DETERMINACION DE HDL INTRODUCCIÓN. Las Lipoproteinas son macromoléculas que estructuralmente están formadas por una parte lipídica y una proteica, cuya función es empaquetar los lípidos insolubles en el plasma proveniente de los alimentos (exógeno) y los sintetizados por nuestro organismo (endógenos), que son transportarlos desde el intestino y el hígado a los tejidos periféricos y viceversa; devolviendo el colesterol al hígado para su eliminación del organismo en forma de ácidos biliares. En la actualidad, las lipoproteínas se clasifican según su densidad en : y y y y y
Quilomicrones VLDL, lipoproteinas de muy baja densidad IDL; lipoproteinas de densidad intermedia LDL; lipoproteinas de baja densidad HDL, lipoproteinas de alta densidad.
Características: Las lipoproteínas son partículas esféricas, de un tamaño menor que los hematíes y solo son visibles al microscopio electrónico. Están formadas por una parte lipídica, y una proteica. Dentro de la lipídica encontramos colesterol esterificado y no esterificado, triglicéridos y fosfolipidos y en la parte proteica a las apolipoproteinas. El colesterol en su forma esterificada se va a encontrar en el centro o core de la lipoproteina, y el colesterol no esterificado lo vamos a encontrar en una capa mas superficial junto a los fosfolípidos. El colesterol es una molécula derivada de los esteroides, y es esencial para nuestro organismo, esta presente en todas las células formando parte de las membranas celulares, en pequeña cantidad en el sistema nervioso central, recubriendo las vainas de mielina. Es precursor de hormonas esteroides (progesterona, estrógeno, testosterona y corticoesteroides. En la piel y por acción de los rayos solares se transforma en vitamina D. El ser humano dispone de colesterol gracias a dos vías: la exógena directamente a través de los alimentos y la endógena que sintetiza el hígado (la mayor parte). La determinación de colesterol total incluye la medición de las formas libres y esterificadas del esteroide. En el suero o en el plasma 2/3 del colesterol total se encuentran como éster y el resto en forma libre. Esto tiene cierta importancia analítica ya que en algunas reacciones químicas, el éster del colesterol desarrolla un color más intenso que el colesterol libre, lo cual puede provocar un sesgo positivo. Por esta razón es de suma importancia el conocimiento de la química de los diversos métodos para colesterol y el reconocimiento de sus limitaciones en la elección del método que se empleara en el laboratorio. DETERMINACION. La L a incidencia de las enfermedades cardiacas coronarias tiene una correlación inversa con el nivel sérico de HDL(High Density Lipoproteín) colesterol, osea que a mayor concentración de HDL-Colesterol, menor es la incidencia de la enfermedad y viceversa. Aparentemente la relación esta dada por el hecho que las HDL transportan el colesterol desde los tejidos perisfericos para ser metabolizados por el higado, evitando así la proliferación y crecimiento de lesiones ateromatosas. Existe HDL aumentado en mujeres , niños y negros. En la enfermedad de Tangierexiste déficit de síntesis de HDL, HDL, acumulando colesterol en los tejidos. El colesterol ligado a HDL es en promedio el 20 % del colesterol total en hombres y 22,5% en mujeres. MÉTODO DE RUTINA: Método Fosfotungstínico-Magnesio
Fundamento. Los quilomicrones, VLDL(Very Low Density Liporpoteín) y LDL(Low Density Liporpoteín), son precipitados por adición de acido fosfotungstinico e iones magnesio. Luego de la centrifugación , la fracción HDL está contenida en el sobrenadante. La cuantificación posterior se realiza utilizando el reactivo para determinar colesterol. Muestra: Muestra : Suero, Plasma heparinizado o EDTA. Linealidad: El test solo debe ser realizado en pacientes con niveles de trigliceridos menores a 400 mg/dl. Consideraciones: Concentraciones elevadas de acido ascorbico (>2,5 mg/dl) puede arrojar valores bajos. Valores de Hemoglobina sobre 100 mg/dl y de Bilirrubina sobre 10 mg/dl interfieren en la metodología. Valores de referencia
Pronóstico favorable Niveles aceptables Indicador de riesgo
HDL colesterol Hombre >55 mg/dl 35-55 mg/dl <35 mg/dl LDL colesterol
Deseable Riego moderado Riesgo elevado
Mujer >65 mg/dl 45-65 mg/dl <45 mg/dl <130 mg/dl Entre 130-159 mg/dl >160 mg/dl
METODO DE REFERENCIA: POR PRECIPITACIÓN En estos métodos, se emplean polianiones (Heparina, Dextránsulfato), Fosfotungstato, Polietilenglicol, en presencia de actiones bivalentes para precipitar las liporpoteinas más grandes, menos densas; las HDL se determinan en el sobrenadante como colesterol-HDL. Dentro de estos métodos se encuentran la determinación por medio de heparina-Cloruro de manganeso que es un reactivo de uso frecuente. OBJETIVO: Establecer la significancia clínica de la determinación de HDL y su correlación con las demás determinaciones del perfil de lípidos. MUESTRA CLÍNICA: Suero obtenido de 12 horas de ayuno. El E l suero puede conservarse a temperatura ambiente hasta 5 días. La refrige r ación ación pu p uede alterar la estr uctu ctura de lass la lilipoproteínas poproteínas dand dan do resultados ba j ba jos os.. Usar suero control comercial comercia l. REACTIVOS: REACTIVOS : y
y
Solución precipi precip itante (Reactivo comer comer cial): cial): 0.5 Molar de MgCI 2 Fosfotungstato al a l 4% 4%
y
Reactivo para la determ inación de colesterol enzimático (reactivo comercial)
y
Solució Solución n estándar están dar de colesterol de 200 2 00 m g/dL
Nota: las soluciones se deben atemperar ante de su uso MATERIAL POR EQUIPO: y
y
y
Tubo de ensaye de 13x1 00 mmm Tubos de centrifuga Micropipeta 1 000 µL Micropipeta 200 µL Gradilla Centrifuga
POR GRUPO Baño María a 25 °C Espectrofotómetro PROCEDIMIENTO Pipetear en tubos de centrifuga Suero Solución precipitante
250 µL 25 µL
A Mezclar y dejar en reposo a la temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar el sobrenadante a 4000 rpm. Separar el sobrenadante claro y emplearlo para la determinación de colesterol con el método CHOD-PAD Sobrenadante Sol.. Reactiva Sol
Probl . Probl. 100uL 2.0
St 20 ul 2. 0
Blanco 2.0
Mezclar e tubos a 37 °C durante 15 min o a 37 °C por 12 min . Leer a 505 nm
incubar
LlNEARIDAD DEL METODO: La reacción es lineal u sigue La le ley de Lambert-Beer ha hasta 1000 1000 mg/dL VALORES DE REFERENCIA: Pronóstico favorable Riesgo Normal Alto ries ri esgo go
Hombres(mg/dL) > 55 35 - 55 < 35
Mujer es(mq es(mq//dL) > 65 45 - 65 < 45
los
RESULTADOS DISCUSION DE RESULTADOS BIBLIOGRAFIA 1. JO AN AN F. ZI ZIL LVA, P.R. P.R. PANNALL. 1998. 1998. BIOQU BIOQUIIMICA CLíNI CLíNICA EN EL DI AGNÓS AG NÓST TICO Y TRATAMIE TRATAMI ENT NTO O. ED. S ALVAT AL VAT 2. LYNCH, R AP APH A AEL EL,, MELLOR SP AR ARE E INWOOD INWOOD.. 1994 94.. METODOS MET ODOS DE DE LABORATORIO. LABORATORI O. EDITOR EDITORII AL AL INTERAMERICAN INTERAMERICAN A A.. http://www.revistaciencias.com/publicaciones/EpllVuAyZuoRKbAyEj.php http://escuela.med.puc.cl/paginas/cursos/tercero/integradotercero/apfisiopsist/nutricion/NutricionPD F/Dislipidemias.pdf
