BQ-II Práctica No 4 “PRODUCCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PIRUVATO Y ACETALDEHÍDO DURANTE LA FERENTACIÓN DE LA !LUCO"A POR LEVADURA#
OB$ETIVO !ENERAL Demostrar experimentalmente la producción de piruvato y acetaldehído por fermentación de la glucosa utilizando levadura.
OB$ETIVO" E"PECÍFICO" 1).- Comprobar la formación de cido pir!vico durante la fermentación de la glucosa por levadura. ").- #dentificar la presencia del cido pir!vico a partir de glucosa utilizando la prueba del nitroprusiato de sodio y "$ % - dinitrofenilhidracina. &).- Demostrar la formación de acetaldehído a partir de glucosa e identificarlo usando la prueba de la piperidina
FUNDAENTO% 'a glucólisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a (tanol y C "$ y*ó a cido lctico dependiendo del organismo +ue lo efect!e$ como siendo en el primer caso las levaduras las responsables.
,mbas rutas de fermentación son similares hasta la formación de piruvato$ manteniendo idnticas las etapas de conservación de energía +ue conducen a la formación de ,/. 'a glucólisis no solo es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa +ue conduce a la producción de ,cetil -Co, y a su oxidación en el ciclo del cido cítrico$ sino +ue tambin proporciona una vía importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. 'a característica de la glucólisis de proporcionar ,/ en ausencia de oxígeno es de significado crítico biomdico$ por+ue permite al m!sculo es+ueltico hacer un traba0o sumamente eficiente a!n cuando la oxidación aeróbica se vuelva insuficiente$ a la vez +ue los te0idos con capacidad glucolítica pueden sobrevivir a episodios de anoxia. #nversamente el m!sculo cardíaco$ +ue est adaptado al traba0o aeróbico$ tiene una capacidad glucolítica relativamente deficiente y supervivencia escasa ba0o condiciones de is+uemia. ay un n!mero pe+ue2o de enfermedades en las +ue las enzimas del sistema glucolítico como por e0emplo la piruvato cinasa muestran actividad deficiente3 estas anomalías se manifiestan principalmente como anemias hemolíticas. (n las clulas cancerosas +ue proliferan con rapidez$ la glucólisis procede a una velocidad mucho mayor +ue la re+uerida por el ciclo del cido cítrico$ por tanto$ se produce ms piruvato +ue el puede ser metabolizado. (l resultado es una producción excesiva del lactato$ +ue favorece un entorno local relativamente cido en el tumor$ situación +ue puede tener implicaciones con ciertos tipos de teraputica contra el cncer. ambin se produce acidosis lctica por deficiencia de piruvato deshidrogenasa.
ATERIAL
14 tubos de ensaye de 1& x 144 1 gradilla para tubos de ensayo % tubos de centrifuga 1tripie 1 mechero 5unsen 1 anillo metlico 1 tela de asbesto & pipetas de 6 ml. graduadas. " vasos de precipitados de "64 ml 1 vaso de precipitado de 744 ml " pinzas para tubos de ensaye 1 propipeta
EQUIPO • •
1 centrífuga 1 5a2o de agua a &89 C o incubadora
•
1 :ortex
REACTIVO"
;osfato de sodio dibsico <=a "/%) 4.6 > ;osfato de potasio monobsico @uspensión de levadura <144 g * l en =a "/%) @uspensión de levadura <144 g* l en ? "/%) @uspensión de levadura <144 g* l en agua Alucosa <144 g* l) =itroprusiato de sodio <64 g* l )B /(/,(@( ,=(@ D( @, idróxido de amonio @ulfato de amonio =a <144 g* l) idrocloruro de "$% E dinitrofenilhidracina ) /iperidina <&4 g*l en solución acuosa) Fcido tricloroactico <144 g* l)
Nota% La &i'o()ci*+ &, (,a&)ra ', .r,.arará ,( &/a &, (a .ráctica PROCEDIIENTO% 012- FORACIÓN DE PIRUVATO A PARTIR DE !LUCO"A 1.- (n dos tubos de ensayo pipetear 6 ml de solución de glucosa 3t)o' A 5 B) ".- (n el t)o A agregue 6 ml de suspensión de levadura en solución ligeramente alcalina de =a"/% y al t)o B agregue 6 ml de suspensión de levadura en solución ligeramente cida de ? "/% &.- Colo+ue los tubos , y 5 en un ba2o >aría a &89 C durante 1 hora %.- ,2ada a cada tubo " ml de solución de cido tricloroactico$ mezcle vigorosamente y centrifugue durante 14 minutos a "644 r.p.m. 6.- @epare el sobrenadante y !selo para la determinación de piruvato
612- IDENTIFICACIÓN DEL PIRUVATO a1 R,acci*+ co+ +itro.r)'iato &, 'o&io
(n un tubo de ensaye agregue " ml del sobrenadante hervido previamente a 1 gr de sulfato de amonio sólido
,gregar dos gotas del reactivo nitroprusiato de sodio
De0ar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de hidróxido de amonio concentrado$ hasta la formación de dos capas. @i hay piruvato se forma un anillo verde o azul en la interfase de los dos lí+uidos. 'a formación de un anillo rosado transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloración azul o verdosa$ característica de la reacción con piruvato. 1 D,t,r7i+aci*+ &, .ir)ato co+ 684-&i+itro9,+i(:i&raci+a
,gregue 1 ml de solución saturada de "$%-dinitrofenilhidracina a " ml de sobrenadante
>ezcle fuertemente y colo+ue " o & gotas de la mezcla en un tubo de ensayo
,gregue 1 ml de solución de =a <144 g*l) y diluya con agua hasta 6 ml. 'a aparición de un color ro0o indica la presencia de piruvato epetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series • •
•
;12- FORACIÓN DE ACETALDEHÍDO A PARTIR DE !LUCO"A
(n dos tubos de ensayo marcados como C 5 D pipetear 6 ml de solución de glucosa$ agregue a cada uno de ellos 6 ml de suspensión de levadura en agua. ,l tubo D a2ada 4.6 g de sulfito de sodio. >ezcle vigorosamente e incube los dos tubos a &89 C durante 1 hora.
Centrifugue$ separe el sobrenadante$ mezcle " ml del sobrenadante con 4.6 ml de solución fresca de nitroprusiato de sodio y " ml de piperidina acuosa$ y agite. @i hay acetaldehído presente se observar una coloración azul
OB"ERVACIONE"BGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG RE"ULTADO"BGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG COENTARIO" Y CONCLU"IONE" GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG CUE"TIONARIO
1. HIu finalidad tiene adicionar a la suspensión de levadura =a "/% y ?"/%J ". H/or+u deben estar los tubos en ba2o maría a &8KC por &4 minutos. &. H/or+u se adiciona C,
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