PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR Introducción al microscopio
El microscopio óptico: fundamentos y tipos • Del griego mikrós (pequeño) y skopéin (observar). • Perm Permititee ver ver obj objeto etoss por por deba debajo jo del del lím límititee de resol resoluc ución ión del ojo ojo humano (alrededor de 100 a 200 µm (0,1 a 0,2 mm). • En la la mayo mayorí ríaa de los los cas casos os la la obse observ rvac ació iónn micr micros oscóp cópic icaa se reali realiza za sobre células muertas procesadas para eliminar el agua, preservar lo mejor posible su estructura, dar contraste a sus distintos componentes y obtener una sección lo suficientemente delgada para que la luz o los electrones la atraviesen. En determinadas circunstancias, sin embargo, también pueden observarse células U1 vivas. • Las célul células as euca eucaririot otas as tie tienen nen un tam tamaño año que oscil oscilaa entr entree 10 y 30 30 µm de diámetro, mientras que las procariotas y los componentes celulares son aún menores. • Su visu visual aliz izaci ación ón sól sóloo es pos posib ible le uti utililizan zando do dif difer erent entes es tip tipos os de de microscopios que, por efecto de sus lentes combinadas, poseen mayor límite de resolución (hasta 0,2 µm en el MO o unos pocos nm en el caso del MET – microscopio microscopio electróni electrónico co de transmisión transmisión -). -).
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Usuario; 20/09/20 20/09/2016 16
Microscopio simple (lupa o microscopio estereoscópico) estereoscópico) • Cons Consta ta de una una sola sola lente ente o si siste stema de lentes convergentes convergentes biconvenxas biconvenxas (parte (parte óptica) sostenidas por un soporte con tornillos de enfoque (parte mecánica). • La dist distan anci ciaa foc focal al varía aría ent entre 5 y 10 10 cm cm. • Prop Propor orci cion onaa una una ima image genn vir virtu tual al,, der derec echa ha,, aumentada entre 2 y 20-30 veces. • Los est estereomicro croscopi opios mode odernos nos cuentan con mayor distancia útil de trabajo, tienen sistemas de iluminación direccionable, de luz polarizada, de campo oscuro y es posible adaptar cámara fotográfica y vídeo. • Las Las lup lupas as se util utiliz izan an como como auxi auxililiar ares es en la observación o disección de piezas anatómicas pequeñas.
Microscopio óptico compuesto (convencional) • Tamb Tambié iénn llam llamado ado micr micros osco copio pio de cam campo po clar claroo o fotó fotónic nico, o, ya ya que que se utiliza un haz de luz común (luz blanca) que atraviesa la muestra e ilumina el campo de observación. • La mues muestr traa debe debe ser ser lo suf sufici icient entem emen ente te fin finaa como como para para que que la luz luz pueda atravesarla. • Los detal detalles les se vis visual ualiz izan an debi debido do a las las dif difer eren enci cias as de de abso absorc rció iónn de la luz en las distintas partes del material biológico. • Este Este mic micro rosc scopi opioo se suel suelee util utiliz izar ar par paraa observ observar ar pre prepar paraci acion ones es histológicas coloreadas. • Se obt obtie iene ne una una ima image genn fina fina,, virt virtual ual,, inve invert rtid idaa y aum aument entada ada de los los objetos observados. • El MO cuen cuenta ta con con tre tress sis siste tema mass de de lent lentes es:: – El condensador, que enfoca los rayos de luz sobre la muestra; – Los objetivos, que magnifican la imagen; – Y los oculares, que agregan una mayor magnificación y permiten la visualización directa del preparado.
MO. Parte mecánica • • •
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Pie. Debe ser sólido y amplio. Columna. Sostiene el tubo y la platina. Tubo. Lleva los oculares y objetivos. Puede ser monocular, binocular o trinocular. Los objetivos están enroscados en un sistema de revólver que permite colocar uno u otro en el eje óptico. Platina. Superficie horizontal donde se coloca el preparado sujeto con pinzas. Generalmente permite el desplazamiento del preparado a derecha e izquierda o de atrás a delante. Un orificio en la parte central de la platina permite el paso de la luz que atraviesa la muestra. Los tornillos de enfoque. Permiten regular la distancia entre el preparado y los objetivos con el fin de obtener una imagen nítida de la muestra. Generalmente hay un tornillo macrométrico macrométrico y uno micrométrico. micrométrico. Debaj ebajoo de de la la pla plattina ina hay hay sopo soport rtes es para para el condensador, el diafragma y los filtros.
MO. Parte óptica • Objetivos. En el revólver de un MO hay generalmente objetivos de diferentes diferentes aumentos: aumentos: uno llamado llamado lupa, lupa, o de campo (3,5x, 4x ó 5x); otro de 10x y/o de 25x, 25x, uno de 40 ó 45x; y, con frecuenci frecuencia, a, uno de inmersión inmersión de 100x. El objetivo de inmersión se utiliza frecuentemente para exámenes citológicos. • Oculares. Son las lentes que recogen la imagen dada por el e l objetivo. Tienen grabado el aumento que proporcionan. El aumento final se calcula multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular. oc ular. • Condensador. Concentra los rayos luminosos y los proyecta proyect a sobre el preparado a través del orificio de la platina. Para observaciones con objetivos de gran aumento se requiere que que el condensador esté cerca de la platina; por el contrario, para trabajar con bajo aumento conviene bajar el condensador para obtener una iluminación más pareja en todo el campo observado. • Diafragma del condensador. Gradúa la cantidad de rayos luminosos que llegan al objeto. Para preparaciones sin teñir o con poco contraste es conveniente cerrar el paso de la luz un poco p oco más de lo habitual para aumentar el contraste. • Sistema de iluminación . Consta de luz, espejo, filtros y diafragma. dia fragma. • Filtros. Se colocan en aros portafiltros situados debajo del condensador.
Microscopios especiales • • • • • • • •
Microscopio de campo oscuro . Generalmente utilizado para observación de células vivas y móviles, como bacterias y espermatozoides. Microscopio de contraste de fases . Permite observar células y tejidos sin colorear y es especialmente útil para la observación de células vivas. Microscopio de interferencia . Es una modificación del anterior y es muy utilizado en cultivos celulares. Microscopio de polarización . Usa luz polarizada (luz que vibra en un solo plano). Permite estudiar tejidos duros (hueso, diente), estructuras que tengan simetría s imetría lineal (tejido muscular), y la presencia o deposición de colágeno. revólver portaobjetivos situado debajo de la platina y el Microscopio invertido . Tiene el revólver sistema de iluminación por encima de la misma. Esto permite contar con una mayor distancia de trabajo y poder observar observar células creciendo en medios medios de cultivo de varios mm de espesor. Microscopio de fluorescencia . Permite detectar moléculas que fluorescen, que absorben determinada longitud de onda y reemiten luz de una longitud de onda mayor. Las estructuras fluorescentes aparecen luminosas y brillantes, resaltando r esaltando sobre fondo oscuro. Microscopio de luz ultravioleta . Usa exclusivamente esta luz para atravesar la muestra. Es particularmente útil para detectar la presencia de distintos tipos de moléculas (ácidos nucleicos) en las células. La visualización sólo puede realizarse con fotografías. Microscopio láser confocal . Permite obtener imágenes de excelente definición y de una resolución un 30% superior a la de un MO común. Combina partes de un MO al que se adapta un equipo fluorescente, con un sistema de barrido en el que se emplea un rayo láser. Pueden lograrse imágenes de la muestra a diferentes profundidades, como si se observara capa por capa, pudiendo reconstruir una imagen tridimensional completa de la célula estudiada.
Polarización Campo oscuro
Contraste de fases
Láser confocal Polarización
El microscopio electrónico: electrónico: fundamentos y tipos • Utiliza el electrones en lu lugar de de fo fotones o lu luz visible visible para para formar formar imág imágenes enes de de objetos objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar amplificaciones mayores que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longit longitud ud de onda de los los electr electrones ones es bastante menor que la de los fotones "visibles". • Exist Existen en dos dos tip tipos os princ principa ipales les:: el el de de tra transm nsmisi isión ón o TEM (Transmission electron microscope ), ), desarrollado en primer lugar, y el de barrido o SEM (Scanning electron microscope ). ).
TEM • El micro croscop scopiio ele electr ctrónico nico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, generalmente no mayore mayoress de unos 5000 Å (10 ángstrom= 1nm), o sea, 0,5 µm. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces.
SEM • En el micr micros osco copi pioo ele elect ctró róni nico co de barr barrid idoo la la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, generalmente oro depositado mediante la técnica del sombreado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. cañón. El haz de electron electrones es no está fijo, sino sino que se mueve y rastrea continuamente la superficie de la muestra. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolución resolución está está entre 3 y 20 20 nm, dependie dependiendo ndo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye sustitu ye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. • Se suel suelee emp emple lear ar para ara la la ob observ servaación ción tridimensional de estructuras completas, pequeños organismos o partes de órganos (cristalino), pequeñas estructuras (esporas, polen), células completas (eritrocitos), así como orgánulos en células fraccionadas.
Comparación de la formación de la imagen en un microscopio microscop io de transmisión óptica, un microscopio electrónico de transmisión (TEM), un microscopio electrónico electrónico de de barrido barrido (SEM) y un tubo de rayos rayos catódicos catódicos (CRT) de pantalla pantalla de TV
