rmin inar ar
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aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores! as sondas sondas comple completas tas consis consisten ten en la suma suma de +arias +arias sondas sondas que ibridan en distintas ,onas del cromosoma y así marcar el cromosoma completo! /e usan para +er translocaciones!
3.3.3.5 IS- en In!erface" No siempre es posible tener n-cleos fi:ados en metafase para reali,ar el IJ/# y los resultados obtenidos no ser&n tan específicos! /in embargo# el IJ/ en interface tiene la +enta:a de que no es necesario culti+ar pre+iamente las clula clulass durant durante e di+ers di+ersos os días días antes antes de poder poder anali, anali,ar ar sus cromos cromosoma omas! s! Adem&s# cuando las clulas se encuentran en interface# la cromatina est& en torno a 10 000 +eces m&s descondensada que en metafase# lo cual permite una mayor resoluci%n a la ora de detectar anomalías pequeñas! /e emplea sobr sobre e todo todo para para la dete detecc cci% i%n n de aneu aneupl ploi oidi dias as o gran grande dess dele deleci cion ones es## duplicaciones! No es posible distinguir entre un cariotipo normal y un cariotipo que presente una translocaci%n equilibrada! Adem&s# puede ser empleado en el an&lisis de tumores s%lidos# que se di+iden con muy poca frecuencia!
3.3.8.5O!ras varian!es de IS-" IS- en 9e#ra "ste tipo de IJ/ (tambin llamado Iiber IJ/ o alo IJ/) se aplica sobre ebras de ADN desproteini,adas (es decir# despro+istas de las istonas encargadas de su compactaci%n)! "sta tcnica permite dete detect ctar ar pequ pequeñ eñas as reor reorga gani ni,a ,accione ioness porq porque ue admi admite te una una may mayor resoluci%n (permite incluso la +isuali,aci%n de genes indi+iduales)! a
tcnica puede ser usada para detectar deleciones en clones y para estimar uecos en los proyectos genoma!
IS- inverso "s una tcnica que se usa muco para determinar la procedencia de un cromosoma marcador ! "ste tipo de IJ/ tiene la peculiaridad de ser el ADN problema el que se marca! "l procedimiento consiste en recortar un fragmento de cromosoma o dico cromosoma marcador de una porta donde donde se encue encuentr ntran an todos todos los cromos cromosoma omass fi:ado fi:ados! s! /e encuen encuentra tran n teñidos con Hiemsa Hiemsa o o con una sonda# esto sir+e para marcar ese ADN y con+ con+er ertitirl rlo o en una una nue+ nue+a a sond sonda! a! A cont contin inua uaci ci%n %n## pone ponemo moss los los cromosomas de un donantes sin anomalías (generalmente procedente de sus linfocitos y de un +ar%n para contemplar todas las opciones# es decir# tener los cromosomas e S) en un porta y añadimos la sonda preparada! "speramos +er que ay ibridaci%n ibridaci%n de de la sonda (cromosoma marcador) con alguno de los crom romosomas del donante por complementariedad en su secuencia! Así# podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el que ibrida! Una +e, identificado# el cromosoma marcador pasaría a ser llamado un cromosoma deri+ati+o!
IS- on a c9ip" "sta nue+a tcnica conlle+a numerosas +enta:as# como la necesidad de utili,ar menor cantidad de reacti+os# el empleo de un menor n-mero tiempo de an&lisis (ya que en menos de una ora se pueden anali,ar los n-cleos# frente a las 5G7 oras que precisa el procedimiento de IJ/ con+en con+encio cional nal)# )# su rapide rapide,, para para la obtenc obtenci%n i%n de result resultado ados# s# su alta alta sens sensib ibililid idad ad o su meno menorr cost coste# e# con con comp compar arac aci% i%n n con con la tcn tcnic ica a con+encional de IJ/! a principal aplicaci%n de este no+edoso sistema es en el campo del diag diagn% n%st stic ico o clín clínic ico# o# sobr sobre e todo todo en el estu estudi dio o de enfe enferm rmed edad ades es neuronales# como es el caso de la enfermedad del Al,eimer Al,eimer en en su estadío temprano# aunque no se descarta su uso en otros campos como en la industria alimentaria!
/e emplea un cip microfluídico con estrecos canales# por los que se ace ace pasar pasar la suspen suspensi% si%n n celula celularr purific purificada ada por capila capilarid ridad# ad# la+ada la+ada pre+iamente con '/! Una +e, aderidas o fi:adas las clulas a los can canale ales por calor alor## diger igerim imos os las las clu lulas las med mediant iante e la adici% ici%n n de proteinasa V y V y desnaturali,amos su material gentico# nue+amente por un incremento de temperatura! =ras estos pasos# ya pueden ser añadidas las sondas y reacti+os necesarios# que difundir&n a lo largo de todo el canal# pudiendo obser+ar los n-cleos ba:o el microscopio en el mismo cip y de manera ordenada! IJ/ IJ/ on cip cip es una una tcn tcnic ica a muy muy -til -til para para dete detect ctar ar anom anomal alía íass cromos cromos%mi %micas cas (aneuploidías aneuploidías))# entre otros defectos! "n el caso del Al,eimer del Al,eimer # es abitual utili,ar muestras de linfocitos procedentes de sangre perifrica# fibroblastos o muestras de orina!
IS- mul!icolor "s una adaptaci%n del IJ/ que permite la +isuali,aci%n de los 57 pares de cromosomas cromosomas a a la +e,# teñidos con diferentes sondas fluorescentes! A ni+el comercial s%lo ay ; colores distintos posibles# por lo que se puede usar la sonda de un color concreto o combinar dos tipos de sondas para crear un nue+o color! "l sistema de detecci%n del equipo empleado debe estar adaptado a los ; colores! Un programa inform&tico se encarga de anali,ar las im&genes y formar el cariograma. organi,a los cromosomas de acuerdo a la emisi%n de las sondas que tiene integradas y las combina asta dar las 57 combinaciones! /e utili,a con frecuencia en el estudio de clulas tumorales! "l poder de dico mtodo reside en su abilidad para. •
Dete Determ rmin inar ar r&pi r&pida dame ment nte e si ay ay algalg-n n crom cromos osom oma a adic adicio iona nall en el cariotipo cariotipo y de qu cromosoma se trata# porque su color permitir& identificarlo!
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Dete Determ rmin inar ar si est& est& pres presen ente te algalg-n n crom cromos osom oma a tran transl sloc ocad ado o y qu qu cromosomas est&n implicados en la translocaci%n por la combinaci%n de dos dos colo colore ress asoc asocia iado doss a crom cromos osom omas as dife difere rent ntes es en un mism mismo o cromosoma!
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R&pida identificaci%n de material cromos%mico de un cromosoma que aya sido insertado en otro cromosoma por la +ariaci%n del color del fragmento insertado respecto al color de todo el cromosoma!
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Jde Jdentif ntific ica aci% ci%n
de
cromo romoso soma mass
peque queños
o
fra fragme gmentad ntados os que
frecuentemente implican el problema de a+eriguar su origen# como es el caso de los cromosomas marcadores! "stas aplicaciones del /VS se deben a que cada cromosoma est& teñido completamente de un -nico color (de una -nica sonda) y por eso# +iendo el color que +an a tener todos los cromosomas de la muestra podemos saber que anomalía presenta el paciente! /in embargo# aunque se pensaba que iba a desbancar al cariotipo tradicional# tiene una serie de des+enta:as que an frenado su uso# especialmente el uso clínico! "stas son. •
"l ele+ado precio!
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eno enorr defin definic ici%n i%n que que el IJ/ IJ/ con+ con+en enci cion onal al!! /%lo /%lo se pued pueden en +er +er cromosomas y traslocaciones grandes# sin poder obser+ar bandas!
Aplicaciones 8.4.5 Aplicaciones "sta tcnica a resultado ser muy -til en el campo de la medicina reproducti+a# con aplicaci%n en el diagn%stico gentico preimplantatorio (DH) preimplantatorio (DH)!! Resulta Resulta una form forma a muy muy prec preco, o, de diag diagn% n%st stic ico o que# que# apoy apoy&n &ndo dose se en las las tcn tcnic icas as de repr reprod oduc ucci ci%n %n asis asistitida da## posi posibi bilit lita a el estu estudi dio o de embr embrio ione ness ante antess de ser ser transferidos al -tero materno y# por consiguiente# antes de que se lle+e a cabo la implantaci%n embrionaria! ara el an&lisis de anomalías cromos%micas embrionarias# tanto numricas como estructurales# puede utili,arse la tcnica DHGIJ/! ara este fin se requiere una biopsia embrionaria# mediante la cual se e*trae una clula del embri%n en culti+o in +itro!
/eguidamente# se procesa la muestra de tal manera que quede fi:ado el n-cleo en interface y se ibrida con sondas específicas para el estudio cromos%mico de la patología que se sospeca pueda estar presente en el embri%n!
8.7.5 Anomal:as 8.7.4.5 Anomal:as numéricas •
Alteraciones en cromosomas se*uales. Alta frecuencia de mosaicismo en pacientes implica que# en mucos casos# s%lo se den defectos le+es en el desa desarr rrol ollo lo!! Hran Hran rele rele+a +anc ncia ia en edi edici cina na Repr Reprod oduc ucti+ ti+a a por por ir asociado# en mayor o menor grado# a problemas de fertilidad! =ales son
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los casos de síndrome de Vlinefelter # trisomía y y monosomía ! ! "dad materna a+an,ada# aborto de repetici%n de causa desconocida y$o fallo de implantaci%n. &s de la mitad de los casos son debidos a alteraciones en los cromosomas 17# 1<# 1Q# 51# 55# e S! "n estos cas casos# os# la selec elecci ci%n %n de aque aquellllos os embri mbrio ones nor normale maless para ara los los cromos cromosoma omass citado citados# s# aumen aumenta ta las probab probabili ilidad dades es de conse consegui guirr una
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gestaci%n a trmino! Iactor masculino gra+e. 3on este estudio embrionario# se pueden e+itar las alteraciones cromos%micas surgidas en la descendencia de aquellos grupos de pacientes con calidad seminal ba:a y que tienen que recurrir a la tc tcnic nica a de mic microi roiny nyecc ecci%n i%n int intrac racito itopla plasm& sm&tic tica a del espermato, espermato,oide oide (J3/J)!
8.7.7.5Anomal:as es!ruc!urales /urgen espont&neamente# en la mayoría de los casos# como consecuencia de un fallo de meiosis durante la oognesis oognesis o o espermatognesis espermatognesis## en los casos en que los padres presentan cariotipos normales! Algunas +eces# alg-n miembro de la pare:a puede ser portador de una anomalía estructural equilibrada# que podría transmitir a su descendencia! De esta manera# por medio del estudio gentico específico de embriones de la pare:a portadora# podrían distinguirse aquellos embriones desequilibrados cromos%micamente de los equilibrados! Una +e, eca esta selecci%n de embriones# podrían transferirse con total
tranquilidad al -tero materno los embriones que no presentan la alteraci%n gnica! Una aplicaci%n adicional del IJ/ en interfase es obtener mayor informaci%n sobre la organi,aci%n de los cromosomas en el n-cleo interf&sico (los llamados territorios cromos%micos)! Adem&s de ser -til para reali,ar diagn%sticos preimplantatorios# el IJ/ tiene aplicaci%n en medicina para detectar enfermedades y determinar el pron%stico de las mismas# así como para e+aluar la remisi%n de algunas enfermedades# como el c&ncer! 3on IJ/ es posible diagnosticar enfermedades incapaces de ser detectadas por otros mtodos tradicionales que implicaban el an&lisis de cromosomas en metafase! Adem&s su utili,aci%n es muco m&s sencilla que los mtodos citogenticos m&s abituales# los cuales requieren clulas en di+isi%n# así como un mayor esfuer,o en tiempo y traba:o para la preparaci%n manual y an&lisis de las muestras! =ambin puede utili,arse para la detecci%n directa de pat%genos a partir de sangre o restos de te:idos de un paciente! "sto supone una gran +enta:a teni tenien endo do en cuen cuenta ta que que muc mucos os micro microor orga gani nism smos os no son son cult culti+ i+ab able less en condiciones de laboratorio! "l IJ/ tambin se usa para comparar genomas de dos especies biol%gicas y deduc deducir ir relaci relacione oness e+olu e+oluti+ ti+as! as! Asimis Asimismo# mo# se puede puede usar usar en el &rea &rea de la "cología icrobiana para identificar microorganismos dentro de un biofilm# así como para obser+ar su distribuci%n y locali,aci%n dentro del biofilm o reali,ar ensayo ensayoss de coloc colocali ali,ac ,aci%n i%n utili, utili,and ando o sondas sondas de distin distinto to color color para para cada cada microorganismo!
