Osmosis y permeabilidad del eritrocito (Resumen)
Osmolalidad: Número de partículas partículas osmóticamente activas que se encuentran disueltas disueltas en 1kg de solvente. Utilizando Utilizando esta
definición como base, se puede clasificar el medio en el que se encuentre una célula (siempre se define en relación al medio). med io). Tonicidad (osmolalidad efectiva): relaciona la cantidad de partículas osmóticamente activas que se encuentren en una solución, sin embargo, solo toma en cuenta aquellas partículas no permeantes, indicando aquellas que son incapaces de atravesar libremente las membranas celulares. Toma en cuenta solamente aquellos solutos que ejercen una presión osmótica, y por lo tanto, provocan movimiento del solvente, de un lado de la membrana al otro, dependiendo del tipo de me dio en el que se encuentre esta célula. Los cambios en el volumen celular se agrupan en: 1. Los cambios de volumen aniosmóticos son aquellos que son inducidos por alteraciones en la osmolalidad extracelular. En condiciones fisiológicas normales las células están protegidas por la función renal de mantenimiento de la osmolalidad. osmo lalidad. 2 2. Los cambios isoosmóticos son aquellas alteraciones en el contenido intracelular. En este caso las células se mantienen protegidas de estas alteraciones por el preciso balance que ma ntiene la célula de los ingresos y egresos de metabolitos. Mecanismo de cambio en el volumen celular: (1) la percepción del cambio en volumen.
Los estímulos que son censados durante un cambio del volumen celular y que generan mecanismos de respuesta son: 1.
“Hacinamiento” “Hacinamiento” macromolecular. macromolecular.
Generalmente se refiera a que si disminuye o aumenta la cantidad de macromoléculas, lo que nos va a afectar es la función enzimática. 2.
Concentración iónica.
Se considera muy documentado la asociación entre la concentración iónica de la célula en casos de alteraciones del volumen y la activación de cascadas de señalización. 3.
Cambios químicos y mecánicos en la bicapa lipídica.
Osmotransducción Dos mecanismos celulares claramente inducidos por por cambios en el volumen celular: celular: cambios bioquímicos (en las concentraciones de macromoléculas y en las concentraciones iónicas) cambios mecánicos (sensados mediante la arquitectura del citoesqueleto y en la tensión de la membrana) Con relación a estos cambios hay descritas algunas teorías de cómo puede ser que funcione este sistema. Se considera que la alteración en la membrana puede producir que estiramiento o desdoblamiento en algunas proteínas de membrana. A pesar de que la mayoría de las proteínas no van a sufrir variaciones significativas, ya y a que están ancladas en la membrana, es importante saber que tienen receptores de estiramiento que son los que van a ser estimulados en estos cambios de volumen.
La activación de las vías de movilización de osmolitos que finalmente restablecen el equilibrio osmótico y el volumen celular
Cuando las células son sometidas a diferentes osmolaridades tienden a presentar dos estados: aumento del volumen celular celular cuando son sometidas a osmolaridades osmolaridades menores que la intracelular. disminución del volumen cuando son sometidas a concentraciones hiperosmolares. Parte I Observación de cambios morfológicos
En el caso de los eritrocitos que no fueron expuestos al agua destilada ni a la solución de salina permanecieron en un ambiente de osmolalidad plasmática. Ósea que permanecieron en un medio isotónico, a raíz de esto no hay diferencia entre la concentración de solutos no permeantes entre el medio y el interior de la célula, por lo cual no hay una diferencia de presión osmótica. Al no haber diferencia en la presión osmótica no se da un flujo neto de agua a través de las membranas de los eritrocitos, lo que permitió que estos conservaran su morfología y tamaño original. Sin embargo la administración de líquidos con una tonicidad diferente a la del plasma originará desplazamientos de agua entre el LEC y el LIC, produciendo cambios en el volumen celular . La solución salina de 1200 mOsm la cual es utilizada en el laboratorio es hiperosmolar. Cuando los eritrocitos son expuestos a la solución salina 1200mOsm se crea una diferencia en la presión osmótica, por lo que se genera un movimiento de agua, en el cual, esta pasa del interior de la célula al medio, en un intento de equilibrar las concentraciones. La perdida de agua provoca una disminución en el volumen. Además, la forma de estas células varía, estás adquieren una forma estrellada, fenómeno que combina cambio de forma y disminución del volumen v olumen y se conoce como crenación. El agua destilada es considerada hipotónica, ya que la cantidad de solutos que posee es inferior al del eritrocito. En un intento por equilibrar las concentraciones de los solutos que se encuentran en el medio hipotónico con los del interior de la célula,
se produce un flujo de agua del medio al interior del eritrocito, lo que provoca que estos se hinchen y pierdan su forma de disco bicóncavo. En algunos casos los eritrocitos se rompen por el exceso de agua en su interior produciendo la salida de hemoglobina. Cuando una célula se expone a condiciones externas de hipotonicidad se produce un hinchamiento celular debido al aumento del contenido de agua que ha difundido pasivamente desde el exterior. El hinchamiento celular induce variaciones en el estado de agrupamiento de proteínas citosólicas intracelulares, por eso una gran variedad de proteínas quinasas como la PKC, PKA, PI-3 quinasa, FAK, MAP quinasas (JNK, ERK-1, ERK-2, p38 MAP), tirosín quinasas (TK) y otras, se han descrito alteradas durante variaciones en el volumen celular (Pasantes-Morales,2006). También se ha demostrado que todos los miembros de la subfamilia de las src TK son sensibles a cambios anisotónicos, participando en la activación de canales de Cl, canales de K+ y cotransportadores (KCC). Incluso algún miembro de la familia src ha sido propuesto como parte de un sistema sensor que junto con las integrinas y proteínas G (del tipo rho) participaría en la mecanotransducción de la deformación de la membrana en algunos modelos celulares. Por lo tanto, existen muchos candidatos para detectar cambios en el volumen celular: desde canales mecanosensibles como receptores TRPV, los cuales son sensibles a estados de hipotonicidad y otra gran variedad de proteínas de membrana, citosólicas o del citoesqueleto que se alteran frente a estos cambios inducidos por el hinchamiento .. No obstante, a pesar de algunos ejemplos documentados, se desconoce con certeza la naturaleza del sistema sensor responsable de la detección de los cambios de volumen debido, principalmente, al carácter integrador de las vías de señalización activadas. Parte II. Curva de Fragilidad osmótica
En el comportamiento sigmoideo de la curva de fragilidad osmótica se refleja que al exponer la célula a soluciones salinas dentro de un rango de 0 mOsm/l (agua destilada)300 mOSm/l, se determinan tres etapas en la curva que señalan los diferentes mecanismos que se están desarrollando dentro de la célula. Se inicia con una osmolaridad semejante a la plasmática de 300 mOsm/l y se van disminuyendo las osmolaridades de las soluciones, presentándose como medios hipotónicos para la célula. Las células son más permeables al agua que a muchos otros iones, esto mediante las acuaporinas, las cuales por efecto del gradiente el agua entra en el eritrocito, y provoca un aumento en el tamaño de la célula, esto es regulado por el mecanismo de disminución reguladora del volumen (RVD). Existe otro mecanismo regulatorio que se encarga de aumentar el volumen de la célula cuando esta se encuentra en un medio hipertónico, el cual se llama mecanismo de aumento regulador del volumen (RVI). Cuando la célula se encuentra entre 200-300 mOsm/ presenta un comportamiento constante, como se observa en la curva, es decir presenta porcentajes de hemólisis semejantes. Los mecanismos de RVD están funcionando activamente para contrarrestar el cambio. La activación de los canales se inicia desde que se sensa aproximadamente un 5% en el cambio del volumen celular. Los cambios dados durante la activación de los RVD incluyen: 1. Debido a la fuerza electroquímica de K+, este puede dirigirse hacia afuera de la célula, pero este requiere de la salida análoga de un anión, que generalmente es el cloruro. 2. El acoplamiento de estos dos iones puede darse gracias a los cotransportadores electroneutro de K y Cl, KCCs se activan en respuesta al aumento del volumen, y la activación es causada por desfosforilación. Cuatro isoformas, estos se rigen por los ciclos de la serina/ treonina fosforilación y desfosforilación. 3. También la salida de estos se da por separado a través de varios tipos de canales de K y la salida de este se debe dar acompañada de un flujo de salida de aniones en paralelo, que se lleva a cabo a través de VRAC. El Cl se piensa que es el sustrato preferido de VRACs. Una reducción en la fuerza iónica intracelular, cuando se da la inflamación celular, parece ser el parámetro detectado por VRACs (son corrientes aniónicas que sensan una reducción en la fuerza iónica intracelular, durante el aumento en el volumen celular ) 4. TRPs: Entrada de Ca++ (cationes), sensores explícitos de cambios en el volumen. Teorías sobre la activación: Distención directa de la membrana
La movilización de moléculas de anclaje La activación de fosfolipasas La inserción de vesículas del interior de la célula. 5. El eflujo de taurina, que en condiciones normales es modesto, aumenta de forma exponencial cuando las células aumentan de volumen, 30-90% de la taurina intracelular sale de la célula después de la inflamación. La identidad de la vía de flujo de salida de la taurina es desconocido, pero se sugiere que los VRACs median este eflujo, así como el otros osmolitos orgánicos. Es importante destacar que este eflujo se lleva a cabo a diferentes tiempos comparados con el de los iones, es decir este se presenta en un tiempo más tardío comparado con el de los iones. Después en la curva se observa un comportamiento lineal donde a menores osmolaridades mayor hemólisis, esto se debe a que aunque todavía hay dentro de la solución algunos eritrocitos que están solucionando el problema de aumento del volumen hay otros que no. Al final del tope de la curva se observa otra vez aplanada, es aquí donde el 100% de los eritrocitos de la solución han sufrido hemólisis. Hay que denotar que nunca se observó una hemólisis en cero, pero esto es claramente esperable. En los seres humanos, el proceso de hemólisis puede ser inducido por razones mecánicas. También es importante agregar que los mecanismos tienden a disminuir en su efectividad, conforme la osmolaridad de la solución varie en grados extremos. Este efecto está claramente reflejado en la figura 1. III Parte. Permeabilidad de la membr ana para varias moléculas orgánicas en concentraciones isoosmolares.
Las membranas celulares representan una importante barrera biológica que juega un papel preponderante en la homeostasis celular y su permeabilidad a las diferentes sustancias le confieren a la célula la capacidad de especializarse en la realización de ciertas tareas. Casi todas las moléculas utilizadas son sustancias orgánicas no cargadas; como es el caso del butanol, el Isobutanol, el etilenglicol, la etanolamina, la tiourea y la dietanolamina.Por otro lado sustancias como el agua, la urea y la glucosa presentan un mecanismo de transporte a nivel de membrana así como el NaCl. El flujo o influjo de este tipo de sustancias va a ser influenciado no solo por un gradiente químico sino también por uno eléctrico como en el caso del NaCl, así como la cinética de transporte de cada una de las proteínas de membrana que participan en el transporte transmembranal de éstos solutos y la cantidad de éstas expresadas en la membrana celular. Los menores tiempos de hemólisis lo poseen las sustancias urea y butanol, a pesar de éste último ser un compuesto que atraviesa la membrana por difusión simple. En concreto el eritrocito maduro del humano adulto posee transportadores de membrana para la urea, específicamente los del tipo UT-B causante de los bajos tiempos de hemólisis registrados para la urea. El ingreso de urea a la célula se debe exclusivamente al gradiente de concentraciones entre el LIC y el LEC, lo que causa el ingreso de ésta, además que no existe ningún mecanismo celular alternativo que extraiga la misma sustancia del eritrocito o bien la metabolice como en el caso de la glucosa. En el caso de sustancias como el butanol y el isobutanol con tiempos de hemólisis bajos, se sigue un patrón de difusión más parecido a lo que determina la ley de Fick, debido a que ambas son moléculas con relativa liposolubilidad y definitivamente un bajo peso molecular (PM), ambos PM 74. El tiempo de hemólisis registrado en el laboratorio para el Isobutanol es 2,3s mayor al del butanol.
Esto se debe a otro factor que tiene que ver con la estructura molecular del compuesto. El isobutanol es un compuesto químico con una conformación molecular más ramificada, esto le proporciona un mayor impedimento estérico debido a la diferente colocación del grupo hidroxilo –OH respecto al butanol Respecto a la etanolamina PM 61 y el etilenglicol PM 62, ambas sustancias presentan un peso molecular aún más bajo que el del butanol y el isobutanol, pero su estructura química les brinda mayor polaridad que los dos alcoholes anteriores. El mayor tiempo para la hemólisis del etilenglicol nos lleva a la observación química de la mayor polaridad brindada al alcohol por sus dos grupos hidroxilo OH ante la polaridad de la am ina dada por un por un grupo NH 2 y un OH. Para el caso de la tiourea y la etanolamina, ambas sustancias siguen un mecanismo de difusión simple a través de la membrana celular. La tiourea presenta una altísima polaridad y en disolución los dos átomos de N2 y de S de cada molécula van a formar enlaces de hidrógeno entre moléculas y con el agua por lo que se crea un impedimento para la libre. Por otro lado de la dietanolamina uno de los mayores factores en su difusión por la membrana es el alto PM 105 si se compara con las sustancias anteriores, además de una baja liposolubilidad debido a su p olaridad. La glucosa (PM 180) no registró hemólisis en la solución de eritrocitos en el período de observación en el laboratorio. La glucosa ingresa a la célula en gran cantidad por un mecanismo de difusión facilitada. Para esto el eritrocito posee el GLUT-1. Los eritrocitos, dependen energéticamente de forma exclusiva de la glucosa y su metabolismo; una vez que ingresa a la célula se fosforila y pasa los procesos de glucólisis o glucogénesis, esto contribuye a mantener el gradiente de concentraciones. El GLUT-1 es una proteína de membrana que tiene 12 dominios transmembrana (12TM) con su respectiva con formación α-hélice cada uno y asas intracelulares y extracelulares que unen cada uno de los 12TM. Además posee una alta afinidad por la glucosa. Km= 1-2mM. El GLUT-1 es especialmente importante en tejidos cuyo metabolismo energético depende altamente de la glucosa, y es entonces que se vuelve importantísimo en el eritrocito, donde se ha llegado ha documentar que corresponde a un 5% del total en peso de la membrana plasmática del eritrocito además posee una alta afinidad por la glucosa. Km= 1-2mM (Bermúdez, V; et al. 2007), esto hace que este transportador pueda internalizar la glucosa casi sin importar la concentración de ésta en el LEC y hace que el control nivel intracelular de glucosa y fuentes energéticas en el eritrocito estén estrechamente reguladas, es por esto y el hecho del metabolismo intracelular de la glucosa que se explica el de hecho de que no se manifestara hemólisis en el laboratorio para la solución de eritrocitos con glucosa. el GLUT-1 también posee un comportamiento de saturación; similar al descrito por Michaelis – Menten, es por eso que a pesar de ser una gran cantidad de glucosa presente en solución no toda la glucosa ingresa inmediatamente a la célula y al ser incapaz de difundir por la bicapa, la hemólisis no se observará hasta que eventualmente el GLUT1 haya internalizado en los eritrocitos mucha de la glucosa de la disolución. El NaCl en solución se disocia en un 93% en la solución lo que causa que los iones de Cl - y Na+ se hidraten. El Na+ posee gran cantidad de transportadores de membrana plasmática entre los que se pueden citar cotransportadores como los SGLT, el NCC, NKCC2, NBC1. En el eritrocito se pueden cotransportar por medio del NCC iones de Na + y Cl- así como con el NKCC2, además en las células rojas resulta importante el NBC capaz de transportar sodio y bicarbonato importante para la función de transporte de CO 2 de los eritrocitos. También hay proteínas de transporte inverso para el sodio como el NHE y el NCX, el primero intercambia hidrogeniones con sodios lo que resultaría importante en la regulación del pH celular y el NCX transporta 3 moléculas de Sodio por cada Calcio. De la misma forma para el Cl- existen transportadores de membrana celular como el AE de especial importancia en el eritrocito como el NHE pues es capaz de intercambiar bicarbonato por cloruro. Así como cotransportadores como el KCC y los mismos canales iónicos específicos para cloruro. Al exponerse los eritrocitos a la solución salina isoosmolar, se va a producir la difusión de los iones a través de la membrana por medio de los diferentes transportadores de membrana existentes sin embargo la célula posee mecanismos muy importantes para evitar que se recargue de estos iones el LIC, el principal mecanismo lo brinda la Na+/K+ ATPasa que utiliza la energía del ATP para transportar 3 moléculas de sodio fuera de la célula y a la vez hacer ingresar a ella 2 moléculas de potasio. Estos mecanismos de transporte transmembranal y en especial la Bomba de Na+/K+ explican el hecho de que en el laboratorio no se observara hemólisis significativa en la solución de eritrocitos con solución salina que además se encontraba en condiciones de isoosmolaridad con el eritrocito por lo que el movimiento molecular por gradientes es mínimo.
