CICLO DEL NITRÓGENO Aislamiento de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno (Rhizobium sp.)
RESUMEN OBJETIVO -Aislar bacterias fijadoras de nitrógeno (Rhizobium sp.), a partir de raíces de trébol.
INTRODUCCIÓN Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes del suelo. Para desarrollar la fertilidad del suelo, debe aumentar el contenido de nitrógeno. En las condiciones medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares que obtienen de la planta, fijan el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana. Si las bacterias satisfacen sus necesidades de nitrógeno, entonces, el nitrógeno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados de proteína en la planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hasta que muere parte de la planta, o se exuda al suelo en la rizósfera. Se dan dos grandes divisiones de bacterias fijadoras de nitrógeno: las bacterias fijadoras de nitrógeno simbióticas y las bacterias fijadoras de nitrógeno asociativas. Las bacterias
fijadoras de nitrógeno simbióticas, tales como el Rhizobium, se dan en las legumbres. Estas bacterias forman nódulos en las raíces de las plantas. Y estos nódulos son fáciles de contar. Las bacterias fijadoras de nitrógeno asociativas ocupan los espacios entre las células de las raíces de la planta, y no alteran la arquitectura de la raíz en absoluto. MARCO TEORICO
Fijación abiótica de nitrógeno Estas reacciones ocurren de forma abiótica en condiciones naturales como consecuencia de las descargas eléctricas o procesos de combustión y el agua de lluvia se encarga de arrastrar al suelo los compuestos formados. También se derivan de la síntesis química realizada en la industria de fertilizantes con un alto consumo de energía.
Fijación del nitrógeno
Entre los microorganismos del suelo que realizan la fijación del nitrógeno atmosférico, los más comunes y efectivos son los del genero Rhizobium, que colonizan y forman nódulos en las raíces de las leguminosas. Las bacterias obtienen alimento de la planta y ésta a cambio, recibe compuestos nitrogenados. El proceso de fijación del nitrógeno atmosférico que las bacterias realizan consiste en combinar el nitrógeno gaseoso con el hidrogeno para formar amoniaco En las células vegetales, los iones nitrato se reducen a iones amonio y los iones amonio se combinan luego con compuestos que contienen carbono, que posteriormente forman aminoácidos, nucleótidos y otros compuestos nitrogenados. Estos compuestos nitrogenados regresan al suelo cuando la planta muere o cuando mueren los animales que han comido de las plantas, son reprocesados por los organismos del suelo y son nuevamente absorbidos por las raíces de las plantas en forma de nitrato disuelto en el agua del suelo. En los suelos destinados a la agricultura, la mayor perdida de nitrógeno se debe a la remoción de las plantas del suelo. Los suelos de cultivo muestran una
declinación constante del contenido de nitrógeno. Si el nitrógeno perdido del suelo no se reemplazara continuamente, toda la vida del planeta finalmente se extinguiría. El nitrógeno perdido regresa al suelo por el proceso de fijación del nitrógeno, por el cual los compuestos orgánicos nitrogenados incorporan el nitrógeno atmosférico. Las bacterias simbióticas son las más importantes en cuanto a la cantidad total del nitrógeno fijado. La bacteria más común entre las simbióticas fijadoras de nitrógeno es la Rhizobium, que invade las raíces de las leguminosas, Donde crecen plantas leguminosas suele aparecer en el suelo un poco de nitrógeno extra que luego queda a disposición de otras plantas. En la agricultura moderna, es una práctica común rotar el cultivo de plantas de las plantas no leguminosas con uno de leguminosas. Las plantas leguminosas son luego cosechadas, y quedan en el suelo las raíces ricas en nitrógeno. Así, por ejemplo, un cultivo de alfalfa puede añadirle al suelo hasta 350 Kg de nitrógeno por hectárea lo cual suele ser suficiente para cultivar una planta no leguminosa sin efectuar ninguna fertilización artificial.
TABLA 1: Géneros representativos de organismos implicados en la fijación de nitrógeno asimbiótica, asociativa y simbiótica
GRUPO FISIOLÓGICO
TIPO DE ASOCIACIÓN
heterótrofo
De vidas libre; aerobio
HUÉSPED (EN EL CASO DE QUE EXISTA)
Anaerobio facultativo
Anaerobio
Asociativa; anaerobio
Anaerobio facultativo Simbiótica; aerobio
autótrofo
De vida libre; unicelular Filamentoso; no heterocistico Filamentoso;
Rizosfera Digitaria paspalum filosfera filosfera filosfera filosfera glicina leguminosas trema alnus myrica gunnera
GENERO REPRESENTATIVO Azotobacter Azomonas Azotococcus Beijerinckia Derxia Pseudomonas Rhizobium Xanthobacter Azozpirillum Bacillus Klebsiella Thiobacillus Clostridium Desulfovibrio Desulfotomaculum Methanobacillus Agrobacterium Azospirillum Azotobacter Bacillus Beijerinckia Enterobacter Klebsiella Bradyrhizobium Rhizobium Rhizobium Frankia Frankia nostoc
Gleocapsa Trichodesmium Anabaena Calothrix
heterocistico
Nostoc Rodospirillum Rhodopseudomo nas Cromatium Chiorobium
Anaherobio; purpureo sin azufre Azufre púrpura Azufre verde Simbiótica; sin nódulos
Liquen Peltigera Collema Hepática Anthoceros Biasia Mohos Sphagnum Helechos Azolla Intracelular oocystis
Nostoc Nostoc Nostoc Nostoc Halosiphon Anabaena Nostoc
gimnospermas cicadaceas nódulos c) Rhizobium Es un género de bacterias Gramnegativas de perfil de suelo que fijan nitrógeno atmosférico.Pertenece a un grupo de bacterias fijadoras de nitrógeno que se denominan colectivamente rizobio. Viven en simbiosis con determinadas plantas (como por ejemplo las leguminosas) en su raíz, después de un proceso de infección inducido por la propia planta mediante la secreción de lectina, a las que aportan el nitrógeno necesario para que la planta viva y esta a cambio le da cobijo. Más específicamente, la condición de simbiosis viene dada
nostoc por la formación de una molécula de transporte de oxígeno, equivalente a la hemoglobina, llamada Leghemoglobina. Sólo se puede sinteitzar cuando los dos organismos se encuentran en simbiosis; por parte de la bacteria se sintetiza el grupo Hemo de dicha molécula, y por parte de la planta se sintetitza la apoproteína. Así, mediante la nueva molécula formada, se puede llevar a cabo el transporte de oxígeno necesario para el metabolismo de la bacteria (y así poder fijar el nitrógeno requerido por la planta).
Importancia en agricultura Aunque mucho nitrógeno es removido cuando se cosechan los granos ricos en proteína o el heno, cantidades significativas pueden permanecer en el suelo para futuros cultivos. Esto es especialmente importante cuando no se usan fertilizantes nitrogenados como en los esquemas de secuencias de cultivos en la agricultura orgánica o en países menos industrializados. Por lo general, el nitrógeno es el nutriente más comúnmente deficitario en muchos suelos del mundo y el más comúnmente agregado al suelo. La fertilización nitrogenada a través de fertilizantes tiene fuertes impactos medioambientales. En cambio, la fijación de nitrógeno por estas bacterias es muy beneficiosa para el ambiente. Simbiosis Los rizobios son únicos debido a su vida en relación simbiótica con leguminosas: garbanzo, poroto, trébol, soja. Los rizobios viven en el suelo donde se encuentran las raíces de las Fabaceae, si la bacteria produce los Factores NOD correspondientes a la especie de Leguminosa la simbiosis ocurre. La bacteria rizobial entra en el pelo radicular y crece como un tubo hacia el centro del pelo. Y las células de la planta proliferan formando el nódulo. La bacteria diferenciada
morfológicamente como bacteroides fija nitrógeno de la atmósfera y lo entrega en una forma usable para el vegetal, ion amonio (NH4+), usando la enzima nitrogenasa. En compensación la planta provee a la bacteria con azúcares, proteínas y oxígeno. Recientemente se descubrió que un grupo de rizobios (Bradyrhizobium) carece de factores NOD y por lo tanto debe dialogar de alguna otra manera con su planta huésped, Aeschynomene La simbiosis leguminosa–rizobio es un ejemplo clásico de mutualismo — el rizobio entrega amonio o aminoácidos a la planta y recibe ácidos orgánicos (principalmente como ácidos di carboxílicos malato y succinato) como fuentes carbonadas de energía — pero su persistencia evolucionaria es actualmente aún motivo de sorpresa. Debido a que muchas razas no vinculadas infectan a cada planta individual, algunas razas pueden re direccionar recursos de la fijación de nitrógeno a su propia reproducción sin matar a la planta hospedante de la cual dependen. Pero si esta forma de relajación del mutualismo se generalizara a todas las razas se produciría la clásica tragedia de los comunes. Por tanto, las leguminosas guían la evolución de los rizobios hacia un mayor mutualismo reduciendo la cantidad de oxígeno que entregan a los nódulos que fijan
menos nitrógeno, reduciendo el porcentaje de bacterias MATERIALES Ø Raíces noduladas de trébol Ø 2 cajas de petri estériles Ø 5mL de solución de hipoclorito al 1% Ø 10 mL de etanol al 95% Ø 1 pinza Ø 1 bisturí Ø 1 Asa bacteriológica redonda Ø 500 mL de agua destilada estéril
MÉTODOS 1. Lave las raíces con agua de la llave para remover el suelo 2. Posteriormente sumerja las raíces, especialmente las zonas donde existan nódulos intactos en etanol al 95% por 10 segundos 3. Transfiéralos nódulos con pinzas previamente flameadas en una solución de hipoclorito de sodio al 1% 6. RESULTADOS
"tramposas" generación.
en
la
siguiente
Ø 2 discos de papel filtro estériles Ø 6 Cajas de agar YMCRA (extracto de levadura manitol rojo congo) g/L: K2HPO4 0,1 MgSO4. 7H2O, 0,5, NaCl 0,2, FeCl3 6H20, 0,01, CaCl2, 0,15, rojo congo, 10 mL (de una solución que se prepara adicionando 0,25g del colorante a 100mL de agua destilada), completar hasta 1000 mL con agua destilada, pH 7.
4. Lave 5 veces en agua destilada estéril y seque sobre un disco de papel filtro estéril 5. Deposite los nódulos en la caja estéril y presionarlos con pinzas para extraer los bacteroides 6. Realice siembra por aislamiento de una muestra de la suspensión de nódulos en medio YMCRA. 7. Incubar en oscuridad a 28°C por 3 a 7 días
8. CONCLUSIONES
