Peran Enzim Protease dalam Pembuatan Senyawa Flavoring
Disusun oleh : Annisa Nurkhasanah
12!!!1"1#P1$%22
&o'h( Ainun Na)ib
12!!!1"!#P1$%2%
*osydina +hassani
12!!!1,1#P1$%!1
-evina Narkian Salim
12!!!1,!#P1$%!%
.N/0E*S/#AS +ADA &ADA FA3.-#AS #E3N4-4+/ PE*#AN/AN .*.SAN #E3N4-4+/ PAN+AN DAN AS/- PE*#AN/AN 54+5A3A*#A
Peran Enzim Protease dalam Pembuatan Senyawa Flavoring I. Pendahuluan Protease adalah enzim yang berfungsi untuk menghidrolisis ikatan peptida dari senyawa-senyawa protein dan diurai menjadi senyawa lain yang lebih sederhana (asam amino). Protease yang dipakai secara komersial seperti serine, protease, dan metalloprotease biasanya berasal dari acillus subtilis yang mempunyai kemampuan produksi dan sekresi enzim yang tinggi. !nzim ini secara komersial digunakan sebagai suplemen makanan dan digunakan pada terapi enzim. ("tami dkk., #$%#) &enyawa fla'or (aroma dan citarasa) sangat penting dan turut menentukan perkembangan industri makanan dan minuman. &enyawa tersebut menentukan sifat organoleptik yang merupakan salah satu atribut mutu makananminuman dan menentukan pasar produk tersebut. da dua kelompok fla'or, yaitu kelompok senyawa indigenus (indigenous fla'or) dan kelompok senyawa yang sengaja ditambahkan ke dalam produk makananminuman. &enyawa fla'or indigenus berasal dari bahan baku makanan itu sendiri atau terbentuk di dalam makanan selama proses pengolahan. *elompok senyawa fla'or yang kedua adalah senyawa fla'or yang sengaja ditambahkan untuk memperbaiki mutu sensoris (fla'or) makanan atau minuman tersebut. &enyawa fla'or ini termasuk ke dalam bahan tambahan makanan. *elompok senyawa ini ada yang +alami (natural) dan sintetisartificial. &enyawa fla'or +alami, sering juga disebut dengan bio-fla'or, merupakan senyawa yang dihasilkan dari ekstraksi tanamanhewan atau diproduksi secara mikrobiologis. enis fla'or ini sering
diperdagangkan dalam bentuk crude fla'or maupun pure fla'or. la'or sintetis merupakan senyawa yang dibentuk secara kimia. &enyawa fla'or sintetis mempunyai sifat sensoris yang sama dengan senyawa fla'or +alami.(nonim , #$%#) la'oring yang banyak menggunakan enzim protease dalam pembuatannya adalah meat fla'or dan yeast extract . *edua fla'or tersebut menggunakan enzim protease golongan sistein yakni enzim papain untuk mendapatkan asam amino sistein dan glutamat yang menjadi prekursor utama pada pembuatan senyawa fla'or tersebut. !nzim protease terbagi menjadi empat kelompok utama, mekanismenya yaitu serin, sistein, aspartat dan metal. Pada sisi aktif protease, sein dan sistein, gugus reaktif menyerang secara nukleofilik pada ikatan peptida. Protease aspartat dan metal mengaktifkan sebuah molekul air untuk menjadikannya sebagai nukleofil daripada menggunakan gugus fungsi enzim itu sendiri. /eskipun demikian, pada dasarnya keseluruhan proses pemecahan ikatan peptida adalah sama pada semua golongan protease. (nonim , #$%0)
!nzim sebagai biokatalisator berstruktur protein dalam mekanisme kerjanya aktiitasnya dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu antara lain, p1, &uhu, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, kehadiran aktiator atau inhibitor, adalah sebagai berikut2
a. P1 atau derajat keasaman p1 merupakan salah satu faktor penting yang harus diperhatikan apabila kita bekerja dengan enzim, hal ini dikarenakan enzim hanya mau dan mampu bekerja pada kondisi p1 tertentu saja. &uatu kondisi p1 di mana enzim dapat bekerja dengan akti'itas tertinggi yang dapat dilakukannya dinamakan dengan p1 optimum. &ebaliknya pada p1 tertentu enzim sama sekali tidak lagi aktif atau bahkan rusak. 1al
ini dapat dijelaskan karna kita ketahui bahwa enzim merupakan molekul protein, molekul
protein
kesetabilannya
dapat
dipengaruhi
oleh
tingkat
keasaman
lingkungannya, pada kondisi keasaman yang ekstrim molekul-molekul protein dari enzim akan rusak. b. &uhu 3emperatur &eperti halnya oleh p1, akti'itas kerja enzim juga dipengaruhi oleh temperatur lingkungan dimana ia bekerja. &eperti reaksi kimia biasa suhu biasanya dapat mempercepat proses reaksi, namun demikian pada titik suhu tertentu kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim akan mulai menurun bahkan akti'itasnya tidak lagi nampak. *ondisi suhu di mana enzim dapat menghasilkan akti'itas tertinggi dinamakan suhu atau temperatur optimum. 4leh karena enzim berstruktur protein, sebagaimana kita ketahui bahwa protein dapat dirusak oleh panas, sehingga pada suhu tinggi tertentu akti'itas enzim mulai menurun dan bahkan aktiitasnya menghilang. 1al ini sangat dimungkinkan karena terjadinya denaturasi atau kerusakan struktur protein oleh pengaruh panas. Panas yang berlebihan akan menybabkan terjadinya kerusakan struktur enzim yang dapat menybabkan kerusakan enzim baik secara keseluruhan maupun sebagian terutama sisi aktifnya. c. *onsentrasi &ubstrat 5eaksi-reaksi biokimia yang diktalisis oleh enzim diperngaruhi pula oleh jumlah substrat. ika kita melakukan pengujian konsentrasi substrat dari rendah ke tingi terhadap kecepatan reaksi enzimatis, maka pada awalnya akan diperoleh hubungan kesebandingan yang menyatakan kecepatan reaksi akan mkeningkat seiring dengan meninkatnya konsentrasi substrat, namun kemudian akan diperoleh data yang menyatakan pada konsentrasi substrat tinggi tertentu kecepatan reaksi tidak lagi
bertambah. Pada kondisi ini konsentrasi substrat menjadi jenuh dan kecepatan reaksi menjadi maksimum yang sering juga disebut sebaai kecepatan maksimum (6ma7). 1ubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi biasanya dinyatakan dengan konstanta /ichelis-/enten (*/). 8ilai */ didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat kecepatan reaksi enzimatis mencapai setengah dari kecepatan maksimumnya. d. *onsentrasi !nzim Peningkatan
konsentrasi
enzim
dalam
suatu
reaksi
biokimia
akan
meningkatkan kecepatan kecepatan reaksi yang dikatalisisnya. e. *ehadiran akti'atorinhibitor kti'ator adalah zat atau senyawa yang dapat menyebabkan meninkatnya aktiitas enzim apabila ia berada pada saat terjadinya reaksi, dan sebaliknya inhibitor adalah zat yang dapat menghambat akti'itas reaksi. (anonim c, #$$9)
II. Peran !nzim Protease %. /eat and ish la'or Prekursor dari fla'or daging dibagi menjadi dua kategori yaitu komponen larut air (asam amino,peptida,karbohidrat,nukleotida,tiamin,dll) dan komponen tidak larut air (lemak). 5eaksi /aillard antara asam amino dan gula reduksi memicu pembentukan aroma. 5eaksi sistein dan gula reduksi membuat karakteristik fla'or daging terutama daging ayam dan babi. la'or daging sapi didapatkan dari reaksi oksidasi lemak,degradasi akibat panas dan interaksi antara protein,peptida,asam amino dan karbohidrat.Prekursor dari fla'or daging babi adalah #-metil-0-firantiol dan bis-(#-metil-0-furil)-disulfida. 5eaksi /aillard antara gula reduksi dan asam
amino terutama sistein merupakan penentu utama aroma.&edangkan prekursor pada fla'or daging ayam adalah #-metil-0-furantiol,#-furfurythiol,metionol,nonanol,dan #trans-nonenal. &enyawa #-metil-0-furantiol adalah komponen utama dari fla'or daging ayam. &enyawa tersebut merupakan hasil reaksi antara ribosa dan asam amino yang mengandung sulfur seperti sistein atau sistin. (:hoe et al ,#$%$) erikut adalah reaksi pembentukan senyawa #-metil-0-furantiol 2
(/elton,%999) Pada pengembangan senyawa fla'or pada daging,senyawa prekursor yang paling penting adalah keberadaan asam amino mengandung sulfur yakni sistein. 4leh karena itu pasti terjadi degradasi protein oleh enzim protease golongan sistein protease yang menghasilkan asam amino sistein. !nzim yang biasanya digunakan dalam pembentukan senyawa fla'or daging adalah enzim papain. !nzim Papain (!: 0.;.##.#) tergolong ke dalam kelompok protease yang merupakan sistein endopeptidase. Pengelompokan tersebut adalah berdasarkan
nukleofil yang bertindak sebagai residu katalitiknya yaitu sistein (-&1).!nzim papain termasuk protease sistein dengan struktur yang terdiri dari rantai tunggal polipeptida dangan tiga jembatan disulfida dan pada sisi aktifnya terdapat residu sistein,histidin dan asparagin. p1 optimum enzim papain adalah <-= dengan suhu <$-=$>:. erikut adalah tabel mengenai senyawa fla'or yang terdapat pada daging 6om7ounds
Flavour dilution
4dour
8a'tor
des'ri7tion
ayam dan sapi 2
(?asser "., and ?rosch 2ðyl!8uranthiol
6hi'ken %,$#;
9ee8 A%#
@,%99$) /eat-like, *ecap
bis ;2ðyl!8uryl< disul7hide 28ur8urylthiol 2=>dimethyl!8uranthiol !mer'a7to27entanone ðionol
2=%=>trimethylthiazole 28ormyl> methylthio7hene Phenyla'etaldehyde 2trans%trans
B%<
#,$;C
sweet /eat-like
ikan
merupakan produk
A%# #A< %#C %#C
%#C <;
A%# B%< 0# A%#
5oasty /eaty &ulphurous :ooked
B%< <;
potato !arthy &ulphurous
fermentasi ikan dengan garam. *ecap
ikan
digunakan oleh masyarakat
%< #,$;C
<; B%<
1oney-like atty
sebagai bumbu masakan,
de'adienal 2trans%'isde'adienal 2unde'enal
%#C #A<
B%< B%<
atty, tallowy 3allowy,
penyedap
dan
pencelupan ?dode'ala'tone
?de'ala'tone Nonanol
A%#
<; <;
B%<
sweet 3allowy,
B%< B%<
fruity Peach-like 3allowy,
2transnonenal 2trans%trans
<; <;
B%< B%<
green 3allowy, fatty atty
nonadienal @ionone 7'resol
<; <;
B%< B%<
6iolet-like Phenolic
seafood. *ecap ikan
memiliki
cita rasa yang berbeda
dengan kecap yang dibuat dari kacang kedelai. @arnanya bening kekuningan sampai cokelat
muda
dengan
rasa
asin
yang
relatif
serta
banyak
mengandung
senyawasenyawa nitrogen. Penggunaan enzim proteolitik yang murni pada pembuatan kecap ikan memiliki kelemahan karena harga enzim yang cukup mahal. Pemanfaatan sumber-sumber enzim yaang berasal dari alam bisa menjadi alternatif pengganti enzim kon'ensional. &alah satu enzim yang bisa dimanfaatkan adalah enzim bromelin yang berasal dari buah nanas dan enzim papain dari daun pepaya. Penambahan bromelin dan papain dapat memperpendek waktu fermentasi kecap ikan (:hoi et al ,%999). /enurut (addows and rdhesir,%9=9),enzim bromelin dan papain dapat mencerna jaringan otot ikan dalam waktu pendek,kemudian memproduksi hidrolisat dengan distriusi dan komponen konsentrasi nitrogenus hampir sama dengan kecap ikan tradisional tetapi memiliki aroma yang berbeda. Proteolisis yang terjadi selama proses fermentasi kecap ikan diasumsikan telah menyebabkan peptida-peptida dan asam amino mengalami perubahan melalui deaminasi,dekarboksilasi dan transaminasi menghasilkan amina,asam-asam keto amonia. 1al penting pada tahap proses proteolisi dalam pembentukan aroma adalah ketersediaan asam amino sebagai substrat untuk transformasi atau sintesis senyawasenyawa fla'or oleh bakteri (eddows et al,%9=<). sam amino yang dominan berperan dalam pembentukan fla'or pada kecap ikan adalah asam glutamat,asam aspartat,lisin,leusin dan sistein. &enyawa 'olatil seperti sulfur dan nitrogen merupukan komponen utama senyawa fla'or pada kecap ikan. &enyawa sulfur bisa didapatkan dari bahan baku atau selama proses fermentasi menghasilkan peptida dan asam amino sistein. (?iri et al ,#$%$) #. &a'ory la'or Pada tahun %9CA, istilah umami atau sa'ory fla'or diakui sebagai istilah ilmiah untuk menggambarkan rasa glutamat dan nukleotida . "mami merupakan rasa asam amino D-glutamat dan AE-ribonukleotida seperti guanosin monofosfat (?/P) dan
inosin monofosfat (I/P). &ensasi umami terjadi karena deteksi anion karboksilat dari glutamat dalam sel reseptor khusus yang ada pada manusia. "mami meningkatkan palatabilitas berbagai macam makanan.
!nzim proteolitik akan menghancurkan
protein dan menghasilkan peptida dan asam amino. egitu juga enzim nuklease yang akan menghancurkan F8 dan 58 menghasilkan nukleotida ataupun nukleosida. la'or sa'ory merupakan salah satu jenis rasa yang banyak disukai yang diidentikkan dengan rasa gurih antara lain seperti pada kaldu, keju dan /&?. &alah satu bahan yang digunakan untuk menghasilkan fla'or sa'ory adalah ekstrak kamir, dimana kelebihannya yaitu tidak ada laporan baik pada hewan percobaan maupun manusia bahwa ekstrak kamir memberi reaksi seperti /&?. Dagipula oleh "& griculture Fepartement menggunakan nama umum ekstrak kamir ( yeast extract ) dan ditetapkan oleh F sebagai fla'or alami. !kstrak kamir banyak digunakan dalam formulasi fla'or dalam produk produk mie instan, ekstrusi ( snack food ), produk panggang (piza) dan berbagai jenis saus pengganti fla'or daging. Pembuatannya dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu hidrolisis, plasmolisis dan autolisis. utolisis adalah metode alternatif yang menarik, dimana ekstrak kamir yang diolah secara autolisis akan menjadi ingridien penting untuk fla'or daging karena mengandung asam amino dan peptida yang tinggi sebagai prekursor untuk reaksi /aillard, dan kemungkinan peptidanya dapat digunakan sebagai bahan tambahan citarasa dan penegas rasa sebagai alternatif /&?.8amun proses ini kurang optimal dalam mendegradasi komponen untuk membentuk fla'or sa'ory yang diinginkan. 4leh karena itu, salah satu upaya untuk memaksimalkan proses ini adalah dengan penambahan enzim protease. Indikator yang digunakan untuk mengetahui tingkat keberhasilan penambahan enzim ini adalah total nitrogen, formol nitrogen, protein terlarut, nila p1, kadar asam glutamat bebas, dan total amonia. Parameter inilah yang akan menggambarkan perbedaan proses autolisis
dengan penambahan enzim protease dan tanpa penambahan enzim protease. !nzim protease yang ditambahkan adalah enzim papain. !nzim papain mempunyai spesifisitas atau akan memotong gugus asam amino pada sisi rg, Dys, ?lu, 1is, ?ly, 3yr. sam amino hasil proteolisi oleh enzim papain salah satunya adalah asam glutamat yang merupakan fla'or dominan pada yeast extract . 0. :hocolate la'or ermentasi dan pengeringan merupakan tahapan dalam pengolahan buah kakao menjadi coklat yang menentukan karakteristik fla'or coklat. Pada saat fermentasi terjadi pembentukan precursor fla'or utamanya asam amino dan reduksi gula. *eduanya berperan dalam reaksi /aillard (pencoklatan) saat proses penyangraian kakao. 5eaksi ini membentuk karakteristik fla'our coklat (warna dan aroma khas) Proteolisis sangat penting dalam pembentukan fla'our coklat. Pada saat fermentasi terjadi proses proteolisis yakni penguraian protein menjadi asam amino dan peptide. sam amino dan peptide ini terbentuk selama proses fermentasi akibat kinerja enzim endoprotease dan e7opeptidase. Protein dalam buah kakao tidak berasa sebab berat molekul protein sangat besar. 1al ini juga disebabkan molekul protein dalam buah kakao merupakan globular yang tertutup dengan konfigurasi struktur yang kompleks, asam amino yang tergolong hidrofobik terjebak didalamnya. sam amino ini tidak dapat kontak dengan taste bud yang ada di lidah sehingga tidak berasa (hambar). pabila protein ini dihidrolisis oleh protein maka struktur globular akan pecah dan grup asam amino hidrofobik dapat terurai. ?rup asam amino ini dapat kontak dengan taste bud dan memberikan rasa pahit. (Gongsheng et al, #$%;). !nzim minopeptidase menguraikan asam amino hidrofobik yang menyebabkan taste pahit. sam amino hidrofobik yang terkandung pada buah kakao setelah fermentasi adalah alanin, isoleucine, leucine, prolin, 'alin,
methionin dan fenilalanin. (&abahannur et al, #$%A). !nzyme yang digunakan adalah leucine aminopeptidase yang memotong peptide yang mengandung asam amino leucine. sam amino leucine ini tergolong asam amino hidrofobik yang apabila terlepas maka akan menimbulkan cecap pahit pada lidah. *arakteristik enzim yang digunakan untuk fla'oring coklat adalah 2 la'ourzyme mengandung Deucine minopeptidase yang diekstraksi dari spergilus oryzae. !nzim ini optimal pada suhu A$-AAo : dan P1 antara 9,$. (/erz et al, #$%A). Deucine minopeptidase yang tergolong e7opeptidase ini memecah Dleucylglycine dan peptide lainnya yang memiliki 8-terminal leucine.
Deucine
minopeptidaseini tergolong metaloprotease yang memerlukan ion /n#H atau /g#H untuk aktifatornya. (Din et al, #$%$)
(5aisonnier, #$$;) Deucine aminopeptidase memecah asam amino leucine dan beberapa asam amino lainnya kecuali arginin dan lisin. (nonim , #$%A). sam amino yang terbentuk seperti alanin, tirosin, 'alin, isoleusin, leusin dan fenil alanin tergolong asam amino hidrofobik yang merupakan precursor pembentukan aroma dan cecap pada kakao. &elain menimbulkan cecap pahit, asam amino hidrofobik ini precursor
utama pembentukan methylpirazins. &enyawa methylpirazin ini merupakan hasil reaksi asam amino dengan gula reduksi pada reaksi /aillard.
Da8tar Pustaka :hoe 1., 8am *., ung &., *im ., Gun 1., o :. #$%$. Fifferences in the Juality characteristics between commercial *orean nati'e chickens and broilers. *orean ood &ci nim 5esour. 0$2%0K%9. ?asser "., ?rosch @. %99$. Primary odorants of chicken broth2 comparati'e study with meat broths from cow and o7. L Debensm "nters orsch. %9$20KC. Din, &hie-ea, Di-Din :hen, :hiou-Gen @en and @en-&hen :hu. #$%$. !7tracellular leucine aminopeptidase produced by Aspergillus oryzae DD% and DD#. frican ournal of /icrobiology 5esearch. ;(0). %AC-%
Niong
GD,
1o
:3,
&hahidi
,
editors*luwer
cademicPlenum
PublishersO8ew Gork2 p. %%AK%0$. /erz, /ichael, 3homas !isele, Pieter berends, Faniel ppel, &wen rabe, Imre lank, 3imo stressler and Dutz ischer. #$%A. la'ourzyme, an !nzyme preparation with Industrial 5ele'ance 2 utomated 8ine-step Purificatiom and Partial :haracterization of !ight !nzymes. &cience.go'. Fiakses pada tanggal #; 4ktober #$%A 5aisonnier, Pr . #$$;. Figestion-Feti7ification. www.chups.jussie.fr. Fiakses pada tanggal #A 4ktober #$%A
&abahannur, &t, /ursalim, Daode srul, /ariyati ilang. #$%A. "se of 1igh Performance DiJuid :hromatography (1PD:) for the nalysis of mino cid of &ulawesi and Docal :lone :ocoa ean ermentation. urnal of ood 5esearch. ;(;). %#$-%#< &ousa de rito, !dy, 8elson 1oracio Pezoa ?arcia, and llan :esar mancio. #$$;. "se of a Proteolytic !nzyme in :ocoa ( 3herobroma cacao D.) Processing. raziian rchi'es of iology and 3echnology. ; (;=). AA0-AAC Gongsheng /a, Dintong @ang, NIanhui &un, ianJiang Lhang, unfeng @ang and Gue Di. #$%;. &tudy on 1ydrolisis :onditions of la'ourzyme in &oybean Polypeptide lcalase 1ydrolysate and &oybean Polypeptide 5efining Process. d'ance ournal of ood &cience and 3echnology, <(9) 2 %$#=-%$0# nonim , #$%#. http2foodre'iew.co.idbaruinde7%.phpidQA<;#A diakses pada tanggal #0 4ktober #$%A pukul %92#A @I
