PIGMEN-PIGMEN DALAM KLOROPLAS
A. Tujuan
Mahasiswa terampil dalam mengekstraksi pigmen-pigmen yang terdapat dalam kloroplas
Mahasiswa terampil dalam mengidentifikasi pigmen-pigmen yang terdapat dalam kloroplas
B. Dasar Teori
Warna-warna yang umum dalam dunia tanaman adalah hijau atau nuansa warna hijau. Klorofil (zat hijau daun) adalah bahan utama yang menghasilkan warna hijau. Klorofil, suatu bahan yang sangat penting, adalah sebuah pigmen yang terkandung dalam kloroplas yang tersebar dalam sitoplasma (cytoplasm) sel-sel tanaman. Pigmen-pigmen ini menyerap cahaya yang berasal dari matahari dengan mudah, tetapi hanya memantulkan warna hijau. Selain memberi warna hijau pada daun, hal ini juga menyebabkan terpenuhinya terpenuhinya kelangsungan sebuah proses yang sangat menentukan, yang dikenal dengan nama "fotosintesis". Dalam fotosintesis, tanaman memanfaatkan sinar matahari, yang terdiri dari kombinasi berbagai warna. Salah satu sifat warna-warna dalam sinar matahari yang terpenting adalah bahwa tingkat energi mereka berbeda satu sama lain. Ragam warna ini dinamakan spektrum, yang diperoleh dari pembiasan warna dalam sebuah prisma misalnya, mempunyai warna m erah dan kuning di ujung yang satu, dan biru dan ungu pada ujung lainnya. Warna dengan tingkat energi paling tinggi adalah warna pada ujung biru spektrum tersebut. Perbedaan tingkat energi warna sangat penting bagi tanaman, karena mereka memerlukan sejumlah besar energi untuk melangsungkan melangsungkan fotosintesis. Untuk itu, selama fotosintesis berlangsung, tanaman menyerap cahaya matahari dengan tingkat energi tertinggi di sekitar ujung ultraviolet dari spektrum, yaitu violet dan biru, dan juga warna sekitar ujung inframerah
(panas) dari spektrum, yaitu merah, oranye dan kuning. Daun melakukan semua proses ini melalui pigmen klorofil yang terdapat dalam kloroplas (harunyahya.com, 2005).
Kurva terputus-putus dan solid berwarna putih di bawah ini menggambarkan spektrum absorpsi klorofil a dan b. Kurva hitam di atas menggambarkan efektivitas pelbagai panjang gelombang cahaya dalam menguatkan fotosintesis. Angka-angka menunjukkan betapa miripnya spektrum absorpsi kombinasi klorofil a dan b dengan spektrum kerja fotosintesis (harunyahya.com, 2005).
Kloroplas dijumpai terutama pada bagian daun yang disebut mesofil, yang sering disebut pula daging daun. Kloroplas juga dijumpai di bagian-bagian lain, bahkan juga pada batang dan ranting yang berwarna hijau. Hal ini disebabkan karena dalam kloroplas terdapat pigmen yang berwarna hijau disebut klorofil. Pigmen ini dapat menyerap energi cahaya. Klorofil terdapat pada membran tilakoid dan perubahan energi cahaya menjadi energi kimia berlangsung dalam tilakoid, sedangkan pembentukan glukosa sebagai produk akhir fotosintesis berlangsung di stroma. Disamping klorofil a ( pigmen berwarna hijau ) dikenal pula klorofil b yang mempunyai struktur mirip klorofil a, yaitu pigmen yang berwarna kuning sampai jingga yang disebut karoten (wordpress.com, 2005). Kromatografi kertas merupakan teknik untuk memisahkan senyawasenyawa tertentu sesuai dengan tingkat kelarutannya pada suatu pelarut. Dikenal ada beberapa teknik kromatografi, yaitu kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, kromatografi kolom dan High Pressure Liquid Cromatografi (HLPC) (wikipedia.com, 2004). Kromatografi kertas pada hakikatnya ialah sama dengan kromatografi lapis tipis selulosa atau kertas. Cara ini ditemukan jauh sebelum kromatografi lapis tipis dan sudah digunakan efektif selama bertahun-tahun. Berdasarkan
hal tersebut, peneliti mengambil kesimpulan bahwa nilai Rf pada kromatografi lapis tipis sama dengan nilai Rf pada kromatografi kertas, sehingga acuan yang dipakai untuk menentukan pigmen boleh dengan nilai Rf pada kromatografi lapis tipis meskipun pada penelitian menggunakan kromatografi kertas (Gritter, dkk. 1991). Macam-macam pigmen menurut Harborne (1984): Macam pigmen
Rf
Warna dibawah
Bentuk senyawa
cahaya biasa
jadian
Feofitin a
0,93
Kelabu
Klorofil bebas Mg
Feofitin b
0,80
Coklat kekuningan
Klorofil a
0,60
Hijau biru
Klorofil b
0,35
Hijau kuning
Feoforbida a
0,18
Kelabu
Feoforbida b
0,07
Coklat kuning
Klorofilida a
0,03
Hijau biru
Klorofil tanpa rantai
Klorofilida b
0,02
Hijau kuning
samping fitil
Klorofilida bebas Mg
C. Alat dan Bahan
- mortar dan pistil
- penutup tabung
- corong kaca
- corong pisah
- kertas saring
- gelas ukur
- pisau
- pipet
- gelas piala
- aseton
- gelas arloji
- petroleum eter
- pipa kapiler
- akuades
- kertas kromatografi
- rak tabung
- tabung reaksi
- daun tumbuhan
D. Cara Kerja
Menimbang daun sebanyak 5 mg
Digerus dalam mortar menggunakan pistil sampai halus
Menambahkan 30 ml aseton pada gerusan daun sambil tetap digerus
Menyaring gerusan daun menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam corong pisah
Menambahkan 10 ml petroleum eter dan mengocoknya
Menambahkan 10 ml akuades, dikocok kemudian didiamkan sampai terlihat adanya pemisahan
Air yang terlihat memisah dikeluarkan pelan-pelan melalui kran bawah
Mengulangi pencucian dengan akuades sampai tidak berbau aseton
Mengeluarkan larutan pigmen dari corong pisah dan diletakkan pada gelas arloji dan biarkan menguap
Menyiapkan campuran eluat, dengan perbandingan 1 ml aseton dengan 9 ml petroleum eter
Mengambil 1 ml eluat dan memasukkan dalam tabung reaksi yang dipakai untuk ruang elusi
Menyediakan kertas kromatografi sesuai dengan lebar dan panjang tabung reaksi
Membuat garis pertama dengan jarak 1 cm dari ujung kertas, dan selanjutnya membuat garis kedua dengan jarak 15 cm dari garis pertama
Mengambil larutan pigmen yang sudah diuapkan dengan pipa kapiler, dan selanjutnya membuat spot pada kertas kromatografi pada garis pertama
Setelah spot kering, kertas kromatografi dimasukkan kedalam tabung elusi dengan ujung sedikit menyentuh pada larutan eluat kemudian tabung ditutup rapat
Meletakkan tabung reaksi pada rak dan biarkan beberapa saat sampai eluat bergerak sampai menyentuh garis kedua
Mengamati warna spot yang terjadi pada ketas kromatografi
E. Data Hasil Pengamatan
Nama daun
Spot
Warna
ds
de
Kembang sepatu
1
Hijau
1,5
11,4
(muda)
2
Kuning
3,5
11,4
Penitian (sedang)
1
Kuning
7,4
10
2
Hijau muda
7,6
10
1
Hijau tua
4
10,9
2
Hijau muda
5,6
10,9
3
Kuning
8,4
10,9
Alpukat (tua)
F. Analisis Data
Berdasarkan dari nilai de dan ds, dengan menggunakan rumus Rf = ds de
maka, diperoleh harga Rf dari masing-masing warna sebagai berikut: 1) Kembang sepatu - spot 1
= Rf = 1,5 11,4 = 0,13
- spot 2
= Rf = 3,5 11,4 = 0,31
2) Penitian - spot 1
= Rf = 7,4 10
- spot 2
= Rf = 7,6 10 = 0,76
3) Alpukat - spot 1
= Rf = 4 10,9 = 0,37
- spot 2
= Rf = 5,6 10,9 = 0,51
- spot 3
= Rf = 8,4 10,9 = 0,77
= 0,74
Dari perhitungan nilai Rf diatas maka dapat dimasukkan ke dalam tabel sebagai berikut: Nama daun
Spot
Warna
ds
de
Rf
Kembang sepatu
1
Hijau
1,5
11,4
0,13
(muda)
2
Kuning
3,5
11,4
0,31
Penitian (sedang)
1
Kuning
7,4
10
0,74
2
Hijau muda
7,6
10
0,76
1
Hijau tua
4
10,9
0,37
2
Hijau muda
5,6
10,9
0,51
3
Kuning
8,4
10,9
0,77
Alpukat (tua)
Dari data pengamatan yang didapat, kemudian menentukan macammacam pigmen yang ada di dalam daun suatu tumbuhan dengan cara mencarinya dalam tabel Rf dan warna klorofil a dan b menurut Harborne (1984: 262), sebagai berikut: Macam pigmen
Rf
Warna dibawah
Bentuk senyawa
cahaya biasa
jadian
Feofitin a
0,93
Kelabu
Klorofil bebas Mg
Feofitin b
0,80
Coklat kekuningan
Klorofil a
0,60
Hijau biru
Klorofil b
0,35
Hijau kuning
Feoforbida a
0,18
Kelabu
Feoforbida b
0,07
Coklat kuning
Klorofilida a
0,03
Hijau biru
Klorofil tanpa rantai
Klorofilida b
0,02
Hijau kuning
samping fitil
Klorofilida bebas Mg
Pada daun yang kami amati yaitu daun kembang sepatu yang masih muda dan daun penitian yang sedang, warna yang terbentuk pada kertas Whatman ada dua macam spot, yaitu pada kembang sepatu spot pertama berwarna hijau dengan Rf = 0,13, dan spot yang kedua berwarna kuning Rf = 0,31, jarak
tempuh eluat yaitu 11,4 cm. Pada daun Penitian juga terbentuk 2 spot, yaitu spot yang pertama berwarna kuning dengan Rf = 0,74 dan spot yang kedua berwarna hijau muda dengan Rf = 0,76, dengan jarak tempuh eluat 10 cm. Sedangkan pada daun alpukat yang tua, terbentuk 3 spot, yaitu spot pertama berwarna hijau tua dengan Rf = 0,37, spot yang kedua berwarna hijau muda dengan Rf = 0,51 dan spot yang ketiga berwarna kuning dengan Rf = 0,77, jarak tempuh eluat yaitu 10,9 cm. Rf dari daun yang diamati dalam praktikum yang mendekati atau sama dengan Rf menurut Harborme (1984: 262), sebagai berikut: Macam pigmen
Rf
Feofitin a
0,93
Feofitin b
0,80
Rf daun amatan
0,77 (daun alpukat spot 3) 0,76 (daun penitian spot 2) 0,74 (daun penitian spot 1)
Klorofil a
0,60
0,51 (daun alpukat spot 2)
Klorofil b
0,35
0,37 (daun alpukat spot 1) 0,31 (daun kembang sepatu spot 2)
Feoforbida a
0,18
Feoforbida b
0,07
Klorofilida a
0,03
Klorofilida b
0,02
0,13 (daun kembang sepatu spot 1)
Dari tabel perbandingan antara Rf daun yang diamati dengan Rf menurut Harborne (1984), maka dapat diketahui Rf daun pengamatan yang mendekati Rf dari feofitin b (coklat kekuningan) ada 3 macam, yaitu Rf daun alpukat pada spot 3 dengan selisih 0,03, daun penitian spot 1 dengan selisih 0,06 dan daun penitian spot 2 dengan selisih 0,04. Sedangkan Rf daun amatan yang mendekati Rf klorofil a (hijau biru) ada 1 macam, yaitu Rf pada daun alpukat spot 2 dengan selisih 0,09. Rf bahan amatan yang mendekati Rf klorofil b (hijau kuning) ada 2 macam, yaitu Rf pada daun alpukat spot 1 dengan selisih 0,02 dan Rf pada daun kembang sepatu spot 2 dengan selisih 0,04. Rf yang
mendekati Rf pada feoforbida a (kelabu) ada 1 macam, yaitu Rf pada daun kembang sepatu spot 1 dengan selisih 0,05. Berdasarkan harga Rf tersebut, maka pigmen yang terdapat pada daun kembang sepatu yang masih muda yaitu pigmen klorofil b (hijau kuning) dan feoforbida a (kelabu). Pada daun penitian yang sedang terdapat pigmen feofitin b (coklat kekuningan). Sedangkan pada daun alpukat yang tua terdapat pigmen feofitin b (coklat kekuningan), klorofil a (hijau biru) dan klorofil b (hijau kuning).
G. Pembahasan
Menurut Parikesit (2006), sebenarnya tumbuhan memiliki berbagai jenis molekul pigmen, masing-masing pigmen mampu menyerap gelombang cahaya yang berbeda. Karena itu, sesungguhnya molekul pigmen pada daun memang menyerap cahaya, akan tetapi dalam proporsi yang berbeda-beda. Molekul pigmen yang menangkap energi dari cahaya biru bekerja paling efisien, sehingga lebih banyak memperoleh energi daripada molekul pigmen lainnya. Sedangkan molekul pigmen yang bisa menyerap warna merah juga penting, terutama pada waktu subuh dan petang hari. Klorofil adalah molekul pigmen yang paling efektif untuk menyerap gelombang cahaya merah dan biru. Dikarenakan untuk efisiensi kerjanya, maka jumlah klorofil pada daun diproduksi dalam jumlah banyak daripada molekul pigmen lainnya (Parikesit, 2006). Kelarutan pigmen dalam pelarut organik berbeda-beda, sehingga dapat dipisahkan dengan tekhnik kromatografi kertas. Pada pemisahan pigmen digunakan pelarut dan eluat tertentu. Sebagai fase diam dipakai kertas Whatman yang khusus untuk kromatografi, sedangkan untuk fase bergerak (eluat) digunakan pelarut organik yaitu campuran antara 1 ml aseton dengan 9 ml petroleum eter (Dahlia, dkk. 2001: 117). Selama perbedaan kelarutan pigmen dalam eluat pada saat elusi menyebabkan terjadinya pemisahan komponen-komponennya. Pigmen yang memiliki kelarutan paling tinggi akan mengikuti eluat sampai jarak yang terjauh. Selama pergerakan bersama eluat, pergerakan solut akan dihambat
oleh fase diam, sebab solut berada dalam fase gerak tetapi juga berada pada fase diam. Besarnya hambatan tersebut dinyatakan dengan nilai Rf (Retandation Factor) dengan rumus Rf = ds/de (Dahlia, dkk. 2001: 116). Pada percobaan pigmen dalam kloroplas ini, teknik kromatografi yang dipakai adalah kromatografi kertas. Menurut Harborne (1984), keuntungan dari pemakaian kromatografi kertas adalah kemudahan tekniknya dan cara yang paling sederhana dan murah. Selain itu, keterulangan bilangan Rf merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan yang baru ditemukan. Menurut Gritter, dkk (1991: 157), kromatografi kertas pada hakikatnya ialah sama dengan kromatografi lapis tipis selulosa atau kertas. Cara ini ditemukan jauh sebelum kromatografi lapis tipis dan sudah digunakan efektif selama bertahun-tahun. Berdasarkan hal tersebut, peneliti mengambil kesimpulan bahwa nilai Rf pada kromatografi lapis tipis sama dengan nilai Rf pada kromatografi kertas, sehingga acuan yang dipakai untuk menentukan pigmen boleh dengan nilai Rf pada kromatografi lapis tipis meskipun pada penelitian menggunakan kromatografi kertas. Berdasarkan hasi pengamatan diketahui Rf daun pengamatan yang mendekati Rf dari feofitin b yang berwarna coklat kekuningan ada 3 macam, yaitu pada Rf daun alpukat pada spot 3 dengan selisih 0,03, daun penitian spot 1 dengan selisih 0,06 dan daun penitian spot 2 dengan selisih 0,04. Sedangkan pada Rf daun amatan yang mendekati Rf klorofil a (hijau biru) ada 1 macam, yaitu Rf pada daun alpukat spot 2 dengan selisih 0,09. Rf bahan amatan yang mendekati Rf klorofil b (hijau kuning) ada 2 macam, yaitu Rf pada daun alpukat spot 1 dengan selisih 0,02 dan Rf pada daun kembang sepatu spot 2 dengan selisih 0,04. Rf yang mendekati Rf pada feoforbida a (kelabu) ada 1 macam, yaitu Rf pada daun kembang sepatu spot 1 dengan selisih 0,05. Oleh karena itu, praktikan untuk menetapkan jenis pigmen daun yang diamati dengan selisih nilai Rf yang terkecil dari nilai Rf literatur. Secara kimia, pada klorofil terdapat satu inti tetra pirol dengan sati atom magnesium yang terikat secara ketat pada bagian tengah dan satu rantai samping hidrokarbon panjang tergabung melalui gugus asam karboksilat. D i
dalam tumbuhan sekurang-kurangnya terdapat 5 jenis klorofil, semuanya memiliki struktur dasar yang sama tetapi memiliki bermacam-macam sifat sesuai dengan rantai samping alifatik yang terikat pada inti porfirin (Harborne, 1987: 259). Dengan demikian, dari pembahasan diatas dapat diketahui bahwa spot dengan warna coklat kekuningan pada daun alpukat spot 3 adalah pigmen yang memiliki kalarutan paling tinggi. Hal ini tampak dari jarak yang ditempuh solut untuk mengikuti eluat. Hal yang dapat mempengaruhi nilai Rf kemungkinan disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu jumlah sampel yag ditotolkan pada kertas Whatman, kemiringan eluat, ketebalan spot yang dibuat, perbandingan konsentrasi pada campuran untuk membuuat eluat, kejenuhan dari tabung reaksi dan suhu serta waktu pemisahan klorofil. Karena itu, perlu diperhatikan faktor tersebut untuk mendapatkan nilai Rf yang cukup valid.
H. Kesimpulan
Dari hasil pengamatan dan pembahasan diatas, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut: a. Terdapat beberapa jenis pigmen yang berperan dalam fotosintesis, yaitu klorofil a dan b, feofitin b dan feoforbida a. b. Kelarutan antar masing-masing pigmen berbeda-beda. Semakin jauh j arak yang ditempuh oleh solut, maka kelarutan dari solut tinggi dan harga Rf-nya juga semakin besar. c. Daun bahan amatan yang memiliki kelarutan tinggi adalah pada daun alpukat yang sudah tua dengan nilai Rf = 0,77. d. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi nilai Rf amatan, yaitu jumlah sampel yang ditotolkan pada kertas Whatman, kemiringan eluat, ketebalan spot yang dibuat, perbandingan konsentrasi pada campuran untuk membuat eluat, kejenuhan dari tabung reaksi dan suhu serta waktu pemisahan klorofil.
I. Daftar Pustaka
Anonimus. 2005. Kesempurnaan Warna Seni Illahi, (Online) (http://www.harunyahya.com/indo/buku/citarasa005d.htm, diakses tanggal 20 Maret 2009) Anonimus. 2005. Analisis Kuantitatif Klorofil, (Online) (http://gedbinlink.wordpress.com/tag/analisis-kuantitatif-klorofil/, diakses tanggal 20 Maret 2009) Anonimus. 2004. Kloroplas, (Online) (id.wikipedia.org/wiki/Kloroplas, diakses tanggal 20 Maret 2009) Dahlia, dkk. 2000. Petunjuk Praktikum Fisiologi Tumbuhan. Malang: JICA Gritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB Harborne, J. B. 1984. Metode Fitokimia. Bandung: ITB Lakitan, Benyamin. 1993. Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: PT Raja Grafindo Persada Parikesit, Gea O. F. 2006. Mengapa daun tidak selalu berwarna hijau?, (Online) (http//72.14.235.104/search?q=cache:4yu, diakses tanggal 28 Maret 2009)
